本发明属于医学免疫应用领域，具体涉及到利 用胶体金免疫层析技术检测肝 病的试纸及其制备方法。 背景技术

原发性胆汁性肝硬化（Primary bi l iary cirrhos is , PBC )是以破坏肝内 小及中等大小胆管为主的器官特异性自身免疫 性肝病， 表现为肝门脉区炎症导 致纤维化， 肝硬化甚至功能性衰竭。 肝炎、 肝硬化病人各种病原检测指标呈阴 性， 需要考虑原发性胆汁性肝硬化或自身免疫性肝 炎。 早期运用药物治疗可控 制疾病的进展， 而 PBC 的治疗关键在于早期治疗， 而早期治疗的前提是早期诊 断， 早期诊断就成为大家所关注的焦点。

在 PBC 患者体内可检出多种自身抗体， 如抗核抗体（ANA )、 抗线粒体抗体 ( AMA )、 抗平滑肌抗体 ( SMA 抗肝肾微粒体抗体（L M )等， 其中最主要的抗 体是 AMA ， PBC常伴有高滴度的 A A， 病程早期就出现 AMA是本病的特点。 AMA 于 1965年由 WalRer等在 PBC患者血清中用间接免疫荧光法首次发现， 其后的 研究显示， PBC患者的 AMA阳性率可高达 90%, 此项检测已成为 PBC诊断的主要 检查项目 。 （ Neuberger J, Thomson R. PBC and AMA -一 what is the connection [J] . Hepatology, 1999, 29 (1) 265-271 )

近年研究发现， AMA存在若干亚型， 迄今已发现的亚型共有 9种 (M1 ~ M9)， 与 PBC有关的有 4种， 即 M2、 M4、 M8、 M9, 其中 M2亚型抗体（AMA- M2)为 PBC的 特异性抗体，对本病有确诊意义。 AMA-M2线粒体抗体对 PBC检测的敏感性达 93% 以上， 特异性几乎达 95%。 （Leung P S， Van de water J , Coppel R L. et al. Molecular aspects and the pathoh) gi ( al bas is of primary bi l iary cirrhos is [J] Autoimnlun, 1996, 9 (2) : 119-128. )

PBC 病人在出现临床症状和组织学特征变化之前几 年甚至十几年就可出现 M2型抗线粒体抗体（姜小华， 仲人前， 孔宪涛.原发性胆汁肝硬化发病机制研究 中国免疫学杂志， 2002， 18： 586-588 ). 因此 M2型抗线粒体抗体即时检 出对 PBC早期检出及辅助诊断有非常重要的意义。 2000年美国肝病学会（ AASLD ) 在发表的《PBC诊断指南》 中， 其中有一很重要的一项为 M2亚型抗线粒体抗体 ( AMA-M2 ) 阳性。

随着对 M2靶抗原的研究深入， 鉴定出 M2的靶抗原为线粒体上的 2-氧¾^ 氢酶复合体〔2-0ADC〕 的一些组分： 丙酮酸脱氢酶（PDC-E2)、 2-氧酸脱氢酶 (BC0ADC- E2)、 2-氧戊二舰氢酶（0GDC-E2)、 X蛋白等， 而其中 PDC的抗原表位 主要位于内酯酰区和部分外酯酰区，在 PBC病人血清中的阳性率为 95%。 BC0ADC, 0GDC的抗原表位位于内酯酰区， 阳性率分别为 53% ~ 55%, 39% - 88%. 三抗原间 无交叉反应， PBC病人血清中 M2型抗线粒体抗体能与一种或一种以上抗原反� ��。 三个靶抗原联合检测， 其阳性率可达 95% ~ 99%， 而且特异性也很高， 正常人阳 性仅为 0. 5¾ (贾继东 自身抗体检测在自身免疫性肝病诊断中的应用 [J] .中华检 验医学杂志， 2003, 26 (2) 116-120)。

本产品釆用基因工程方法（定康，陈燕等人源 M2二联体靶抗原 PO-E2融合 蛋白的克隆表达与鉴定. [J]临床军医杂志. 2007,6 36(3):323： 325. )成功克隆、 原 核表达全部为人源的 三个靶抗原， 即丙酮酸脱氢酶（PDC)、 2-氧酸脱氢酶 (BC0ADC) , 2-氧戊二酸脱氢酶 (0GDC) , 且成功连接形成抗原蛋白三联体即为本 产品的检测抗原。

目 前 M2 型 抗线粒体抗体的检测 方 法有 间接免疫荧光 Indirectmmunof luorescence , IIF ) 和醉联免疫吸附试验 (Enzyme - l inked Immunosorbent Assay, E SA)。

目前市场上商品化 M2 型抗线粒体抗体检测试剂盒主要为 ELISA试剂盒。

ELISA法操作程序烦瑣， 完成整个实验过程需三小时左右， 亦需要专业免疫学技 术人员在实验室中进行实验操作， 并且需经酶标仪检测后读取实验结果， 这在 基层医疗机构的实验室和小型门诊中较难实现 该项目的实验检测， 同时基于 ELISA方法学易受各种温度和孵育时间等环境条� ��因素的影响，对试验带来诸多 不便。

间接免疫荧光， 观察结果需要专业人员操作特殊的仪器设备， 间接免疫荧 光法存在检测时间长但须有荧光显微镜观察结 果， 并有一定的主观人为判断误 差， 另外易受其他干扰产生假阳性， 标准化困难， 也不适合高通量标本的检测。

