DEGISTIRICI, Özer (Weissdornweg 38, Bonn, 53177, DE)
THIE, Michael (Kolumbusring 17, Bonn, 53175, DE)
DEGISTIRICI, Özer (Weissdornweg 38, Bonn, 53177, DE)
Patentansprüche
1. Therapeutische Zusammensetzung zumindest bestehend aus einer zellfreien Substanz, die aus stimulierten Stamm- und/oder Vorläuferzellen hervorgegangen ist.
2. Therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die zellfreie Substanz eine Zellkultur ist, in der die lebenden Zellen abgetötet und/oder Zellbestandteile zumindest teilweise entfernt sind.
3. Therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die zellfreie Substanz Zellextrakt und/oder Zellsekret umfasst.
4. Therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die zellfreie Substanz Knochen- oder Knorpelmatrix ist.
5. Therapeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Stammzellen multipotente Zellen aus einem Weichgewebe eines Zahns, vorzugsweise Follikel oder Pulpa, sind.
6. Therapeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Stammzellen Zellen eines kissenartigen Weichgewebes sind, das unmittelbar an der apikalen Seite eines extrahier- ten unreifen Zahns unterhalb der Papille lokalisierbar ist.
7. Therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das kissenartige Weichgewebe ein Zellverbund aus einer Anlage eines impaktierten und/oder retinierten Zahns in der Entwicklungsphase zwischen dem Auftreten des knöchernen Alveolarfundus und dem Abschluss der Wurzelbildung ist.
8. Therapeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die zellfreie Substanz ein definiertes Verhältnis von Calcium zu Phosphat aufweist.
9. Therapeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die zellfreie Substanz ein definiertes Verhältnis von Calciumphosphat zu Kollagen aufweist.
10. Verfahren zur Herstellung einer therapeutische Zusammensetzung, bei dem Stamm- und/oder Vorläuferzellen isoliert, in vitro kultiviert und zur an- schließenden Differenzierung stimuliert werden, wobei die Zellen nach der
Differenzierung zur Herstellung einer zellfreien Substanz abgetötet und/oder zumindest teilweise entfernt werden, dadurch gekennzeichnet, dass die zellfreie Substanz für die therapeutische Verwendung hergerichtet wird.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die zellfreie Substanz zerkleinert, pulverisiert und/oder gefriergetrocknet wird.
12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass die zellfreie Substanz in Form einer Paste, Salbe oder Suspension hergerichtet wird.
13. Verfahren nach Anspruch 10, 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Stamm- und/oder Vorläuferzellen osteogen und/oder chondrogen sti- muliert werden.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Dauer der Stimulation zur Einstellung bestimmter Eigenschaften der zellfreien Substanz variiert wird.
15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass durch die Wahl einer bestimmten Stimulationsdauer ein definiertes Verhältnis von Calcium zu Phosphat und/oder von Calciumphosphat zu Kollagen eingestellt wird.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Stamm- und/oder Vorläuferzellen derart stimuliert werden, dass sie eine Knochen- oder Knorpelmatrix bilden.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass intakte oder zerkleinerte Knochen- oder Knorpelmatrix zum Aufschluss der Zellen mit einer hypotonen Lösung und/oder in flüssigen Stickstoff behandelt wird.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die aufgeschlossenen Zellen unter Schütteln in Salzlösung und/oder Säure/Base ausgewaschen, und/oder mit Triton-X100 und/oder SDS behandelt werden.
19. Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, dass die aufgeschlossenen Zellen mit RNAse und DNAse behandelt werden.
20. Verfahren nach Anspruch 17, 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass die aufgeschlossenen Zellen mit einer Pufferlösung gewaschen und/oder dialysiert werden.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Stammzellen aus einem Weichgewebe eines Zahns, vorzugsweise Follikel oder Pulpa, isoliert werden.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Stammzellen aus einem kissenartigen Weichgewebe, das unmittelbar an der apikalen Seite eines extrahierten unreifen Zahns unterhalb der Papille lokalisierbar ist, isoliert werden.
23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass das kissenartige Weichgewebe aus einer Anlage eines impaktierten und/oder retinier- ten Zahns in der Entwicklungsphase zwischen dem Auftreten des knöchernen Alveolarfundus und dem Abschluss der Wurzelbildung gewonnen wird.
24. Verfahren nach Anspruch 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, dass das kissenartige Weichgewebe nach dem chirurgischen Entfernen des Zahns entlang einer makroskopisch sichtbaren Grenze zwischen dem kissenarti- gen Weichgewebe und der Papille von dem Zahn getrennt wird.
25. Therapeutische Zusammensetzung hergestellt nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 24.
26. Zellfreie Knochenmatrix, hergestellt mittels des Verfahrens nach einem der Ansprüche 10 bis 24.
27. Zellfreie Knorpelmatrix, hergestellt mittels des Verfahrens nach einem der Ansprüche 10 bis 24.
28. Verwendung einer zellfreien Substanz für therapeutische Zwecke im Rahmen einer Gewebeersatztherapie.
29. Verwendung eines zellfreien Zellextrakts und/oder Zellsekrets für thera- peutische Zwecke im Rahmen einer Gewebeersatztherapie.
