SENEGALENSE

La présente invention entre dans le domaine des compositions chimiques utilisables dans la préparation de médicaments ou de compléments alimentaires.

En particulier, l'invention permet la préparation de médicaments ou compléments alimentaires capables d' augmenter l'immunité et les défenses de l'organisme, notamment contre les virus, les bactéries, les champignons, les protozoaires responsables de nombreuses pathologies, parfois mortelles.

L'invention concerne spécifiquement une composition chimique comprenant des molécules actives biologiquement qui contribuent à augmenter et stimuler l'activité immunitaire de l'organisme et améliorent les défenses immunes, notamment contre les virus.

Plus particulièrement, la composition chimique de l'invention présente une activité biologique contre le « Virus de l' Immunodéficience Humaine » (VIH) et de sa résultante : le « Syndrome d' Immunodéficience Acquise » (SIDA) , accompagné généralement de ses infections opportunistes.

On notera que le VIH est un rétrovirus infectant l'homme dont on connaît actuellement deux types : le VIH-1 et le VIH-2. L' infection par le VIH est une pandémie couvrant la planète entière, en particulier l'Afrique subsaharienne qui rassemble à elle seule 69% des cas. L'infection d'un patient par le VIH évolue en plusieurs phases :

- La première phase dite de « primo-infection » ;

- Une phase asymptomatique, dite de « latence »,

- Une phase d' immunodépression accrue dite « SIDA » .

La phase de primo-infection consiste en la réplication active, dans l'organise, du VIH qui entraine la destruction des cellules du système immunitaire notamment des lymphocytes T4.

La phase de « latence » représente une phase dans laquelle la charge virale diminue légèrement et se stabilise dans 1' organisme . La phase « SIDA » consiste en une multiplication accrue et invasive du VIH où les symptômes du SIDA apparaissent, ainsi que les maladies opportunistes, avec comme finalité le décès du patient.

A ce jour, il n'existe aucun traitement pour guérir du

SIDA et éliminer complètement la propagation et le développement du virus (VIH) dans l'organisme des patients atteints .

De manière connue, des traitements de type trithérapie associant trois molécules antivirales sont utilisés pour ralentir le développement et la multiplication du VIH dans l'organisme et son évolution vers le stade SIDA.

Néanmoins, ces traitements restent très coûteux à l'achat car longs à fabriquer et à produire à échelle industrielle. De plus, ces derniers nécessitent des conditions strictes de conservation, ainsi leur accessibilité est restreinte pour les patients des pays sous-développés .

En outre, les traitements actuels ne sont pas forcément efficaces sur tous les patients. En effet, la rapidité de multiplication et de mutation du VIH dans l'organisme étant telle, ces traitements perdent au cours du temps de leur efficacité.

De plus , même lorsqu' ils sont efficaces , ces traitements ont pour désavantage de présenter de nombreux effets secondaires indésirables sur la santé du patient traité qui va perdre en qualité de vie. En effet, les traitements actuels présentent une certaine toxicité nuisible pour l'organisme du patient, notamment due à de nombreux excipients chimiques de synthèse d'origine non naturelle pouvant présenter des risques de rejet par l'organisme.

Ainsi, la présente invention a pour but de pallier les inconvénients de l'état de la technique en proposant une composition chimique consistant en une solution alternative aux solutions susmentionnées. Cette alternative doit être efficace et permettre d' augmenter les défenses immunitaires , notamment chez les patients atteints du VIH, tout en limitant les effets secondaires dus à la prise du médicament comprenant la composition chimique alternative.

En outre, cette solution alternative se doit d'être accessible aux patients des pays sous-développés , aussi bien en termes de coûts de production que de coûts d'achat, mais aussi en matière de conservation du produit actif, et de facilité de prise par le patient.

En outre, pour atteindre cet objectif, la composition chimique se doit d'être la moins toxique possible pour l'organisme et cibler uniquement les virus, bactéries champignons, protozoaires responsables des pathologies affaiblissant le système immunitaire. Afin de limiter les risques de toxicité, il est avantageux que la composition chimique présente un maximum d' éléments d' origine naturelle, jugés peu nuisibles pour la santé et l'environnement.

La présente invention a pour but de pallier les inconvénients de 1 'état de la technique , en proposant une composition chimique comprenant :

- la molécule A ou un de ses sels physiologiquement acceptables ,

et/ou ;

- la molécule B ou un de ses sels physiologiquement acceptables ,

ladite molécule A étant de formule suivante :

et la molécule B étant de formule suivante ;

De manière spécifique dans la composition chimique de 1' invention :

- la molécule Ά ou un de ses sels physiologiquement acceptables est biologiquement actif (ve) et stimulateur (trice) de l'activité immunitaire,

- la molécule B ou un de ses sels physiologiquement acceptables est biologiquement actif (ve) et stimulateur (trice) de l'activité immunitaire.

