一种小盐芥同源异型-亮氨酸拉链蛋白 HDbZHV?及其编码基因与应用

技术领域 本发明涉及植物蛋白及其编码基因与应用， 特别是涉及一个来源于小盐芥的同 源异型-亮氨酸拉链蛋白 HDbZIP-3及其编码基因， 以及其在培育耐旱性提高的转基因 植物中的应用。 背景技术 温度、 盐渍和干旱等逆境胁迫会对高等植物的生长发 育造成严重危害， 导致作物产 量降低， 品质下降， 严重威胁农业生产和自然环境。 其中干旱对作物产量的影响， 在诸 多自然逆境中占首位， 其危害相当于其它灾害之和， 是许多地区是农业发展的瓶颈。 据 统计， 世界干旱、 半干旱地区占陆地面积的 34%; 我国干旱、 半干旱地区约占国土面积 的 52%， 年受旱面积达 200 - 270万公顷 ， 全国灌溉区每年缺水约 30亿立方米， 因缺水 而少收粮食 350 - 400亿公斤； 特别是我国主要产粮区如华北、 东北和西北， 是我国缺水 最严重的地区， 春旱频繁达到十年九遇。

植物耐旱性大多属于多基因控制的数量性状， 利用常规育种方法改良作物的抗旱性 受到周期长、 优异种质资源缺乏的限制。 近年来的转录组学、 蛋白组学和基因表达调控 的研究初步揭示了植物干旱胁迫的作用分子机 理。 目前， 利用干旱胁迫相关基因提高植 物的抗旱能力， 已经成为植物抗逆分子生物学的研究热点和植 物抗逆基因工程重要的研 究方向。

植物受到逆境胁迫时会产生相应的应答反应， 以降低或消除逆境胁迫给植物带来的 危害。 植物的这种应答反应是一个涉及多基因、 多信号途径及多基因产物的复杂过程。 但就目前的研究状况而言， 由于其机制十分复杂， 许多植物对逆境下的生物化学和生理 学上的响应机制仍有待深入研究。 在抗逆应答基因的功能及表达调控方面的研究 将对植 物抗逆相关的信号传递途径之间的联系以及整 个信号传递网络系统的研究提供重要的基 础。 发明内容 本发明人利用 SSH (抑制差减杂交） 与 RACE (cDNA末端快速扩增） 相结合的方 法克隆出了小盐芥的一种亮氨酸拉链蛋白 (本文命名为 HDbZIP-3) 的编码基因， 并测定 了其 DNA序列。 并且发现将其导入植物超量表达后， 可明显改善转基因植株的耐旱性， 而且这些性状可稳定遗传。

本发明第一方面提供小盐芥的一种同源异型-� �氨酸拉链蛋白 HDbZIP-3的编码基因 (本文命名为 ThHDbZIP-3 ； 优选地， 其序列为 SEQ ID NO: 2。

本发明第二方面提供一种重组表达载体， 其含有本发明第一方面所述的基因， 其是 通过将所述基因插入到一种用于构建所述重组 表达载体的基础载体而获得的， 并且所 述基因的核苷酸序列与所述基础载体的表达控 制序列可操作地连接； 优选地， 所述基础 载体为 pCAMBIA2300;优选地，所述重组表达载体为附图 2所示的 35S-7¾HZ½Z/P-3-2300 载体。

本发明第三方面提供一种重组细胞， 其含有本发明第一方面所述的基因或者本发明 第二方面所述的重组表达载体； 优选地， 所述重组细胞为重组农杆菌细胞。

本发明第四方面提供一种改善植物耐旱性的方 法， 包括： 将本发明第一方面所述的 基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体 导入植物或植物组织并使所述基因表达； 优选地， 所述植物是拟南芥。

本发明第五方面提供一种制备转基因植物的方 法， 包括： 在有效产生植物的条件下 培养含有本发明第一方面所述的基因或者本发 明第二方面所述的重组表达载体的植物或 植物组织； 优选地， 所述植物是拟南芥。

本发明第六方面提供本发明第一方面所述的基 因、 本发明第二方面所述的重组表达 载体或者本发明第三方面所述的重组细胞用于 改善植物耐旱性以及用于植物育种的用途; 优选地， 所述植物是拟南芥。

本发明第七方面提供本发明第一方面所述的基 因编码的蛋白质， 其氨基酸序列如 SEQ ID NO: 1所示。 附图说明 图 1是 ThHDbZIP-3的植物表达载体 (358-7Μ/Ζ¾Ζ/Ρ-3-2300;)的构建流程（图 la-lb)。 图 2是 ThHDbZIP-3的植物表达载体 (358-7Μ/Ζ½Ζ/Ρ-3-2300;)的质粒图。

图 3是 7¾HZ½Z/P-3 T1代转基因拟南芥植株（图中， T106)和作为对照的非转基因 拟南芥植株（图中， CK)的耐旱模拟实验结果。 (图 3a为正常生长 20天的拟南芥植株； 图 3b为正常生长 20天后干旱处理 14天的拟南芥植株）。 图 4干旱胁迫和正常生长条件下的 T1代转基因拟南芥植株及对照植株 ABA含量 变化检测结果。 1-7 依次为株系 （从左至右）： T101、 Τ102、 Τ103、 Τ104、 Τ105、 Τ106、 CK， 其中 Τ101、 Τ102、 Τ103、 Τ104、 Τ105、 T106为转基因植株， CK为 对照植株。

图 5是转基因 T1代拟南芥植株和非转基因对照植株在转录水� ��上的蛋白表达验 证结果。 M为 DNA Ladder Marker ( DL2000, TakaRa), 1-6为耐旱转基因拟南芥 T1代 植株 （依次为： Τ101、 Τ102、 Τ103、 Τ104、 Τ105、 Τ106)， 7-11为不耐旱转基因拟南 芥 Τ1代植株， 12-16为非转基因拟南芥对照。 具体实施方式 下面结合非限制性实施例对本发明进行进一步 说明。所述实施例仅出于示例性目的， 并非意在限制本发明的范围。

下面实施例中提到的未注明来源的限制性内切 酶均购自 New England Biolabs公司。 实施例 1 干旱胁迫下小盐芥 SSH文库构建：

具体方法为：

利用 Clontech公司的 PCR-select™ cDNA Subtraction Kit所示的方法通过抑制差减杂 交方法构建差减文库。 在实验过程中以干旱处理的盐芥幼苗的叶片的 mRNA作为样本 ( Tester), 以未处理的小盐芥幼苗的叶片的 mRNA作为对照 （Driver)。 具体步骤简述如 下：

( 1 ) 供试材料：

小盐芥 （ T ellungiella halophila, 购自中国内蒙古巴彦淖尔市乌兰布和沙漠绿色 植物园盐生植物繁育中心） ， 播种到灭过菌的蛭石上， 在 25 °C、 光周期 16小时光照 /8小时黑暗（光强 2000— 3000 Lx)条件下培养，每周浇 1/2MS培养基（ 9.39 mM KN0 ₃ ， 0.625 mM KH ₂ P0 ₄ ， 10.3 mM NH ₄ N0 ₃ , 0.75 mM MgS0 ₄ ， 1.5 mM CaCl ₂ ， 50 μΜ KI， 100 μΜ Η ₃ ΒΟ ₃ ， 100 M MnSO ₄ ， 30 μΜ ZnS0 ₄ , 1 μΜ Να ₂ Μο0 ₄ , 0.1 μΜ CoCl ₂ , 100 μΜ Na ₂ EDTA, 100 M FeSO ₄ ) —次。 当苗株高达 25-30 cm时用于实验。