为了克服上述检测方法的不足， 我们将胶体金层析法应用到 M2型抗线粒体 抗体的检测中。 股体金免疫层析法（gold-immunochromatography assay, GICA) 是应用胶体金标记技术， 以胶体金作为示踪物， 以条状纤维层析材料为固相， 通过毛细效应使样品溶液在层析条上泳动， 使样品中的待测物与结合垫上针对 待测物的受体（如抗原或抗体）发生免疫反应 ， 并与条状纤维层析材料上的抗 原（或抗体）发生免疫反应而被截留， 进而形成肉眼可见的紫红色条带， 得到 直观的实验结果， 达到快速检测的目的 （ Sikowicz G et al. One-step chromatographic immunoassay for qualitative determination of choricogonadotropin in urine. Clin Chem. 1990(36)1579-1586. ). 使用时只将样品加样到样品垫上， 数 分钟就根据检测线上紫红色条带出现情况来判 断阴阳性结果。 与其他检测方法 相比， 检测时间短， 只需要 5 ~ 10分钟， 操作人员无需培训， 操作简便、 快速， 无需低温保存， 储运方便等优势。

在自身免疫性疾病方面， 目前国外市场上出现了一些检测自身免疫疾病 的 试纸条产品， 但 M2 型抗线粒体抗体的胶体金免疫试纸在国内外市 场上仍没有 问世。 本发明将基因工程菌表达的抗原蛋白首次引入 到试纸条中， 实现了高特 异性、 高灵敏度、 高准确度的检测性能。 目前市面上也出现了商品化 ELISA试 剂盒， 但金标层析试纸与 · 目比， 仍有诸多不同之处， 不受场地人员之限， 检 测时间短即 5-10分钟， 判读结果简便。 此外该试纸具有高特异性、 高灵敏度、 高准确度， 能满足市场的快速筛选 PBC， 为病 ^5L早诊断治疗提供条件， 同时， 也能满足基层实验室、 即时检测、 床边检测的需求。 发明内容

本发明为了克服以上方法学的不足， 将胶体金层析法应用到 Μ2型抗线粒体 抗体的检测中， 同时首次将 Μ2型线粒体抗原蛋白应用到胶体金层析法中， 采用 间接法来实现血液中的 Μ2型抗线粒体抗体检测， 实现高特异、 高灵敏度、 高准 确性的检测性能， 快速筛选出 Μ2型抗线粒体抗体的阳性样本， 能快速、 便捷地 辅助诊断原发性胆汁肝硬化。。

本发明目的之一在于提供一种胶体金层析法肝 病检测试纸。

本发明目的之二在于提供一种胶体金层析法肝 病检测试纸的制备方法。 一种胶体金层析法肝病检测试纸，包括有硝酸 纤维素包被膜（ 3 )、结合垫（ 2 )、 样品垫（1 )、 吸水垫（6 ), 它们依次粘贴在底板上， 其特征在于：

所述的结合垫包被有金标抗体 ( a )和金标抗体（b )，

所述的硝酸纤维素包被膜 ( 3 )上有检测线（4 )和质控线（5 )，

其中检测线包被有 M2型线粒体抗原蛋白，其中的质控线（ 5 )包被有抗体 ( c )。 进一步， 所述的抗体（a )为抗人 IgG单克隆抗体或抗人 IgG多克隆抗体， 或葡萄球菌 A蛋白 （SPA )或链球菌 G蛋白 （Protein G )中的一种或多种。 所述的抗体（a ) 中的多克隆抗体为鼠源、 马源、 羊源、 兔源或豚鼠源中的 一种， 抗体（a ) 中的单克隆抗体为鼠源或兔源中的一种。

所述的抗体（b )和抗体（c )均为单克隆抗体或多克隆抗体中的一种， 其中 ( b )和（c )可发生特异性结合形成免疫复合物。

所述的抗体（b )和抗体（c )中的多克隆抗体为鼠源、 马源、 羊源、 兔源或 豚鼠源中的一种， 单克隆抗体为鼠源或兔源中的一种。

所述的检测线上包被的蛋白为通 核表达克隆化基因获得的 M2型线粒体 抗原蛋白。

所述检测是定性检测人血清中 M2型抗线粒体抗体， 辅助诊断早期原发性胆 汁肝炎。

所述 M2型线粒体抗原蛋白是针对 M2的靶抗原即线粒体的 2-氧酸脱氢酶复 合体〔2- 0ADC〕 的一些组分： 丙酮酸脱氢酶（PDC- E2 ) 、 2-氧酸脱氢酶复合体 E2 (BCOADC- E2)、 2-氧戊二酸脱氢酶复合体 E2 (OGDC- B2)， 通过基因克隆技术构 建重组基因， 然后采用原核表达技术成功表达出 为人源的 M2三个靶抗原蛋 白， 且成功连接形成抗原蛋白三联体（姜小华， 仲人前等. M2 自身抗原及其三 联体的克隆表达和初步鉴定.中华消化杂志， 2001 (21) : 530-533 ) 。

所述样本来自人血清、 血浆、 全血样本。

根据本发明应用的单克隆抗体可通过由 Kohler等（Cont inuous cul tures of fused cel ls secret ing ant ibody of predef ined specif icity [J] . Nature, 1975 (256)： 495-497 )首先描述的杂交瘤法进行制备， 或者可通过 重组 DM 法进行制备（见美国专利 4816567 ) 。 "单克隆抗体 "由 Clackson等 ( Making ant ibody fragments using phage display l ibraries [J] . Nature, 1991: 624-628 )和 Marks 等 ( By-pass ing immunization: Human ant ibodies from V- gene l ibraries displayed on phage [J] . Journal of Molecular Biology, 1991: 581-597 )所述技术从噬菌体抗体文库中分离。

