CAMPO DA INVENÇÃO

[1] A presente invenção se refere ao processo de epoxidaçãc enzimática de terpenos utilizando lipase e peróxido de hidrogénio, compostos epoxidados e p uso dos compostos como agente antiproliferativo,

(2] A presente invenção se insere no campo de aplicação farmacêutica, mais especificamente na área de antiproliferativos.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[3] A biocatálise é a utilização de catalisadores naturais como enzimas para realizar transformação química de compostos orgânicos. A enzima utilizada pode estar isolada ou presente em organismos celulares como nos microrganismos..

[4] A biocatálise possui algumas vantagens sobre os processos químicos convencionais de reaçâo tais como:

·. processo limpo;

• redução de etapas de processo;

• redução do consumo de energia - baixas temperaturas (60 - 70°C) ;

• evita a formação de sub-produtos;

• redução do impacto ambientai;

• redução Kg de CO2 equivalente (crédito de carbono) ; « alta seletividade;

• redução de insalubridade e periculosidade na área produtiva;

f5] As lipases constituem uma classe de enzima amplamente utilizadas em biocatálise e apresentam estabilidade tanto na presença de solventes orgânicos quanto em condições extremas de pH e em líquidos iónicos. No entanto, um conceito importante que se deve observar quando se faz o uso de enzimas em reações químicas é o conceito de promiscuidade enzimática.

[6] Segundo Carboni-Oerlemans e colaboradores o conceito de promiscuidade enzimática é a habilidade de uma enzima (ou grupo de enzimasj promover diferentes reações através de um sitio ativo "secundário" os quais podem estar mais ou menos distantes do escopo natural do seu principal sitio ativo. As lipases, que pertencem à família das hidrolases, representam um excelente exemplo de promiscuidade enzimática. As lipases catalisam tanto a clivagem das ligações ésteres de óleos vegetais ou de ésteres graxos, como a formação das mesmas. Segundo Kapoor e colaboradores uma das reações não convencionais catalisadas pelas lipases é a perldrólise, onde o ácido peroxicarboxilico é gerado a partir de um ácido carboxilico e peróxido de hidrogénio (Fig. 1) ,

[7]. A epoxidação enzimática vem sendo amplamente estudada nas últimas décadas, conforme demonstrado pelos documentos abaixo.

[8] 0 documento WO2010098651A1 tem como objetivo epoxidar as insaturações dos óleos obtidos de plantas, principalmente o óleo de palma e o óleo de palma kernel. As cadeias graxas insaturadas são o ácido oleico, com 44% no óleo de palma e 15,3% no óleo de palma kernel, e o ácido lin.ole.ico, com 10% no óleo de palma e 2,3% no óleo de palma kernel. No processo foi utilizado uma mistura de duas enzimas imobilizadas co&o a Novozymes 435 obtida do microrganismo Cândida Antárctica, e a Lipozyme RM IM obtida do microrganismo Rhizomucor miehei, embora não cite a proporção entre elas, podendo em alguns casos como no exemplo citado utilizar somente uma delas, no caso a Novozyme 435. A biocatálise é realizada na presença de peróxido de hidrogénio e de solvente orgânico apolar, preferencialmente o tolueno, com temperaturas entre 25°C a 60°C, preferencialmente 30°C. [9] Entretanto, o documento acima não antecipa a presente invenção, porquê o material de partida são óleos vegetais, e não terpenos (mono, sesqui e diterpenos) como no caso da presente invenção. Apesar de utilizar a enzima imobilizada 435, utiliza solvente tolueno durante a biocatálise, e na presente invenção não é utilizado solvente ("solvent free") , com exceção da epoxidação da coronarina D por ser sólida.

[10] ^Q documento DE10201QG0Q168 utiliza um polipeptideo, que é isolado ou expressado de forma recombinante num organismo hospedeiro, possuindo uraa sequência de aminoácidos que ê pelo menos 80% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID N * 1, já a presente invenção utiliza enzimas purificadas (lipases) imobilizadas e comerciais. No documento alemão há exemplos em que a sequência codificante foi clonada para o citocromo P450 CYP109D1 em microrganismos correspondentes por métodos geralmente conhecidos, as proteínas expressas de acordo e depois isoladas e purificadas. Em outros casos além do citocromo P450 CYP109D1, o complexo de chaperona GroES / GroEL foi também clonado em microrganismos apropriados. Em outros exemplos foram utilizadas toda a célula, onde o citocromo P450 CYP109D1 foi expresso em um organismo hospedeiro ou o citocromo P450 CYP109D1 foi expresso no Somagium cellulosum. Embora a presente invenção apresente a reaçâo de epoxidação e utilize mono- ou sesquiterpenos como material de partida, os produtos obtidos no documento citado são preferencialmente 2,3-epoxi-geraniol, 6,7-epoxi- geraniol, 2,3-, 6, 7-epoxi-geraniol, 2, 3-epoxi-Nerol, 6,7- epoxi-nerol, 2*-hidroxi-alfa-ionona ou 4-hidroxi-beta- ionona. Já os produtos resultantes do processo de epoxidação da presente invenção foram diferentes, foram obtidos epóxidos do OÍ e β-pineno, derivados do cariofileno, do humuleno e da coronarina D, sendo que foram obtidos 3 produtos inéditos: o humulenoperoxidiol (13) resultante da epoxidação do humuleno (4j, o diol 22 inédito que foi obtido através da epoxidação enzimática do cariofileno (3) na presença do 1, 3-propanodiol (20) e o epóxido 19 resultante da epoxidaçào ^: da coronarina D (5) . Além disso, no documento alemão nào é citado o rendimento das conversões e do produto eticamente puro (OP) . A utilização do polipeptídeo demanda várias etapas como a clonagem do citocromo P450 CYP109D1 em microrganismos correspondentes, depois de expressadas as proteínas corretamente, o isolamento e purificação do mesmo. Ainda para melhorar o rendimento das proteínas recém sintetizadas deve-se adicionar chaperonas. Adicionalmente são necessários adicionar também "parceiros de transferência de elétrons". São etapas trabalhosas e caras, não sendo viável para um processo industrial. Mesmo quando se utiliza toda a célula, onde o citocromo Ρ45Ό CYP109D1 foi expresso em um organismo hospedeiro ou o citocromo P450 CYP109D1 foi expresso no Sornagium cellulosum, há o problema de escala dã obtenção da cultura para um processo industrial. Se for um grande volume industrial, diferentemente do volume para óleos essenciais, com certeza haverá problemas operacionais. O volume citado na. patente foi de 200mL do meio utilizado, não compatível com volumes industriais.