Avantageusement, ladite molécule A présente :

- en position 16, en remplacement de la fonction carbonyl =0, soit un -OH, soit un groupement carbonyl aldéhyde- RCOH, soit une cétone -R1-CO-R2, soit un ester -R-C00- R' , soit un amide de type -R-C (=0)NH2 ; et/ou

- en position 3, une glycosilation ou une estérification sous la forme de -OR, où « R » est soit un groupe feruloyl ou caffeoyl, soit un sucre ou soit un amide.

Avantageusement encore, ladite molécule A est conjuguée avec des amino-acides , des sels d' ammonium quaternaires , des glycosides , des hemiphtalates ou encore des carbamates .

De manière avantageuse aussi, ladite molécule B présente, en position 28, une estérification avec un amide ou un sucre.

De plus, selon d'autres caractéristiques de l'invention, ladite composition chimique de l'invention comporte au moins une des molécules suivantes ou un de ses sels physiologiquement acceptables, ou une des combinaisons possibles desdites molécules suivantes, la ou lesdites molécule (s) étant choisie (s) parmi la liste suivante !; - La molécule C de formule :

avec « n » compris entre 8 et 26

La molécule D de formule

- La molécule F de formule : ~ La molécule G de formule :

La molécule H de formule ;

- La molécule I de formule

Selon un premier mode de réalisation de l'invention, chacune desdites molécules A, B, et chacun de leurs sels physiologiquement acceptables est d' origine synthétique et issue d'une synthèse chimique en laboratoire ou d'une hémisynthèse .

Selon une autre caractéristique de l'invention, chacune desdites molécules A, B et chacun de leur sels physiologiquement acceptables de ladite composition de l'invention est d'origine naturelle et issue d'un extrait végétal d'Anthostema senegalense.

Avantageusement, l'extrait végétal d'Anthostema senegalense :

- consiste en un extrait polaire, aqueux, alcoolique ou hydro-alcoolique ou un extrait apolaire ou une teinture mère d'Anthostema senegalense avec une teneur en éthanol de 70% V/V,

- ledit extrait végétal est obtenu à partir d'écorces de tronc, notamment séchées, d'Anthostema senegalense.

De manière avantageuse également, ladite composition chimique de l'invention est destinée à être utilisée comme médicament ou comme complément alimentaire.

Plus spécifiquement encore, ladite composition chimique de l'invention est destinée à être utilisée dans le traitement de l'infection par le VIH de type 1 ou de type 2, du SIDA et des manifestations cliniques qui l'accompagnent.

De préférence, ladite composition chimique de l'invention se présente sous une forme galénique orale, ou sous une forme galénique d' infusette .

Selon un autre mode de réalisation, ladite composition de l'invention, se présente sous une forme galénique orale de microsphères réalisées par un procédé d'extrusion et de sphéronisation, de comprimés, de capsules molles, de granules, de gélules, de poudre, d'ampoules, de sirop ou encore de écoctés .

La présente invention concerne également un procédé d'isolation par extraction, d'identification et de sélection de la ou des molécules biologiquement active (s) de la composition chimique de 1' invention dans lequel : - On sèche une partie de la plante d'Anthostema senegalense ;

- On prépare un extrait végétal, à partir de la partie de la plante séchée, par extraction avec un solvant apolaire ou polaire ou par macération, infusion, décoction, percolation, digestion ou lixivation,

- On concentre sous vide ledit extrait végétal,

- On sépare les molécules de l'extrait végétal par chromatographie,

- On teste in Vitro l'activité biologique desdites molécules à 1' encontre d'un pathogène virale de type VIH selon la méthode de E de Clercq,

- On sélectionne et isole les molécules possédant un index de sélectivité à 1' encontre dudit pathogène ≥ 50 et une CC ₅₀ ≥ 45 pg/mL,

- On identifie la ou les molécules séparées, sélectionnées et isolées par résonance magnétique nucléaire et spectrométrie de masse.

Plus spécifiquement pour la mise en œuvre dudit procédé de 1' invention :

- La partie de la plante d'Anthostema sengalense qui est séchée consiste en l'écorce du tronc, ou en l'écorce de racines ou en des feuilles ou en des fruits ;

- on prépare un extrait végétal par percolation au CHC13 pour obtenir un extrait végétal apolaire ;

- après concentration sous vide, on sépare les molécules de l'extrait végétal par chromatographie sur colonne répétée et chromatographie sur couche mince.

De manière avantageuse, dans ledit procédé d' isolation par extraction de la ou des molécules biologiquement active (s) et stimulatrice (s) du système immunitaire, on sépare les molécules dudit extrait végétal apolaire par chromatographie sur colonne avec, comme phase stationnaire, un gel de silice polaire et, comme phase mobile, un éluant apolaire constitué par un gradient de CHC1 ₃ dans de l'hexane.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention rassortiront de la description détaillée qui va suivre des modes de réalisation non limitatifs de 1 ' invention.

La présente invention concerne une composition chimique comprenant la molécule A et/ou la molécule B, ou un de ses sels physiologiquement acceptables.

En d' autres termes , ladite composition chimique comprend la molécule A ou un des sels physiologiquement acceptables de la molécule A ; en présence ou non de la molécule B ou un des sels physiologiquement acceptable de la molécule B.