( 2 ) 材料处理：

将供试幼苗分为 2组， 每组 4盆， 每盆 1株。 第一组为对照组， 在 25 °C、 光周 期 16小时光照 /8小时黑暗条件下培养， 正常浇灌。 第二组为干旱处理组， 25 °C、 光 周期 16小时光照 /8小时黑暗条件下培养， 停止浇灌， 处理 10天， 处理完毕后及时剪 取两组幼苗顶端 1/3的叶片， 用液氮迅速冷冻后， 于 -70 °C冰箱中保存。

( 3 ) 总 RNA提取：

分别取对照组和干旱处理组的小盐芥叶片 0.5 g， 用植物 RNA提取试剂盒（购自 invitrogen) 提取小盐芥叶片的总 RNA。 用 HITACHI公司的紫外分光光度计 U-2001 测定总 RNA在 260 nm和 280 nm的吸光度值， OD ₂₆₀ /OD ₂₈₀ 比值为 1.8-2.0， 表明总 RNA纯度较高； 用 1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA的完整性， 28S条带的亮度 约为 18S条带的 2倍，表明 RNA的完整性良好。使用 Qiagen公司的 Oligotex mRNA 纯化试剂盒 (purification of poly A+ RNA from total RNA)分离 mRNA。

( 4 ) 抑制差减杂交：

按 Clontech公司的 PCR-select ^TM cDNA Subtraction Kit试剂盒所示的方法进行抑制差 减杂交。先将 Driver mRNA和 Tester mRNA分别反转录，得到双链 cDNA,再以 2 Tester cDNA禾 P 2 g Driver cDNA作为起始材料进行差减杂交。 在 37°C水浴下分别将 Tester cDNA和 Driver cDNA用 Rsa I 酶切 1.5小时，然后将酶切后的 Tester cDNA分成两等份， 连接上不同的接头， 而 Driver cDNA不连接头。 两种连有不同接头的 Tester cDNA分别 与过量的 Driver cDNA混合， 进行第一次正向差减杂交。 将两种第一次差减杂交的产物 混合， 再与新变性的 Driver cDNA进行第二次正向差减杂交， 然后通过两次抑制性 PCR 扩增差异表达的片段， 使其得到富集。

为了增加获得表达序列标签 （Expressed sequence tag, EST) (Unigene)的有效性， 避 免基因无酶切位点及所获得序列在非翻译区， 本实验同时用内切酶 Haelll按上述步骤对 Tester cDNA和 Driver cDNA进行酶切并先后进行两次正向差减杂交和� �次抑制性 PCR 扩增， 最后合并两组正向差减杂交 cDNA片段的第二次抑制性 PCR产物。

( 5 ) cDNA差减文库的构建与初步筛选、 克隆、 鉴定

依照 pGEM-T Easy试剂盒的程序， 将上述合并的正向差减杂交 cDNA片段的第二次 PCR产物 （使用 QIAquick PCR Purification Kit纯化， 购自 Qiagen) 与 pGEM-T Easy (购 自 Promega试剂盒)载体连接， 其具体步骤如下： 用 200 μΐ PCR管依次加入下列成分： 纯 化的正向差减杂交 cDNA片段的第二次 PCR产物 3 μ1，2χΤ4连接酶缓冲液 5 ，pGEM-T Easy载体 1 μ1， T4 DNA连接酶 1 μΐ ， 于 4°C连接过夜。 取 10 连接反应产物， 加入 到 100 感受态大肠杆菌 JM109 (购自 TAKARA) 中， 冰浴 30分钟、 热休克 60秒、 冰 浴 2分钟， 另加 250 μL LB培养液 （ 1% Tryptone购自 OXOID, 0.5% Yeast Extract购自 OXOID, 1% NaCl购自国药）置 37°C水浴中， 以 225转 /分钟振荡培养 30分钟，取 200 μL 菌液涂布于含 50 g/mL氨苄青霉素 （购自天根生化科技 (北京)有限公司） 的 LB (同上） /X-gal/IPTG (X-gal/IPTG购自 TAKARA, lg包装配制成 20 mg/ml母液，其工作浓度为： 以上母液 200 μΙ/100 ml LB培养基； IPTG购自 TaKaRa, 5g包装配制成 100 mM浓度的母 液， 其工作浓度为： 以上母液 100 μΙ/lOOml LB培养基） 固体培养平板上， 37°C培育 18 小时。计数培养板中直径 > 1 mm的清晰白色及蓝色菌落数，随机挑取 198个白色菌落 (编 号： Gh-B001至 Gh-B198)。 将所有白色克隆分别接种于含有 50 g/mL氨苄青霉素的 LB 液体培养基的 96孔细胞培养板 (CORNING)中， 37°C培养过夜后加甘油至终浓度 20%， 于 -80°C保存备用。以巢式 PCR 引物 Primer 1和 Primer 2R( Clontech公司的 PCR-select™ cDNA Subtraction Kit试剂盒自带） 进行菌液 PCR扩增验证， 得到 166个阳性克隆， 然 后将所有阳性克隆在送英潍捷基 （上海） 贸易有限公司测序。

( 6) 差异克隆的 cDNA测序分析：

将 DNA 测序结果去除载体和不明确序列及冗余的 cDNA 后， 共得到 123 个 EST(Unigene；)。 经分析有 22个重叠群， 有 101个单一的序列。 经 BlastN发现其中 53条 EST (Unigene) 在 GenBank 中有同源序列， 21条 EST功能未知或者为假定蛋白， 另有 27条未获得同源匹配， 推测可能是处于 3 '或 5'末端非翻译区的较短序列。 实施例 2 盐芥亮氨酸拉链蛋白编码基因 ThHDbZIP-3的克隆

克隆子 YLS-120 去掉冗余 DNA后， 序列为 SEQ ID No: 3， 序列分析表明该序列的 编码的蛋白质属于亮氨酸拉链蛋白， 本文将克隆子 YLS-120对应的全长编码基因命名为 ThHDbZIP-3， 其对应的蛋白命名为 HDbZIP-3。

SEQ ID No: 3

1 TTTGGAGCTG AACG TGGAT CGCTACTCTC CAAAGAATGT GCGAGAGATT CAAGACTGTA

61 CTAGAACCCG CAACATCTTC CCGCGATCTC AAAGGAGTGA TTCCATCTCT GGAAGGGAAG 121 AGAAGTATAA TGAGACTATC TCAAAGAATG GTAAGCAACT TTGC TGAG CGT GGCACA

181 TCTAACAACA ATGGCTCAAC GGTTATTTCC GGGTTGGAGG AGTTTGGAAT CCGTGTGACC

241 TCGTATAAGA GTCAGCATGA ACCAAATGGA ATGGTTCTAT GTGCAGCCAC TAGTTTCTGG

301 CTCCCAATTT CTCCACAAAA CGTCTTCAAT TTCCTCAAAG ATGAAAGAAC TCGGCCACAG

361 GGGACGTTC TTTCGAATGG AAATTCTGTT CAAGAAGTTG CTCATATCGC AAACGGCTCA 421 CACCCTGGAA ACTGCATTTC GGT CTCCGC GGATTCAA G CATCTTCATC ACAAAACAAC