[113 O artigo FURANQDITERPEN.0IDS OF THE LABDANE SERIES : "OCCURRENCE IN PLANTS, TOTAL S.YNTHESIS, SEVERAL TRANSFORMATIONS, AND BIOLOGICAL AÇTIVITY", Chemístry of Natural Compounds, Vol. 50, No. 1, March, 2014, cita algumas estruturas de furanolabdenóides de piantas, e do esquema de síntese para uma série de furanolabdenóides (coronarina A e E, hedichenona, acuminolida e 17-0- acetilacuminolida) a partir de diterpenos disponíveis como o esclareci e larixol. Foram também citados os dados de atividade biológica dos furanolabdenóides naturais e de seus derivados sintéticos. Apesar de citar a família Zingiberaceae e os metabólitos da Hedychlum coronarium Koen. (ginger lily) hedichenona, 9- hidrpxihedichenona, 7-hldroxihedichenona, hedichialactona B, coronarina E, e coronarina A (de Hedychium spp.), estes são compostos diferentes da coronarina D utilizada aa presente invenção. A coronarina D tem um anel de lactona, enquanto que a maioria dos compostos citados no artigo, com exceçâo da hedichialactona B por exemplo, apresentam um anel furano na sua constituição de onde vêm o termo ^M furanolabdenóides". Alguns dos metabólitos citados também exibem atividade citotóxica contra células tumorais humanas [Colo-205 (câncer de colón), L-431 (câncer de pele), MCF-7 (câncer de pulmão) 3. Tanto a coronarina D (5) quanto o epôxido de coronarina D (19) apresentaram atividade citotóxica contra linhagem tumoral humana de ovário com fenótipo de resistência a múltiplos fármacos (NCI-ADR/RES) e linhagem tumoral humana de colón (HT29) .. Os resultados positivos semelhantes para atividade tumoral, como para o câncer de colón, não invalida os resultados da presente invenção, porquê são moléculas diferentes, é citado no artigo que a coronarina D entre outros compostos (Hedichenona, coronarina E, hedichialactona B e villosina inibem significantemente o acúmulo de óxido nítrico (produzido in vivo pela oxidação da L-arginína pela NO-sintase) através da inibição da indução de 1N0S em macrófagos ativados por lipopolissacarídeo. Esta atividade biológica não foi testada para a coronarina D na presente invenção. Outra diferença bastante significativa é o processo de síntese para se obter os derivados. No artigo são utilizados diterpenos como o esclareol e larixol como material de partida, e as sínteses são baseadas em metodologias convencionais, utilizando várias etapas de síntese. Já a presente invenção é uma reaçâo de epoxidação enzimática (biocatálise), partindo da própria coronarina D como material de partida. A epoxidação por biocatálise é realizada em uma única etapa- As sínteses totais dos compostos de interesse citados no artigo são sinteses convencionais, com várias etapas, tornando o processo inviável tecnicamente e economicamente para uma aplicação industrial. Muitos dos reagentes utilizados são viáveis somente em testes de bancada em laboratório, não podendo ser aplicados em larga escala na indústria.

[12] O documento PI11065370 se refere ao desenvolvimento de um processo de modificação de biodiesel, óleos e gorduras de origem vegetal ou animal e de ésteres derivados de ácidos graxos, principalmente por reações de epoxidação, através de catálise enzimática suportada em líquidos iónicos, onde as enzimas de interesse são lipases. O processo apresenta como material de partida óleos e gorduras de origem vegetal ou animal e de ésteres derivados de ácidos graxos, portanto não antecipa a presente invenção que têm como material de partida terpenos (mono, sesqui e diterpenos) . Apesar de também utilizar a lipase para realizar a epoxidação enzimática, a reação de biocatálise é realizada em líquidos iónicos imidazólicos como o l-n-butil-3- metilimidazolio hexa-fluorfosfato (BMI+PF6-) , l-n-butil-3- metilimidazolio b.is.(tri-fluormetilsulfonil) imida

(BMI+NTf2-) , l-n-butil-3-metilimidazoli tetra-fluorborato (BMl+BF4--) que são suportes para reações catalisadas por enzimas. A utilização de líquidos iónicos não é viável economicamente para escalas industriais.

[13] O documento US005478734 descreve a epoxidação de benzopiranos para se obter um composto epoxidado o qual ê o intermediário chave para a síntese de compostos que têm atividade para ativar o canal de potássio. Utiliza enzimas livres ou microrganismo, que podem ser expressos em E. coli. Portanto, o documento não antecipa a presente invenção, pois o documento não revela o uso de lipases derivadas do microrganismo Cândida antárctica. Além disso o material de partida são benzopiranos, e não terpenos como na presente invenção.

[14] O documento US20150507O5 descreve a utilização de um polipeptideo, preferencialmente produzido por tecnologia recombinante, com atividade de uma peroxigenase para realizar a epoxidação de alcenos não cíclicos (alifáticos) e um terpeno, o limoneno (monoterpeno} , na presença de peróxido de hidrogénio. Utilizam também tensoativos no processo de epoxidação. O referido documento também não revela o uso de lipases derivadas do microrganismo Cândida antárctica. Portanto., a enzima utilizada na presente invenção não é antecipada pelo documento acima. 0 documento utiliza um polipeptideo para realizar a epoxidação e não uma lipase imobilizada, como na presente invenção. Não foi utilizado nenhum tipo de tensoativo na presente invenção, a epoxidação foi realizada sem solvente (''solvent free", com exceção da epoxidação da coronarina D) , conferindo uma vantagem para aplicação industrial técnica e economicamente. Na presente invenção são utilizados mono, sesqui, diterpenos cíclicos, e não somente alcenos alifáticos e monoterpeno como o limoneno.

