Die Erfindung betrifft neue Gewebe mit verbesserten Eigenschaften zur Herstellung von Elektrophoresegelen und Verfahren zu ihrer Herstellung.

Bei zahlreichen Elektrophoresetechniken werden Polyacrylamidgele und Agarose als antikonvektive und siebende Mdlrizeκ verwendeL. Die Gele werden in zwei Konfigurationen eingesetzt:

1) Zylindrische Gele, die eine Zeitlang sehr populär waren, werden heute vor allem für die Trennung in der ersten Dimension bei der zweidimensionalen Elektrophorese bevorzugt.

2) Flache Gele werden bei den heute am häufigsten angewandten Techniken, nämlich der Natriumdodecylsul at (SDS)-Elektrophorese und der isoelektriεchen Fokusεierung, verwendet. Beide Geometrien haben gemeinsam, daß die Gele während der Trennung von außen, z.B. durch die Wände eines Glasröhrchens oder, eine Glasplatte abgestützt werden. Nach der Trennung werden die Gele z.B. durch Proteinanfärbung, Enzymvisualiεierung oder Blotting ausgewertet. Die nicht abgestützten Gele sind dabei einer beachtlichen mechanischen Belastung unterworfen, so daß Gele mit einer Schichtdicke < 0,7 mm nicht verwendet werden können.

Ein weiterer beachtlicher Nachteil liegt darin, daß herkömmliche Gele nicht di enεionsεtabii εind und durch Quellen oder Schrumpfen in Löεungεmitteln unterschiedlicher Zusammensetzung leicht ihre Dimension ändern, was die Zuordnung der viεualisierten Komponenten erschwert oder unmöglich macht.

Durch Aufpolymeriεieren der Gele auf entsprechend vorbehandelte Polyesterfolien können die oben geschilderten Nachteile zum Teil beseitigt werden. Auf entsprechend vorbehandelten Polyesterfolien gelingt eε, auch ultradünne, d.h. etwa 50 - 350 -μ dünne Gele herzustellen, die im Vergleich mit Gelen herkömmlicher Schichtdicke (z . B . 1 - 3 m entscheidende arbeitstechnische Vorteile bei der isoelektrischen Fokusεierung und SDS-Elektrophorese bieten. Solche foliengestützte Gele haben jedoch den Nachteil, daß sie für ein Kapillarblotting nicht optimal und für ein Elektroblotting völlig ungeeignet sind.

Eine Alternative zu den extern stabilisierten Gelen sind gewebegestützte Gele mit interner Stabilisierung. Solche Gele sind von beiden Seiten offen und damit für ein Blotting besonders geeignet. Sie sind aber auch für andere Anwendungen interessant, z.B. die präparative isoelektriεche Fokussierung. Entgegen den Erwartungen hat sich jedoch gezeigt, daß die aus Geweben hergestellten Elektrophoresegele den Anforderungen in der Praxis nicht gerecht wurden.

Man ist bisher davon ausgegangen, daß aufgrund der größeren Kontaktfläche zwischen dem Gewebe und dem Gel, im Vergleich zu Gelen auf Trägerfolien, eine ausreichende Haftung der gewebegestützten Gele auch auf nicht vorbehandelten Geweben geeignet iεt. Dies mag für die Anwendungen zutreffen, bei denen die gewebegestützten Gele nach der elektrophoretischen Trennung lediglich angefärbt werden, weil dabei an die Gelhaftung keine erhöhten Anforderungen gestellt werden.

Anders ist es bei der derzeit wichtigsten Anwendung σewebegestützer Gele, nämlich beim Blotting. Bei dieser Technik wird nach der Trennung vom Gel mit Hilfe geeigneter Membranen, z.B. Nitrocellulose-Me branen, ein Abklatsch oder "Blot" angefertigt, in dem die aufgetrennten Komponenten immobilisiert werden, um dann für weitere Reaktionen, z.B. immunologische Nachweiεverfahren zur Verfügung stehen. Der Transfer der aufgetrennten Komponenten in die Membran erfordert einen guten Kontakt zwischen der Geloberfläche und der Nitrocellulose-Membran, da sonst ein Teil der im Gel erzielten Auflösung verloren geht.