481 ATGCTGATTC TACAAGAAAG CTGGGTAGAC TCATCAGGCT CGCTTGTGGT GTACACTCCG

541 GTGGATCTAC CAGCACTGAA CATGGCAATG AGCGGTCAAG ACACATCTTA TGTTCCCATT

601 CTACCCTCGG GT TCGCCGT TTCACCAGAC GGAACCAGGA ATAACCAGCT CGCAGAGCAC

661 AAAGTTGAAG GAGGAGGAGG TTCATTGATA ACGGT GGTT TTCAGATAAT GGTGAGTAGT 721 TTGCAGTCAG CGAAAT GAA TGTGGAGTCA ATGGAAACAG TTAATAATCT CATCAGCACC 781 ACTGTCCACC AAATTAAAAC CACCTTGAAC TGTCCTTCAA CTGCTTGA HDbZIP-3全长编码基因的克隆

根据已经获得的 SEQ ID No: 3序列分析， SEQ ID No: 3 为编码基因 HZ½Z/P-3 的 3端序列。 根据已经获得的 SEQ ID NO: 3序列， 设计如下三条特异性引物， 作为反转录引 物及 5 'RACE的特异性引物。

YLS-120GSP 1 ( SEQ ID NO: 4 ) ：

TGAGCCGTTTGCGATATGAG YLS-120GSP2 ( SEQ ID NO: 5 ) ：

CCATTCGAAAGAACGTCCCA

YLS-120 GSP3 ( SEQ ID NO:6 ) ：

TTTGGAGCTGAACGTTGGAT

试剂盒自带通用引物：

AAP ( SEQ ID NO: 7 ) ：

GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG

AUAP ( SEQ ID NO: 8 ) ：

GGCCACGCGTCGACTAGTAC 实验步骤按试剂盒说明书操作 （5' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends试剂盒购自 Invitrogen公司）。

以 YLS-120GSP1(SEQ ID NO: 4)为反转录引物，以小盐芥 mRNA为模板进行反转录， 获得 cDNA模板， 然后按照上述 5' RACE试剂盒说明书中的步骤加 Poly C尾， 以加尾后 的产物为模板进行第一轮 PCR扩增，所用引物为 SEQ ID NO: 4与通用引物 SEQ ID NO: 7 (试剂盒自带， I为次黄嘌吟修饰的 a、 c、 g或 t)， 具体步骤如下：

50 μΐ PCR反应体系： 5 μΐ ΙΟ Εχ Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP， 2.0 μΐ mRNA反转录 的 cDNA, 1.0 μΐ Ex Taq (购自 TAKARA)、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 4和 SEQ ID NO: 7 各 2.0 μ1， 以及 35 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环（ 94 °C 变 性 50秒， 58°C退火 50秒， 72°C 延伸 90秒）， 72 °C 延伸 10分钟。

所得的 PCR产物用双蒸水稀释 50倍后取 2.0 μΐ作为模板， 用 SEQ ID NO: 5与通用 引物 SEQ ID NO: 8进行第二轮 PCR扩增， 具体步骤如下：

50 μΐ PCR反应体系： 5 μΐ ΙΟ Εχ Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP， 2.0 μΐ稀释的第一轮 PCR产物， 1.0 l Ex Taq、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 5和 SEQ ID NO: 8各 2.0 μ1， 以及

35 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环（ 94 °C 变性 50秒， 58 °C 退火 50秒， 72°C 延伸 90秒）， 72 °C 延伸 10分钟。 回收第二次 PCR产物中约为 l. lKbp 大小的条带 （Gel Extraction Kit购自 OMEGA), 并将其连接到 pGEM-T Easy Vector, 然 后转化到 JM109 (具体方法同上）， 随机挑取 6个白色菌落分别接种于含有 50 g/mL氨苄 青霉素的 LB 液体培养基中培养， 37°C培养过夜后加甘油至终浓度 20% (v/v), -80°C下 保存备用。用引物 SEQ ID NO: 5与 3'端引物 SEQ ID NO: 6进行菌液 PCR扩增（反应体 系及反应条件同上）， 得到 6个阳性克隆， 送英潍捷基 （上海） 贸易有限公司测序测序， 获得该基因的 cDNA的一段 5'端序列。

所得的 5'RACE产物克隆子 YL16-3测序获得序列为 SEQ ID NO: 9：

GGGGGGGGGG AACTTGGTTT TATCAGACAT AGATAAGTCT CTTA GACCA GCATCGCTGT

61 GACCGCTATC GAAGAATTGC TTAGGCTCAC ACAAACAAAT GAGCCTCTAT GGATCAAAAC

121 GGATGGATGC AGAGAAATTC TCAATCTCGA AAGCTATGAG AATATATTCT CAAGATCAAG

181 TAGCCG GGA GGAAAGAACC ATAACC TCG AAAGGAAGCA TCTAGATTTT CTGGGGTTGT

241 TTTCACIAAT GCTATGACCC TTGTTGATAT GCTCATGGAC TCGGTCAAAT CTGCAGAGCT

301 T TTCCCTCA ATTGTTGCAA CATCTAAAAC CCTTGCAG G ATTTCATCCA GCTTGCGCGG

361 AAACCG GCA GA GCATTGC ATTTGATGCT TGAAGAGCTT CAAGTGCITT CCCCATTGGT

421 ACCGACGCGT GAGTTCTGGG GGCIAAGATA TTGTCAGCAA ATACAACATG GAACTTGGGC

481 AATTGTAAAT GTCTCCTA G AGTTCCCTCA GTTTATATCT CAT CTCGGT CGTATCGGTA

541 TCCTTCTGGT TGCTTGATTC AAGACATGTC CAATGGCTAT TCCAAGGTTA T TGGGTCGA

601 ACATGTTGAT ACGGAGGAGC AAGAAGCGGT TCACGAGA G TTTAAAGATA ATGTCCGTCA

661 AGGATTAGCT TTTGGAGCTG AACGTTGGAT CGCTACTCTC CAAAGAATGT GCGAGAGATT

721 CAAGACTGTA CTAGAACCGG CAACATCTTC CCGCGATCTC AAAGGAGTGA TTCCATCTCT

781 GGAAGGGAAG AGAAGTATAA TGAGACTATC TCAAAGAA G GTAAGCAACT TTGCTTGAG

841 GGTTGGCACA TCIAACAACA ATCGCTCAAC GGTTATTTCC GGGT GGACG AGTTTGGAAT

901 CCGTGTGACC TCGTATAAGA GTCAGCATGA ACCAAATGGA ATGGTTCTAT GTGCAGCCAC

961 TAGTTTCTGG CTCCCAATTT CTCCACAAAA CGTC TCAAT TTCCTCAAAG ATGAAAGAAC

1021 TGGGCCACAG TGGGACGT C T TCGAATGG 将 5 ' RACE获得的序列 SEQ ID NO: 9， 与获得的序列 SEQ ID NO: 3拼接， 获得 SEQ ID NO: 10:

1 GGGGGGGGGG AACTTGGTTT TATCAGACAT AGATAAGTCT CTTA GACCA GCATCGCTGT

61 GACCGCTATC GAAGAATTGC TTAGGCTCAC ACAAACAAAT GAGCCTCTAT GGATCAAAAC

121 GGATGGATGC AGAGAAATTC TCAATCTCGA AAGCTATGAG AATATATTCT CAAGATCAAG 181 TAGCCG GGA GGAAAGAACC ATAACC TCG AAAGGAAGCA TCTAGATTTT CTGGGGTTGT

241 TTTCACIAAT GCTATGACCC TTGTTGATAT GCTCATGGAC TCGGTCAAAT CTGCAGAGCT

301 T TTCCCTCA ATTGTTGCAA CATCTAAAAC CCTTGCAG G ATTTCATCCA GCTTGCGCGG

361 AAACCG GCA GA GCATTGC ATTTGATGCT TGAAGAGCTT CAAGTGCITT CCCCATTGGT

421 ACCGACGCGT GAGTTCTGGG GGCIAAGATA TTGTCAGCAA ATACAACATG GAACTTGGGC 481 AATTGTAAAT GTCTCCTATG AGTTCCCTCA GTTTATATCT CAT CTCGGT CGTATCGGTA