[15} Diante do exposto a presente invenção dispõe de um processo de epoxidação capaz de ser completamente operacional industrialmente, além de ser viável economicamente, porquê a enzima que é o componente mais caro, pode ser recuperada diminuindo significativamente o custo. E a reutilização da enzima é possível por ela ser imobilizada. Os rendimentos da conversão também foram altos. Por exemplo, a porcentagem de conversão total dos lotes enzimáticos de β-cariofileno (3), chegou acima de 90% e em 96,0% em alguns lotes. A porcentagem de conversão total dos lotes enzimáticos para. a epoxidação do bumuleno (4) ficou entre 63,0% e 75,0%. Já a epoxidação do β-cariofileno (3) na presença de 1,3 -propanodiol (20) teve uma conversão de 96,3%. Outra vantagem foi a obtenção de 3 produtos inéditos na presente invençãoí o humulenoperoxidiol (13) resultante da epoxidação do humuleno (4), o diol 22 inédito que foi obtido através da epoxidação enzimática do cariofileno (3) na presença do 1, 3-propanodiol (20) e o epóxido 19 resultante da epoxidação da coronarina D (5) , Além disso, dois destes compostos inéditos (humulenoperoxidiol (13) e o epóxido (19) apresentaram resultados positivos nos testes antiproliferativos in vitro.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[16] A presente invenção se refere ao processo de epoxidação enzimática de terpenos utilizando lipase e peróxido de hidrogénio, compostos epoxidados e o uso dos compostos como agente antiproliferativo.

117]

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[18] A Figura 1 mostra a peridrolise catalisada por hidrolase (lipase) .

[19] A Figura 2 mostra o óxido de cariofileno (6), do diepóxido de cariofileno (7), do 8,9-diidroxi-l (12) - cariofileno (8) e dos diois cariolano-1, 9β-diol (9) e clovano-2β, 9α-diol (.10).

[20] A Figura 3 mostra o monoepóxido humuleno (11), do diepóxido humuleno (12) e dos diois: humuleno-peroxidiol (13) e humulenodiol (14) .

[21] A Figura 4 mostra a análise de raio-X do diepóxido de humuleno (12) .

[22] A Figura 5 mostra a estrutura do humulenoperoxidiol (13) indicada pela análise de raio-X, como contendo um grupo hidroxila e um peróxido. Os centros quirais são relativos, e a MM = 254.

£23] A Figura 6 mostra a estrutura do humulenodiol (14) obtida através dá análise de difração de raio-X. Os centros quirais mostrados são configurações relativas, e a MM = 238.

[24] A Figura 7 mostra os álcoois monoterpênicos: borneol (15), exo-fenchol (16), a-terpinol (17) e (-) - mirtenol (18).

[25] A Figura 8 mostra a estrutura do diepóxido de cariofileno (7), do 8, 9-diidroxi-l (12) -cariofileno (8), dos diois cariolano-1, 9β-diol (9) e clovano-2β, 9α-diol (10) e do diol (22),

[26] A Figura 9 mostra a reação de epoxidação enzimática do β-cariofileno (3).

[27] A Figura 10 mostra a reação de epoxidação enzimática do ot-humuleno (4) .

[28] A Figura 11 mostra o gráfico que demonstra os. resultados dos testes de atividade antiproliferativa com o humulenoperoxidiol (13) (HUEQ1) .

[29] A Figura 12 mostra as reações de epoxidação enzimática do α-pineno (1) (a) e do β-pineno (2) (b) .

[30] A Figura 13 mostra a reação de epoxidação enzimática da coronarina D (5) .

[31] A Figura 14 mostra a reação de epoxidação enzimática do padrão de cariofileno (3) na presença de 1,3- propanodiol (PDQ) (20), resultando na formação dos diois 21 e 22. O diol 21 é o derivado análogo do diol 10, e o diol 22 é o derivado análogo do diol 9.

[32] A. Figura 15 mostra os espectros de RMN ₁ H e de RMN ¹³ C do humulenoperoxidiol (13) .

[33] A Figura 16 mostra os espectros de DEPT 90 e 135 do humulenoperoxidiol (13) .

[34] A Figura 17 mostra o espectro de COSY do humuleno peroxidiol (13).

(353. A Figura 18 mostra c espectro de HMQC do humuleno peroxidiol (13) .

[36} A Figura 19 mostra os espectros de RMN ₁ H e de RMN ¹³ C do diol 19 resultante da reaçâo de epoxidação enzimática da coronarina D (5) .

[37] A Figura. 20 mostra os espectros de DEPT 90 e 135 do epóxido 19.

[38] A Figura 21 mostra o espectro de COSY do epóxido

19...

[39] A Figura 22 mostra o espectro de HMQC do epóxido

19.

[40] A Figura 23 mostra os espectros de RMN ₁ H e de RMN ¹³ C do diol 22 resultante da reaçâo de epoxidação enzimática do cariofileno (3) na presença de 1, 3-pro.panodiol (20).

[41] A Figura 24 mostra os espectros de DEPT 90 e 135 do diol 22 resultante da reação de epoxidação enzimática do cariofileno (3} na presença de 1, 3-propanodiol (20) .

[42] A Figura 25 mostra o espectro de ÇOSY do diol 22.

[43] A Figura 26 mostra o espectro de HMQC do diol 22. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[44] A presente invenção se refere ao processo de epoxidação enzimática de terpenos utilizando lipase e peróxido de hidrogénio, compostos epoxidados e o uso dos compostos como agente antiproliferativo.

[45] É uma epoxidação enzimática. de terpenos; monoterpenos (a e β pinenos), sesquiterpenos (cariofileno e humuleno), diterpenos (cor.onarina-D) , fraçôes sesguitepênicas Cfrações neutras} e diterpênicas (fração ácida) de plantas. Tem ainda a epoxidação enzimática do cariofileno na presença de 1, 3-propanodiol .

[46] é um processo enzimático de epoxidação com Peróxido de Hidrogénio 30 a 60% (melhor 30%) e Lipase Imobilizada (Novozymes 435) .