30. Verwendung einer zellfreien Knochen- oder Knorpelmatrix für therapeutische Zwecke im Rahmen einer Gewebeersatztherapie. |
Therapeutische Zusammensetzung und Verwendung einer zellfreien Substanz
Erfindungsgebiet
Die Erfindung betrifft eine therapeutische Zusammensetzung, ein Verfahren zur Herstellung einer therapeutischen Zusammensetzung sowie die Verwendung einer zellfreien Substanz, insbesondere einer zellfreien Knochen- oder Knorpelmatrix.
Hintergrund der Erfindung
Die Rekonstitution größerer knöcherner Defekte und kleinerer Defekte in der Kieferchirurgie/Orthopädie ist noch immer ein gravierendes therapeutisches Problem. Das Einbringen von künstlich hergestellten Ersatzmaterialien (Biomaterialien) in die knöcherne Defektzone führte in der Vergangenheit nur zu unbefriedigenden Ergebnissen. So sind größere, mit Hydroxylapatit (HA) aufgefüllte ossäre Bereiche biochemisch instabil und bergen das Risiko einer Fraktur. Wei- tere unerwünschte Wirkungen von implantierten Biomaterialien sind eine chronisch aseptische Entzündungsreaktion und ein erhöhtes lokales Infektionsrisiko durch Störung der körpereigenen Immunitätslage (Vacanti et ai, 1998).
Aufgrund mangelnder Alternativen (wie z.B. der alleinige Einsatz von Biomate- rialien mit niedriger biologischer Wertigkeit) sind autologe Knochen- und Knochenmarktransplantate (Spongiosa) noch immer Standard (Gerngross et ai, 1982; Jerosch & Plewka, 1992; Rueger, 1998). Dieses Verfahren erfordert jedoch einen zweiten Eingriff und führt bei ca. 55% aller Operationen zu dauerhaften Beschwerden. Die deutlich längeren Heilungszeiten dieser Therapie füh- ren zu einer zusätzlichen Belastung des Gesundheitswesens. Ferner steht au- tologer Knochensubstanz nur sehr begrenzt zur Verfügung (Wippermann et ai, 1997).
Als Stammzellen bezeichnet man Körperzellen, die nicht differenziert sind, d. h. Stammzellen sind noch nicht für eine Aufgabe im Organismus spezialisiert, beispielsweise als Haut- oder Leberzelle. Aus Stammzellen können durch Teilung weitere Stammzellen entstehen und/oder ausdifferenzierte Zellen hervorgehen, d. h. Stammzellen sind in der Lage sich asymmetrisch zu teilen. Eine Stammzelle behält ihre Teilungsfähigkeit dabei über einen sehr langen Zeitraum, oft sogar während des gesamten Lebens des Organismus. Ausgelöst durch spezifische Signale während der Entwicklung des Organismus kann eine Stammzelle in unterschiedliche Zelltypen differenzieren, die dann den Organismus bilden. Man unterscheidet im Allgemeinen zwischen embryonalen und adulten Stammzellen.
Embryonale Stammzellen (ES - Zellen), die aus einem Embryo bis zum 8-ZeII- Stadium gewonnen werden, werden als totipotent bezeichnet. Aus diesen ZeI- len entwickelt sich der vollständige Organismus (Mensch). Embryonale Stammzellen aus späteren Blastozysten-Stadien bezeichnet man als pluripotent, da sich aus ihnen in der Regel noch sämtliche Arten von Körperzellen des Endoderms (Wandzellen des Verdauungstraktes), Mesoderms (Muskeln, Knochen, Blutzellen) und Ektoderms (Hautzellen und Nervengewebe) differenzieren kön- nen, aber kein vollständiger Organismus mehr. Aus ethischen Gründen und aufgrund von Problemen mit der molekularen Kontrolle der Zelldifferenzierung sind ES - Zellen aber bisher therapeutisch nicht anwendbar.
Adulte Stammzellen (AS - Zellen) dagegen entstehen nach dem embryonalen Stadium, sind also undifferenzierte Zellen, die in einem differenzierten Gewebe angesiedelt sind und aus denen spezialisierte Zellen hervorgehen, die denen des differenzierten Gewebes entsprechen. ES - Zellen können aber auch in Zelltypen differenzieren, die einem anderen Gewebe zuzuordnen sind. Adulte Stammzellen, die in Organen, im Knochenmark oder auch in der Nabelschnur zu finden sind, können sich aber nicht mehr so frei differenzieren wie embryonale Stammzellen. Obwohl adulte Stammzellen nicht das gleiche Differenzierungspotential wie embryonale Stammzellen besitzen, haben sie dennoch keimblattüberschreitendes Differenzierungspotential. Man bezeichnet sie daher als
multipotent. So können sich zum Beispiel mesenchymale Stammzellen, die aus dem Mesoderm stammen, auch zu neuronalen Zellen differenzieren, welche sich sonst aus dem Ektoderm entwickeln. AS - Zellen sind also in der Lage, nach übersiedlung in einen anderen Gewebetyp in einen Zelltyp zu differenzie- ren, der nicht dem ihres Stammgewebes entspricht. Adulte Stammzellen sind in jedem Organ verfügbar, beispielsweise im Knochenmark. Die Entnahme von Knochenmark ist aber eine komplizierte und riskante Operationstechnik. Die Gewinnung von Stammzellen aus Zahngewebe ist im Gegensatz hierzu eine weniger aufwendige Alternative, wie für AS - Zellen aus Zahnfollikel in der WO 03/066840 A2 beschrieben. Solche Stammzellen aus leicht zugänglichem Gewebe eröffnen beispielsweise die Perspektive des Gewebeersatzes durch körpereigene Zellen. Auch scheint die Neigung zur malignen Entartung bei Implantation adulter Stammzellen kleiner zu sein als bei embryonalen Stammzellen. Adulte Stammzellen sind also für die Entwicklung innovativer therapeutischer Ansätze von steigender Bedeutung.