根据本发明应用的多克隆抗体可通过陈学清等 （免疫学常用实验方 法. [M] , 2000: 15-26 )通过免疫动物来制备。

本发明的 SPA、 Protein G通过原核表达克隆化重组基因， 由 J.萨姆布鲁克 等（分子克隆实验指南. [M] , 2002: 1228-1232 )描述的大肠杆菌原核表达克隆化 基因。

一种胶体金层析法肝病检测试纸的制备方法， 该试纸由样品垫、 结合垫、 包 被膜、 吸水垫和底板共同组成， 其特征在于该方法包括有以下步骤：

步骤 1， 抗原的制备， 是通过原核表达克隆化基因获得 M2线粒体抗原蛋白， 以及包被膜的制备， 是用包被膜緩冲液稀释抗原蛋白至浓度为 1.0- 1.5mg/mL,将抗体（ c )稀释到 0.8 ~ 1.5mg/mL, 以 1 ~ ΙΟμΙ/cm硝酸纤维素膜上， 置放于 37 Ό烘干备用，

以及金标抗体的制备， 是用 0.1M碳酸钾调节胶体金 pH 7.0~9.0, 按每毫 升胶体金溶液緩慢加入 4 - 25μ ₈ 蛋白，搅拌 10 ~ 30min, 然后加入 BSA至终浓度 0.5 - 5%, 搅拌 10~30min， 离心， 弃上清， 将沉淀用洗涤液洗涤 2 ~ 3次， 末次 用十分之一初始体积的保存液将沉淀重悬， 置 4Ό备用，

以及结合垫的制备，是经处理液浸渍处理的聚 脂膜，烘干后，将金标抗体 (a) 和金标抗体（b)混合后， 以 0.5 ~4μ1 /cm的用量喷涂在预处理的聚脂膜上， 25 °C~30TC干燥后， 置于 2°C~8°C的环境下备用，

以及样品垫的制备， 是经处理液浸渍处理的玻璃纤维膜， 于 37"C烘干后备 用；

步骤 2，在底板上顺次相互搭接粘贴经前述步骤 1所制作完成的硝酸纤维素 包被膜、 结合垫、 样品垫、 吸水垫；

步骤 3, 对步骤 2所制作完成的材料， 切割成试纸条。

所述的步骤 1中，金标抗体的制备方法为用 0.1M碳酸钟调节胶体金 pH值至 8.0-9.0，■ ^毫升胶体金溶液緩慢加入 8― 12μ ₈ 羊抗人 IgG,搅拌 10 - 30min, 然后加入 BSA至终浓度 0.5 ~1%， 搅拌 10~30min， 离心， 弃上清， 将沉淀用洗 涤液洗涤 2-3次， 末次用十分之一初始体积的保存液将沉淀重悬 ， 置 4Ό备用。

所述的步骤 1中，金标抗体的制备方法为用 0.1M碳酸钾调节胶体金 pH值至 7.0-8.0, ■ ^毫升胶体金溶液緩慢加入 8 ~ 12pg兔 I _g G， 搅拌 10~30min， 然 后加入 BSA至终浓度 0.5 ~ 1%， 搅拌 10~30min， 离心， 弃上清， 将沉淀用洗涤 液洗涤 2~3次， 末次用十分之一初始体积的保存液将沉淀重悬 ， 置 4Ό备用。

所述的步骤 1中，金标 SPA的制备方法为用 0.1M碳酸钾调节胶体金 pH值至 5.0-6.5, 毫升胶体金溶液緩慢加入 10~15μ ₈ SPA, 搅拌 10~30min, 然 后加入 BSA至终浓度 0.5 ~ 154， 搅拌 10~30min， 离心， 弃上清， 将沉淀用洗涤 液洗涤 2 ~ 3次， 末次用十分之一初始体积的保存液将沉淀重悬 ， 置 4Ό备用。 然后将金标 SPA 0D 20 2~4μΐΛ;πι喷涂于结合垫， 干燥后备用。

所述的步骤 1中，金标 SPA的制备方法为用 0.1M碳酸钟调节胶体金 H值至 7. 0 ~ 8. 0, 毫升胶体金溶液緩慢加入 8 - 12μΒ鼠^ IgG,搅拌 10 ~ 30min, 然后加入 BSA至终浓度 0. 5 ~ 1%, 搅拌 10 ~ 30min， 离心， 弃上清， 将沉淀用洗 涤液洗涤 2 ~ 3次， 末次用十分之一初始体积的保存液将沉淀重悬 ， 置 4°C备用。 然后将金标 SPA0D 30 2 ~ 4μ1/ η喷涂于结合垫， 干燥后备用。

所述的步骤 1中， 将制备好的金标抗体 ( a )和金标兔 IgG按 20 ~ 40/15 - 20比例混合，用 BIO-Dot喷膜机以 2. 0 ~ 4μ1/οπι喷于预处理的聚脂膜上， 25 °C― 37'C干燥， 封袋， 置 2°C ~ 8°C备组装粘板用。