[47] As reações de epoxidaçâo enzimática foram realizadas com e sem a presença do ácido orgânico (RCOH): para a geração do correspondente perácido (RCOOH) . Os ácidos orgânicos mais utilizados para a formação do correspondente perácido foram o ácido octanóico e o ácido acético onde seu precursor é o acetato de etila. 0 acetato de etila foi utilizado preferencialmente porquê na peridroli.se leva a formação do ácido peracético e etanol. Além disso, foi utilizado o acetato de etila em substituição ao ácido acético para evitar o efeito do pH sobre a enzima e substrato,

148] As reações de epoxidaçâo enzimática foram realizadas sob agitação com temperaturas entre 40 e 70°C (melhor 60 a 70°C}, com exceção da coronarina D (5) cuja epoxidaçâo foi realizada a temperatura ambiente e a baixas temperaturas .

[49] As reações de epoxidaçâo enzimática foram realizadas sem a presença de solvente ("solvent free") , com exceção da coronariana D (5}.

(50] As reações de epoxidaçâo enzimática da coronariana D (5) foram realizadas em solventes orgânicos como tolueno, diclorometano e clorofórmio, preferencialmente clorofórmio..

[51] 0 processo de epoxidaçâo compreende as seguintes etapas;

a) adicionar 2 a 15g, preferencialmente de 3 a 1.0g dos terpenos como monoterpenos (a e β pinenos) e sesquiterpenos (cariofileno, humuleno e frações sesquiterpénicas de plantas) diretamente no reator aquecido» com exceção da coronarina D que é diluida em 30 mL de clorofórmio e a reação acontece à temperatura ambiente;

b) manter em banho de silicone, preferencialmente a 60°C e sob agitação magnética a 250 rpm por 15 a 72 horas, preferencialmente 24. horas;

c) adicionar a enzima imobilizada correspondente de 2 a 20% do peso do terpeno, preferencialmente 10 a 20%; d) adicionar de 2,0 a 10,0 mols de peróxido de hidrogénio a 30%, preferencialmente 3,0 e 10,0 mols; e 0,5 a 9,0 mols de acetato de etila, preferencialmente 1,5 e 6,0 mols; simultaneamente por 1 hora e 30 minutos, de 15 em 15 minutos; mantendo-se a temperatura entre 58°C e 62°C;

e) manter por pelo menos 24 horas e no máximo 69 horas em reação;

f) extrair o residuo de peróxido, com 25 a 50 ml éter etílico,, preferencialmente 40 mL e 25 mL de água, por meio de pelo menos 3 lavagens aquosas;

g) descartar as fases aquosas;

h) remover o solvente da fase orgânica sob pressão reduzida com vácuo de 15/8 mbar e a 40°C em um rota- evaporador; e

i) recuperar os epóxidos,

[52] A epoxidação enzimática do çariofileno (3) teve como epóxidos produzidos o óxido de çariofileno (6) {MM ^« 220} como produto majoritário, o diepóxido de çariofileno (7) (MM=236), o 8, 9-diidroxi-l (12) -çariofileno (8) (MM=238) e os diois (MM=>238) cariolano-1, 9-fr-diol (9) e clovano-2£, 9α-diol (10) , preferencialmente o óxido de çariofileno (6) e os diois cariolano-1, 9~β-^ΐο.1 (9) e clovano-2{J, 9α-diol (10).

[53] A epoxidação enzimática do humuleno (4) teve como epóxidos produzidos o monoepóxido humuleno (11) (MM-220) , o diepóxido humuleno (12) (MM=236) , os dióis: humuleno- peroxidiol (13) (MM=°254) e humulenodiol (14) (MM=238) , O humulenoperoxidiol (13) contendo um grupo hidroxila e um grupo peróxido foi isolado e caracterizado como sendo um composto inédito na literatura. [54] A epoxidação enzimática da coronarina D (5) teve como epóxido produzido o epóxido (19) (Mtf-334), composto inédito na literatura.

[55] A epoxidação enzimática do cariofileno (3) na presença de 1, 3-propanodiol (20) teve como epóxidos produzidos diepòxido de cariofileno (7) (MM*=236), o 8,9-diidroxi-l (12) - cariofileno (8) (MM*238), os diois (MM=238) cari.olano-1, 9- β-diol (9) e clovano-2β, 9α-diol (10) como produtos majoritários, e um produto no tempo de retenção em 35,22 min. não identificado (7,7%) e o diol 22 ÍMM=296) com o 1,3- propanodiol (PDO) (20), preferencialmente o 8, 9-di.idroxi- 1 (12) -cariofileno (8) (MM=238) , os diois (MM-238) cariolano- l,9-β-diol (9) e clovano-2p, 9α-diol (10) e o diol 22 (ΜΜ=296) , este último sendo um composto inédito na literatura.

Modalidade preferencial

[1] O processo de epoxidação em sua modalidade preferencial foi executado como descrito abaixo.

[2] Em um balão de fundo redondo ou reator de 3 bocas, foram adicionados os terpenos (material de partida ou amostra) a serem epoxidados, lembrando que tanto o padrão de cariofileno (3), de humuleno (4), as frações sesquiterpênicas e os monoterpenos α-pineno (1) e β-pineno (2) são líquidos. A coronarina D (5) por ser sólida precisou ser diluída em solvente orgânico.

[3J 0 balão foi aquecido a 60°C, em banho de silicone, mantendo-se sob agitação. Sob agitação magnética foi adicionada a enzima Novozyme 435, correspondente de 2 a 20% do peso do terpeno (preferencialmente 10 a 20%).

[4] Foram carregadas duas seringas para adição; uma. contendo de 2, 0 a 20,0 mols de peróxido de hidrogénio a 30% (preferencialmente 3,0 e 10, 0 ^: mols), e outra contendo 0,5 a 9,0 mols de acetato de etila (preferencialmente 1,5 e 6,0 mola) . Outras reaçôes de epoxidaçâo enzimática foram realizadas sem o ácido doador.

[5] O peróxido de hidrogénio e o acetato de etila foram adicionados, simultaneamente, por 1 hora e 30 minutos (a adição foi realizada de 15 em 15 minutos) . A temperatura foi controlada de 15 em 15 minutos durante 1 hora e. 30 minutos de adição, mantendo-se entre 58°ç e 62*C, e resfriando-se o sistema se necessário. (REAÇÃG EXOTERMICA) .