Aus der EP 0 957 944 B1 ist ein Verfahren zur Herstellung einer mit osteogenen Zellen besiedelten Knochenmatrix bekannt, die nach Implantation in vivo die Knochenneubildung durch Induktion von Differenzierungsvorgängen in den Zellen des umgebenden Gewebes stimulieren soll. Zu diesem Zweck werden zunächst osteogene Vorläuferzellen aus Explantaten somatischer Zellen der Haut, des Knorpels, des Knochens oder des Zahnapparates, insbesondere humane Stammzellen aus dem Beckenkamm, isoliert. Die isolierten Zellen werden in vitro durch Zugabe von Wachstumsfaktoren, beispielsweise Bone Morphoge- netic Proteins (BMPs), stimuliert und dadurch zur Synthese von Knochenmatrix angeregt. Die Knochenmatrix kann dann durch enzymatische Behandlung oder Einfrieren und anschließendes Waschen von den Zellen getrennt werden, so dass eine zellfreie Knochenmatrix entsteht. Diese zellfreie Knochenmatrix wird dann wieder mit frischen osteogenen Zellen neu besiedelt, wodurch ein autolo- ger, zellbeladener Knochenersatz entsteht. Bei diesem Verfahren werden also osteogene Zellen und Knochenmatrix getrennt hergestellt und anschließend zur Herstellung eines Knochenersatzmaterials wieder zusammengebracht. Der Einsatz eines zellhaltigen Knochenersatzes hat aber den Nachteil, dass dieser
aufgrund der antigenen Eigenschaften der lebenden Zellen zu immunogenen Abstoßungsreaktionen führen kann, wenn die Zellen nicht von der zu behandelnden Person selbst stammen. Eine solche zellbeladene Knochenmatrix ist folglich in der Therapie nicht universell einsetzbar.
Zusammenfassung der Erfindung
Es ist daher Aufgabe der Erfindung, eine therapeutische Zusammensetzung zur hocheffizienten Vorbereitung von Patienten, die aufgrund von Defiziten im Gewebeaufbau nicht oder nur unter Schwierigkeiten mit Implantaten versorgt wer- den können, zu schaffen.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch eine therapeutische Zusammensetzung gelöst, die zumindest aus einer zellfreien Substanz besteht, welche aus stimulierten Stamm- und/oder Vorläuferzellen hervorgegangen ist. Dadurch, dass die therapeutische Zusammensetzung frei von Zellen ist und keine typischerweise antigenen Zellbestandteile enthält, kommt es bei der therapeutischen Anwendung in vivo nicht zu immunogenen Reaktionen. Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann also unabhängig von der Herkunft der Stamm- und/oder Vorläuferzellen universell zur Therapie eingesetzt werden und ihre natürliche regenerative Potenz für den Gewebeersatz, beispielsweise einen geeigneten Knochen- und/oder Knorpelaufbau hocheffizient nutzen. Die erfin- dungsgemäße therapeutische Zusammensetzung kann die Neubildung von zerstörtem Gewebe in vitro und in vivo stimulieren, obwohl sie selbst keine Stammzellen mehr enthält. Offenbar sind die in den stimulierten Stamm- und/oder Vorläuferzellen enthaltenen oder durch diese Zellen produzierten Stoffe ausreichend, um eine effektive Gewebeersatztherapie zu ermöglichen oder zumindest zu unterstützen. Die erfindungsgemäße Zusammensetzung enthält dabei keine antigenen Zellbestandteile und kann somit bei allen Patienten ohne das Risiko immunogener Reaktionen angewandt werden. Dies ermöglicht eine industrielle Produktion des Präparats und sichert somit ständige Verfügbarkeit.
In vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen, dass die zellfreie Substanz eine Zellkultur ist, in der die lebenden Zellen abgetötet und/oder Zell-
bestandteile zumindest teilweise entfernt sind. Dabei müssen alle antigenen Bestandteile, beispielsweise Antigene der Zelloberfläche oder andere Proteine, effektiv entfernt werden. Nukleinsäuren sollten ebenfalls entfernt oder zumindest vollständig degradiert werden, um etwaige Risiken durch das Einbringen von genetischem Material auszuschließen.
