以下、式(I)、(IA)及び(II)で表される化合物� �化合物(I)、(IA)及び(II)という。他の式番号の 化合物についても同様である。
 式(I)、(IA)及び(II)の各基の定義において、
 低級アルキル、低級アルコキシ、低級アル� ��キシカルボニル、低級アルキルアミノ、ジ� ��級アルキルアミノ、低級アルキルアミノカ� ��ボニル、ジ低級アルキルアミノカルボニル� ��び低級アルキルスルホニルの低級アルキル� ��分としては、例えば直鎖または分枝状の炭� ��数1~8のアルキルが挙げられ、具体的にはメ� ��ル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブ� ��ル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、イ� ��ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプ� ��ル、オクチル等が挙げられる。ジ低級アル� ��ルアミノ及びジ低級アルキルアミノカルボ� ��ルにおける2個の低級アルキル部分は同一で も異なっていてもよい。

 低級アルケニルとしては、例えば直鎖また� ��分枝状の炭素数2~8のアルケニルが挙げられ� ��具体的にはビニル、アリル、1-プロペニル� �メタクリル、クロチル、1-ブテニル、3-ブテ� ��ル、2-ペンテニル、4-ペンテニル、2-ヘキセ� ��ル、5-ヘキセニル、2-ヘプテニル、2-オクテ� ��ル等が挙げられる。
 低級アルキニルとしては、例えば直鎖また� ��分枝状の炭素数2~8のアルキニルが挙げられ� ��具体的にはエチニル、プロピニル、ブチニ� ��、ペンチニル、ヘキシニル、ヘプチニル、� ��クチニル等が挙げられる。

 低級アルカノイル及び低級アルカノイルオ� ��シの低級アルカノイル部分としては、例え� ��直鎖または分枝状の炭素数1~7のアルカノイ� ��が挙げられ、具体的にはホルミル、アセチ� ��、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル� ��バレリル、イソバレリル、ピバロイル、ヘ� ��サノイル、ヘプタノイル等が挙げられる。
 シクロアルキルとしては、例えば炭素数3~8� ��シクロアルキルが挙げられ、具体的にはシ� ��ロプロピル、シクロブチル、シクロペンチ� ��、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シク� ��オクチル等が挙げられる。

 アリール、アリールスルホニル、アリール� ��キシ及びアロイルのアリール部分としては� ��例えば炭素数6~14の単環式、二環式または三 環式のアリールが挙げられ、具体的にはフェ ニル、インデニル、ナフチル、アントリル等 が挙げられる。
 アラルキルとしては、例えば炭素数7~15のア ラルキルが挙げられ、具体的にはベンジル、 フェネチル、ベンズヒドリル、ナフチルメチ ル等が挙げられる。

 芳香族複素環基としては、例えば窒素原� ��、酸素原子及び硫黄原子から選ばれる少な� ��とも1個の原子を含む5員または6員の単環性� ��香族複素環基、3~8員の環が縮合した二環ま� ��は三環性で窒素原子、酸素原子及び硫黄原� ��から選ばれる少なくとも1個の原子を含む縮 環性芳香族複素環基等が挙げられ、具体的に はピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピ リダジニル、キノリニル、イソキノリニル、 フタラジニル、キナゾリニル、キノキサリニ ル、ナフチリジニル、シンノリニル、ピロリ ル、ピラゾリル、イミダゾリル、トリアゾリ ル、テトラゾリル、チエニル、フリル、チア ゾリル、オキサゾリル、インドリル、インダ ゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾトリア ゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾ リル、プリニル、ベンゾジオキソラニル等が 挙げられる。

 複素環基、複素環アルキル、複素環アル� ��ルオキシ及び複素環カルボニルの複素環基� ��分としては、例えば前記芳香族複素環基の� ��義で挙げた基に加え、脂環式複素環基が挙� ��られる。脂環式複素環基としては、例えば� ��素原子、酸素原子及び硫黄原子から選ばれ� ��少なくとも1個の原子を含む5員または6員の� ��環性脂環式複素環基、3~8員の環が縮合した� ��環または三環性で窒素原子、酸素原子及び� ��黄原子から選ばれる少なくとも1個の原子を 含む縮環性脂環式複素環基等が挙げられ、具 体的にはピロリジニル、ピペリジノ、ピペラ ジニル、ピペラジニル、モルホリノ、モルホ リニル、チオモルホリノ、チオモルホリニル 、ホモピペリジノ、ホモピペラジニル、ホモ ピペラジニル、テトラヒドロピリジニル、テ トラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキ ノリニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒ ドロピラニル、ジヒドロベンゾフラニル、オ キソピペラジニル、2-オキソピロリジニル、� ��キソラニル、ジオキソラニル等が挙げられ� ��。