[6] Após 24 ou 69 horas do término da adição, a reação foi finalizada e o produto epoxidado (lote) foi transferido para um funil de extração para retirar o resíduo de peróxido, com éter etílico e água. Foram realizadas várias lavagens (3 a 4 lavagens) , as fases aquosas foram descartadas e o solvente da fase orgânica foi removido sob pressão reduzida num rota-evaporador .

[7] O produto final epoxidado (lote) foi ínjetado no croraatôgrafo gasoso com detector de espectro de massa (CG- EM). Apôs a caracterização do produto final epoxidado (lote) no CG-EM foi avaliada a porcentagem de conversão.

[8] Os lotes obtidos nas reações de epoxidaçâo enzimática foram isolados por cromatografia em coluna de silica, gerando algumas frações dos produtos epoxidados, os quais foram caracterizados por ressonância magnética de prótons (RMN de ₁ H) , ressonância magnética de carbono 13 (.RMN de ¹³ C) , infravermelho (IV) , ponto de fusão, rotação ótica, etc, e em alguns casos difração de raio-X.

[9] Pelo processo de epoxidaçâo desenvolvido na presente invenção foram obtidos 3 produtos inéditos: o humulenoperoxidiol (13) resultante da epoxidaçâo do humuleno (4), o diol 22 inédito que foi obtido através da epoxidaçâo enzimática do cariofileno (3) na presença do 1, 3-propanodiol (20) e o epóxido 19 resultante da epoxidaçâo da coronarina D (5) . [10} .Alguns dos produtos obtidos apresentaram uma performance diferenciada nos testes antiproliferativo _. s ^, in vitro" como anticancerigenos para alguns tipos de câncer como o humulenoperoxidiol (13) contra o câncer de próstata (p = PC-3), o humulenoperoxidiol (13), a coronarina D (5) e o epóxido de coronarina D (195 contra o câncer de ovário com fenótipo de resistência a múltiplos fármacos (a =NCI- ADR/RES) , e a coronarina D (5) e o epóxido de coronarina D (19) contra o câncer de colón (HT29) e leucemia (K562) .

Ill] A (+)-galanolactona é um diterpeno natural descrito na literatura com diversas atividades biológicas, como o seu uso terapêutico para atividade antiemética pelo efeito anti-5HT (5-HidroxiTriptamina antagonista), atividades citotóxicas e antifúngicas, além de atividades anti-HIV-1. O epóxido de coronarina D (19) tem uma estrutura semelhante à (+) -galanolactona, diferindo somente pela presença de uma hidroxila no C15, e poderia ser testado para algumas destas atividades.

[12] O diol 22 pode ser utilizado como intermediário para a sinte.se de outros compostos, principalmente para a área farmacêutica.

Sxemplo X - Processo de epoxidaçáo enzimática, do caxiofileno (6) - Figura 9

[131 Em um balão de fundo redondo de 25,0 mL de 3 bocas, foram adicionados cerca de 3,0 g do padrão de cariofileno

(3) (amostra) . O balão foi aquecido a 6Q°C, em banho de silicone, mantendo-se sob agitação. Sob agitação magnética foram adicionados cerca de 300,0 mg de enzima Novozyme 435, correspondente a 10% do peso da amostra. Foram carregadas duas seringas para adição: uma contendo 5,0 mL de peróxido de hidrogénio a 30% (3,0 mols), e outra contendo 2,16 mL

(1,5 mols) de acetato de etila.

[14] O peróxido de hidrogénio e o acetato de etila foram adicionados,, simultaneamente, por 1 hora e 30 minutos (a adição foi realizada de 15 em 15 minutos) . A temperatura foi controlada de 15. em 15 minutos durante 1 hora e 30 minutos de adição, mantendo-se entre 58°C e 62°C, e resfriando-se o sistema se necessário. (REAÇÃO EXOTÊRMICA) , A coleta da primeira amostra (1* Am) foi realizada após 15 horas do término da adição e a reação foi mantida por mais 24 horas nas mesmas condições do processo. A I ^a Am foi transferida para um funil de extração de 60 mL, contendo éter etilico e água, para retirar o resíduo de peróxido. Foi realizada a ínjeção np CG-EM da 1* AM extraída. Após 24 horas do término da adição, a reação foi finalizada e o produto epoxidado final (lote) foi transferido para um funil de extração para retirar o residuo de peróxido, com éter etiiico e água. Foram realizadas várias lavagens (3 a 4 lavagens), as fases aquosas foram descartadas: e o solvente da fase orgânica foi removido sob pressão reduzida num rota-evaporador .

[15] 0 produto final epoxidado (lote) foi injetado no cromatógrafo gasoso com detector de espectro de massa (CG- EM) . Após a caracterização do produto final epoxidado (lote) no CG-EM, foi avaliada a porcentagem de conversão (Tabela 1) e, as suas respectivas, massas moleculares (MM).

[16] Na presente invenção os testes realizados foram denominados de lotes, com sua respectiva identificação. 0 termo ^M íote" para designar um teste/experimento que é o termo comumente utilizado na indústria, e cada lote recebe uma identificação, que pode ser numérica ou alfa-nuraêrica.

Tabela 1 - Resultados da epoxidação enzimática do padrão de β-cariofileno (3) através de CG-EM.

[17] A porcentagem de conversão total dos lotes enzimáticos de β-cariofileno (3) , no tempo de 24 h _t chegou acima de 90% e em 96,0% em alguns lotes (Tabela 1). Estes resultados indicam que foram alcançadas as melhores condições de reaçâo enzimática. Através das análises dos espectros de CG-EM destes produtos obtidos nas diferentes reações de epoxidação enzimática (lotes) , foi verificada a formação do óxido de cariofileno (65 ((MM=220) como produto majoritário, do diepóxido de cariofileno (7) (MM=236), do 8, 9-d.iidroxi-l (12) -cariofileno (8) (MM=238) e dos diois (MM=238) cariolano-1, 9-p-diol (9) e clovano-2(5, 9«-diol (10) (Fig. 2), com as porcentagens relativas de 70%, 4-5%, 1-3%, 11-12%, e de 2,8-4,5%, respectivamente (Tabela 1). Estes dados foram obtidos em porcentagem relativa de área, uma vez que todos os compostos produzidos são voláteis.