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung umfasst die zellfreie Substanz Zellextrakt und/oder Zellsekret, d. h. antigenfreie Zellbestandteile, Zellin- haltsstoffe und/oder Stoffe, die durch die stimulierten Zellen produziert wurden.
In besonders vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung ist die zellfreie Substanz sich entwickelnde Knochenmatrix. Die Bildung dieser Matrix erfolgt auf der Basis ektomesenchymaler Vorläuferzellen und kommt in ihrem Wesen der der embryonalen Knochenbildung nahe, so dass die erfindungsgemäße Zusam- mensetzung hinsichtlich der wachstumsfördernden Modulatoren in einer Knochenersatztherapie eingesetzt bzw. verwendet werden kann (Katalysator beim Knochenaufbau). Die zellfreie Knochenmatrix ermöglicht dabei eine gezielte Stimulation des Knochenaufbaus in vivo, ohne dass mit immunogenen Reaktionen zu rechnen ist. So können beispielsweise Patienten, die aufgrund von Defi- ziten im Knochenaufbau nicht oder nur unter Schwierigkeiten mit Implantaten, z. B. Zahnimplantaten, versorgt werden können, durch Einbringen der therapeutischen Zusammensetzung in das defekte Gewebe auf einfache Weise und ohne Risiko vorbereitet werden. Zusätzlich oder alternativ kann die zellfreie Substanz auch Knorpelmatrix sein, so dass mittels der erfindungsgemäßen Zusammen- setzung auch defektes Knorpelgewebe regeneriert werden kann. Die therapeutische Zusammensetzung kann also auch zur Behandlung von Verletzungen oder degenerativen Erkrankungen in Gelenken verwendet werden.
Die Stamm- und/oder Vorläuferzellen, die die zellfreie Substanz bilden, können in vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung multipotente Zellen aus einem
Weichgewebe eines Zahns sein. Vorzugsweise können Stammzellen aus Follikel oder Pulpa eingesetzt werden. Besonders bevorzugt sind Stammzellen aus einem kissenartigen Weichgewebe, das unmittelbar an der apikalen Seite eines
extrahierten unreifen Zahns unterhalb der Papille lokalisierbar ist. Das kissenartige Weichgewebe ist vorteilhafter Weise ein Zellverbund aus einer Anlage eines impaktierten und/oder retinierten Zahns in der Entwicklungsphase zwischen dem Auftreten des knöchernen Alveolarfundus und dem Abschluss der Wurzel- bildung. Um die gewünschten multipotenten Stammzellen isolieren zu können, sollte das kissenartige Weichgewebe nach dem chirurgischen Entfernen des Zahns entlang einer makroskopisch sichtbaren Grenze zwischen dem kissenartigen Weichgewebe und der Papille, vorzugsweise unterhalb einer gedachten Linie zwischen den sich entwickelnden Wurzelfortsätzen, von dem Zahn ge- trennt werden. Das derart ausgewählte Gewebe ermöglicht die Isolierung ekto- mesenchymaler Stamm- bzw. Vorläuferzellen, die sich aufgrund ihrer Multipo- tenz in unterschiedliche Zelltypen, beispielsweise Knochen- oder Knorpelzellen, differenzieren lassen. Die Wahl des richtigen Ursprungsgewebes für die Isolierung der Stammzellen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ist ein wesent- licher Faktor für eine hohe Ausbeute an multipotenten Stammzellen. Die isolierten Zellen sind ektomesenchymale Stamm- und/oder Vorläuferzellen, die nach der Isolierung aus dem Gewebeverbund osteogen und/oder chondrogen stimuliert werden können.
In besonders vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung weist die zellfreie Substanz ein definiertes Verhältnis von Calcium zu Phosphat auf. Durch das gezielte Einstellen eines definierten Calcuim/Phopshat-Verhältnisses kann beispielsweise Knochenmatrix hergestellt werden, die einem jungen Knochen oder einem alten Knochen entspricht. Je nach dem wie lange die Stammzellen unter osteogener Stimulation kultiviert werden, kann die erfindungsgemäße zellfreie Substanz also gezielt für die gewünschte Anwendung konfektioniert werden. Das Calcium/Phosphat-Verhältnis liefert Hinweise auf das Alter des Knochens (Dorozhkin, S.V., Epple, M. 2002). Erfindungsgemäß kann folglich eine therapeutische Zusammensetzung bereitgestellt werden, die eine zellfreie Substanz mit einem definierten Calcium/Phosphat-Verhältnis umfasst, vorzugsweise ein Calcium/Phosphat-Verhältnis zwischen 0,5 und 2,0, so dass ein für die gewünschte Therapie optimiertes Heilmittel vorliegt, welches definierte Eigenschaften aufweist. Darüber hinaus kann die zellfreie Substanz auch ein definier-
tes Verhältnis von Calciumphosphat zu Kollagen aufweisen, so dass auch die Qualität der therapeutischen Zusammensetzung genau eingestellt werden kann.