541 TCCTTCTGGT TGCTTGATTC AAGACATGTC CAATGGCTAT TCCAAGGTTA T TGGGTCGA

601 ACATGTTGAT ACGGAGGAGC AAGAAGCGGT TCACGAGA G TTTAAAGATA ATGTCCGTCA

661 AGGATTAGCT TTTGGAGCTG AACGTTGGAT CGCTACTCTC CAAAGAATGT GCGAGAGATT 721 CAAGACTGTA CTAGAACCGG CAACATCTTC CCGCGATCTC TTCCATCTCT

781 GGAAGGGAAG AGAAGTATAA TGAGACTATC TCAAAGAA G TTGCTTGAG

841 GGTTGGCACA TCIAACAACA ATCGCTCAAC GGTTATTTCC AGTTTGGAAT

901 CCGTGTGACC TCGTATAAGA GTCAGCATGA ACCAAATGGA GTGCAGCCAC

961 TAGTTTCTGG CTCCCAATTT CTCCACAAAA CGTC TCAAT ATGAAAGAAC

1021 TGGGCCACAG TGGGACGT C T TCGAATGG AAATTCTGTT CTCATATCGC

1081 AAACGGCTCA CACCCTGGAA ACTGCATTTC GGT CTCCGC CATCTTCATC

1141 ACAAAACAAC ATGCTGATTC TACAAGAAAG CTGCGTAGAC CGCTTGTGGT

1201 GTACACTCGG GTGGATCTAC CAGCACTGAA CATGGCAA G ACACATCTTA

1261 TGTTCCCATT CTACCCTCGG GT TGGCCGT TTCACCAGAC ATAACCAGCT

1321 CGCAGAGCAC AAAGTTGAAG GAGGAGGAGG TTCATTGATA TTCAGATAAT

1381 GGTGAGTAGT TTGCAGTCAG CGAAATTGAA TGTGGAGTCA TTAATAATCT

1441 CATCAGCACC ACTGTCCACC AAATIAAAAC CACCTTGAAC CTGCTTGA 根据 SEQ ID NO: 10序列检索分析， SEQ ID NO: 10 不是 Γ /Ζ½Ζ/Ρ-3的全长 序列。 需进一步进行 5'RACE， 从而获取基因全长。 根据 SEQ ID NO: 10序列， 设 计如下三条特异性引物， 作为反转录引物及 5'RACE的特异性引物。

YLS-120GSP1 : SEQ ID NO: 11 :

GCTCTGCAGATTTGACCGAG

腹厘¾ AAS i

YLS-120GSP2: SEQ ID NO: 12:

GCATATCAACAAGGGTCATAGC ϋ=

YLS-120 GSP3 : SEQ ID NO: 13 :

AACTTGGTTTTATCAGACATAG 实验步骤按试剂盒说明书操作 （5' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends试剂盒购自 Invitrogen公司）。

以 YLS-120GSP1(SEQ ID NO: 11)为反转录引物，以小盐芥 mRNA为模板进行反转录， 获得 cDNA模板， 然后按照上述 5' RACE试剂盒说明书中的步骤加 Poly C尾， 以加尾后 的产物为模板进行第一轮 PCR扩增，所用引物为 SEQ ID NO: 11与通用引物 SEQ ID NO: 7 (试剂盒自带， I 为次黄嘌吟修饰的 a、 c、 g或 t)， 具体步骤如下：

50 μΐ PCR反应体系： 5 μΐ ΙΟ Εχ Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP， 2.0 μΐ mRNA反转录 的 cDNA, 1.0 μΐ Ex Taq (购自 TAKARA)、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 11和 SEQ ID NO: 7各 2.0 μ1， 以及 35 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环（ 94°C 变性 50秒， 56°C退火 50秒， 72°C 延伸 90秒）， 72 °C 延伸 10分钟。

所得的 PCR产物用双蒸水稀释 50倍后取 2.0 μΐ作为模板，用 SEQ ID NO: 12与通用 引物 SEQ ID NO: 8进行第二轮 PCR扩增， 具体步骤如下：

50 μΐ PCR反应体系： 5 μΐ ΙΟ Εχ Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP， 2.0 μΐ稀释的第一轮 PCR产物， 1.0 l Ex Taq、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 12和 SEQ ID NO: 8各 2.0 μ1， 以及

35 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环（ 94 °C 变性 50秒， 50 退火 50秒， 72°C 延伸 90秒）， 72 V 延伸 10分钟。 回收第二次 PCR产物中约为 l . lKbp 大小的条带 （Gel Extraction Kit购自 OMEGA) , 并将其连接到 pGEM-T Easy Vector, 然 后转化到 JM109 (具体方法同上）， 随机挑取 6个白色菌落分别接种于含有 50 μ /ηιΣ氨苄 青霉素的 LB 液体培养基中培养， 37°C培养过夜后加甘油至终浓度 20% (v/v) , -80°C保 存备用。 用引物 SEQ ID NO: 12与 3 '端引物 SEQ ID NO: 13进行菌液 PCR扩增 （反应体 系及反应条件同上）， 得到 6个阳性克隆， 送英潍捷基 （上海） 贸易有限公司测序测序， 获得该基因的 cDNA的一段 5 '端序列。

所得的 5 'RACE产物克隆子测序获得序列为 SEQ ID NO : 14：

1 GGGGGGGGGG ATGGAGTTTC TGGGCGACAG CCAAAATCAC GACAGTTCTG AAATGGACAA

61 GAGGAAGAAG AAGAAGCGAT T CACCGCCA CACACCTCAC CAGATCCAAC GCCTGGAATC

121 AACTTTCAAT GAGTGTCAAC ATCCAGATGA GAAACAGAGG TGCAACTTA GCAGAGAATT

181 GGGTTTAGCT CCAAGACAGA TCAAGTTTTG GTTTCAGAAC AGAAGAACAC AAAAGAAGGC 241 ACAACAGGAG AGAGCTGATA ACTGTGCACT CAAGGAAGAG AATGATAAGA TCGT GCGA

301 AAACATTGCG ATTAGAGAAG CTATAAAACA CGCCAT TGC CCTAACTGTG GTGATTCTCC

361 GTTAA GAA GACTCTTACT TTGATGAACA GAAGCTTCGA ATCGAAAATG CACAGCTAAG

421 ACAAGAGCTT GAAAGGGTTT CAAGCATTGC AGCTAAATTC ATAGGACCTC TGCTCATCT

481 CCCACCAATA CTAAATCCGA TGCACATTTC GCCATCAGAG TTATTCCATA GTGGTCCTTC 541 GCTTGATTTT GATCTTCTTC CAGGAAGTTG TTCTTCAA G GCTACTGTTC CTAATTTACC

601 ATCTCAGCCA AACTTGGTTT TATCAGACAT AGATAAGTCT CTTATGACCA GCATGGCTGT

661 GACCGCTATC GAAGAATTGC TTAGGCTCAC ACAAACAAAT GAGCCTCTAT GGATCAAAAC

721 GGATGGATGC AGAGAAATTC TCAATCTCGA AAGCTATGAG AATATATTCT CAAGATCAAG

781 TAGCCG GGA GGAAAGAACC ATAACC TCG AAAGGAAGCA TCTAGATTTT CTGGGGTTGT 841 TTTCACIAAT GCTATGACCC TTGTTGATAT GC 将 5 'RACE获得的序列 SEQ ID NO : 14， 与获得的拼接序列 SEQ ID NO : 10拼接， 得 SEQ ID NO: 15：