Der Transfer kann entweder durch ein Kapillarblot ing oder ein Elektroblotting im elektrischen Feld durchgeführt werden. Bei beiden Transfertechniken wird auf das Gel und die Membran ein Druck angelegt, um eine 'möglichst genaue Kopie im Blot zu gewinnen.

Für die weitere Auswertung des Blotε muß die Membran von der Geloberfläche abgehoben werden. Hierbei hat sich nun unerwarteterweiεe gezeigt, daß die Haftung der Gele mit dem stützenden Gewebe unzureichend ist. Teile des Gels oder sogar die gesamte Geloberfläche werden von der Membran mit abgelöst, so daß die anschließend Auswertung des Blots gestört oder sogar gänzlich unmöglich ist.

Ein weiterer Nachteil der bisher verwendeten gewebegeεtützten Gele ist, daß sich diese Gele häufig nicht vollständig entfärben lassen und hierdurch bedingt einen ungleichmäßigen Untergrund aufweisen. Dies kann sich nachteilig auf die weitere Auswertung der Gele auswirken.

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Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, technische Gewebe bereitzustellen, die die Herstellung gewebegestützter Elelctrophoresegele mit verbesserten Eigenschaften, z.B. bei der Auswertung, bereitzustellen.

Die Aufgabe der Erfindung wird durch ein technisches Ge 6_>e gelost, das einen ein oder mehrschichtiger, hydrophilen Überzug als Haftvermittler aufweist.

Geeignete Gewebe sind aus dem Stand der Technik bekannt und werden von verschiedenen Firmen auf dem Markt angeboten. Bevorzugt werden technische Gewebe aus Polyester mit einer definierten Maschenweite zwischen 10 und 100 _l im verwendet, ebenfalls geeignet sind Gewebe aus Polypropylen oder Gewebe aus Polyamid. Bei der Auswahl der Gewebe ist darauf zu achten, daß sie bei den mitunter in der Elektrophoresetechnik häufig verwendeten agressiven Reagenzien oder Lösungsmitteln nicht angegriffen werden. Gewebegestützte Gele, werden vorzugsweise zur Herstellung ultradünner Elektrophoreεegele (50 bis 500 μm) eingesetzt, so daß die eingesetzten technischen Gewebe eine Stärke zwischen 40 und 70 -μm, bevorzugt 50 bis 60 -μm aufweisen sollten.

Als Haftvermittler werden im Sinne der Erfindung auch solche Verbindungen bezeichnet, die eine Vernetzung zwischen dem Gewebe und dem später aufzubringendem Gel bewirken können. Geeignete Verbindungen sind beispielsweise Polymere und Copolymere mit reaktionsfähigen funktioneilen Gruppen die zu einer Vernetzung mit dem Gel fähig sind. So offenbart die deutsche Offenlegungsεchrift 30 32 06 9 Copolymerisate auf der Basis von Malein¬ säureanhydrid-Derivaten mit ungesättigten primären oder seeundären Aminen oder C=C-Doppelbindungen enthaltenen Epoxiden.

Weiterhin geeignet sind Copolymeriεate aus Maleinsäureanhydrid und Vinylalkylethern, Copoly- merisate aus Polyεacchariden und Allylglycidylethern und Tenεide.

Bevorzugte Haf vermittler (Vernetzungsmittel) bestehen ouc cincir» Ccpclyir.srisst aus Maleinsäure..nnvr.rid und Vinylmethylether (Gantrez AN) mit Diallylamin; aus Agaroεe und Allylglycidylether (Allylglyceidylagarose) , oder aus dem Copolymerisat von Maleinsäureanhydrid und Methylvinylether (Gantrez AN), bevorzugtes Tenεid ist Surfynol.