 隣接する窒素原子と一緒になって形成さ� ��る複素環基としては、例えば少なくとも1個 の窒素原子を含む5員または6員の単環性複素� ��基(該単環性複素環基は、他の窒素原子、酸 素原子または硫黄原子を含んでいてもよい)� �3~8員の環が縮合した二環または三環性で少� �くとも1個の窒素原子を含む縮環性複素環基( 該縮環性複素環基は、他の窒素原子、酸素原 子または硫黄原子を含んでいてもよい)等が� �げられ、具体的にはピロリジニル、ピペリ� �ノ、ピペラジニル、モルホリノ、チオモル� �リノ、ホモピペリジノ、ホモピペラジニル� �テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロキ� �リニル、テトラヒドロイソキノリニル、オ� �ソピペラジニル、2-オキソピロリジニル等が 挙げられる。

 複素環アルキル及び複素環アルキルオキシ� ��アルキレン部分は、前記低級アルキルの定� ��から水素原子を1つ除いたものと同義である 。
 ハロゲンは、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素� ��各原子を意味する。
 置換低級アルキル、置換低級アルコキシ、� ��換低級アルコキシカルボニル、置換低級ア� ��キルアミノカルボニル、低級アルキル(置換 低級アルキル)アミノカルボニル、ジ置換低� �アルキルアミノカルボニル、置換低級アル� �ルスルホニル、置換低級アルケニル及び置� �低級アルキニルにおける置換基(A)としては� �同一または異なって、例えば置換数1~3のヒ� �ロキシ、オキソ、シアノ、ニトロ、カルボ� �シ、アミノ、ハロゲン、置換もしくは非置� �の低級アルコキシ、シクロアルキル、低級� �ルカノイル、低級アルコキシカルボニル、� �級アルキルアミノ、ジ低級アルキルアミノ� �ヒドロキシ低級アルキルアミノカルボニル� �が挙げられる。置換基の置換位置は、特に� �定されない。ここでハロゲン、低級アルコ� �シ、シクロアルキル、低級アルカノイル、� �級アルコキシカルボニル、低級アルキルア� �ノ及びジ低級アルキルアミノは、それぞれ� �記と同義である。ヒドロキシ低級アルキル� �ミノカルボニルのアルキレン部分は、前記� �級アルキルの定義から水素原子を1つ除いた� ��のと同義である。置換低級アルコキシにお� ��る置換基としては、同一または異なって、� ��えば置換数1~3のヒドロキシ、ハロゲン等が� ��げられ、該ハロゲンは前記と同義である。� ��低級アルキルアミノにおける2個の低級アル キル部分は同一でも異なっていてもよい。

 置換低級アルカノイル、置換低級アルカ� ��イルオキシ、置換シクロアルキル、置換ア� ��ール、置換アリールスルホニル、置換アリ� ��ルオキシ、置換アラルキル、置換アロイル� ��置換フェニル、置換複素環基、置換複素環� ��ルキル、置換フリル、置換複素環カルボニ� ��、置換芳香族複素環基及び隣接する窒素原� ��と一緒になって形成される置換複素環基に� ��ける置換基(B)としては、同一または異なっ� ��、例えば置換数1~3のヒドロキシ、ハロゲン� ��ニトロ、シアノ、アミノ、カルボキシ、カ� ��バモイル、置換もしくは非置換の低級アル� ��ル、置換もしくは非置換の低級アルケニル� ��低級アルキルアミノカルボニル、ジ低級ア� ��キルアミノカルボニル、置換もしくは非置� ��の低級アルコキシ、アラルキルオキシ、低� ��アルキルスルホニル、低級アルキルスルフ� ��ニル、低級アルキルチオ、アリールオキシ� ��シクロアルキル、低級アルコキシカルボニ� ��、低級アルキルアミノ、ジ低級アルキルア� ��ノ、低級アルカノイル、複素環基、置換も� ��くは非置換のアリール、置換もしくは非置� ��の複素環アルキルオキシ、置換もしくは非� ��換の複素環カルボニルアルキルオキシ等が� ��げられる。置換基の置換位置は、特に限定� ��れない。ここでハロゲン、低級アルキル、� ��級アルケニル、低級アルキルアミノカルボ� ��ル、ジ低級アルキルアミノカルボニル、低� ��アルコキシ、アリールオキシ、シクロアル� ��ル、低級アルコキシカルボニル、低級アル� ��ルアミノ、ジ低級アルキルアミノ、低級ア� ��カノイル、複素環基及びアリールは、それ� ��れ前記と同義であり、低級アルキルスルホ� ��ル、低級アルキルスルファニル及び低級ア� ��キルチオの低級アルキル部分は前記低級ア� ��キルと同義であり、アラルキルオキシのア� ��ルキル部分は前記アラルキルと同義であり� ��複素環アルキルオキシ及び複素環カルボニ� ��アルキルオキシの複素環基部分ならびにア� ��キレン部分はそれぞれ前記複素環基ならび� ��前記低級アルキルの定義から水素原子を1つ 除いたものと同義である。置換低級アルキル 、置換低級アルケニル、置換低級アルコキシ 及び置換アリールにおける置換基としては、 同一または異なって、例えば置換数1~3のヒド ロキシ、カルボキシ、低級アルカノイル、ハ ロゲン、低級アルコキシ、シアノ、低級アル キルアミノ、ジ低級アルキルアミノ(ジ低級� �ルキルアミノにおける2個の低級アルキル部� ��は同一でも異なっていてもよい)等が挙げら れ、該ハロゲン、低級アルカノイル、低級ア ルコキシ、低級アルキルアミノ及びジ低級ア ルキルアミノはそれぞれ前記と同義である。 置換複素環アルキルオキシ及び置換複素環カ ルボニルアルキルオキシにおける置換基とし ては、同一または異なって、例えば置換数1~3 のヒドロキシ、ハロゲン、低級アルキル、低 級アルコキシ、複素環基等が挙げられ、ここ で示したハロゲン、低級アルキル、低級アル コキシ及び複素環基はそれぞれ前記と同義で ある。