De la même manière, ladite composition chimique comprend la molécule B ou un des sels physiologiquement acceptables de la molécule B ; en présence ou non de la molécule A ou un des sels physiologiquement acceptables de la molécule A.

On entend par l'expression « physiologiquement acceptables » le fait que la ou les molécules ainsi que leur (s) sels ne nuisent pas au fonctionnement ni à l'organisation mécanique, physique, biochimique d'un organisme vivant, en particulier de l'être humain.

La composition chimique de l'invention est « physiologiquement acceptable » dans sa globalité, c'est-à- dire que tous les éléments qui la composent sont « physiologiquement acceptables ». Ladite composition chimique de l'invention est « physiologiquement acceptable » au travers de ses différents composants, c'est-à-dire qu'elle est biocompatible, non ou peu toxique pour le bon fonctionnement de l'organisme et sans propriété physique ou chimique rendant difficiles et compliquées son administration et sa métabolisation.

Ainsi, la composition de l'invention est également « pharmaceutiquement acceptable », c'est-à-dire qu'elle peut être utilisée comme médicament pour soigner un patient et qu' il y a plus d'effets positifs que d'effets négatifs sur la santé du patient.

La ou lesdites molécule (s) A et/ou B sont « biologiquement active (s) », notamment à 1' encontre des entités virales, bactériennes , protozoaires ou champignons responsables de pathologies . En d' autres termes , la molécule A ou la molécule B a un effet seul ou de manière synergique à l' encontre de la prolifération desdites entités responsables desdites pathologies .

Ainsi grâce à la capacité d'être « biologiquement active (s) », la ou lesdites molécule (s) A et/ou B ont pour propriété et effet de stimuler l'activité immune de l'organisme et de l'augmenter.

Selon l'invention, la molécule A, un pentacyclic triterpenoid gammacerane, présente la formule suivante :

Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, la formule de la molécule A peut être modifiée de sorte que :

- En position 16, le carbonyl =o peut être réduit et donner un - OH, ou encore la fonction carbonyl aldéhyde -RCOH, une cétone -R ¹ -CO-R ² , un ester -R-COO-R' , un amide par exemple de type -R-C (=0)NH ₂ ;

- En position 3, une glycosilation ou une estérification peut être réalisée sous la forme de groupement fonctionnel de type 3-OR, où « R » peut être un groupe feruloyl ou caffeoyl, un sucre ou un amide par exemple de type -R-C (=0)NH2.

Selon un autre mode de réalisation particulier, la molécule A peut-être conjuguée avec des amino-acides , des sels d' ammonium quaternaires , des glycosides , des hemiphtalates ou encore des carbamates. Selon l'invention, la molécule B se présente sous la formule suivante :

Selon un mode de réalisation particulier, la molécule B peut subir des estérifications en position de son carbone 28 notamment avec des sucres de type rhamnose, arabinose, glucose, aminosucres , glucosamine , galactosamine ou encore avec des amides de type benzylamide, amide hétéroaromatique .

Far exemple, pour la molécule B, un couplage peut se faire avec une chaine latérale d' aminoacides ou de peptides entre autre au niveau de son carbone 28.

Selon un mode de réalisation particulier, la molécule B peut subir des modifications au niveau de son carbone 3, telles que :

- des estérifications avec divers acides comme des acides féruliques ou caféiques , acides hydroxycinnamiques , acides diméthylsucciniques ,

- des conjugaisons avec des nucléosides inhibiteurs de la transcriptave inverse tels que la zidovudine, 1' azidothymidine,

- des liaisons avec des sucres de type mono ou oligosaccharides .

De préférence, ladite composition chimique de l'invention peut comporter, en plus des molécules A et/ou B, l'une des molécules suivantes, un de ses sels physiologiquement acceptables, ou encore une des combinaisons possibles desdites molécules suivantes :

La molécule E : 3-0-acetyl-o-friedo-olean-14-en-28-oic- acid (O-acetyl aleuritolic acid) , de formule :

- La molécule F ; un (3β) -Stigmasta-5, 22, 25-trien-3-ol de formule :

- La molécule 6, un β-Stigmasterol, de formule :

La molécule I, un benzoate d' iso-alcool , de formule

Avec « n » compris entre 14 et 26 ; - La molécule J de formule :

De manière avantageuse et selon un mode de réalisation particulier, chacune des molécules A à J susmentionnées est d'origine naturelle, issue et sélectionnée à partir d'un extrait végétal d'Anthostema senegalense notamment pour ses capacités à être biologiquement active.

Avantageusement, ledit extrait végétal est obtenu à partir d'écorce de tronc, notamment séchée, d'Anthostema senegalense.

Néanmoins, d'autres parties de la plante d'Anthostema senegalense telles que les feuilles, l'écorce de racine ou les fruits peuvent également être utilisés pour obtenir ledit extrait végétal .

De préférence, ledit extrait végétal d'Anthostema senegalense consiste en un extrait polaire, aqueux, alcoolique ou hydro-alcoolique ou un extrait apolaire, ou encore en une teinture mère d'Anthostema senegalense avec une teneur en éthanol d'environ 70% V/V.