Der erfindungsgemäße Überzug kann aus einer einzigen Schicht oder aber auch mehreren Schichten aufgebaut sein. Mehrεchichtige Überzüge können aus Kombinationen von einzelnen Schichten bestehen, die unterschiedliche Copolymerisate als Haftvermittler enthalten können. Gegebenenfalls kann auf dem ein- oder mehrschichtigen Überzug des Verrie zungsmittelβ ein weiterer Überzug aus einem Tensid, wie z.B. 2,4,7,9 -Tetramethyl-5- decin-4,7-diol, aufgebracht werden. In einer weiteren Ausführungsform kann daε Tenεid dem Haftvermittler als weitere Komponente direkt zugeεetzt εein.

Zweckmäßigerweise wird die Zusammensetzung und der Aufbau des Überzuges dem später aufzutragenden Gel angepaßt.

Die Stärke (Dicke) des Überzugs ist variabel und kann beispielsweise bei der Herstellung durch Einstellung der Viskosität der verwendete Lösungen des Haftvermittlerε beim Tauchverfahren eingestellt werden. Es ist jedoch in jedem Fall er orderlich, daß die gewebeartige Struktur des technischen Gewebes erhalten bleibt, d.h. die Maschen des Gewebes dürfen durch den Überzug nicht verschlossen werden, da sonst die Eigenscha ten des gewebegestützten Geleε nachteilig verändert würden.

Erfindungsgemäße Gewebe, die zur Herstellung eines gewebegestützten Polyacryla id-Gels geeignet sind, zeigen beispielsweise folgenden Aufbau.

a) Polyestergewebe mit einer Porengröße zwischen 50 und ICO -μm, bevorzugt 60 μm. und einer Stärke zwischen 40 und 70 μm.

b) 1. Überzug aus einen Copolymerisat aus Gantrez und Dially amin.

c) 2. Überzug aus Allylglycidylagaroεe

d) 3. Überzug aus Surf nol 104.

Ein weiteres erfindungsgemäße Gewebe zur Herstellung eines gewebegeεtützen Agarose-Gels weist einen zweischichtigem Überzug auf.

a) Polyestergewebe mit einer Porengröße zwischen 50 und 100 μm, bevorzugt 60 μm,

b) 1. Überzug aus Gantrez AN

c) 2. Überzug aus Agarose.

Da die verwendeten Gewebe zumeist für eine andere Verwendung (z.B. als Siebe) vom Fachhandel angeboten werden, kann es vorteilhaft sein, diese vorzubehandeln, um die Haftung des Überzuges zu verbessern. Dies kann beispielsweise durch einfaches Waschen mit Wasser erfolgen.

Die Überzüge können in Analogie zu bekannten Tauchverfahren in einfacher Weise hergestellt werden.

Hierzu werden verwendeten Copoly erisate oder Tenεide in geeigneten, möglichεt leichtflüchtigen Lösungsmitteln gelöst. Geeignete Lösungsmittel sind beispielsweise Aceton, Methanol, Wasser und andere, wobei darauf zu achten ist, daß das Lösungsmittel die verwendeten Gewebe nicht angreift.

Anschließend eid n die Gewebe in die Lösung getaucht, so daß sie vollständig benetzt sind; daraufhin läßt man die überschüssige Lösung abtropfen und trocknet die nun überzogenen Gewebe vorsichtig. Vorzugsweise erfolgt die Trocknung des Gewebes bei erhöhten Temperaturen. Nach demselben Procedere können anschließend weiterer Überzüge derselben oder aber auch einer anderen Zusammensetzung aufgebracht werden.

Die so präparierten Gewebe können dann nach sorgfältiger Trocknung zur Herstellung gewebegestützter Elektrophoresegele verwendet werden. Entsprechende Techniken sind bekannt und brauchen nicht näher erläutert werden.