 化合物(I)、(IA)及び(II)の薬学的に許容され� �塩は、例えば薬学的に許容される酸付加塩� �金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加� �、アミノ酸付加塩等を包含する。
 化合物(I)、(IA)及び(II)の薬学的に許容され� �酸付加塩としては、例えば塩酸塩、硫酸塩� �硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、酢酸塩、� �レイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩等の� �機酸塩が挙げられ、薬学的に許容される金� �塩としては、例えばナトリウム塩、カリウ� �塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、� �ルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アル� �ニウム塩、亜鉛塩等が挙げられ、薬学的に� �容されるアンモニウム塩としては、例えば� �ンモニウム、テトラメチルアンモニウム等� �塩が挙げられ、薬学的に許容される有機ア� �ン付加塩としては、例えばモルホリン、ピ� �リジン等の付加塩が挙げられ、薬学的に許� �されるアミノ酸付加塩としては、例えばグ� �シン、フェニルアラニン、リジン、アスパ� �ギン酸、グルタミン酸等の付加塩が挙げら� �る。

 化合物(I)、(IA)及び(II)の塩を取得したい場� �には、化合物(I)、(IA)及び(II)が塩の形で得ら れるときはそのまま精製すればよく、また遊 離の形で得られるときは適当な溶媒に化合物 (I)、(IA)及び(II)を溶解または懸濁し、酸また� ��塩基等を加え塩を形成させればよい。
 化合物(I)、(IA)及び(II)には、位置異性体、� �何異性体または光学異性体等の異性体が存� �し得るが、可能な異性体及び該異性体のい� �なる比率における混合物も本発明の治療薬� �して用いることができる。

 また、化合物(I)、(IA)、(II)、ならびにそれ� �の薬学的に許容される塩は、水または各種� �媒との付加物の形で存在することもあるが� �それら付加物も本発明の治療薬として用い� �ことができる。
 Hsp90ファミリー蛋白質阻害とは、Hsp90ファミ リー蛋白質とHsp90ファミリー蛋白質が結合す� ��蛋白質(Hsp90 client protein)との結合を阻害す� ��ことを意味する。

 Hsp90ファミリー蛋白質としては、例えばHsp90 α蛋白質、Hsp90β蛋白質、grp94、Hsp75/TRAP1等が� �げられる。
 Hsp90ファミリー蛋白質が結合する蛋白質は� �Hsp90ファミリー蛋白質が結合する蛋白質であ ればいずれでもよいが、例えばEGF受容体、Erb -B2、Bcr-Abl、src、raf-1、AKT、Flt-3、PLK、Wee1、FAK 、cMET、hTERT、HIF1-α、変異p53、エストロゲン� �容体、アンドロゲン受容体等が挙げられる[E xpert Opinion on Biological Therapy、第2巻、3-24頁( 2002)]。

 Hsp90ファミリー蛋白質阻害剤としては、例� �ばラディシコール(Radicicol)、ゲルダナマイシ ン(Geldanamycin)、17-AAG、ハービマイシン(Herbimyci n)A、ノボビオシン(Novobiocin)、化合物(I)、(IA)� �(II)等が挙げられる。
 Hsp70ファミリー蛋白質は、分子量約70 kDaのH spの総称であり、例えばHsp70、Hsc70、Bip/Grp78、 mtHsp70等が挙げられる。

 Hsp27ファミリー蛋白質は、分子量27 kDa付近� ��Hspの総称であり、Hsp27蛋白質は、低分子のHs pの一つである。
 Bcl-2ファミリー蛋白質は、アポトーシスの� �御に主要な役割を果たす蛋白質群である。
 多くの癌治療剤において、長期の投薬によ� ��癌細胞が、その癌治療剤に対して耐性を獲� ��することが知られている。治療初期に認め� ��れた効果が持続的な投薬によって低下する� ��また、再発した場合に効果が認められなく� ��る、といった現象がしばしば観察される。� ��って、例えばプロテアーゼ阻害剤耐性の多� ��性骨髄腫を始め、抗腫瘍剤耐性の癌に効果� ��示す治療薬が必要とされている。