[18} Nos lotes obtidos na reaçâo de epoxidação do β- cariofileno (3) (Tabela 1) foram observadas duas manchas principais, as quais foram purificadas por cromatografia em coluna de silica gel. Os compostos isolados foram caracterizados através das análises de CG-EM, de RMN de ₁ H (Tabela 2) e de ¹³ C (Tabela 3) como sendo o óxido cariofileno (6) em 70% de rendimento e os diois cariolano-1, 9(i-diol (9) e clovano-23, 9α-diol (10) como uma mistura em 15% de rendimento. Apesar de nào ter sido possível separar os diois 9 e 10, os quais permaneceram em mistura com predominância do cariolano-1, 9β-diol (9), a identificação de ambos foi feita baseada nos dados de RMN de ₁ H e de 13C em comparação com os dados destes compostos descritos na literatura. O diepóxido cariofileno (7) e o 8, 9-diidroxi- 1(12) -cariofileno (8) também não puderam ser separados nesta

Exemplo 2 - Processo de epoxidação enzimática do huaculeno (4) - Figura 10

[19] Embora a reação de epoxidação possa ocorrer em qualquer, das três olefinas contidas no a-humuleno (4), segundo dados da literatura (Damodaran e colaboradores), o monoepóxido 11 tem sido isolado como epóxido majoritário por ser uma das duas olefinas trissubstituidas) .

[20] Em um balão de fundo redondo de 25,0 mL. de 3 bocas, foram adicionados cerca de 3,0 g do padrão de humuleno (4) (amostra) . O balão foi aquecido a 6Q°C, em banho de silicone, mantendo-se sob agitação. Sob agitação magnética foram adicionados cerca de 300,0 mg de enzima Novozyme 435, correspondente a 10% do peso da amostra. Foram carregadas duas seringas para adição: uma contendo 5,0 mL de peróxido de hidrogénio a 30% (3,0 mols), e outra contendo 2,16 mL (1,5 mols) de acetato de etila.

[21] O peróxido de hidrogénio e o acetato de etila foram adicionados, simultaneamente, por 1 hora e 30 minutos (a adição foi realizada de 15 em 15 minutos)„ Â temperatura foi controlada de 15 em 15 minutos durante 1 hora e 30 minutos de adição, mantendo-se entre 58 ^Ô C e 62°G, e resfriando-se o sistema se necessário. (REAÇÃO EXOTÉRMICA) . A coleta da primeira amostra (1* Am) foi realizada após 15 horas do. término da adição e a reação foi mantida por mais 24 horas nas mesmas condições do processo. A 1* Am foi transferida para um funil de extração de 60 mL contendo éter etilico e água para retirar o residuo de peróxido. Foi realizada a injeção no CG-EM da 1* AM extraída. Após 24 horas do término da adiç¾o, a reação foi finalizada e o produto epoxidado final (lote) foi transferido para um funil de extração para retirar o resíduo de peróxido, com éter etílico e água.

[22] Foram realizadas várias lavagens (3 a 4 lavagens), as fases aquosas foram descartadas e o solvente da fase orgânica foi removido sob pressão reduzida num rota- evaporador. 0 produto final epoxidado (lote) foi injetado no cromatógrafo gasoso com detector de espectro de massa (CG- EM) . Após a caracterização do produto final epoxidado (lote) no CG-EM foi avaliada a porcentagem de conversão (Tabela 4), a qual ficou entre 63,0% e 75,0%, em 24 h,

Tabela 4 - Resultados da epoxidaçâo enzimática do padrão de Oi-humuleno (4) através de CG-EM.

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[23] Através da análise dos espectros de CG-EM das amostras dos lotes obtidos nos processos enzimáticos _/ foi verificada a formação de quatro compostos: o monoepóxido humuleno (11) (MM«22Q), o diepôxido humuleno (12) (MM=236) , os diois: hurauleno-peroxidiol (.13) (MM=*254) e humulenodiol (14) (MM-238) (Fig, 3). O humulenoperoxidiol (13) contendo um grupo hidroxila e um grupo peróxido foi isolado e caracterizado como sendo um composto inédito na literatura. EPÓXIDO: Bunmi eno-peroxxdiol (13) iCxsBzéOi)

[24] Aspecto físico: cristal incolor em forma de agulhas.

[25] Ponto de Fusão: 159 - 160 QC, [<*]*+ 00 (c 2,11, MeOHJ (mistura racêmica). IV cm-1: 3.390 (L), 3240, 1454, 1385, 1070., 1038, I.011 _: . IE-EM m/z (%) : 254 (M+, 0,00), 220 .(1,00), 205 (1,00), 187 (4,00), 177 (4,00)., 162 (6, 00),. 149 (8,00) , 147 (8,00) , 145 (8,00), 138 (12,0.0), 135 (12,00), 131 (12,00), 121 (24,00), 119 (24,00), 109 (40,00), 107 (32,00), 105 (26,00), 95 (48,38), 93 (43,56), 91 (36,00), 79 (38,00), 67 (34,00), 55 (42,76), 43 (100,00). CL/AR-EM m/z: 255,1499 (M + H+) cale. (Mt) 254,3674.

[26] Dados de RMN de ₁ H e de ^1J C: encontram-se nas Tabelas 5 e 6, respectivamente.

[27] Vale ressaltar aqui que, os compostos 12, 13 e 14 foram obtidos na forma racêmica e as estruturas apresentadas abaixo foram obtidas com o auxílio de um estudo de cristalografia de raio-Oí (Fig,. 4, 5 e 6) .

[28] A cromatografia em camada delgada (CCD) dos produtos formados na reação de epoxidação enzimática do a- humuleno (4) (lotes) mostrou quatro manchas principais, as quais foram purificadas por cromatografia em coluna de sílica gel. Após purificação, os compostos isolados. foram caracterizados através das análises de CG-EM, de RMN de ^: H e (Tabela 5) (Fig. 15) de "C (Fig. 15 e 16) (Tabela 6) sendo identificadas como sendo o monoepóxido humuleno (11) (MM ^« 220), diepóxido humuleno (12) (MM=236), humuleno- peroxidiol (13) (MM=254) e o humulenodiol (14) (MM=238) com rendimento de 8%, 17%, 21% e 5%, respectivamente. Os dados de RMN do diepóxido de humuleno (12) e dos diois 13 (Fig. 17 e 18) e 14 também foram analisados com o auxílio de experimentos: como COSY, HMQC e HMBC.