Die aus den erfindungsgemäßen Geweben hergestellten Elektrophoresegele haben gegenüber aus bekömmlichen Geweben hergestellten wesentliche Vorteile:

Gewebegestütze Gele, die mit erfindungsgemäß vorbehandeltem Gewebe hergestellt werden, haben eine deutlich verbesserte Haftung, was z. B. in einem Test mit trockenem Membranen ermittelt werden kann. Angefeuchtete Membranen, wie εie beim Blotting verwendet werden, lassen sich leicht von der Geloberfläche abheben, ohne daß auch nur ein Teil des Gels mitgeriεεen wird.

Ein weiterer Vorteil der vorbehandelten Gewebe ist bei der Herstellung der gewebegeεtützen Gele gegeben. Die stark hydrophoben Eigenschaften der unbehandelten Gewebe erschweren das Eindringen der

Polymerεitationslösung bei der Herstellung ultradünner Gele.

Dieser Nachteil wird durch die erfindungεgemäß behandelten technischen Gewebe beseitig. Die er indungsgemäße Gewebe ermöglichen die Herstellung ultradünner Elektrophoresegele mit Schichtεtärken zwischen 50 und 500 μm, wobei Gele mit einer Schichtstärke von ca. 150 μ bevorzugt sind.

Zusätzlich zu diesem Vorteil zeigen die vorbehandelten Gewebe auch bessere Eigenschaften beim Entfärben und der Transfereffizienz. Während unbehandelte Gewebe beim Entfärben häufig einen ungleichmäßigen Untergrund haben, sind die behandelten Gewebe gleichmäßig entfärbt.Die Transfereffizienz ist bei den behandelten Geweben beεεer. Auf diese Weise wird erreicht, daß sich die Proteine vom Gewebe quantitativ auf die Membran übertragen lassen.

Ausführungsbeispiele

Beispiel 1

Technisches Gewebe zur Herstellung eines gewebegestützten Polyacrylamid - Elektrophoresegels.

Ein Gewebe aus Polyester (PES Monodur 60 N, Fa. Verseidig, Kempen) wir wie folgt behandelt, a) Herstellung der ersten Überzugsschicht: Das Gewebe wird in eine Lösung* aus

6 ltr. Aceton

R 381 mg Gantrez AN 179 (Serva )

22 ml DMF und

237,6 mg Diallylamin getaucht, so daß es vollständig benetzt ist.

Anschließend läßt man überschüssige Lösung abtropfen und trocknet bei Zimmertemperatur.

*Die Lösung ist erst nach 24 Stunden gebrauchsfertig.

b) Herstellung der zweiten Überzugεεchicht :

Daε wir unter a) beschrieben behandelten Gewebe wird nach dem Trocknen in eine 0,2 ige Lösung von Allylglycidylagarose in Wasser getaucht und „ T 4 __ a „ -.A — ~ a- _ „__!_.„ ^ f- αilS Ul l -UCll ^U t-J_ — _' V-.| _.1.C L .

c) Herstellung der dritten Überzugsεchicht :

Nach dem Trocknen wird daε Gewebe abεchließend in eine 0,1 %ige ethanoliεche Lösung von Surfynol 104 (Serva ) getaucht und getrocknet.

Das so präparierte Gewebe wird dann nach bekannten Verfahren, der sogenannten Klapptechnik oder Kassettentechnik, in die Monomerenmischung von Acrylamid und den bekannten Zusatzstoffen (Polymeriεationsεtarter etc.) eingelegt, die dann zu dem Gel polymerisier .

Beispiel 2

Technisches Gewebe zur Herstellung eines gewebegestützten Agarose - Elektrophoresegels.

Das Polyeεtergewebe (PES Monodur 60 N) wird wie in Beispiel 1 beschrieben nach dem Taυchverfahren präpariert.

1. Überzug

Zusammensetzung 8 ltr. Aceton der Lösung: 8 g Gantrez

Λo

Überzug

Zusammensetzung 8 g Agarose/5,6 ml Wasser der Lösung: 6 ltr. Methanol 20 ml Glycerin

Das fertig präparierte Cewebe wird nach bekannten Verfahren in Agarose eingebracht.