 プロテアーゼ(蛋白質分解酵素)は、蛋白質� �ペプチドのペプチド結合を加水分解する酵� �のことで、様々な生理作用を有することが� �られている。
 プロテアーゼ阻害剤には、例えばマトリッ� ��スメタロプロテアーゼ阻害剤、ウロキナー� ��プラスミノーゲン活性化因子阻害剤、カテ� ��シン阻害剤、プロテアソーム阻害剤、アミ� ��ペプチダーゼ阻害剤等が含まれる。

 マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤� ��しては、例えばBatimastat(BB-94)、Ilomastat(GM-6001 )、Marimastat(BB-2516)、Tanomastat(BAY-12-9566)、Prinomas tat(AG-3340)、Metastat(COL-3)、Neovastat(AE-941)、BMS-275 291、MMI-270B(CGS-27023A)、Trocade(Ro-32-3555)、MMI-166� �が挙げられる[Nature Reviews Cancer、6巻、227頁( 2006年)]。

 ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子� ��害剤としては、例えばWX-771(WO2007/025718)、WX-6 71[Expert Opinion on Biological Therapy、6巻、257頁( 2006年)]、WX-UK-1[Neoplasma、52巻、185頁(2005年)]、B -428[Neoplasma、52巻、185頁(2005年)]等が挙げられ� ��。
 カテプシン阻害剤としては、例えばAFG-495[AA CR Annual Meeting、要旨2910(2005)]、E-64、CA030、CA0 74、NS-134、CLIK148[E-64、CA030、CA074、NS-134及びCLI K148の参考文献:Biochemical Journal、381巻、511頁(2 004年)]等が挙げられる。

 プロテアソーム阻害剤[European Journal of C ancer、42巻、1623頁(2006年)]としては、例えばボ ルテゾミブ、MG-132、carfilzomib(PR-171、US2005/02454 35)、NPI-0052[British Journal of Cancer、95巻、961頁 (2006年)]、SC-68896(WO2007/017284)、tyropeptin A、TP-11 0、TP-104(WO2005/105826)、belactosin誘導体[Biochemical� �Pharmacology、67巻、227頁(2004年)]等が挙げられ� �。

 アミノペプチダーゼ阻害剤としては、例え� ��ubenimex(Bestatin)、TNP-470[Angiogenesis、7巻、91頁(2 004年)]、PPI-2458[Clinical Cancer Research、12巻、258 3頁(2006年)]、CHR-2797[Proceedings of the American So ciety for Clinical Oncology、25巻、要旨3053(2006年) ]等が挙げられる。
 本発明で用いられる化合物(I)及び(IA)または それらの薬学的に許容される塩は、例えばWO2 005/000778記載の方法により合成することがで� �る。

 本発明で用いられる化合物(II)またはその薬 学的に許容される塩は、例えばWO2005/063222記� �の方法により合成することができる。
 以下の表1及び表2に本発明で用いられる化� �物の具体例を示すが、本発明はそれらに限� �されるものではない。なお、以下の表にお� �て、Phはフェニルを表す。
 表1記載の化合物1~22はWO2005/000778記載の方法� ��より合成することができる。一方、表2記載 の化合物23~37はWO2005/063222記載の方法により合 成することができる。

 本発明の治療薬は、プロテアーゼ阻害剤� ��性を有する癌の治療に対して用いることが� ��き、例えばプロテアーゼ阻害剤耐性を有す� ��、造血器腫瘍による癌(例えば急性骨髄性白 血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血 病、慢性リンパ性白血病等の白血病、多発性 骨髄腫等の骨髄腫、リンパ腫等)、乳癌、子� �体癌、子宮頚癌、前立腺癌、膀胱癌、腎癌� �胃癌、食道癌、肝癌、胆道癌、大腸癌、直� �癌、膵癌、肺癌、頭頚部癌、骨肉腫、メラ� �ーマまたは脳腫瘍による癌の治療に用いる� �とができる。中でも、プロテアーゼ阻害剤� �性を有する白血病、骨髄腫、リンパ種等の� �療に用いるのが好ましい。

 一方、本発明の治療薬は、Hsp70、Hsp27また はBcl-2の発現が上昇している癌の治療に対し� ��用いることができ、好ましくは、プロテア� ��ゼ阻害剤耐性を有する癌で、且つHsp70、Hsp27 またはBcl-2の発現が上昇している癌の治療に� ��いることができる。さらに、好ましくは、H sp70、Hsp27またはBcl-2の発現が上昇している多� ��性骨髄腫等の治療に用いることができる。