Partir d'un extrait végétal d'origine naturelle pour obtenir les molécules biologiquement actives et stimulatrices de l'activité immunitaire a pour avantage de les rendre accessibles en termes de coûts de production pour les pays sous-développés .

En effet, Anthostema senegalense est un arbre forestier répandu en Afrique Occidentale, notamment en Guinée, Guinée- Bissao , Sénégal , Mali , en Côte d' Ivoire , en Sierra Leone , au Bénin, au Nigéria, etc., qui sont des pays présentant peu de moyens et dont la possibilité d' accès aux soins est souvent limitée .

En outre, partir d'un extrait végétal d'origine naturelle permet de limiter les risques de toxicité et entre dans une démarche écoresponsable où l'on puise les molécules d'intérêt directement dans le milieu naturel.

Selon un autre mode de réalisation, chacune des molécules A à J susmentionnées est d'origine synthétique, c'est à dire issue d'une synthèse chimique complète en laboratoire ou encore d'une hémi-synthèse.

Selon une particularité de l'invention, ladite composition chimique de l'invention est destinée à être utilisée comme médicament ou en tant que complément alimentaire.

En particulier, ladite composition chimique de l'invention est destinée à être utilisée par les personnes fatiguées dont le système immunitaire est affaibli par la présence d'un pathogène viral, bactérien, fongique etc....

De manière avantageuse, la demanderesse a pu démontrer que la composition chimique de l'invention possède une activité biologique à l' encontre du VIH de type 1 et de type 2, du SIDA et des manifestations cliniques qui l'accompagnent, ainsi que de certains protozoaires en particulier Trypanosoma crazl, Trypanosoma brucei, Plasmodium falclparvm.

L'activité biologique de la composition chimique de l'invention est, en particulier, due à la présence des molécules qui la composent. Plus spécifiquement, la molécule A, la molécule B et les molécules C à J sont responsables et à l'origine de l'activité biologique de la composition chimique de 1' invention . La présence de ces molécules A à J dans le corps humain génère l'activité biologique.

Plus spécifiquement, l'activité biologique des molécules A à J a été démontrée par des tests in vitro mentionnés ultérieurement.

Ainsi, selon l'invention, ladite composition chimique peut servir à la préparation d'une composition pharmaceutique aidant à lutter contre le VIH, le SIDA, ses pathologies opportunistes associées mais également contre les maladies résultant de certains protozoaires comme des trypanosomiases ou le paludisme .

En outre, la présente invention protège également une composition pharmaceutique comprenant la composition chimique de l'invention, ladite composition pharmaceutique se présentant sous une forme galénique orale.

Le terme « forme galénique orale » désigne la forme sous laquelle sont mis les excipients et les principes actifs, à savoir les molécules A à J seules ou en combinaison, constituant un médicament à usage par voie orale.

Selon un mode de réalisation particulier de la composition pharmaceutique de l'invention, la composition chimique de l'invention peut se présenter sous forme d' infusettes , ceci uniquement lorsqu'elle est intégralement d'origine naturelle et issue d'un extrait végétal d'Anthostema senegalense.

Le terme « infusette » désigne la forme sous laquelle se présente le principe actif, c'est-à-dire les molécules Ά à J issues de préférence d'un extrait végétal d'Anthostema senegalense. Plus spécifiquement, une infusette est un petit sachet contenant une dose d'extrait de plante séchée à infuser.

Ainsi, dans le cadre de l'invention, la composition pharmaceutique comprenant la composition chimique de l'invention peut se présenter sous la forme d'un sachet contenant un extrait végétal d'Anthostema senegalense séché que l'on va pouvoir infuser. Dans ce cas, l'extrait végétal du sachet contenant lui-même au moins l'une des molécules A ou B, est avantageusement une combinaison des molécules A à J.

De préférence, la composition pharmaceutique de l'invention se présente sous la forme galénique orale, notamment de type microsphères . Ces dernières sont réalisées par un procédé d'extrusion et de sphéronisation . La composition pharmaceutique de 1' invention peut également se présenter sous une forme galénique orale différente des microsphères, notamment sous la forme de comprimés, de capsules molles, de granules, de gélules, de poudre, d'ampoules, de sirop ou encore de décoctés .

La composition pharmaceutique de l'invention a pour avantage de présenter une alternative efficace et peu coûteuse pour soigner les patients atteints du VIH de type 1 ou de type 2, du SIDA ou des maladies cliniques qui en découlent.

En effet, la forme galénique orale ou la forme d' infusette de la composition pharmaceutique de l'invention facilite sa prise par le patient, ne nécessite que peu ou pas de matériel pour la prise et ne pose pas de problème de conservation.

L'activité de la ou des molécule (s) de la composition chimique de l'invention a été démontrée suite à l'isolation par extraction, 1' identification et la sélection de la ou desdite (s) molécule (s) d'intérêt actives biologiquement à partir d'une plante d'Anthostema senegalense.