Tabela 5: Dados de RMN de ^X H do g-humuleno (4), do epóxido de humuleno (11), do diepóxido de humuleno (12), do humuleno- peroxidiol (13) e do humulenodiol (14) .

[29] Foram realizados testes de atividade antiproliferativa ^H in vitro" com o a-humuleno (4) comercial e com seus derivados sintéticos como o epójcido humuleno (1.1) , o diepóxido humuleno (12), o humulenoperoxídiol (13) e o humulenodiol (14). Somente o humuleríoperoxidiol (13) apresentou um resultado interessante e promissor mostrando maior atividade, era concentrações menores, do que a da Doxorrubicina que é normalmente utilizada como referência nos testes contra o câncer de próstata (p - PC-3) e contra o câncer de ovário com fenótipo de resistência a múltiplos fármacos (a ~NCI-ADR/RES) (Fig. 11 - Gráfico) (Tabela 7). Tabela 7 - Resultado da atividade antiproliferativa. com o humulenoperoxidiol (13) para GI50: Growth Inhibition 50 -

Exemplo 3 - Processo de epoxidação enzimática: dos padrões de α-pineno (1) e β-pineno (2) - Figura 12

[30] As reaçoes de epoxidação dos padrões de a-pineno (1) e β-pineno (2) foram efetuadas pelo processo enzimático com e sem a adição do ácido, conforme descritos acima nas epoxidações do β-cariofileno (3) e do or-humuleno (4 ⁾ .

[31] Os resultados da análise de CG-EM. das reações de epoxidação enzimática mostradas na Figura 12, estão apresentados na Tabela 8. Observa ^s se que alguns produtos identificados não são necessariamente os epóxidos esperados, mas sim álcoois monoterpênicos oriundos do processo da abertura/rearranjo do ep6xi ou do processo direto da reação de oxidação. É bem provável que tenha ocorrido um rearranjo durante o processo da reação de epoxidação já que se trata de um meio ácido podendo ^: resultar na obtenção dos álcoois como o borneol (15),. exo-fenchol (16), a-terpinol (17) e o (-) -mirtenol (18) (Fig. 7).

[32] Como esperado, a reação de epoxidação enzimática do padrão de terebintina (contendo principalmente a mistura do a-pineno (.1) e do (5-pineno (2.) (lotes PIEO060613ENZ01, PIEO160713ENZ01 e PIEO200713ENZÓ2) resultou em maior número de produtos do que a epoxidação do padrão de α-pineno (1) , Já a reação de epoxidação enzimática usando somente o or- pineno (1) (lotes PIEO040613ENZG1 e PIEQ120613ENZ01) , foi observado que quanto maior o tempo de reação, maior foi o consumo do material de partida como observado na comparação dos resultados entre o tempo de reação de 16 h para 24 h.

[33] Embora não tenha sido possivel isolar, até o momento, nenhum destes compostos para caracterização por RMN 1H e por RMN ⁱ³ C, o cromatograma de CG-EM foi devidamente analisado com cuidado e os dados foram comparados com os da biblioteca NIST do CG-EM da Agilent. A análise de dados do cromatograma, segundo a biblioteca, mostra que o composto de MM ~ 152, no tempo de retenção 31,53 min., seja provavelmente o epôxido do α-pineno e o composto de MM - 170, no tempo de retenção 16,53 min.:, seja o ^xv diol" do ot-terpinol (17) ou do

(-)-mirtenol (18). Foi observado que os picos de ambos compostos desapareceram nos lotes com maior tempo de reação

(lotes PIEO160713ENZ01 e ΡΙ.ΕΟ200713ΕΝΖΌ1) .

Bxwoogp-L© 4 - Srocaeso de epoxidação enzimática da coronarína D (5) - Figura 13 [34] Inicialmente a reação de epoxidaçâo enzimática da coronarina D (.5) foi realizada a uma temperatura entre 60 - 70oC com e sem o uso de ácido orgânico e, como citada anteriormente em todas: as reaçôes de epoxidaçâo enzimática. Por ser sólida a coronarina D, neste caso a epoxidaçâo foi realizada em meio contendo solvente inerte como tolueno, diclorometano ou clorofórmio. O clorofórmio, sendo o mais polar, foi o melhor solvente para solubilizar a coronarina D (5) do que o tolueno e por ser menos volátil do que o diclorometano,

[35] Nos primeiros experimentos não foi observada qualquer indicio da ocorrência da reação de epoxidaçâo enzimática da coronarina D (5) . Foi observado, no entanto, após vários ensaios, que a reação de epoxidaçâo enzimática da coronarina D (5) ocorria somente em condições de baixa temperatura, a reaçào foi mantida a temperatura ambiente (T.A.) obtendo-se melhor conversão de 43,0 %.

[36] Nas condições de reação descrita acima, a CCD da reação de epoxidaçâo enzimática da coronarina D (5) (lotes) mostrou a presença do material de partida que não reagiu e uma segunda mancha mais polar _/ como produtos principais desta reação. Após a purificação dos produtos de reação por cromatografia em coluna de sílica gel, o primeiro composto eluido foi identificado como sendo a coronarina D (5) (56,6%, MM=318) através de análise de dados de RMN de IH (Tabela 9) e de 13C (tabela 10} da coronarina D (5) e estão de acordo com os dados descritos na literatura. O segundo composto eluido foi caracterizado, após análise de dados espectroscópicos de RMN de ^r H (Tabela 9) (Fig. 19) e de ^1¾ C (Tabela. 10} (Fig. 19 e 20) e espectrométrico de EM-EM, como sendo o epóxido esperado 19 (MM=334) com rendimento de 43,4%. Os dados de RMN do epóxido inédito 19 também foram analisados cora o auxilio de experimentos como COSY (Fig, 21), HMQC (Fig. 22) e HMBC.

EPÓXIDO: Coronarina D (19) (C ₂ 0H30Q ₄ )

[37] Aspecto fisico: pastoso levemente amarelado, [α] ⁿ + 00 (c 1,80, CHC13), CL/AR-EM m/z: 333,2052 (M - H+), cale. (M+J 334, 4530. IV cm-1: 3389 (L) _f 1741, 1215, 1003, 945, 757.