 本発明において、培養細胞株を用いてプロ� ��アーゼ阻害耐性を有する癌に有効な医薬組� ��物を評価することができる。または、培養� ��胞株を用いてHsp70、Hsp27またはBcl-2の発現が� ��昇している癌に有効な医薬組成物を評価す� ��ことができる。
 本発明における培養細胞株は、例えば、KMS- 11細胞及びOPM-2細胞に、プロテアーゼ阻害剤� �性を獲得させた細胞等が挙げられる。KMS-11� �胞、OPM-2細胞はヒト多発性骨髄腫の患者由来 の細胞であり、German Collection of Microorganisms� �and Cell Cultures等の公的セルバンク、各種研� ��機関等から、または市販品として入手でき� ��。KMS-11細胞及びOPM-2細胞の培養液に、プロ� �アーゼ阻害剤であるボルテゾミブを添加し� �、持続的に培養することによりプロテアー� �阻害剤耐性を獲得させた、KMS-11/Bor及びOPM-2/B orの細胞株が得られた。プロテアーゼ阻害剤� ��性を獲得したKMS-11/Bor細胞、OPM-2/Bor細胞は、 プロテアーゼ阻害剤耐性癌のモデルになりう るものであり、さらに好ましくは、プロテア ーゼ阻害剤耐性の多発性骨髄腫のモデルにな りうるものである。

 本発明の医薬組成物の効果は、in vitro細� ��増殖阻害活性を測定することによって、ま� ��は動物モデルを用いたin vivo抗腫瘍活性を� �定することによって調べることができる。in  vitro細胞増殖阻害活性の測定方法としては� �抗腫瘍剤耐性の癌細胞株を用いた、例えば� �ロテアーゼ阻害剤耐性の癌細胞を用いた実� �を挙げることができる。動物モデルを用い� �in vivo抗腫瘍活性を測定する試験としては、 ヌードマウス等の免疫不全マウスに抗腫瘍剤 耐性の癌細胞株を移植した、例えばプロテア ーゼ阻害剤耐性を有する癌細胞を移植したモ デルが挙げられる。

 本発明において、プロテアーゼ阻害剤耐� ��を有する、癌組織由来の培養細胞株を用い� ��、Hsp90ファミリー蛋白質阻害剤のin vitro細� �増殖阻害活性を評価することで、または、� �物モデルを用いてHsp90ファミリー蛋白質阻害 剤を投与して評価することで、プロテアーゼ 阻害耐性を有する癌に有用なHsp90ファミリー� ��白質阻害剤の医薬組成物をスクリーニング� ��て、選択することができる。

 本発明において、Hsp70、Hsp27またはBcl-2の� ��現が上昇している、癌組織由来の培養細胞� ��を用いて、Hsp90ファミリー蛋白質阻害剤のin  vitro細胞増殖阻害活性を評価することで、� �たは、動物モデルを用いてHsp90ファミリー蛋 白質阻害剤を投与して評価することで、Hsp70� ��Hsp27またはBcl-2の発現が上昇している癌に有 用なHsp90ファミリー蛋白質阻害剤の医薬組成� ��をスクリーニングして、選択することがで� ��る。

 化合物(I)、(IA)、(II)またはそれらの薬学的� �許容される塩は、そのまま単独で投与する� �とも可能であるが、通常各種の医薬製剤と� �て提供するのが望ましい。
 本発明の治療薬は、活性成分として化合物( I)、(IA)、(II)またはそれらの薬学的に許容さ� �る塩を単独で、あるいは任意の他の治療の� �めの有効成分との混合物として含有するこ� �ができる。また、それら医薬製剤は、活性� �分を薬学的に許容される一種もしくはそれ� �上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分� �においてよく知られている任意の方法によ� �製造される。

 投与経路としては、治療に際し最も効果的� ��ものを使用するのが望ましく、経口または� ��例えば静脈内等の非経口を挙げることがで� ��る。
 これら製剤は、それぞれ有効成分の他に製� ��学的に許容される希釈剤、賦形剤、崩壊剤� ��滑沢剤、結合剤、界面活性剤、水、生理食� ��水、植物油、可溶化剤、等張化剤、保存剤� ��抗酸化剤等を用いて常法により作成するこ� ��ができる。

 錠剤の調製にあたっては、例えば乳糖等の� ��形剤、澱粉等の崩壊剤、ステアリン酸マグ� ��シウム等の滑沢剤、ヒドロキシプロピルセ� ��ロース等の結合剤、脂肪酸エステル等の界� ��活性剤、グリセリン等の可塑剤等を常法に� ��って用いればよい。
 注射剤の調製にあたっては、水、生理食塩� ��、植物油、溶剤、可溶化剤、等張化剤、保� ��剤、抗酸化剤等を常法により用いればよい� ��

 化合物(I)、(IA)及び(II)またはそれらの薬学� �に許容される塩は、上記の目的で用いる場� �、通常、経口的、または注射剤等として非� �口的に投与可能であり、その有効容量及び� �与回数は投与形態、患者の年齢、体重、症� �等により異なるが、通常一日当たり、0.01~20� �mg/kgを投与するのが好ましい。
 続いて、本発明の治療薬の効果について以� ��の試験例により具体的に説明する。なお、� ��下の試験例において、試験化合物としては� ��プロテアーゼ阻害剤であるボルテゾミブとM G-132を、Hsp90阻害剤の17-AAGと化合物22を用いた 。化合物22のHsp90阻害活性は、WO2005/000778に記� ��されている。

試験例1:ボルテゾミブ耐性を獲得� ��たKMS-11細胞、OPM-2細胞の作製
 KMS-11細胞を、10%牛胎児血清(FCS)を含むRPMI1640 培地中で5×10 ⁴ 細胞/mLの濃度に懸濁して、5%炭酸ガスインキ� ��ベーター内で37 ℃にて培養した。ボルテゾ ミブを最終濃度5 nmol/Lになるように添加して 培養を継続した。細胞の生存が確認され、順 調に増殖している細胞が確認できたなら、5× 10 ⁴ 細胞/mLの濃度に細胞を懸濁して、ボルテゾミ ブを10 nmol/Lになるように添加して培養を継� �した。その後、細胞の生存が確認され、順� �に増殖している細胞が確認できたなら、段� �的にボルテゾミブの濃度を濃くしながら培� �・継代を繰り返し、100 nmol/Lの濃度で増殖可 能なボルテゾミブ耐性のKMS-11細胞を造成した 。以下、作製された細胞を「KMS-11/Bor」と呼� �。

 OPM-2細胞を、10%牛胎児血清(FCS)を含むRPMI1640� ��地中で5×10 ⁴ 細胞/mLの濃度に懸濁して、5%炭酸ガスインキ� ��ベーター内で37 ℃にて培養した。ボルテゾ ミブを最終濃度2.5 nmol/Lになるように添加し� ��培養を継続した。細胞の生存が確認され、� ��調に増殖している細胞が確認できたなら、� ��ルテゾミブを3.75 nmol/Lになるように添加し� ��培養を継続した。その後、細胞の生存が確� ��され、順調に増殖している細胞が確認でき� ��なら、段階的にボルテゾミブの濃度を濃く� ��ながら培養・継代を繰り返し、15 nmol/Lの濃 度で増殖可能なボルテゾミブ耐性のOPM-2細胞� ��造成した。以下、作製された細胞を「OPM-2/B or」と呼ぶ。

試験例2:KMS-11及びKMS-11/Borに対する 増殖阻害試験
 96穴マイクロプレート(ヌンク社製)中に、10% FCSを含むRPMI1640培地(以下、培地)で5×10 ⁴ 個/mLに懸濁したKMS-11またはKMS-11/Borの細胞溶� �を90 μL/wellずつ播種し、また、ブランクと� �て培地を100 μL/wellずつ添加し、5%炭酸ガス� �ンキュベーター内で5時間培養した。

 試験化合物を段階的に希釈し、最終処理� ��度の10倍濃度の薬剤希釈液を調製し、10 μL/ wellずつ添加した(1濃度につきn=3)。コントロ� �ルについては、薬剤を含まない培地を10 μL/ wellずつ添加した。コントロール及びブラン� �についてn=8で実験を行った。薬剤を添加し� �から72時間培養後、生存細胞数をCell Prolifera tion Reagent WST-1(WST-1試薬、Roche Diagnostics)を用 いて測定した。WST-1試薬を、各プレートに10  μL/wellずつ添加した。炭酸ガスインキュベー� ��ー内で、2時間培養後、プレートミキサーで 攪拌し、マイクロプレート分光光度計(モレ� �ュラーデバイス社製、SPECTRAmax340PC-384)を用い 、450 nmと655 nmの吸光度を測定し、各ウェル� ��つき450 nmの吸光度から655 nmの吸光度を減� �た値(差吸光度)を算出した。さらに差吸光度 からブランクの差吸光度を減じて、生細胞数 に相当する吸光度を算出した。

 IC ₅₀ の算出方法を以下に記す。試験化合物未処理 のウェルで得られた生細胞数に相当する吸光 度を100%とし、試験化合物を処理したウェル� �得られた吸光度を相対値(% control)で表した� �これらの数値を用いて、生細胞数のIC ₅₀ (生細胞数をコントロールの50%にまで減少さ� �る濃度)を算出した。また、試験化合物を処� ��して得られた各薬剤濃度の% controlを図1~4に 示した。各試験化合物のIC ₅₀ を表3に示した。さらに、各試験化合物のボ� �テゾミブ耐性度として、KMS-11/Borに対するIC ₅₀ を、KMS-11のIC ₅₀ で除した値(IC ₅₀ ratio)を表3に示した。