1 GGGGGGGGGG ATGGAGTTTC TGGGCGACAG CCAAAATCAC GACAGTTCTG AAATGGACAA 61 GAGGAAGAAG AAGAAGCGAT T CACCGCCA CACACCTCAC CAGATCCAAC GCCTGGAATC

121 AACTTTCAAT GAGTGTCAAC ATCCAGATGA GAAACAGAGG TTGCAACTTA GCAGAGAATT

181 GGGTTTAGCT CCAAGACAGA TCAAGTTTTG GTTTCAGAAC AGAAGAACAC AAAAGAAGGC

241 ACAACAGGAG AGAGCTGATA ACTGTGCACT CAAGGAAGAG AATGATAAGA TCGT GCGA

301 AAACATTGCG ATTAGAGAAG CTATAAAACA CGCCAT TGC CCTAACTGTG GTGATTCTCC 361 GTTAA GAA GACTCTTACT TTGATGAACA GAAGCTTCGA ATCGAAAATG CACAGCTAAG

421 ACAAGAGCTT GAAAGGGTTT CAAGCATTGC AGCTAAATTC ATAGGACCTC TGCTCATCT

481 CCCACCAATA CTAAATCCGA TGCACATTTC GCCATCAGAG TTATTCCATA GTGGTCCTTC

541 GCTTGATTTT GATCTTCTTC CAGGAAGTTG TTCTTCAATG GCTACTGTTC CTAATTTACC

601 ATCTCAGCCA AACTTGGTTT TATCAGACAT AGATAAGTCT CTTATGACCA GCATGGCTGT 661 GACCGCTATC GAAGAATTGC TTAGGCTCAC ACAAACAAAT GAGCCTCTAT GGATCAAAAC

721 GGATGGATGC AGAGAAATTC TCAATCTCGA AAGCTATGAG AATATATTCT CAAGATCAAG

781 TAGCCG GGA GGAAAGAACC ATAACC TCG AAAGGAAGCA TCTAGATTTT CTGGGGTTGT

841 TTTCACIAAT GCTATGACCC TTGTTGATAT GCTCATGGAC TCGGTCAAAT CTGCAGAGCT 901 T TTCCCTCA ATTGTTGCAA CATCTAAAAC CCTTGCAG G ATTTCATCCA GCTTGCGCGG

961 AAACCG GCA GA GCATTGC ATTTGATGCT TGAAGAGCTT CAAGTGCITT CCCCATTGGT

1021 ACCGACGCGT GAGTTCTGCG GGCTAAGATA TTGTCAGCAA ATACAACATG GAACTTGGGC

1081 AATTGTAAAT GTCTCCTATG AGTTCCCTCA GTTTATATCT CAT CTCGGT CGTATCGGTA

1141 TCCTTCTGGT TGCTTGATTC AAGACATGTC CAATGGCTAT TCCAAGGTTA T TGGGTCGA

1201 ACATGTTGAT ACGGAGGAGC AAGAAGCGGT TCACGAGA G TTTAAAGATA ATGTCCGTCA

1261 AGGATTAGCT TTTGGAGCTG AACGT GGAT CGCTACTCTC CAAAGAATGT GCGAGAGATT

1321 CAAGACTGTA CTAGAACCCG CAACATCTTC CCGCGATCTC AAAGGAGTGA TTCCATCTCT

1381 GGAAGGGAAG AGAAGTATAA TGAGACTATC TCAAAGAA G GTAAGCAACT TTGCTTGAG

1441 CGTTGGCACA TCTAACAACA ATCGCTCAAC GGTTATTTCC GGGT GGACG AGTTTGGAAT

1501 CGGTGTGACC TCGTATAAGA GTCAGCATGA ACCAAATGGA ATGGTTCTAT GTGCAGCCAC

1561 TAGTTTCTGG CTCCCAATTT CTCCACAAAA CGTC TCAAT TTCCTCAAAG ATGAAAGAAC

1621 TGGGCCACAG TGGGACGT C T TCGAATGG AAATTCTGTT CAAGAAGTTG CTCATATCGC

1681 AAACGGCTCA CACCCTGGAA ACTGCATTTC GGT CTCCGC GGATTCAATG CATCTTCATC

1741 ACAAAACAAC ATGCTGATTC TACAAGAAAG CTGCGTAGAC TCATCAGGCT CGCTTGTGGT

1801 GTACACTCGG GTGGATCTAC CAGCACTGAA CATGGCAA G AGCGGTCAAG ACACATCTTA

1861 TGTTCCCATT CTACCCTCGG GT TGGCCGT TTCACCAGAC GGAACCAGGA ATAACCAGCT

1921 CGCAGAGCAC AAAGTTGAAG GAGGAGGAGG TTCATTGATA ACGGTTGG T TTCAGATAAT

1981 GGTGAGTAGT TTGCAGTCAG CGAAAT GAA TGTGGAGTCA ATGGAAACAG TTAATAATCT

2041 CATCAGCACC ACTGTCCACC AAATIAAAAC CACCTTGAAC TGTCCTTCAA CTGCTTGA 根据 SEQ ID NO: 15序列检索分析， SEQ ID NO: 15 为：^^^^/^-^的全长序列。 根据 SEQ ID NO: 15 序列设计一对引物如下： ThHDbZIP-3F ( SEQ ID NO: 16 ) ： ATGGAGTTTCTCGGCGACAG

ThHDbZIP-3R ( SEQ ID NO: 17 ) ： TCAAGCAGTTGAAGGACAGTTC AP ( SEQ ID NO: 18 ) ：

GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT 通过 SEQ ID NO: 16和 SEQ ID NO: 17来克隆 ThHDbZIP-3全长编码序列。

提取小盐芥 RNA， 以引物 SEQ ID NO: 18为反转录引物， 获取小盐芥 cDNA .采 用 Stratagene的 PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase, 以小盐芥的 cDNA为模板进行 PCR反应。 50 μΐ PCR反应体系： 5 μΐ lO PfuUltra II reaction Buffer, 0.5 μΐ 25 mM的 dNTP, 2.0 μΐ cDNA, 1.0 μΐ PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 16和 SEQ ID NO: 17各 2.0 μ1， 以及 37.5 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 95 °C预 变性 2分钟， 35个循环（95 °C 变性 25秒， 58 °C退火 25秒， 72°C 延伸 1分钟）， 72 °C 延伸 5分钟。 PCR扩增产物加 A尾： PCR产物补水至 400 μ1， 先用氯仿抽一遍去除蛋白， 吸取 上清加入 3Μ 醋酸钠溶液 40 μ1， 加 2倍的无水乙醇， -20°C放置 10分钟， 离心， 去上 清， 晾干， 用 21 μΐ双蒸水溶解。 加入 2.5 μΐ ΙΟχΕχ Buffer, 0.5 μΐ 5 mM的 dATP ， 1.0 μΐ Ex Taq。 反应条件： 70°C反应 30分钟。 将得到约 2.1Kbp的 DNA片段回收（Omega 回收试剂盒） ， 连接至 pGEM T-easy载体上 （得到 7¾HZ½Z/P-3-pGEM质粒） ， 然后 转化 JM109,随机挑取 6个白色菌落分别接种于含有 50 g/mL氨苄青霉素的 LB 液体 培养基中培养， 37°C培养过夜后加甘油至终浓度 20% ( v/v) ， -80°C保存备用。 用引 物 SEQ ID NO: 16与 SEQ ID NO: 17进行菌液 PCR扩增（反应体系及反应条件同上）， 得到 6个阳性克隆，送至英潍捷基（上海）贸易有� �公司测序，序列为 SEQ ID NO: 2， 其编码的蛋白的氨基酸序列为 SEQ ID NO: 1