En conséquence, la présente invention concerne également un procédé d'isolation par extraction, d'identification et de sélection de la ou des molécules biologiquement active (s) de la composition chimique de l'invention.

Ce procédé permet d'extraire d'une plante d'Anthostema senegalense, la ou les molécule (s) d'intérêt qui est/sont alors d'origine entièrement naturelle. La ou les molécules d'intérêt étant celle (s) possédant une activité biologique à 1' encontre des pathogènes, en particulier une activité biologique qualifiée de « significative ».

Dans la présente demande, une activité biologique « significative » définit un composé possédant, à 1' encontre du pathogène, une concentration cytotoxique (CC ₅₀ ) ≥ 45 μg/mL et un index de sélectivité ≥ 50.

Ledit procédé comprend les étapes suivantes :

- On sèche une partie de la plante d'Anthostema senegalense, par exemple l'écorce du tronc ou les feuilles ;

- On prépare un extrait végétal à partir de la partie de la plante séchée par extraction avec un solvant polaire ou apolaire, à froid ou à chaud, par extraction aqueuse, alcoolique ou hydro-alcoolique ou par macération, infusion, décoction, percolation, digestion ou lixivation,

- On concentre sous vide ledit extrait végétal,

* On sépare les molécules de l'extrait végétal par chromatographie ,

~ On teste in Vitro l'activité biologique desdites molécules à 1' encontre d'un pathogène virale de type VIH selon la méthode de E de Clercq,

_* On sélectionne et isole les molécules possédant un index de sélectivité à 1' encontre dudit pathogène ≥ 50 et une CC 50 ≥ 45 μg/mL,

- On identifie la structure de la ou des molécules séparées et sélectionnées par Résonance Magnétique Nucléaire et spectrométrie de masse.

Selon un mode de réalisation particulier du procédé de 1' invention :

- la partie de la plante d'Anthostema sengalense qui est séchée consiste en l'écorce du tronc, ou en l'écorce de racine ou en des feuilles ou en des fruits ;

- on prépare un extrait végétal par percolation au CHC13 pour obtenir un extrait végétal apolaire ;

- après concentration sous vide, on sépare les molécules dudit extrait végétal apolaire par chromatographie sur colonne répétée sur gel de silice avec, comme éluant, un gradient de CHC1 ₃ dans de l'hexane et par chromatographie sur couche mince.

La chromatographie sur couche mince peut être effectuée avec, comme phase mobile, un mélange de dichlorométhane/toluène ou un mélange de toluène/chloroforme ou encore avec du chloroforme .

Ainsi, la mise ne œuvre du procédé de l'invention a permis d' identifier et d' isoler les molécules à activité biologique présentes dans un extrait végétal biologiquement actif à 1' encontre du VIH. Puis, la réalisation du procédé a permis de sélectionner, au travers du test In Vitro, les molécules possédant l'activité biologique « significative » et stimulatrice du système immunitaire.

Les expériences et résultats ci-dessous ont permis à la demanderesse d'illustrer l'activité biologique et stimulatrice du système immunitaire de la ou des molécules active (s) biologiquement de la composition chimique de l'invention.

1/Test in vitro de l'activité biologique des molécules de la composition chimique de l'invention

L'efficacité anti-réplication virale des molécules de la composition chimique de l'invention a été testée in vitro contre la réplication du virus du VIH de type 1 (souche III _B ) et du VIH de type 2 (souche ROD) au sein de cellules MT-4 infectées .

Cette efficacité a été réalisée en comparaison à trois molécules antirétrovirales témoins positifs : la néviparine, la didéoxycitidine et la didéoxyinosine .

Plus spécifiquement, l'activité antirétrovirale des molécules a été testée en mettant en œuvre la méthode de E De Clercq en microplaque.

Cette méthode consiste à réaliser une culture cellulaire de MT-4 en microplaque contenant, comme milieu de culture cellulaire : le milieu du Roswell Park Mémorial Institute (dit « RPMI 1640) , du sérum embryonnaire de veau, de la glutamine, du bicarbonate de sodium et de la gentamicine en tant qu'inhibiteur bactérien.

Les molécules de la composition chimique de l'invention sont ajoutées à des concentrations différentes au milieu de croissance cellulaire. Chaque concentration en molécules à tester est réalisée en triplica. Les cellules MT4 mises en présence des molécules à tester sont nommées « cellules traitées ». Dans chaque puits de croissance cellulaire est ajoutée une quantité définie de VIH -1 ou VIH -2 afin d'obtenir la même concentration de virus dans chaque puits .

Les cellules mises en présence du VIH sont nommées « cellules infectées ».

Cinq jours après le début de l'infection des cellules MT4 par le VIH 1 ou le VIH-2 en présence des molécules à tester à des concentrations différentes, on compte le nombre de cellules vivantes par un test colorimétrique au MTT (Sel de tétrazolium) en mesurant la densité optique à 540 nm.

En tant que témoins négatifs, on utilisera des cellules sans VIH 1 ou VIH 2, dites « cellules non infectées », mais aussi des cellules sans molécules à tester dites « cellules non traitées » .