所述的步骤 3中， 切割成的试纸的宽度优选为 4mm和 3mm两种。

本发明的检测原理具体为选用亲和层析纯化的 M2抗原蛋白， 金标抗体（ a ) 和金标兔 IgG作为胶体金标记复合物， 喷涂于结合垫， 利用间接法来检测血清 样品中是否含有 M2型抗线粒体抗体。 检测时， 样本随着层析泳动到结合垫并浸 润金标复合物， 其中的人 IgG和金标抗体 ( a )结合形成人 IgG-金标抗体 ( a ) 复合物， 由于毛细效应， 此复合物沿包被膜泳动向前， 若血清样品中有 M2型抗 线粒体抗体， 此复合物与包被于硝酸纤维素膜上的抗原蛋白 发生特异性免疫结 合反应， 形成金标抗体（ a ) -人 IgG-M2抗原蛋白三联体复合物而被截留在检测 线上， 逐渐富集形成较深的紫红色条带； 由于毛细效应继续泳动向前， 金标兔 IgG与包被在质控线上的羊抗兔 IgG发生特异的免疫反应被截留，逐渐富集在质 控线上形成较深的紫红色条带， 多余的未结合的物质继续层析到吸水垫上， 因 此在检测线和质控线都出现条带的判为阳性结 果； 若血清样品中不含有 M2型抗 线粒体抗体， 金标抗体（a )到 ¾^测线时， 不与包被在检测线上的抗原蛋白发 生免疫反应， 因此在检测线处没有出现紫红色条带， 金标抗体 )继续泳动向 前到达吸水垫， 而金标兔 IgG继续泳动向前与包被于质控线处羊抗兔 IgG发生 特异的免疫反应而被截留， 逐渐富集在质控线上形成紫红色条带， 因此仅在质 控上出现条带判为阴性结果。

与现有的检测方法相比， 本发明优点：

1. 该测定方法的独特性在于基因重组表达的三联 体抗原蛋白首次应用于胶 体金层析试纸， 大大提高了其检测灵敏度， 通 体金试纸可快速筛选出 M2型 抗线粒体抗体所有阳性样本（能检出大于 25RU/ml的样本）。

2. 本发明的优点是生产成本低。 本发明所提供的 M2型抗线粒体抗体检测 试纸所需的核心试剂是抗体 ( a )即抗人 IgG或 SPA或 PROTEIN G、抗体 ( c )、 抗体（b )、 抗原蛋白， 其单条试纸所用试剂量少， 且可通过购买商品化试剂或 自制， 抗原蛋白来源于商品化的纯化基因工程抗原蛋 白， 或者自行制备。

3. 与已公开的用于 M2型抗线粒体抗体检测的其他方法相比，本发� ��的试纸 具有许多其他方法所不能比拟的优点， 如检测时间短（ ⁵ ~10min); 不需要任何 特殊仪器， 可实现床边检测和门诊即时检测； 操作简便， 只需一步反应， 操作 人员无需培训， 检测成本低； 对温度无特殊要求， 无需冷冻， 储存运输方便， 室温可 24个月。 附图说明

图 1为本发明的侧面结构示意图。 图 1所示， 该试纸是在支撑胶板（7)上 顺次相互搭接地粘贴硝酸纤维素包被膜（3)、 结合垫（2)、 样品垫（1)、 吸水 垫（6)。

结合垫（ 2 )上包被有金标抗体 ( a )和金标抗体 ( b );硝酸纤维素包被膜 ( 3 ) 有检测线（ 4 )和质控线（ 5 )， 其中， 检测线（ 4 )包被有 M2型线粒体抗原蛋白， 质控线（5) 包被有抗体（c)。

图 2为本发明的检测结果示意图。

图 2a所示为：加样后，反应 3 - 5min即可看到检测区 4 ( T )和控制区 5 ( C ) 相应位置上出现紫红色条带；

图 2b所示为： 当 C区 5和 T区 4均出现紫红色条带， 结果为阳性， 说明血 清中含有 M2型抗线粒体抗体；

图 2c所示为： 如只在 C区 5出现一条紫红色条带， T区 4不出现紫红色条 带， 结果为阴性， 说明血清中不含 M2型抗线粒体抗体；

图 2d、 2e所示为： 如 C区 5不出现紫红色条带， 无论 T区 4是否有条带出 现， 都说明试纸失效。 具体实施方式

本发明所述的胶体金免疫层析法肝病检测试纸 ，如图 1所示，该试纸是在支 撑胶板 (7)上顺次相互搭接地粘贴硝酸纤维素包被膜（ 3)、 结合垫（2)、 样品 垫（ 1 )、 吸水垫（ 6 )。 所述的结合垫（ 2 )上包被有金标抗体 ( a )和金标兔 IgG。 所述的硝酸纤维素包被膜 (3)有检测线（4)和质控线（5)， 检测线（4) 包被 有 M2型线粒体抗原蛋白， 质控线（5) 包被有羊抗兔 IgG。

如图 2所示， 加样后， 反应 3 - 5min即可看到检测区 4 ( T )和控制区 5 (C) 相应位置上出现紫红色条带， 如图 2a所示； 当 C区 5和 T区 4均出现紫红色条 带（如图 2b所示）， 结果为阳性， 说明血清中含有 M2型抗线粒体抗体； 如只在 C区 5出现一条紫红色条带， T区 4不出现紫红色条带（如图 2c所示）， 结果为 阴性， 说明血清中不含 M2型抗线粒体抗体； 如 C区 5不出现紫红色条带， 无 论 T区 4是否有条带出现（如图 2d、 2e所示）， 都说明试纸失效。

下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。

实施例一抗原组成

应用于本试纸的抗原蛋白是针对 M2的靶抗原即线粒体的 2 -氧^ ¾氢酶复合 体〔2-0ADC〕 的一些组分： 丙酮酸脱氢酶（PDC- E2 )、 2-氧酸脱氢酶复合体 E2 (BC0ADC- E2)、 2-氧戊二酸脱氢酶复合体 E2 (0GDC-E2) , 通过基因克隆技术构 建重组基因， 然后采用原核表达技术成功表达出全部为人源 的 M2三个靶抗原蛋 白， 且成功连接形成抗原蛋白三联体。