HDbZIP-3蛋白的氨基酸序列： SEQ ID NO: 1

1 MEFLGDSQNH DSSE DKRKK KKRFHRHTPH QIQRLESTFN ECQHPDEKQR LQLSRELGLA

61 PRQIKFWFQN RRTQKKAQHE RADNCALKEE NDKIRCENIA IREAIKHAIC PNCGDSPVME

121 DSYFDEQKLR IENAQLRQEL ERVSSIAAKF IGPLAHLPPI LNPMHISPSE LFHSGPSLDF 181 DLLPGSCSSM ATVPNLPSQP NLVLSDIDKS LM SIAVTA EELLRLTQTN EPLWIK DGC

241 REIL LESYE NIFSRSSSRG GKNHNLRKEA SRFSGWFTN AMTLVDMLMD SV SAELFPS

301 IVATSK LAV ISSSLRG RA DALHLMLEEL QVLSPLVP R EFCGLRYCQQ IQHGTWAIV

361 VSYEFPQFIS HSRSY YPSG CLIQDMSNGY SKVIWVEHVD TEEQEPVHE FKDNVRQGLA

421 PGAERWIATL QR CERFK L LEPATSSRDL KGVIPSLEGK RSIMRLSQR VSNFCLSVGT 481 SNNNRSTVIS GLDEFGIRVT SY SQHEPNG MVLCAATSFW LPISPQNVFN FLKDERTRPQ

541 WDVLSNGNSV QEVAHIA GS HPGNCISVLR GFNASSSQ N MLILQESCVD SSGSLWYTP

601 VDLPAL MAM SGQDTSYVPI LPSGFAVSPD GTRNNQLAEH KVEGGGGSLI TVGFQIMVSS

661 LQSAKL VES METVNNLIST TVHQIK TLN CPSTA

ThHDbZIP-3编码基因的核苷酸序列： SEQ ID NO：

ATGGAGTTTC TGGGCGACAG CCAAAATCAC GACAGTTCTG AAATGGACAA GAGGAAGAAG

61 AAGAAGCGAT T CACCGCCA CACACCTCAC CAGATCCAAC GCCTGGAATC AACTTTCAAT

121 GAGTGTCAAC ATCCAGATGA GAAACAGAGG TTGCAACTTA GCAGAGAATT GGGTTTAGCT

181 CCAAGACAGA TCAAGTITTG GTTTCAGAAC AGAAGAACAC AAAAGAAGGC ACAACACGAG

241 AGAGCTGATA ACTG GCACT CAAGGAAGAG AATGATAAGA TCGT GCGA AAACATTGCG

301 ATTAGAGAAG CTATAAAACA CGCCAT TGC CCTAACTGTG GTGATTCTCC TGTTAATGAA

361 GACTCTTACT TTGA GAACA GAAGCTTCGA ATCGAAAATG CACAGCTAAG ACAAGAGCTT

421 GAAAGGGTTT CAAGCATTGC AGCTAAATTC ATAGGACCTC TTGCTCATCT CCCACCAATA

481 CTAAATCCGA TGCACATTTC GCCATCAGAG TTATTCCATA GTGGTCCTTC GCTTGATTTT

541 GATCTTCTTC CAGGAAGTTG TTCTTCAATG GCTACTGTTC CTAATTTACC ATCTCAGCCA

601 AACTTGGTTT TATCAGACAT AGATAAGTCT CTTATGACCA GCATGGCTGT GACCGCTATG

661 GAAGAATTGC TTAGGCTCAC ACAAACAAAT GAGCCTCTAT GGATCAAAAC CGATGGATGC

721 AGAGAAATTC TCAATCTCGA AAGCTATGAG AATATATTCT CAAGATCAAG TAGCCGTGGA

781 GGAAAGAACC ATAACC TCG AAAGGAAGCA TCTAGATTTT CTGGGGTTGT TTTCACTAAT

841 GCTATGACCC TTGTTGATAT GCTCA GGAC TCGGTCAAAT CTGCAGAGCT TTTTCCCTCA

901 ATTGTTGCAA CATCIAAAAC CCTTGCAGTG ATTTCATCCA GCTTGCGCGG AAACCGTGCA 961 GA GCATTGC ATTTGATGCT TGAAGAGCTT CAAGTGCITT CCCCATTGGT ACCGAGGCGT 1021 GAGTTCTGCG GGCTAAGATA TTGTCAGCAA ATACAACA G GAACTTGGGC AATTGTAAAT 1081 GTCTCCTATG AGTTCCCTCA GTTTATATCT CAT CTCGGT CGTATCGGTA TCCTTCTGGT 1141 TGCTTGATTC AAGACATGTC CAATGGCTAT TCCAAGGTTA T TGGGTCGA ACATGTTGAT 1201 ACGGAGGAGC AAGAACTGGT TCACGAGATG TTTAAAGATA ATGTCCGTCA AGGATTAGCT 1261 TTTGGAGCTG AACG TGGAT GGCTACTCTC CAAAGAATGT GCGAGAGATT CAAGACTCTA 1321 CTAGAACCCG CAACATCTTC CTGCGATCTC AAAGGAGTGA TTCCATCTCT GGAAGGGAAG 1381 AGAAGTATAA TGAGACTATC TCAAAGAATG GTAAGCAACT TTGC TGAG CGT GGCACA 1441 TCTAACAACA ATCGCTCAAC GGTTATTTCC GGGTTGGAGG AGTTTGGAAT CCGTGTGACC 1501 TCGTATAAGA GTCAGCATGA ACCAAA GGA ATGGTTCTAT GTGCAGCCAC TAGTTTCTGG 1561 CTCCCAATTT CTCCACAAAA GGTCTTCAAT TTCCTCAAAG ATGAAAGAAC TCGGCCACAG 1621 TGGGACGT C T TCGAATGG AAATTCTGTT CAAGAAGTTG CTCATATCGC AAACGGCTCA 1681 CACCCTGGAA ACTGCATTTC GGTTCTCTGC GGATTCAA G CATCTTCATC ACAAAACAAC 1741 ATGCTGATTC TACAAGAAAG CTGCGTAGAC TCATCAGGCT CGCTTGTGGT CTACACTCCG 1801 GTGGATCTAC CAGCACTGAA CATGGCAATG AGCGGTCAAG ACACATCTTA TGTTCCCATT 1861 CTACCCTCGG GT TCGCCGT TTCACCAGAC GGAACCAGGA ATAACCAGCT CGCAGAGCAC 1921 AAAGTTGAAG GAGGAGGAGG TTCATTGATA ACGGT GGTT TTCAGATAAT GGTGAGTAGT 1981 TTGCAGTCAG CGAAAT GAA GTGGAGTCA ATGGAAACAG TTAATAATCT CATCAGCACC 2041 ACTGTCCACC AAATTAAAAC CACCTTGAAC TGTCCTTCAA CTGCTTGA 实施例 3 7¾HZ)6ZHV?基因植物表达载体构建

选择植物双元表达载体 pCAMBIA2300 (购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司） 作为植物表达载体， 用 Pnos启动子替换 ΝΡΤΠ基因含双增强子的 35S启动子， 以降低 ΝΡΤΠ蛋白在植物中的表达。 选择含双增强子的 35S启动子及终止子 Tnos分别作为 ThHDbZIP-3基因的启动子和终止子。