Ainsi, de manière succincte, la méthode de E De Clercq permet d' obtenir une mesure de densité à 540 nm pour :

- des cellules infectées par le VIH-1 ou 2, traitées avec les molécules de la composition de l'invention ;

- des cellules non infectées, traitées avec les molécules de la composition de l'invention ;

- des cellules infectées par le VIH-1 ou VIH 2, non traitées avec les molécules de la composition de 1' invention ;

- des cellules non infectées, non traitées avec les molécules de la composition de l'invention.

En particulier, l'efficacité des molécules de la composition de l'invention a été testée :

- par mesure et calcul de la concentration inhibitrice médiane (IC ₅₀ ) ,

- par mesure et calcul de la concentration cytotoxique (CCso) ,

- par mesure et calcul de la dose effective 50 (EC ₅₀ ) , et

- par mesure et calcul de l'index de sélectivité (SI), des fractions contenant lesdites molécules en présence des deux souches de VIH. L' IC ₅₀ est la concentration en molécule permettant de diminuer de 50% la prolifération virale du témoin négatif in vitro pour un temps donné, c'est-à-dire du VIH sans substance, uniquement en croissance dans son milieu de culture.

La CC ₅₀ est la concentration en molécules actives permettant de diminuer de moitié l'effet cytopathique du VIH sur les cellules infectées. En d'autres termes, c'est la concentration en molécules actives permettant de diminuer de 50% la viabilité des cellules.

L'EC ₅₀ correspond à la concentration en molécules nécessaires pour que 50% des cellules en croissance dans le milieu ne subissent pas l'action du virus, c'est-à-dire qu'elles soient protégées de l'effet cytopathique du virus.

L'EC50 se calcule avec la formule suivante :

[(DO _T )VIH ⁺ ] - [(DO _c ) VIH ⁺ ]/[(DO _T ) VIH-] - [(DO _c ) VIH-] X 100 Où :

• (DO _T )VIH ⁺ représente la mesure de densité optique à 540 nm, 5 jours après l'infection, pour les cellules infectées avec du VIH et traitées avec la composition de l'invention, c'est à dire en présence des molécules de la composition de l'invention ;

* (DO c) VIH ⁺ représente la mesure de densité optique à 540 nm, 5 jours après l'infection, pour les cellules infectées avec du VIH en absence des molécules de la composition de l'invention ;

» (DO _T ) VIH" représente la mesure de densité optique à 540 nm, 5 jours après l'infection, pour les cellules non infectées avec du VIH et traitées avec la composition de l'invention, c'est à dire en présence des molécules de la composition de l'invention ; i (DO _c ) VIH- représente la mesure de densité optique à 540 nm, 5 jours après l'infection, pour les cellules non infectées avec du VIH en l'absence des molécules de la composition de 1' invention.

L'index de sélectivité représente le rapport CC ₅₀ / EC ₅₀ . Dans le cadre de la présente demande, il sera considéré que l'activité biologique à 1' encontre du pathogène, de préférence du VIH -1 et 2, est significative et qu'il y a une activité biologique stimulatrice de l'activité immunitaire, lorsque l'index de sélectivité est ≥ à 50 et une CC ₅₀ ≥ 45 pg/ml.

Les résultats sont illustrés dans le tableau 1 ci-dessous qui montre les valeurs moyennes obtenues sur des duplicatas pour l'ICSO, CC50 et SI :

On constate que les molécules présentes dans les fractions AsC4.2, AsC4.5, AsC4.6 et AsC4.7 possèdent une activité biologique significative à 1' encontre du VIH-1 et du VIH-2.

En particulier, les molécules présentes dans la fraction Asc4.5 présentent une activité significative contre le VIH de type 1 et de type 2.

Les molécules présentes dans chacune des fractions AsC4.2 , AsC4.5 , AsC4.6 et AsC4.7 possèdent une activité biologique significative à l' encontre du VIH de type 2. L' IC ₅₀ des molécules contenues dans chacune de ces fractions est meilleure que celle des témoins positifs de Nevirapine et Dideoxyinosine. Ainsi, les molécules de ces fractions agissent en synergie pour lutter contre la multiplication virale.

En particulier, les molécules des fractions AsC4.5 et Asc4.6 ont une forte activité biologique, meilleure que celles des antirétroviraux Nevirapine, Dideoxycitidin et Dideoxyinosine, à 1' encontre du VIH de type 2.

L'isolation, l'identification et la sélection des molécules à activité biologique significative de la composition chimique de l'invention, issues desdites fractions « actives biologiquement » sont décrites ci-dessous .

2/ Préparation des fractions, isolation et sélection des molécules à activité biologique de l'invention :

A partir d' un extrait brut d' écorce du tronc d' une plante d'Anthostema senegalense, on réalise, par percolation au CHC1 ₃ liquide, un extrait végétal polaire. On concentre sous vide ledit extrait végétal polaire.

Puis on réalise une chromatographie sur colonne avec, comme éluant, un gradient de polarité de CHC1 ₃ dans de l'hexane, ceci afin de séparer les constituants en fonction de leur charge. Suite à la chromatographie, on obtient dix fractions nommées respectivement Ascl à AsClO.