实施例二抗体制备

抗体 ( a )及抗体 ( c )、 抗体（ b )用下述方法来实现胶体金层析法肝病检测 试纸的制备。 其中抗人 IgG、 抗体（c )及抗体 ( b )一般可通 i½动物上经多 次皮下（sc )或 «内 （ip )注射纯化的免 和佐剂而产生。

通过将 0. 05mg ~ lmg免疫制剂（分别针对山羊或小鼠）与 3倍体积的 Freund，s 完全佐剂混合， 将该溶液在皮内多部位注射， 一个月后将动物用 1/5至 1/10原 初量的人 IgG的 Freund's完全佐剂混合液经多部位皮下注射而加� ��免疫。 7 ~ 14 天后将动物放血， 测定血清抗人 IgG 滴度。 对动物加强免疫直至滴度达到平台 期。 在许多免疫学教科书中描述了生产多克隆抗体 的方法， 例如， 陈学清等《免 疫学常用实验方法》。 通过从被免疫的动物回收脾细胞并使细胞永生 化， 例如通 过与骨髓瘤细胞融合或通过 Epstein- Barr病毒转化， 并且筛选能表达目的抗体 的单克隆抗体 ( Kohler, Mi lstein. Derivat ion of specif ic ant ibody- producing tissue culture and tumor l ines by cel l fus ion [J] . European Journal of Immunology, 1976: 501-511 )。

可通过大肠杆菌原核表达克隆化基因来制备重 组葡萄球菌 A蛋白和链球菌 G 蛋白 ， 具体操作方法参见 J. 萨姆布鲁克等 （ 分子克隆实验指 南. [M] , 2002: 1228-1232 ) ， 或购买商品化的 SPA或 Protein G。

实施例三 羊抗人 IgG标记

羊抗人 IgG的标记： 用 0· 1M碳酸钾调节胶体金 pH 8. 0 ~ 9. 0，按每毫升胶体 金溶液緩慢加入 8 ~ 12 g羊抗人 IgG， 搅拌 10~30min, 然后加入 BSA至终浓度 0.5-1%, 搅拌 10~30min， 离心， 弃上清， 将沉淀用洗涤液洗涤 2 ~ 3次， 末次 用十分之一初始体积的保存液将沉淀重悬， 置 4Ό备用。

实施例四 兔 IgG标记

兔 IgG的标记： 用 0.1M碳酸钟调节胶体金 pH值至 7.0 ~ 8.0, 按每毫升胶 体金溶液緩慢加入 8 ~ 12μ _ε 兔 IgG，搅拌 10 ~ 30min,然后加入 BSA至终浓度 0.5 ~ 1%, 搅拌 10~30min, 离心， 弃上清， 将沉淀用洗涤液洗涤 2 ~ 3次， 末次用十 分之一初始体积的保存液将沉淀重悬， 置 4°C备用。

实施例五 葡萄球菌 A蛋白 （SPA)的标记

SPA蛋白的标记：用 0.1M碳酸钾调节胶体金 pH值至 5.0 ~ 6.5， ^毫升胶 体金溶液緩慢加入 10 - 15 gSPA蛋白，搅拌 10 ~ 30min, 然后加入 BSA至终浓度 0.5-1%, 搅拌 10~30min， 离心， 弃上清， 将沉淀用洗涤液洗涤 2 ~ 3次， 末次 用十分之一初始体积的保存液将沉淀重悬， 置 4Ό备用。

实施例六 鼠抗人 IgG的标记

鼠抗人 IgG的标记： 用 0.1M碳酸钾调节胶体金 pH值至 7.0 ~ 8.0， 按每毫 升胶体金溶液緩慢加入 8 ~ 12μ ₈ 鼠抗人 IgG, 搅拌 10 - 30min, 然后加入 BSA至 终浓度 0.5-1%, 搅拌 10~30min, 离心， 弃上清， 将沉淀用洗涤液洗涤 2~3 次， 末次用十分之一初始体积的保存液将沉淀重悬 ， 置 4'C备用。

实施例七

本发明所述胶体金层析法肝病检测试纸的制备 方涤：

步驟 1， 包被膜的制备

用包被緩冲液将 M2蛋白稀释到 1.0-1.5mg/mL, 调整 BIO- Dot仪器， 喷涂 检测线（T)， 靠近结合垫端， 距结合垫端约 9.5隱； 用包被緩冲液将羊抗兔 IgG 稀释到 0.8 ~ 1.5mg/mL, 用 BIO-Dot仪器喷涂羊抗兔 IgG于质控线（ C )靠近吸 水垫， 距吸水垫约 9 醒。 两线距离约 5-8 瞧， 喷线应粗细均匀。 37Ό烘干， 封装备用。

其中的包被緩冲液可以是硼酸盐，碳酸盐，磷 酸盐， Tris- HC1或 Tris-磷酸 盐， 醋酸盐， 巴比妥， 等等， 其緩冲液的目的为提供一定 pH和离子强度使蛋白 包被并牢固包被于 NC膜，其緩冲液 pH值一般约为 6 ~ 9.5范围内，优选为 6.5 - 7.5的中性緩冲范围内， 且最优选緩冲液的 pH值为 7.0~ 7.4范围内。緩冲液优 选为磷酸盐。 其中的 NC膜可以为任何商品化硝酸纤维素膜， S&S AB99, Whatman 8μιη、 millipore M135 sartorius CN140等。 使用的具体的 NC膜不是本发明的关键， 但是在每次测定中， 上述几种 NC膜可以作为优选。 不同厂家使用的含不同表面 活性剂的不同緩冲液处理的膜， 与所用检测线抗体溶液亲和力有不同程度的差 距， 也会很大程度造成线条不均匀， 拖带或是弥散的现象， 因此运用组装试纸 来选择优选的 NC膜。