Die Aufgabe wird ferner erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Herstellung einer therapeutische Zusammensetzung gelöst, bei dem Stamm- und/oder Vorläuferzellen isoliert, in vitro kultiviert und zur anschließenden Differenzierung stimuliert werden, wobei die Zellen nach der Differenzierung zur Herstellung einer zellfreien Substanz abgetötet und/oder zumindest teilweise entfernt wer- den, und wobei die zellfreie Substanz für die therapeutische Verwendung hergerichtet wird. Erfindungsgemäß wird also im Gegensatz zum Stand der Technik eine zellfreie Substanz, die aus stimulierten Stamm- und/oder Vorläuferzellen hervorgegangen ist bzw. produziert wurde, direkt in eine therapeutische Anwendungsform gebracht, ohne sie erneut mit Stammzellen zu besiedeln. Ll- berraschender Weise hat sich nämlich herausgestellt, dass die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte therapeutische Zusammensetzung die Neubildung von zerstörtem Gewebe in vitro und in vivo stimulieren kann, obwohl sie nicht mit frischen Stammzellen besiedelt wird. Offenbar sind die in den stimulierten Stamm- und/oder Vorläuferzellen enthaltenen oder durch diese ZeI- len produzierten Stoffe ausreichend, um eine effektive Gewebeersatztherapie zu ermöglichen oder zumindest zu unterstützen. Das Herstellungsverfahren wird dadurch erheblich vereinfacht und zudem kostengünstiger, da parallel zur Erzeugung der zellfreien Substanz keine Stamm- oder Vorläuferzellen mehr kultiviert werden müssen.
Erfindungsgemäß wird die zellfreie Substanz vorzugsweise zerkleinert, pulverisiert und/oder gefriergetrocknet, so dass ein leicht zu handhabendes und zu verarbeitendes Produkt entsteht. Die zellfreie Substanz kann dann erfindungsgemäß beispielsweise in Form einer Paste, Salbe oder Suspension hergerichtet werden. In dieser oder ähnlicher Form kann die zellfreie Substanz bzw. die therapeutische Zusammensetzung auf einfache Weise in das zu behandelnde Gewebe eingebracht werden. Diese schonende Art der Applikation ist von beson-
derem Vorteil, da hierdurch zusätzliche, den Patenten belastende Eingriffe vermieden werden können.
In besonders vorteilhafter Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, die Stamm- und/oder Vorläuferzellen osteogen und/oder chondro- gen zu stimulieren. Dabei können die Stamm- und/oder Vorläuferzellen derart stimuliert werden, dass sie eine Knochen- oder Knorpelmatrix bilden bzw. produzieren. Diese Matrix und jede andere Substanz, die in vitro ohne zusätzliche Hilfsmittel wie beispielsweise Trägermaterialen entsteht, kann dann durch en- zymatische, chemische oder mechanische Behandlung von lebenden Zellen und/oder antigenen Zellbestandteilen befreit und anschließend zur Herstellung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung verwendet werden. Lebenden Zellen sollten dabei zumindest abgetötet und/oder antigene Zellbestandteile möglichst vollständig entfernt werden. Nukleinsäuren sollten ebenfalls entfernt oder zumindest vollständig degradiert werden, um etwaige Risiken durch das Einbringen von genetischem Material auszuschließen. Vorzugsweise wird die intakte oder zerkleinerte Knochenmasse mit einer hypotonen Lösung (z.B. deionisiertes Wasser) behandelt und/oder in flüssigen Stickstoff zur Eiskristallbildung behandelt, um die Zellmembranen zu zerstören und die Zellen zu lysieren. Abhängig vom Reifegrad des Knochengewebes und der damit gewünschten Zusammensetzung des späteren Produktes werden die Proben unter Schütteln in Salzlösung (z.B. 3M NaCI) und/oder Säure/Base (z.B. 0,15-1 % per acidic acid-PAA) ausgewaschen, und/oder in Triton-X100 (0,1%-1%) und/oder SDS (0,1%-1%) für unterschiedliche Zeiten extrahiert. Zwischenschritte zur bioche- mischen Veränderung der organischen Knochengrundsubstanz mit Enzymen (z.B. Trypsin-EDTA) sind wahlweise möglich. Zwischenschritte zur chemischen Veränderung der anorganischen Grundsubstanz mit Säuren/Basen sind ebenso möglich. Um freigesetzte Nukleinsäuren (RNA und DNA) zu entfernen, wird die Knochengrundsubstanz mit RNAse und DNAse behandelt. Anschließend wird die zellfreie Knochengrundsubstanz mit Pufferlösung (z.B. PBS) gewaschen, dialysiert und lyophilisiert, pulverisiert und in Form einer Paste, Salbe oder Suspension hergerichtet.