Une chromatographie sur couche mince est réalisée avec chacune des dix fractions AsCl, AsC2, AsC3, AsC4, AsC5, AsC6, AsC7, AsC8, AsC9, AsclO susmentionnées, afin de détecter le nombre de molécules potentiellement différentes de chacune des fractions .

Afin de démontrer l'activité biologique de chacune des fractions, notamment stimulatrices , du système immunitaire, chacune des fractions a été testée in vitro vis-à-vis du VIH de type 1 et du VIH de type 2, selon la méthode expliquée ultérieurement.

La fraction AsC4 a montré la meilleure activité anti VIH.

Cette fraction AsC4 contient donc un assemblage de molécules à activité biologique significative à 1' encontre du VIH.

Cette fraction AsC4 a, en conséquence, été séparée par chromatographie sur colonne jusqu' à obtention de 8 fractions allant de AsC4.1 à AsC4.8. L'activité anti-VIH a été testée in vitro selon la méthode de £ de Clerq sur chacune des fractions susmentionnées AsC4.1 , AsC4.2, AsC4.3, AsC4.4 , AsC4.5, AsC4.6, AsC4.7 et AsC4.8.

Les fractions AsC4.5 ; AsC4.6 ; AsC4.2 et AsC4.7 ont montré les meilleures activités antivirales telles qu'illustrées dans le tableau 1 susmentionné.

Ainsi, les molécules présentes en majorité dans ces fractions sont responsables de l'activité biologique anti VIH.

Plus spécifiquement, la fraction AsC4.5 présente une activité biologique « significative » au sens de l'invention contre le VIH-1 et la meilleure activité biologique « significative » à 1' encontre du VIH-2.

Plus précisément également, à 1' encontre du VIH-2, l'intégralité des fractions AsC4.5 ; AsC4.6 ; AsC4.2 et AsC4.7 présentent une activité biologique « significative » au sens de 1' invention.

Un échantillon de chacune de ces fractions AsC4.5 et AsC4.6 a été séparé par chromatographie en gel de silice Si02 , puis les molécules ont été identifiées par RMN (Résonnace Magnétique Nucléaire) et Spectrométrie de Masse.

Les résultats montrent une présence majoritaire, dans chacun de ces échantillons AsC4.5 et AsC4.6 , de ladite molécule A et de ladite molécule B, en plus d' une série d' autres molécules plus minoritaires .

Ainsi, la molécule A et la molécule B sont envisagées comme étant responsables de l'activité biologique « significative » de chacun des échantillons AsC4.5 et Asc4.6.

Afin de confirmer cette opinion, d'autres analyses ont été réalisées .

En particulier ; l'intégralité des fractions AsC4.5,

AsC4.6 , AsC4.2 et AsC4.7 présentant une activité biologique anti-VIH a été mélangée et séparée sur colonne de chromatographie en gel de silice Si0 ₂ de façon répétitive (au moins six fois) avec, comme éluant, du toluène/CHCl ₃ créant un gradient de polarité pour obtenir les sous- fractions nommées AsC4.5.1 à AsC4.5.7. Chacune des sous- fractions AsC4.5.1 à AsC4.5.7 a fait l'objet d'un test in vitro tel que susmentionné sur le virus du VIH 1 et du VIH 2. Les résultats des tests ont montré une activité inhibitrice significative contre ces deux souches pour chacune des sous-fractions testées.

Chacune des sous fractions susmentionnées Asc4.5.1, AsC4.5.2, AsC4.5.3, AsC4.5.4, AsC4.5.5, AsC4.5.6, AsC4.5.7 a été séparée et purifiée sur chromatographie sur couche mince préparative en utilisant différents éluants comme phase mobile.

Les éluants utilisés en tant que phase mobile sont les suivants :

- une phase mobile de CH ₂ Cl ₂ /Toluène dans un ratio 1 :2 volume à volume,

- une phase mobile de Toluène / CHC13 dans un ratio 4 : 1 volume à volume ;

- une phase mobile de Toluène / CHC1 ₃ dans un ratio 1 : 1 volume à volume ;

- une phase mobile de CHC13 100%.

Plus d'une dizaine de composés différents a été obtenue pour l'ensemble des différentes phases mobiles utilisées. Chaque composé a été testé individuellement à 1' encontre du VIH-1 et du VIH-2 selon la méthode in vitro susmentionnée.

De manière spécifique, parmi l'ensemble des composés, seuls les composés ci-dessous ont montrés une activité biologique « significative » au sens de l'invention à 1' encontre de la prolifération du VIH-1 ou 2.