 ボルテゾミブ及びMG-132のIC ₅₀  ratioは21及び7.7であり、明らかにKMS-11/Borに� �して増殖阻害効果の低下が認められた。一� �、17-AAG及び化合物22のIC ₅₀ ratioは0.76及び0.96であり、KMS-11/Borに対して増� ��阻害効果の低下が認められなかった。
 以上より、Hsp90ファミリー蛋白質阻害剤は� �プロテアーゼ阻害剤耐性を有する癌の治療� �有用であることが明らかとなった。

試験例3:OPM-2及びOPM-2/Borに対する� �殖阻害試験
 96穴マイクロプレート(ヌンク社製)中に、10% FCSを含むRPMI1640培地(以下、培地)で5×10 ⁴ 個/mLに懸濁したOPM-2またはOPM-2/Borの細胞溶液� ��90 μL/wellずつ播種し、また、ブランクとし� ��培地を100 μL/wellずつ添加し、5%炭酸ガスイ� ��キュベーター内で5時間培養した。

 試験化合物を段階的に希釈し、最終処理� ��度の10倍濃度の薬剤希釈液を調製し、10 μL/ wellずつ添加した(1濃度につきn=3)。コントロ� �ルについては、薬剤を含まない培地を10 μL/ wellずつ添加した。コントロール及びブラン� �についてn=8で実験を行った。薬剤を添加し� �から72時間培養後、生存細胞数をCell Prolifera tion Reagent WST-1(WST-1試薬、Roche Diagnostics)を用 いて測定した。WST-1試薬を、各プレートに10  μL/wellずつ添加した。炭酸ガスインキュベー� ��ー内で、2時間培養後、プレートミキサーで 攪拌し、マイクロプレート分光光度計(モレ� �ュラーデバイス社製、SPECTRAmax340PC-384)を用い 、450 nmと655 nmの吸光度を測定し、各ウェル� ��つき450 nmの吸光度から655 nmの吸光度を減� �た値(差吸光度)を算出した。さらに差吸光度 からブランクの差吸光度を減じて、生細胞数 に相当する吸光度を算出した。

 IC ₅₀ の算出方法を以下に記す。試験化合物未処理 のウェルで得られた生細胞数に相当する吸光 度を100%とし、試験化合物を処理したウェル� �得られた吸光度を相対値(% control)で表した� �これらの数値を用いて、生細胞数のIC ₅₀ (生細胞数をコントロールの50%にまで減少さ� �る濃度)を算出した。また、試験化合物を処� ��して得られた各薬剤濃度の% controlを図5~8に 示した。各試験化合物のIC ₅₀ を表4に示した。さらに、各試験化合物のボ� �テゾミブ耐性度として、OPM-2/Borに対するIC ₅₀ を、OPM-2のIC ₅₀ で除した値(IC ₅₀ ratio)を表4に示した。

 ボルテゾミブ及びMG-132のIC ₅₀  ratioは28及び16であり、明らかにOPM-2/Borに対� ��て増殖阻害効果の感受性の低下が認められ� ��。一方、17-AAG及び化合物22のIC ₅₀ ratioは1.1及び1.4であり、OPM-2/Borに対して感受� ��の低下が認められなかった。
 以上より、Hsp90ファミリー蛋白質阻害剤は� �プロテアーゼ阻害剤耐性を有する癌の治療� �有用であることが明らかとなった。

試験例4:OPM-2/Bor細胞移植マウスモ� ��ルにおける抗腫瘍効果
 癌細胞移植前日にFox C.B-17/Icr-scidJclマウス(� ��本クレア)に抗アシアロGM1抗体を0.3 mg/マウ� ��ずつ腹腔内投与した。OPM-2/Bor細胞は、10%FCS� ��含むRPMI1640培地中、5%炭酸ガスインキュベー ター内で37 ℃にて培養し増殖させ、マウス1� ��あたり1×10 ⁷ 細胞にて腹側皮下に移植した。移植18日後に� ��ギスにて皮下で増殖した腫瘍の長径・短径� ��測定し、以下の式に従って腫瘍体積を求め� ��。

 同時に各マウスの体重も測定し、平均腫瘍� ��積と平均体重が均一になるように1群5匹ず� �以下のような投与群に分け、この日を投与� �験開始0日として投与を開始した。
 化合物22は生理食塩水(大塚製薬社製)に10及� ��5 mg/mLの濃度で溶解させ、投与開始0から4日 目まで連日1日2回、マウス体重1 gあたりそれ ぞれ0.01 mL(100及び50 mg/kgに相当)の用量で、� �静脈より静脈内投与した。