Erfindungsgemäß kann die Dauer der Stimulation zur Einstellung bestimmter Eigenschaften der zellfreien Substanz variiert werden. In besonders vorteilhafter Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann beispielsweise durch die Wahl einer bestimmten Stimulationsdauer ein definiertes Verhältnis von Calcium zu Phosphat und/oder von Calciumphosphat zu Kollagen eingestellt werden. Die Stimulationsdauer, d. h. die Dauer der Kultivierung der Stammzellen in Anwesenheit der stimulierenden Substanzen, liegt erfindungsgemäß zwischen 15 und 50 Tagen, vorzugsweise zwischen 20 und 45 Tagen, besonders bevorzugt zwischen 21 und 42 Tagen. Durch die gezielte Wahl einer bestimmten Stimulationsdauer kann der Reifegrad und die Qualität der zellfreien Substanz beeinflusst und somit definiert eingestellt werden. Je kürzer die Stimulationsdauer ist, umso geringer ist der Reife- bzw. Mineralisierungsgrad (kleines Calcium/Phosphat-Verhältnis) der erzeugten Knochenmatrix bzw. zellfreien Substanz. Je länger die Stimulationsdauer ist, umso höher ist der Reife- bzw. Mineralisierungsgrad (großes Calcium/Phosphat-Verhältnis) der erzeugten Knochenmatrix bzw. zellfreien Substanz. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht also in besonders vorteilhafter Weise die gezielte Einstellung der Eigenschaften des Verfahrensproduktes durch die Wahl einer bestimmten Stimulationsdauer.
In weiterer besonders vorteilhafter Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass die Stammzellen aus einem Weichgewebe eines Zahns, wie beispielsweise Follikel oder Pulpa, isoliert werden. Bevorzugt werden die Stammzellen aus einem kissenartigen Weichgewebe, das unmittelbar an der apikalen Seite eines extrahierten unreifen Zahns unterhalb der Papille lokalisierbar ist, isoliert. Im Hinblick auf die Multipotenz der im Zuge des erfin- dungsgemäßen Verfahrens zu isolierenden Stammzellen ist es besonders vorteilhaft, wenn das kissenartige Weichgewebe aus einer Anlage eines impaktier- ten und/oder retinierten Zahns in der Entwicklungsphase zwischen dem Auftre- ten des knöchernen Alveolarfundus und dem Abschluss der Wurzelbildung gewonnen wird. Um die gewünschten multipotenten Stammzellen isolieren zu können, sollte das kissenartige Weichgewebe nach dem chirurgischen Entfernen des Zahns entlang einer makroskopisch sichtbaren Grenze zwischen dem
kissenartigen Weichgewebe und der Papille, vorzugsweise unterhalb einer gedachten Linie zwischen den sich entwickelnden Wurzelfortsätzen, von dem Zahn getrennt werden. Das derart ausgewählte Gewebe ermöglicht die Isolierung ektomesenchymaler Stamm- bzw. Vorläuferzellen, die sich aufgrund ihrer Multipotenz in unterschiedliche Zelltypen, beispielsweise Knochen- oder Knorpelzellen, differenzieren lassen. Die Wahl des richtigen Ursprungsgewebes für die Isolierung der Stammzellen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ist ein wesentlicher Faktor für eine hohe Ausbeute an multipotenten Stammzellen. Der Gewebeverbund kann zur weiteren Kultivierung der Zellen durch enzymatische Behandlung, vorzugsweise mit Collagenase/Dispase, aufgelöst werden. Dabei können die Zellen nach der Gewinnung aus dem Gewebeverbund auch vereinzelt werden. Die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens isolierten Zellen sind ektomesenchymale Stamm- und/oder Vorläuferzellen, die nach der Isolierung aus dem Gewebeverbund in vitro osteogen und/oder chondrogen stimuliert werden können.
Jede mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellte therapeutische Zusammensetzung ist ebenfalls Gegenstand der Erfindung. Insbesondere jede mittels des zuvor beschriebenen Verfahrens hergestellte zellfreie Knochen- und/oder Knorpelmatrix.
In besonders vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung kann die zuvor beschriebene zellfreien Substanz wie bereits erläutert für therapeutische Zwecke im Rahmen einer Gewebeersatztherapie verwendet werden. Die Erfindung um- fasst ferner die Verwendung eines zellfreien Zellextrakts und/oder Zellsekrets für therapeutische Zwecke im Rahmen einer Gewebeersatztherapie sowie die Verwendung einer zellfreien Knochen- oder Knorpelmatrix für therapeutische Zwecke im Rahmen einer Gewebeersatztherapie.
Die Erfindung wird im Weiteren anhand der Abbildungen und Ausführungsbeispiele beispielhaft näher erläutert.
Kurze Beschreibung der Abbildungen In den Abbildungen zeigt
Figur 1 (a) eine photographische Aufnahme eines extrahierten Weisheits- zahns mit apikalem Weichgewebe (apikalem Kissen) und (b) eine mikroskopische Aufnahme von aus dem apikalen Kissen isolierten Zellen,
Figur 2 rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von Knochenformati- onen nach 28 Tagen Inkubation der isolierten Zellen nach Gluta- raldehyd-Fixierung (mit Gold beschichtet), (a) Kontrolle, (b) Außenansicht und (c) Schnittansicht,
Figur 3 mikroskopische Aufnahmen osteogen stimulierter Kulturen nach immunohistochemischer Detektion von (a) Osteocalcin (Fa. Acris),
(b) Kollagen Typ I (Fa. Abcam) und (c) nach Färbung mit Alizarin rot.