用引物 SEQ ID NO: 19和 SEQ ID NO: 20以植物表达载体 pBI121 (购自北京华夏 远洋科技有限公司） 为模板扩增 Pnos， 采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μ1 ΡΟ 反应体系： 10 μΐ 5 xPS Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP， 1.0 μΐ ρΒΙ121 , 1.0 μΐ PrimeSTAR、 10 μΜ的引物 SEQ ID ΝΟ: 19和 SEQ ID NO: 20各 2.0 μ1， 以及 31 μΐ的双 蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环（94°C变性 30秒， 56°C退火 30 秒， 72°C延伸 30秒）， 72°C延伸 10分钟。 通过 EcoRI、 Bglll酶切后将所得 PCR产物 连接到 pCAMBIA2300 (Promega, T4连接酶盒)获得 pCAMBIA2300-l。

SEQ ID NO: 19：

GCACGAATTCATACAAATGGACGAACGGAT SEQ ID NO: 20：

ATCCAGATCTAGATCCGGTGCAGATTATTTG

SEQ ID NO: 21禾 P SEQ ID NO: 22以 pBI121为模板扩增 Tnos, 采用 TaKaRa的

PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μΐ PCR反应体系： 10 μΐ 5 ><PS Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP, 1.0 μΐ pBI121 , 1.0 μΐ Prime STAR、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 21禾 P SEQ ID NO:

22各 2.0 μ1， 以及 31 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环 (94°C 变性 30秒， 58°C退火 30秒， 72°C延伸 30秒）， 72 °C 延伸 10分钟。 通过 Sacl、 EcoRI 酶切后将所得 PCR 产物连接到 pCAMBIA2300-lCPromega T4 连接酶盒）获得 pCAMBIA2300-2。

SEQ ID NO: 21：

AAGGAGCTCGAATTTCCCCGATCGTTCAAA SEQ ID NO: 22：

TCAGAATTCCCAGTGAATTCCCGATCTAGTA SEQ ID NO: 23和 SEQ ID NO: 24以 pCAMBIA2300质粒为模板扩增拟南芥 35S 启动子。采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μΙ ΡΟ 反应体系： 10 μΐ 5 xPS Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP, 1.0 μΐ稀释 50倍的 pCAMBIA2300质粒， 1.0 μΐ PrimeSTAR、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 23禾 P SEQ ID NO: 24各 2.0 μ1， 以及 31 μΐ的双蒸水。 PCR 反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环 (94 °C变性 30秒， 50°C退火 30秒， 72°C延 伸 30秒；)， 72°C延伸 10分钟。 通过 HindIII、 Pstl酶切后将所得 PCR产物连接到 （连 接方法同上） pCAMBIA2300-2获得 pCAMBIA2300-3

SEQ ID NO: 23：

ACTAAGCTTATGGTGGAGCACGACACTCT SEQ ID NO: 24：

TGACTGCAGAGAGATAGATTTGTAGAGAGAGAC

SEQ ID NO: 25和 SEQ ID NO: 26扩增 ThHDbZIP-3 (模板是实施例 2所获得的阳 性 ThHDbZIP-3-pGEM质粒），采用 Stratagene的 PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase。 50 μΐ PCR反应体系： 5 μΐ lOxPfuUltra II reaction Buffer, 0.5μ1 25 mM的 dNTP, 2.0 μΐ ThHDbZIP-3-pGEM质粒， 1.0 μΐ PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 25禾 P SEQ ID NO: 26各 2.0 μ1， 以及 37.5 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 95 °C预变性 2分钟， 35个循环 (95 °C变性 25秒， 58 °C退火 25秒， 72°C延伸 1分钟， 72°C延伸 5分钟。 通过 Sall、 Smal酶切后将所得 PCR产物连接 （连接方法同上） 到 pCAMBIA2300-3 , 获得植物表达载体 35S-7¾HZ½Z P-3-2300。

SEQ ID NO: 25：

GCGTCGAC ATGGAGTTTCTCGGCGACAG SEQ ID NO: 26：

CCCCCGGGTCAAGCAGTTGAAGGACAGTTC 实施例 4 35S-ThHDbZIP-3-23 表达载体转化农杆菌

农杆菌 LBA4404 (购自 Biovector Science Lab, Inc) 感受态细胞的制备： 提前 1-2 天将农杆菌 LBA4404在含 50 g/ml利福平和 50 g/ml链霉素的 LB固体培养基上划单斑 接种， 28°C培养 1至 2天。挑取单菌落接种于 5 ml含 50 μ _§ /ιη1利福平和 50 μ _§ /ιη1链霉素 的 LB液体培养基中， 28°C下摇动培养过夜 (约 12-16小时)至 OD _6(K) 值为 0.4， 形成种子菌 液。 取 5 ml活化后的菌液 （1 :20的比例）接种于 100 ml同样浓度抗生素的 LB液体培养 基中， 28°C摇动培养 2-2.5小时至 OD _6(K) =0.8。 冰浴菌液 10分钟， 每隔 3分钟摇匀一次， 使细菌均匀进入休眠状态。 于 4°C下 4000 g离心 10分钟， 弃上清液； 加入 10 ml冰预冷 的 10% (v/v)甘油重悬浮菌体， 4°C下 4000 g离心 10分钟， 收集沉淀； 用冰预冷的 10% (v/v) 甘油重复洗 3-4次； 加入 4 ml冰浴预冷的 10% (v/v) 甘油重新悬浮细菌沉淀， 以 40 μΐ/管将其分装， 于 -70°C保存备用。

转化农杆菌： 在冰上融化感受态细胞， 往 40 μΐ的感受态细胞中加入 1 μΐ实施例 3 中所得的阳性 35S-7¾HZ½Z/P-3-2300质粒，混匀后冰浴约 10分钟。将所述感受态细胞和 质粒 DNA的混合物用移液枪转移到冰预冷的电击杯中 ， 轻敲使悬浮液到达底部，注意不 要有气泡。 将电击杯（购自 Bio-Rad)放到电击室的滑道上， 推动滑道将电击杯放至电击 室基座电极处。 使用 0.1 cm规格的电击杯， MicroPuMUer (购自 Bio-Rad)的程序设置为 "Agr"， 电击一次 。 立即取出电击杯， 加入 28 °C预热的 1 ml LB培养基。 快速而轻柔的 用移液枪将细胞打匀。将悬浮液转入 1.5 ml的离心管，在 28°C下， 225 rpm培养 1小时。 取 100 - 200 μΐ的菌液涂布于相应的抗性筛选培养基平板� �（LB固体培养基，含 50 μ _§ /ιη1 利福平、 50 μ _§ /ιη1链霉素、 50 μ _§ /ιη1卡那霉素）， 28°C培养。 筛选阳性转化克隆， 并将其 菌液于 -70°C保存备用。 实施例 5利用农杆菌介导的转化法获得转基因拟南芥

待转化植株培养： 拟南芥种子 （哥伦比亚型， 来自美国俄亥俄州立大学的拟南芥生 物资源中心） 播种在泥炭土中， 经 4°C低温处理 3天后， 置于 23 °C、 16小时光照 /8小时 黑暗的培养箱中发芽。 7 - 10天后移栽到装有泥炭土和蛭石（体积比 3 : 1 )的口径为 7.5 cm 的塑料钵中， 每钵栽种 6株， 置于 23 °C， 16小时光照 /8小时黑暗的培养箱中生长。 移 栽前每钵浇营养液 40 ml，移栽后视土壤湿度及时补充水分。在生长� ��间适当浇灌营养液。 按需要每 3-4周一次 （或者时间更长）。 为了在每个植株上得到较多的花芽， 当大多数植 株第一个花序形成后剪去第一个花序， 解除顶端优势， 促使多个次生花序的同步出现。 当大多数花序约 1 - 10 cm高 （剪去第一个花序后 4 - 8天） 时准备浸染。