2. 胶体金溶液制备

将 0.01%的 HAuCl ₄ 溶液加热至沸腾， 迅速加入每 lOOmL HAuCl ₄ 溶液加入还 原剂溶液， 开始有些蓝色， 然后浅蓝、 蓝色， 再加热出现红色， 煮沸 7~10min 出现透明的橙红色。 再用超滤或微孔滤膜（0.45μΐη)过滤， 以除去其中的聚合 物和其它可能混入的杂质。 制备好的胶体金外观应纯净、 透亮、 无沉淀和漂浮 物， 液面出现油状物和大量黑色颗粒状沉淀物时弃 用。

其中所使用的还原剂可以为柠檬酸三钠 （Frens 1973 )、 鞣酸一柠檬酸三钠 (Slot与 Gueeze 1985年）、 白磷， 优选使用柠檬酸三钠， 更优选地使用 1%柠 檬酸三钠。

其中所用玻璃容器应绝对清洁， 用前需经酸洗、硅化。 其水应为去离子超纯 水， 电阻率达 18.2 ΜΩ。

3. 金标抗体的制备

参见实施例 3、 实施例 4、 实施例 5、 实施例 6。

其中所述洗涤液也即保存液为含 0.2-1%大分子蛋白的硼酸盐， 碳酸盐， 磷 酸盐， Tris- HC1 或 Tris-磷酸盐， 醋酸盐， 巴比妥， 等等， 大分子蛋白可以为 牛血清白蛋白、 PEG20000、 酪蛋白等， 緩冲液优选为磷酸盐緩冲液， 更优选为 0.2%BSA pH7.2磷酸盐緩冲液。

4. 结合垫的预处理

用緩冲液将聚脂膜浸泡 30分钟， 37Ό烘干。

可以用于此目的的緩冲液包括

(a)含有 1% PVA, 0.71%Na ₃ P0 ₄ 、 1%BSA、 0.05% NaN ₃ 、 0.1% TritonX-100;

(b) 1%PVA、 1%BSA、 0.05% PROCLIN™300、 0.1% TritonX-100, pH7.0 PBS;

(c) 1% PVA、 1%BSA, 0.05% PROCLIN™300, pH7.0 PBS;

(d)含有 1% PVA、 0.71% Na ₃ P0 ₄ 、 1¾BSA、 0.05% NaN ₃ 、 0.1% Tween-20;

( e )含有 1% PVA、 0.71% Na ₃ P0 ₄ 、 1%BSA、 0.05% NaN ₃ 、 0.1% Tween-20, pH7. 0 PBS; 本文所述测定法优选的緩冲液是緩冲液（ a )， 因为它具有区別阴阳 性样品的最大分辨率。 PROCLIN™300和 NaN ₃ 起防腐作用， 而 Tween- 20具有去污 和亲水作用。

5. 结合垫的制备：

将金标抗人 IgG( a )和金标抗体（ b )按一定比例混合，用 BIO-Dot仪器 0. 5 ~ 4μ1/αη喷涂在预处理的聚脂膜上， 25°C ~ 30'C干燥， 待干燥完毕之后， 封袋， 置 2°C ~ 8°C备用。

6. 样品垫的处理

将样品垫按 45mL/片用处理液均匀洒涂于样品垫上，于 37°C烘千后，用铝箔 袋封装， 备用。

可以用于此目的的緩冲液包括（a ) 0. 05M Borax, 0. 01MPBS ( H 7. 0 )、 0. l%Sodium Casein, 1%PEG20000、 2¾BSA、 0. 05%NaN ₃ ; ( b ) 0. 05M Borax, 0. 01MPBS ( H 7. 0 ), 0. l%Sodium Casein, 1%PEG20000, 2%Casein, 0. 05%NaN ₃ ; ( c ) 0. 05M Tri s-cl ( pH 7. 0 )、 0. 01MPBS、 0. l%Sodium Casein, 1%PEG20000、 2% Casein, 0. 05%NaN ₃ „ 本文所述测定法优选的緩冲液是緩冲液（a ), 因为它具有区别阴阳 性样品的最大分辨率， NaN ₃ 起防腐作用。

7. 原材料预裁剪

玻璃纤维膜的栽切： 用裁切机将玻璃纤维膜切成与 PVC 胶板等长度即长 28cm, 宽 2. 4cm， 置干燥房间备用。

吸水纸的裁切： 用裁纸机将吸水纸切成与 PVC板等长度即长 28cm， 宽 3cm, 置干燥房间备用。

聚脂膜的裁切： 用裁纸机将其切成与 PVC板等长度即长 28cm， 宽 lcm， 置干 燥房备用。

将硝酸纤维素膜、 吸水纸、 聚脂膜、 玻璃纤维膜按图 1所示依次层叠在 PVC 塑料底板上， 组成大板。 组装车间温度应控制在 25Ό ~ 37Ό，湿度 20% ~ 30%。

8. 切条

用切条机将大板切成单人份， 每人份宽度按照一定要求切成 2. 5mm ~ 4mm的 宽度， 随;^检， 灵敏度能检出室内质控样品（即弱阳性样本)� � 条带显色程度 达到如图 2d， 且无非特异性条带， 则产品通过质控规定成为合格产品。