Figur 1 zeigt einen chirurgisch entfernten Weisheitszahn mit apikalem Kissen (a). Das apikale Kissen wird entlang der makroskopisch sichtbaren Grenze zwischen dem kissenaφgen Weichgewebe und der Papille unterhalb der gedachten Linie zwischen den Zahnwurzeln von dem Zahn getrennt, mit PBS (steril) mehrmals gewaschen und dann mit einem Skalpell zerkleinert. Das so gewonnene Gewebe wird mit Collagenase/Dispase aufgeschlossen. Nach der Be- handlung des apikalen Weichgewebes mit Kollagenase/Dispase werden die Kulturen bei 37°C in DMEM LG 10% FCS kultiviert. Die isolierten Zellen wachsen als fibroblastoide Zellen in Kulturen (b).
Figur 2 zeigt rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von Knochenformati- onen nach 28 Tagen Inkubation der isolierten Zellen. Die Zellen werden in Kontrollmedium (a) und in osteogen stimulierendem Medium (b) kultiviert. Die in osteogen stimulierendem Medium kultivierten Zellen bilden eine Knochenähnliche Formation (b), die von innen organisiert Knochen-ähnlich strukturiert
ist (c), während die Zellen, die nur mit Kontrollmedium behandelt wurden, keine Knochenformation bilden und als adhärenter Verband wachsen (a).
Figur 3 zeigt mikroskopische Aufnahmen osteogen stimulierter Kulturen. Die osteogen stimulierten Kulturen werden nach 42 Tagen gestoppt und mit 4 % PFA fixiert. Anschließend wird die gebildete Knochenformationen in Paraffin eingebettet und dann geschnitten. Um die Knochen-ähnliche Formationen zu detektieren, werden die Schnitte immunohistochemisch mit einem ersten Antikörper gegen Osteocalcin oder Kollagen Typ I (beide sind Knochenmarker) ge- färbt. Die gebundenen Antikörper werden mit dem DAB Kit nach Herstellerangaben (Fa. R&D) detektiert. Um die Kalzifizierung zu detektieren, werden die Schnitte mit Alizarin rot (1,2 %Alizarin rot in pH4,2) gefärbt. Die stark rot gefärbten Areale sind kalzifizierte bzw. Knochen-ähnliche Bereiche.
Bevorzugte und beispielhafte Ausführungsformen der Erfindung
Dentale Stammzellen verfügen über ein spezifisches Muster von aktiven Stoffen, die den Aufbau verschiedener Gewebearten steuern. Zur Nutzung dieser Potenz wird eine speziell isolierte Subpopulation humaner dentaler Stammzellen in einem zellbiologischen Verfahren dazu angeregt, einen dem jungen Kno- chen ähnlichen Gewebeverband zu entwickeln. Die dabei gebildete hochspezifische Matrix wird anschließend zu einem nicht-zellulären Produkt aufbereitet, das den Knochenaufbau und damit den Verlauf der Einheilungsphase und das Einwachsverhalten von Implantaten deutlich beschleunigt. Damit wird die spezielle Eigenschaft dieser Matrix genutzt, aufgrund ihrer Zusammensetzung den komplexen Knochenaufbau physiologisch korrekt in einer Wunde zu stimulieren.
Im ersten Schritt werden Stamm-/Progenitorzellen unter geeigneten Bedingungen osteogen stimuliert, um aus sich heraus einen knochenähnlichen Gewebe- verband entstehen zu lassen. Die osteogene Stimulation kann beispielsweise durch Inkubation bzw. Kultivierung der Stammzellen mit 10 "7 M Dexamethason, 50 μg/ml Ascorbinsäue-2-Phosphat und 10 mM ß-Glycerolphosphat erfolgen. Dieses biologische Konstrukt ist in seiner Zusammensetzung mit dem sich bil-
denden Knochen vergleichbar. Im zweiten Schritt wird deshalb die Matrix aufbereitet und zu einem Produkt verarbeitet. Das gesamte Verfahren ist ein rein biologisches und kommt ohne jegliches Trägermaterial (Scaffold) aus.
Als Ausgangsmaterial dient ein differenziertes Knochengewebe wie es nur aus jungen dentalen Stammzellen, den sogenannten dNC-PCs, die osteogen stimuliert werden, in einem sich selbst generierenden Kultursystem geformt werden kann. Das Kultursystem ist besonders vorteilhaft, weil das dreidimensionale Knochengewebe samt seiner spezifisch gebildeten Interzellularsubstanzen aus- schließlich von dNC-PCs selbst organisiert wird und in seiner Struktur und Funktion ausschließlich den eigenen formenden und ordnenden Prinzipien unterliegt. Bei dem Knochengewebe handelt sich somit um werdendes, unreifes Knochengewebe, das in seiner Struktur und Festigkeit, seinem Mineralisationsgrad sowie seiner Zusammensetzung an Grundsubstanzkomponenten von be- sonderer Bauweise ist. Dieses Knochengewebe wird zu einem nicht-zellulären Produkt (Knochengrundsubstanz) aufbereitet, das den Knochenaufbau und damit den Verlauf der Einheilungsphase und das Einwachsen von Implantaten (Scaffolds) im Patienten beschleunigt. Dieses Knochengewebe kann in unterschiedlichen Reifegraden, die sich nach Phasen des Aufbaus der Matrix und der Mineralisierung richten, geerntet und in vom Reifegrad abhängigen Verfahren aufbereitet werden. Die Reifegrade werden anhand der Differenzierungszu- stände der dNC-PCs bzw. der Strukturierung und Zusammensetzung der Matrix bestimmt.