[38] Dados de RMN de ^X H e de ¹³ C: encontram-se descritos nas Tabelas 9 e 10, respectivamente.

[39] Foram realizados os testes de a.tividade antiproliferativa in vítro para a coronarina D (5) e para o epóxido o de coronarina D (19). (14- Fr 14-19 col.), utilizando a Doxorrubicina como referência padrão (Tabela 11).. Conforme os dados mostrados abaixo de TGI (Total Growth Inhibition) - os resultados mostram que a concentração necessária dos dois compostos para inibir totalmente o crescimento celular foi próximo à da droga padrão para a linhagems tumoral humana de glioma (0251) . Já para a linhagem tumoral humana de ovário com fenótipo de. resistência a múltiplos fármacos (NCI-ADR/RES) , tanto a coronarina D (5) quanto o epóxido de coronarina D (19) ficaram com valores melhores, isto é, as concentrações necessárias para inibir totalmente o crescimento celular foram menores do que a da Doxorrubicina _* A concentração de 2,8 ug/mL para a coronarina D (5) ficou abaixo do que o do epóxido de coronarina D (19) com valor de 6,4 pg/mL e da Doxorrubicina com a concentração de 12,2 pg/mL. O mesmo resultado positivo aconteceu para a linhagem tumoral humana de colón (HT.29) , onde a coronarina D (5) teve a menor concentração, 3,7 ug/mL, seguida pelo epóxido de coronarina D (19) com 16,8 ug/mL contra concentração de 25 pg/mL da Doxorrubicina. Para a linhagem de leucemia (K562) os valores ficaram similares (Tabela 11). Tabela 9: Dados de RMN de ₁ H da coronarina D (5), e do epóxido 19. Exemplo 5 - Processo de epoxidaçào enzimática do cariofileno (3) na presença de 1, 3-propauaodiol (PDO) (20)- Figura 14

[40] Nesta reaçâo seriam esperados, segundo a proposta de mecanismo feita por Heymann e colaboradores dois diois: um derivado análogo do diol 10 (o diol 21) , e outro derivado análogo do diol 9 (o diol 22) .

[41] 0 processo de epoxidaçào enzimática do cariofileno (3) na presença cio 1, 3-propanodiol (20) foi idêntico ao processo já descrito no Exemplo 1, inoluindo-se a adição do 1/ 3-propanodiol (20) - Foram adicionados 8,9> mais do peróxido de hidrogénio, 4,4 raois de acetato de etila, 15% da enzima Novozyme 435 em relação ao peso do cariofileno (3) e 13,2 mols de 1, 3-propanodiol (20) cedido pela empresa Du Pont (Zemea) . A extração também foi similar ao processo já descrito anteriormente, e os lotes foram injetados no CG-EM.

[42] Os produtos da reaçâo de epoxidaçào enzimática ( lotes) foram analisados por CG-EM, obtendo-se uma conversão de 96,3%, e alguns dos picos foram identificados através da MM e também através de fragmentações observadas nos seus respectivos espectros de massa, além de comparação de dados com os encontrados na biblioteca do equipamento. Desta forma/ foi identificada a presença de compostos como o diepóxido de cariofileno (7) (MM=236) (6,5%), do 8,9- diidroxi-1 (12) -cariofileno (8) (MM=238) (10,2%), dos diois ÍMM=238) cariolat.o-l,9-p-diol (9) (21, 0%) e clovano-2J¾, 9α- diol (10) (34,6%) como produtos majoritários, de um ptoduto no tempo de retenção era 35,22 min. não identificado (7,7%) e do diol 22 (MM»296) (16,3%) com o 1, 3-propanodiol (PDO ⁾ (20) (Fig. 8), conforme a Tabela 12. Ê interessante observar que nesta epoxidaçào na presença do 1, 3-propanodiol (PDO) (20) a relação entre os diois 9 e 10 está invertida em relação à epoxidaçào enzimática do cariofileno (3) (Tabela 12) « Tabela 12- Resultados das análises de CG-EM da reaçâo de epoxidação enzimática do padrão de β- cariofileno (3) na presença de 1, 3-propanodiol (PDO) .

[43] Os lotes obtidos nas reaçôes de epoxidação do cariofileno (3) na presença do 1, 3-propanodiol (20) foram isolados por cromatografia em coluna de sílica. Nos lotes obtidos da reaçâo de epoxidaçâo do (5-cariofileno (3) çom o .1, 3- _^ propanodiol (20). (Tabela 12), foram observadas quatro manchas principais em CCD, as quais foram purificadas por cromatografia em coluna de sílica gel. Os compostos isolados foram caracterizados através de análise dos dados de CG-EM, de RMN de ^L H (Tabela 13) e de ^l3 C (Tabela 14) como sendo o 8, 9-diidroxi-l (12) -cariofileno (8) (5,7%), os diois cariolano-1, 9(}-diol (9) e clovano-2jJ, 9c*-diol (1Q) (15,6%), um produto não identificado com tempo de retenção em 35,22 min. (2,5%), além do dioi 22 (4,8%) (Fig. 23 e 24) inédito na literatura. Os dados de RMN do diol 22 também foram analisados com o auxílio de experimentos como COSt (Fig. 25), HMQC (Fig. 26) e HMBC.

EPÓXIDO: Diol 22 (CUB32O3)

(44] Aspecto físico; sólido amorfo levemente amarelado,

22

ta] o + 180 (c 1,45, MeOH) , IV cm-1: 3401 (L), 1462, 1369, 1069. ΓΕ-ΕΜ m/z (%) : 296 (Μ+, 0,9), 252 (3,6), 237 (100,0), 220 (.2,7), 185 (81,8)., 167 (10,9), 149 (.10,0), 127 (30,9), 109 (47,3), 95 (27,3), 81 (40,0), 69 (34,5), 67 (34,5), 55 f61,8), 43 (51,8), 41 (60,9). CL/AR-EM m/z: 295,1755 (M - H+), cale. (Μ+;) 296,4478. Dados de RMN de ₁ H e de "C: estào es ri o s