农杆菌的培养： 取出实施例 4中保种的农杆菌阳性转化克隆的菌液活化后� � 挑取农 杆菌单菌落接种到 10 mL无菌 LB液体培养基中 （含 75 mg/ L利福平、 100 mg/ L链霉素 和 100 mg/L卡那霉素）， 28 °C恒温下 250转 /分钟振摇过夜培养。再将所得到的菌液按 1% - 2% (v/v)的比例接种到 200 mL同样含上述抗生素的 LB液体培养基中， 28 °C恒温振摇 使农杆菌的浓度达到 OD _6(K) =1.8， 然后在 4°C下 3000转 /分钟离心 15分钟， 弃去上清液后 用浸染培养基（该浸染培养基含有 5.0% (w/v)的蔗糖和 0.05% ( 500 μΙΤθ的 Silwet L-77 ) 重新悬浮农杆菌， 悬浮至 0D _6(K) 约 0.80。

花序的浸染： 将上述含农杆菌的浸染培养基加入大口容器中 ， 每个口径 9 cm的容器 中加入 200 - 300 mL所述含农杆菌的浸染培养基用于浸染。 将植株倒置， 使地上组织全 部浸没在农杆菌悬浮液中 3 - 5秒， 并要轻轻搅动。 浸润后植株上应该有一层液体膜。 浸 染过的植株放在塑料盘中， 用干净的塑料或保鲜膜覆盖以保湿， 然后放置在弱光或暗处 过夜， 注意小心防止阳光直射植株。 处理后约 12 - 24小时去掉覆盖。 正常培养植株， 植 株进一步生长 3 - 5周， 直至角果变褐变干。 收获种子， 并将种子用离心管在 4 °C下干燥 贮存。

转基因种子筛选:配制含 1/4 MS大量元素的水溶液，加入 0.8 % 琼脂粉，用微波炉加 热至琼脂完全溶化， 待冷却到 50°C左右， 加入所需量的终浓度为 50 rn U ¹ 的卡那霉素， 摇匀后每培养皿中倒入 25 mL, 置实验台冷却凝固后即可播种。 把称量好的种子倒在一 张普通复印纸上， 用手指轻敲复印纸， 将种子均匀地播种在琼脂胶上， 盖上培养皿盖， 置 4 °C冰箱冷处理 72小时后， 移至 23 °C、 16小时光照 /8小时黑暗的培养箱中发芽， 定 期统计种子发芽和幼苗生长情况， 将抗性幼苗及时移栽到营养土中。 移栽后视土壤湿度 及时补充水分。在生长期间适当浇灌营养液。 取生长 20天的拟南芥叶片 0.1 g，提取 DNA， 用 SEQ ID NO: 16：和 SEQ ID NO: 17扩增 ThHDbZIP-3 ( 50 μΐ PCR反应体系： 5 μΐ ΙΟ Εχ Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP， 2.0 μΐ DNA, 1.0 μΐ Ex Taq、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 16 和 SEQ ID NO: 17各 2.0 μ1， 以及 35 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环 （94°C 变性 45秒， 58 °C退火 45秒， 72°C 延伸 90秒）， 72 °C 延伸 7分钟）， 将 PCR鉴定为阳性的植株进行编号 （T101-T1012 ) , 并保存。 实施例 6 过表达 ThHDbZIP-3的转基因拟南芥 T1代植株的耐旱模拟实验及功能鉴 定

灭过菌的蛭石用 1/2MS培养基浸透。 T101-T106及对照拟南芥种子分别播种在蛭石 上，每盆播种 10颗种子，25 °C、10小时光培养 /14小时暗培养循环，每 7天浇一次 1/2MS, 培养 20天之后， 每盆保留大小较一致的 4-5棵苗， 用于干旱实验。 转基因拟南芥、 对照 拟南芥干旱 14天 （不浇水)， 25 °C、 10小时光培养 /14小时暗培养循环。 T1代转基因植 株 （TO代转基因植株的种子长成的植株） 的抗旱性鉴定表明， 对照植株都萎蔫严重， 而 T101、 Τ102、 Τ103、 Τ104、 Τ105、 T106六个株系共 26棵 （每株系各 4-5棵） 拟南 芥中 22棵能够存活并继续生长显现出明显的耐旱性 （参见图 3a和 3b， 以 T106为例， T101、 T102、 T103、 TIC 4、 T105 的结果与 T106类似， 在此未示出）。

实施例 7干旱胁迫后 ABA变化的测定

ABA是公认的与逆境胁迫相关的一种植物激素， 可以作为信号分子调控多个逆境诱 导基因的表达， 从而提高植物的抗逆能力。 我们取干旱胁迫 10天和正常生长条件下的转 基因植株 （T101、 Τ102、 Τ103、 Τ104、 Τ105、 T106)及对照植株 （CK) 叶片各 0.2 g 左右， 用植物激素脱落酸 (ABA)酶联免疫 （ELISA) 试剂盒 (购自上海锐谷生物科技有限 公司） 测定 ABA含量 （见图 4)。 实验结果表明， 无论干旱处理还是对照条件下， 转基因 植株的 ABA含量均高于对照（CK)，证明 ThHDbZIP-3基因可以正调控植物内源的 ABA 实施例 8在转录水平上验证 ThHDbZIP-3蛋白表达

分别取对照拟南芥植株、 耐旱转基因拟南芥 T1 代植株 （分别属于 T101、 Τ102、

Τ103、 Τ104、 Τ105、 T106六个株系） 和不耐旱转基因拟南芥 Τ1代植株的干旱 10天 的叶片各 0.05 g， 用植物 RNA提取试剂盒 （Invitrogen)提取的总 RNA。 用 HITACHI公 司的紫外分光光度计 U-2001测定总 RNA在 260 nm和 280 nm的吸光度值，计算各个 RNA 浓度。 依照 Invitrogen反转录试齐 Ll盒 Superscript III Reverse Transcriptase所示方法进行反 转录（2 μ _β 总 RNA作为模板， 反转录引物 SEQ ID NO: 18)。通过 SEQ ID NO: 16和 SEQ ID NO: 17扩增 ThHDbZIP-3， 检测 HDbZIP-3蛋白相对表达情况。

采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶，以反转录的 cDNA为模板进行 PCR 反应。 50 μ1 ΡΟ 反应体系： 10 μΐ 5 xPS Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP， 2.0 μΐ cDNA, 1.0 μΐ PrimeSTAR 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 16禾 Ρ SEQ ID ΝΟ: 17各 2.0 μ1， 以及 30 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 29个循环 （94 °C变性 45秒， 58 °C 退火 45秒， 72°C延伸 2分钟） ， 72°C延伸 10分钟。

产物电泳结果如图 5所示： M为 DNA Ladder Marker (DL2000, TakaRa) ， 1-6 为耐旱转基因拟南芥 T1代植株（依次为： T101、T102、T103、T104、T105、T106)，

7-11， 为不耐旱转基因拟南芥 T1代植株， 12-16为非转基因拟南芥对照。 图中所示 PCR产物电泳条带大小与 7¾HZ½Z/P-3的大小一致 （约 2.1Kbp) 。 结果表明， 对照 拟南芥没有 ThHDbZIP-3转录， 耐旱转基因拟南芥 T1代植株中 ThHDbZIP-3的转录 较强， 不耐旱转基因拟南芥 T1代植株转录很弱。