9. 组装、 包装

将 1 人份已切好的试纸组装在备好的试纸卡里， 使加样窗对应试纸的样品 u 垫， 结果显示窗对应检测区和控制区， 组装车间温度应控制在 25Ό~37Ό， 湿 度 20%~30%。 再与一包干燥剂、 说明书、 样品加样器封装在外包袋里， 于 4~ 25Ό避光保存。

实施例八确定金标抗体 (a)和金标抗体 (b)的混合比例

以金标羊抗人 IgG和兔 IgG为例来说明比例的确定，其他抗体如鼠抗人 IgG 和兔 IgG、 葡萄球菌 A蛋白和兔 IgG、 链球菌 G蛋白和兔 IgG也可据此方法来确 定。

1. 在实施例 7的步骤 3中， 所述两者混合比例确定具体为： 通过预实验基 本确定金标兔 IgG的 0D20,用 BIO-Dot喷量 Ιμΐ/cm喷于结合垫上，用 0.01MPBS 为上样緩冲液， 即能得到预期的颜色强度的条带， 确定兔 IgG的应用 0D喷量为 1μ1。

2. 将金标羊抗人 IgG进行梯度稀释到终浓度 0D 100、 80、 60、 40、 20， 然后将金标兔 IgG稀释到终浓度 0D 20， 用 BIO- Dot将以上金标羊抗人 IgG和金 标兔 IgG混合物喷量为 3μ1/αη喷于处理好的聚酯膜，将制备的包被膜 、结合垫、 样本垫、 吸水塾依次粘贴于塑料底板上, 用阳性血清、 临界参考值血清、 阴性 血清为调试对象。 判定依据： 阳性血清的检测线（Τ)和质控线（C) 两者的条 带颜色强度一致为依据， 临界参考值血清能出现， 阴性血清无条带出现的那个 0D值， 即为这批的应用量。 通过本试验得出 OD20- 40较为符合要求。

实施例九试纸组成及试剂配制

本发明提供的一种胶体金层析法肝病检测试纸 的組成： 是在支撑塑料 PVC 板（ 7 )上顺次相互搭接地粘贴硝酸纤维素包被膜 ( 3 )、结合垫（ 2 )、样品垫（ 1 )、 吸水垫（4)。 所述的结合垫（2)上包被有金标抗体（a)和金� �抗体 (b), 所 述硝酸纤维素包被膜 (3)有检测线和质控线， 检测线（T) 包被有 M2型线粒体 抗原蛋白 （5)， 质控线处（C) 包被有抗体 (c), 其中， M2型线粒体抗原蛋白来 源于商品化的纯化基因工程抗原蛋白， 或者自行制备。

将重组表达的 M2型线粒体抗原蛋白引入到胶体金层析法肝病� ��测试纸， 能 实现血液样本中的 M2型抗线粒体抗体的检测， 能快速、 便捷地辅助诊断原发性 胆汁肝硬化。

本发明所述的胶体金层析法肝病检测试纸， 所用的试剂配制如下：

1. 包被緩冲液的配制： 9gNacK 1.15gNa ₂ HP0 ₄ 、 0.23g NaH ₂ P0 ₄ » 10gSucrose、 0.5gEDTA溶于 1L超纯水中， 过滤置于 4"C备用。 2. 11( 1 ₄ 的配制： 用超纯水溶解氯金酸， 配成 1%溶液， 置 4Ό备用， 有效 期四个月。 1000 mL 1% HAuC 溶液配方： 10g HAuCl ₄ 、 超纯水定容至 1000 mL。

3. 1%柠檬酸三钠（Sodium Citrate )的配制：用超纯水溶解 Sodium Ci trate, 配成 1%溶液， 0. 22μιη膜滤过， 现配现用。

4. 0. 1MK ₂ C0 ₃ 的配制： 用超纯水配制， 0. 22μιη膜滤过， 置 4°C备用， 有效期 一个月。 1000 mL 0. 1M K ₂ C0 ₃ 溶液配方： 13. 8g ₂ C0 ₃ ; 超纯水定容至 1000 mL。

5. 10½ BSA的配制： 用超纯水配制， 0. 05%叠氮钠（ NaN ₃ )， 0. 22μιη膜滤过， 置 备用， 有效期两周。 lOOOmL 10% BSA溶液配方： 100g BSA, 0. 5g NaN ₃ ; 超纯水定容至 1000 mL。

6. 洗涤液也即保存液的配制：

2% BSA、 0. 05% ( NaN ₃ )、 0. 01M pH 7. 2 PBS, 0. 22μιη膜滤过， 置 4Ό备用， 有效期两周。 1000 mL标记洗涤保存液配方： 20g BSA、 0. 5g NaN ₃ 、 0. 01M pH 7. 2 PBS定容至 1000 mL。

7. 金标稀释液的配制：

lOOOmL稀释液的配制: 2. 423g tris , lOgBSA, 0. 2gNaN ₃ 溶于超纯水中, 调 pH 8. 0, 定容到 1000mL _o

用稀释液将金标稀释到工作浓度后， 加入 20%Sucrose和 5%的海藻糖。 实施例十 样本处理

取全血 l ~ 5ml， 自然凝集 5分钟后， 3000 ~ 5000g/5min ~ 10min， 取上清即 得到待测样品溶液， 至少有 ΙΟΟμΙ以上待测样品溶液。