- Les composés AsC4.5.1.1 et R.3.6.6.1, obtenus avec une phase mobile de CH ₂ Cl ₂ /Toluène dans un ratio 1 :2 volume à volume ;

- Le composé AsC4.5.2.1, obtenu avec une phase mobile de

Toluène / CHC1 ₃ dans un ratio 4 : 1 volume à volume ;

- Le composé AsC4.5.4.1, obtenu avec une phase mobile de Toluène / CHC1 ₃ dans un ratio 1 : 1 volume à volume ;

- Les composés AsC4.5.5.1, AsC4.5.6.1, AsC4.5.7.1 et AsC4.5.7.2, obtenus avec une phase mobile de CHC1 ₃ 100% . De manière avantageuse, les composés AsC4.5.1.1 et AsC4.5.7.2 présentent une activité inhibitrice au moins deux fois supérieure à l' encontre du VIH-1 et du VIH-2 à celle des autres composants identifiés comme possédant une activité biologique « significative ».

L'identification de l'ensemble des composés à activité biologique « significative » susmentionnés a été réalisée par résonnance magnétique nucléaire et spectrométrie de masse.

Après identifications, il s'avère que les composés identifiés qui possède une activité à 1' encontre du VIH-1 et du VIH-2 sont constitués par les molécules A à J susmentionnées .

De manière plus précise, il a été constaté que les composés AsC4.5.1.1 et AsC4.5.7.2 correspondent respectivement à la molécule A et à la molécule B revendiquées dans l'invention. Ces deux molécules A et B sont, en conséquence, bien responsables de l'effet inhibiteur significatif de la prolifération du VIH-1 et 2.

En outre , dans les fractions les plus actives AsC4.5 et AsC4.6 à l' encontre du VIH-1, il été constaté que les deux molécules A et B sont représentées majoritairement et en forte concentration.

De la même manière, toujours à l' encontre du VIH-1, dans la fraction active AsC4.2 on retrouve majoritairement la molécule A mais pas la molécule B, et dans la fraction active AsC4.7 on retrouve majoritairement la molécule B mais pas la molécule A.

En conséquence, l'effet technique d'inhibition de la prolifération du VIH 1 ou 2 des fractions à activité inhibitrice « significative » est dû à la présence spécifique et à l'action des molécules A et/ou B.

La molécule A, ainsi que la molécule B possèdent une activité d' inhibition de la prolifération du VIH-1 ou 2 , chacune des molécules A ou B étant capable de stimuler l'activité immunitaire d'un organisme infecté.

Au regard de ces résultats, les molécules A et B seules ou combinées ont été spécialement sélectionnées et choisies par la demanderesse, parmi les molécules A à J pour lesquelles une activité d'inhibition du VIH-1 et 2 a également été constatée, pour les inclure dans la composition chimique de l'invention stimulant biologiquement l'activité immunitaire.

II résulte de ces études que chacune des molécules A à J de l'invention isolées par les techniques susmentionnées présentent une activité synergique inhibitrice à 1' encontre de la prolifération au sein des cellules infectées par le VIH de type 1 et du VIH de type 2. L' activité biologique de chacune de ces molécules prise individuellement ou en combinaison à l' encontre du VIH-1 ou VIH-2 a été démontrée par ces expériences .

Plus spécifiquement, les molécules A et B étant représentées en majorité dans les fractions à activité inhibitrice de la prolifération du VIH -1 et VIH-2, sont considérées comme responsables de l'activité biologique majoritaire et principale à 1' encontre des virus, en particulier du VIH 1 ou 2.

Des études complémentaires de l'activité biologique des molécules A et B, prises seules ou en combinaison ont montré que l'activité biologique contre le VIH est essentiellement due à la présence de ces deux molécules. En particulier, la présence de la molécule A et/ou B dans une composition chimique a ainsi pour effet d' inhiber la prolifération virale du VIH-1 et 2 donc de stimuler biologiquement le système immun.

C'est pourquoi, dans une démarche inventive, la demanderesse a sélectionné spécifiquement les molécules A et/ou B parmi l'ensemble des molécules A à J présentant une activité biologique, car ces deux molécules A et B présentent l'effet significatif attendu contre la prolifération du VIH-1 et 2 et permettent de stimuler l'activité immunitaire.

Les résultats d'expériences ont montré qu'aussi bien la molécule A seule, la molécule B seule, ou la combinaison des deux molécules A et B, a/ont une activité biologique significative à 1' encontre du VIH-1 ou 2. De plus, l'activité biologique significative est augmentée en présence des deux molécules A et B. En conséquence, il y a bien synergie entre les deux molécules quant à leur activité et leur effet contre le VIH-1 ou 2. En d' autres termes , une synergie existe entre ces deux molécules pour accroître leur effet inhibiteur respectif contre la prolifération du VIH 1 ou 2.

De manière avantageuse, la composition chimique de l'invention propose une alternative efficace, peu coûteuse, accessible aux pays en voie de développement, de production facile si elle est issue d'origine naturelle, qui soit biologiquement active et stimulatrice de l'activité immunitaire .

En particulier, la composition chimique de l'invention peut être utilisée dans le domaine pharmaceutique dans le traitement de l'infection par le virus du VIH, du SIDA et des manifestations cliniques qui l'accompagnent.

En outre, la composition chimique de l'invention peut être utilisée également en tant que complément alimentaire permettant de stimuler l'activité immunitaire et les défenses immunes naturelles de l'être humain qui peut être immunodéprimé.