Die Entfernung der Zellen und das Herstellen einer zellfreien Substanz erfolgt mit physikalischen, chemischen und biologischen Methoden. Um die Zellmembranen zu zerstören und die Zellen zu lysieren, wird die intakte oder zerkleinerte Knochenmasse mit einer hypotonen Lösung (z.B. deionisiertes Wasser) behandelt und/oder in flüssigen Stickstoff zur Eiskristallbildung behandelt. Abhängig vom Reifegrad des Knochengewebes und der damit gewünschten Zusammensetzung des späteren Produktes werden die Proben unter Schütteln in Salzlösung (z.B. 3M NaCI) und/oder Säure/Base (z.B. 0,15-1 % per Essigsäure-PAA) ausgewaschen, und/oder in Triton-X100 (0,1%-1%) und/oder SDS (0,1%-1%)
für unterschiedliche Zeiten extrahiert. Zwischenschritte zur biochemischen Veränderung der organischen Knochengrundsubstanz mit Enzymen (z.B. Trypsin- EDTA) und/oder der chemischen Veränderung der anorganischen Grundsubstanz mit Säuren/Basen sind wahlweise möglich. Um freigesetzte Nukleinsäu- ren (RNA und DNA) zu entfernen, wird die Knochengrundsubstanz mit RNAse und DNAse behandelt. Anschließend wird die zellfreie Knochengrundsubstanz mit Pufferlösung (z.B. PBS) gewaschen, dialysiert und lyophilisiert, pulverisiert und in Form einer Paste, Salbe oder Suspension hergerichtet.
Die zellfreie Substanz basiert also im Prinzip auf der Syntheseleistung einer Neuralleistenzelle. Diese Zellen isolieren wir aus den Zellen eines kissenartigen Weichgewebes, das unmittelbar an der apikalen Seite eines extrahierten unreifen Zahns unterhalb der Papille lokalisierbar ist (wo sie sich in ihrer Nische abgesetzt haben) und beschreiben sie in ihren Eigenschaften als multipotente dNC-PCs (= dental neural crest-derived progenitor cells). Nur dieser bestimmte Zelltyp, d.h. die dNC-PCS, kann unter osteogener Stimulation ein dreidimensionales, rein biologisches Zell-Matrix-Aggregat bilden. Dieses Aggregat, das sich völlig selbständig formiert, besteht im Prinzip aus einem „Kern" und einer „Schale". Der Kern wird von inneren Zellen, die Schale von äußeren Zellen gebildet. Beide Zelltypen lassen sich phänotypisch unterscheiden, stammen aber initial von dNC-PCs als gemeinsamem Vorläufer ab. Der Kern des Aggregats besteht aus vitalen Zellen, die alle miteinander verwandt sind und zur Familie der Osteoblasten und Osteoblasten-Helferzellen gehören. Die Schale des Aggregats besteht aus ebenfalls vitalen Zellen. Die äußeren Zellen eine haben eine Barrie- refunktion, um das Innere des Aggregats von der Außenwelt (= Medium, Faktoren, Serum) abzuschirmen und die Einstellung eines spezifischen Milieus zu ermöglichen. Die inneren Zellen beginnen mit zunehmender Kulturdauer eine embryonale Matrix abzuscheiden, die zunächst nicht mineralisiert ist. Erst bei langen Kulturzeiten kommt es zu einer sukzessiven Einlagerung von Mineral (Varianten von Ca-Phosphaten bis hin zum Hydroxylappatit) und damit zur Ausbildung von Hartsubstanz. Der Vorgang der Mineralisierung erfolgt nur im Inneren des Aggregats und ist wahrscheinlich an das Vorhandensein der Schale gebunden. Die Mineralisierung ist ein aktiver Prozess, d.h. sie ist abhängig
von den inneren Zellen und dem speziellen Milieu des Kerns. Das Innere des Aggregats ist das Ausgangprodukts für die erfindungsgemäße zellfreie Substanz, die in unterschiedlichen Reifegraden geerntet werden kann. Zur Ernte wird das Aggregat aufgebrochen. Die äußeren Zellen werden über Enzymbe- handlung oder auch Immunosurgery entfernt. Zurück bleibt der Kern des Aggregats, der nicht direkt genutzt, sondern noch aufbereitet wird. Die Zellen werden mit Enzym und Detergenz isoliert. Was zurückbleibt, kann in eine organische und eine anorganische Phase getrennt werden. Jede Phase kann weiter verändert werden - die organische mit Enzym, die anorganische mit Säure und/oder Base. Je nach Reifegrad des Aggregats und je nach Verfahren der Aufbereitung ergibt sich dabei jeweils ein anderes Produkt.
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