用微量加样器吸取以上血清 50 ~ 70μ1样本于样品垫， 緩' ft加样。 或者用吸 管将血清样本緩慢滴加 3 ~ 5滴于样品垫上， 5 - lOmin观察结果，根据条带出现 情况来判读阴阳性结果。

实施例十一 试剂盒的检测和临床性能评估

1. 稳定性试验

1. 1 37 °C加速稳定性

将试纸置于 37°C进行加速实验， 每天取出用室内质控品进行测试， 通过阴 阳性参考品（各 10份） 的阴阳性符合率的批内精密度来判断试纸的稳 定性。 4 个月后结果显示， 质控品的检测结果符合预期， 各个阴阳性参考品的阴阳性符 合率为 100%„ 阴阳性参考品为 10份 M2型抗线粒体抗体阳性血清和 10份 M2型 抗线粒体抗体阴性血清。 1. 2 4°C稳定性实验

将试纸置于 4°C进行常规稳定性实验， 每月取出用室内质控品测试， 同样通 过阴阳性参考品（各 10份）的阴阳性符合率的批内精密度来判断试� ��的稳定性。

12 个月后结果显示， 质控品检测结果符合预期， 各个阴阳性参考品的阴阳性符 合率为 100%。 18个月后结果显示，各个阴阳性参考品的阴阳� ��符合率仍为 100¾。 24个月后检测结果显示， 出现一例假阴性。 综合以上结果说明试纸在 2 ~ 8X贮 存， 2年内是稳定的。

2. 诊断灵敏度

从临床中收集到 100份确诊为原发性胆汁肝炎（PBC )病人的血清， 用自制 的胶体金试纸按照说明书上的操作步骤对上面 收集到的 PBC病人血清进行检测。

5min后统计结果如下：

根据上面统计的结果，根据对 100份确认的 PBC病人血清的检测，可以发现 有 M2型抗线粒体抗体阳性的样本数量为 91例， 阴性样本数量为 9例。 因此通 过计算得出：

诊断灵敏性（％) =91/ ( 91+9 ) xl00%=91%

3. 诊断特异性

从临床中收集到健康献血者血清和非 PBC病人（包括其他自身免疫性疾病如 类风湿关节炎和自免肝病人）血清各 300份， 用自制的胶体金试纸按照说明书 上的操作步骤对上面收集到的健康献血者和非 PBC 病人的血清进行检测。 5min 后统计结果如下：

根据对非 PBC病人和健康献血者各 300份血清的检测的统计结果，发现在健 康献血者中测得 M2型抗线粒体抗体阴性的样本数量为 296例， 而非 PBC病人血 清的 M2型抗线粒体抗体阴性的样本数量为 297例。 因此通过计算得出：

(健康献血者）诊断特异性（％) =296/300xl00 =98. 6% (非 PBC病人血清）诊断特异性（％) =297/300=99%

600例对照组（包括健康献血者和非 PBC病人血清）

诊断特异性 ( % ) =593/600=98. 8%

4. 诊断准确性

根据上面诊断特异性和诊断灵敏度的统计， 可以得到下面这个总表:

根据上面的统计表可以看到，对于确认 PBC的病人血清，检测得到的阳性样 本数为 98例， 对于 600例健康献血者和非 PBC病人血清中， 检测到阴性样本为 593例。

即： 诊断准确性 = ( 91+593 ) /700=97. 7%

5. 批内不精确度

选用生产的某一批试纸， 同时选择四种不同浓度的血清（强、 中、弱、 阴性） 各一份， 每份血清做 10个重复， 5min后观察结果。 不同血清 阴性结果数 阳性结果数 强阳血清 0 10 中阳血清 0 10 弱阳血清 0 10

阴性血清 10 0

根据上面的结果得知，生产的同一批胶体金层 析法肝病检测试纸，对四份稀 释的不同浓度的血清检测， 每个样本重复 10次， 均能够准确的分出阴阳性， 得 到一致的阴阳性结果。

因此，得出以下结论:胶体金层析法肝病检测� �纸没有存在批内不精密现象。

6. 批间不精确度

选用生产的三批不同的胶体金层析法肝病检测 试纸，同时选择四种不同浓度 的血清（强、 中、 弱、 阴性）各一份， 每份血清重复 10次， ⁵ min后观察结果。 第- -批 第二批 第三批 不同血清

阴性 阳性 阴性 阳性 阴性 阳性 强阳血清 0 10 0 10 0 10 中阳血清 0 10 0 10 0 10 弱阳血清 0 10 0 10 0 10 阴性血清 10 0 10 0 10 0 根据上面的结果得知， 生产的不同批次的三批胶体金层析法肝病检测 试纸， 对四份不同的血清检测， 每个检测重复 10次， 均能够准确的分出阴阳性， 得到 一致的阴阳性结果。

因此,得出以下结论:胶体金层析法肝病检测试� ��没有存在批间不精密现象。

7.与同类检测项目不同方法学的产品-德国欧蒙 公司生产的 M2型抗线粒体 抗体检测试剂盒（ ELISA法） 的对比试验从临床收集随机患者样本血清 100份， 分别用欧蒙的 ELISA试剂盒和自制胶体金层析法肝病检测试纸� ��行检测， 得到 以下结果：

阳性符合率： 56/57xl00%=98. 2%

阴性符合率： 6%

总的符合率： （ 56+42 ) /100=98%

根据上面的统计，自制胶体金层析法肝病检测 试纸和欧蒙的 ELISA试剂盒总 的符合率可以达到 98%。 以上是对本发明的描述而非限定，基于本发明 思想的其它实施方式，均在本 发明的保护范围之中。