 ボルテゾミブは生理食塩水に0.1及び0.05 mg/m Lの濃度で溶解させ、投与開始0、3、7及び10日 目にそれぞれ1日1回、マウス体重1 gあたりそ れぞれ0.01 mL(1及び0.5 mg/kgに相当)の用量で、 尾静脈より静脈内投与した。ボルテゾミブの 用量と投与スケジュールは、マウスモデルで ボルテゾミブの抗腫瘍効果について報告され ている論文情報を参考に、ボルテゾミブが著 効を示した用量とスケジュールを選択した[Ca ncer Research、第62巻、4996-5000頁(2002)]
A. 陰性対照群(Control):試験化合物非投与
B. ボルテゾミブ投与群:1 mg/kg(1日1回/0、3、7� ��10日目に投与)
C. ボルテゾミブ投与群:0.5 mg/kg(1日1回/0、3、 7、10日目に投与)
D. 化合物22投与群:100 mg/kg(1日2回×5日間)
E. 化合物22投与群:50 mg/kg(1日2回×5日間)
 0日目以降、週に2回腫瘍体積の測定を行っ� �。抗腫瘍効果の判定は各群の腫瘍体積の平� �値を算出し、0日目の腫瘍体積をV0としたと� �の腫瘍体積変化(V/V0)の比較で行った。経日� �定した各群のV/V0を図9に示す。

 図9に示したように、化合物22は、用量依存� ��に強い増殖抑制効果を示すと共に、腫瘍縮� ��効果も示した。一方、ボルテゾミブは明ら� ��な増殖抑制効果を示さなかった。すなわち� ��Hsp90ファミリー蛋白質阻害剤である化合物22 は、ボルテゾミブが無効である細胞移植マウ スモデルにおいて高い抗腫瘍効果を有してい た。
 14日目の各群のV/V0を陰性対照群のV/V0で除し た値(T/C)を表5に示す。化合物22投与群のT/Cは� ��D群で0.092、E群で0.24であり、腫瘍増殖を有� �に抑制した。ボルテゾミブ投与群のT/Cは、B� ��で0.85、C群で1.0であり、陰性対照群と同等� �あった。

 以上より、Hsp90ファミリー蛋白質阻害剤� �、プロテアーゼ耐性を有する癌の治療に有� �であることが明らかとなった。

試験例5:OPM-2およびOPM-2/Borにおけ� �Hsp70、Hsp27、Bcl-2及びβ-Actinの発現量の比較試 験
 6穴マイクロプレート(コーニングインター� �ショナル社製)中に、10%FCSを含むRPMI1640培地(� ��下、培地)で2×10 ⁵ 個/mLに懸濁したOPM-2またはOPM-2/Borの細胞溶液� ��2 mL/wellずつ播種し、5%炭酸ガスインキュベ� ��ター内で24時間培養した。細胞を沈殿物と� �て回収したあと、1%protease inhibitor cocktail(シ グマアルドリッチ社製)及び1 mmol/Lフッ化フ� �ニルメチルスルホニル(PMSF)を含むNP40 cell ly sis buffer(インビトロージェン社製)を用い、� �上において細胞を30分間溶解させた後、15000G で10分間遠心した。得られた上清の蛋白質濃� ��を測定し、各レーンあたり同一蛋白質量に� ��るよう試料を調製した後、SDS-PAGEにより蛋� �質の分離を行なった。分離された蛋白質試� �は、ポリフッ化ビニリデン(PVDF)膜(ミリポア� ��)に移した後、1次抗体として、抗Hsp70抗体(SP A-810、アッセイデザイン社製)、抗Hsp27抗体 (# 2402、セルシグナリングテクノロジー社製)、� ��Bcl-2抗体(sc-509、サンタクルズバイオテクノ� ��ジー社製)または抗β-Actin抗体(AC-15、シグマ� ��ルドリッチ社製)を加え、膜上の蛋白質と反 応させた。その後、2次抗体として、それぞ� �の1次抗体と反応する西洋ワサビペルオキシ� ��ーゼ(Horseradish Peroxidase)標識2次抗体(抗ウサ� ��Ig抗体、または抗マウスIg抗体、GEヘルスケ� ��バイオサイエンス社製)を反応させた。検出 はECL試薬(No. 34080、ピアスバイオテクノロジ� ��社製)を用いて行ない、X線フィルム上で得� �れたバンドを検分し、OPM-2およびOPM-2/Borで発 現しているHsp70、Hsp27、Bcl-2及びβ-Actinの蛋白� ��量を比較した。結果を図10に示す。図10によ れば、両細胞株間でβ-Actinの発現量に差はな� ��が、OPM-2に比べ、OPM-2/Borにおいて、Hsp70、Hsp 27及びBcl-2の発現量が上昇していることが明� �かとなった。これら蛋白質の発現上昇が、� �ルテゾミブ耐性に寄与していると考えられ� �。

 以上の結果より、本発明の治療薬は、Hsp7 0、Hsp27及びBcl-2の発現が上昇した癌の治療に� ��効であることが明らかとなった。さらに、H sp90ファミリー蛋白質阻害剤はプロテアーゼ� �害剤耐性を有し、Hsp70、Hsp27及びBcl-2の発現� �上昇した癌の治療に有効であることが明ら� �となった。