Y/O C ANNABIN OIDE S

REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS

[001] Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional estadounidense n.° 62/757.660 presentada el 8 de noviembre de 2018 y n.° 62/897.235 presentada el 6 de septiembre de 2019. Los contenidos de estas solicitudes se incorporan cada uno en el presente documento como referencia.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0001] Los canales de la superfamilia de receptores transitorios (TRP), tales como TRPV1, TRPM8 y TRPA1, son canales de cationes no selectivos que conducen calcio y sodio al interior de una variedad de tipos celulares en mamíferos. Están presentes en neuronas sensoriales, e inicialmente se identificó que desempeñaban un papel en la nocicepción debido a su capacidad de respuesta a nivel molecular a metabolitos secundarios de las plantas que son nociomiméticos (por ejemplo, capsaicina) y a compuestos que son de otro modo picantes y que imitan sensaciones de ardor o refrescantes (por ejemplo, alicina, cinamaldehído, mentol).

[0002] Debido a su papel en la nocicepción, los canales de TRP se han identificado como dianas para el tratamiento de trastornos del dolor. Se han aprovechado tanto el antagonismo como el agonismo del canal de TRP para el tratamiento del dolor. Por ejemplo, los antagonistas de TRPV1 tienen utilidad en la analgesia aguda. Para el tratamiento del dolor crónico, normalmente se usan agonistas de TRPV1. Esta última estrategia se aprovecha del hecho de que el agonismo continuado del receptor TRP VI produce desensibilización en la superficie celular (internalización, degradación y recirculación de receptores). El agonismo prolongado de TRPV1 también conduce a sobrecarga catiónica de calcio y sodio de las neuronas sensoriales que contienen TRPV1, lo que conduce a la muerte celular.

[0003] En la práctica, el uso de agonistas de TRPV1 para efectuar desensibilización implica la aplicación tópica de altos niveles de un agonista de TRPV1 bien conocido, la capsaicina, de manera repetida a lo largo del tiempo a la zona afectada. Este enfoque terapéutico tiene el beneficio de la eficacia y el bajo coste. Sin embargo, también tiene puntos débiles. [0004] En primer lugar, los agonistas de TRPV1 de alta afinidad y alta especificidad sólo seleccionan como diana nociceptores que contienen TRPV1, sin afectar a otras neuronas sensoriales y canales de TRP implicados en el dolor. En segundo lugar, el uso de agonistas de TRPV1 de alta afinidad y alta especificidad tales como la capsaicina, produce altos niveles de malestar durante el tratamiento inicial, en el periodo previo a la desensibilización. Por este motivo, el dolor postherpético no puede abordarse actualmente usando desensibilización mediada por TRPV1 debido a la naturaleza sumamente irritante de la terapia sobre las zonas sensibles tales como la mucosa gástrica y la mucosa del aparato reproductor. En tercer lugar, los tratamientos de desensibilización mediados por capsaicina se limitan al uso tópico; el dolor visceral, la cefalea y determinados trastornos de dolor musculoesquelético no se abordan mediante esta terapia.

[0005] Por tanto, existe la necesidad de ligandos de TRPV1 terapéuticos, tales como agonistas de TRPV1, que tangan menor afinidad que la capsaicina y que puedan administrarse por la boca para el alivio sistémico. Tales ligandos de menor afinidad deben producir dolor reducido durante la desensibilización, permitiendo de ese modo el tratamiento tópico de zonas corporales sensibles. Existe la necesidad de ligandos de TRPV1 con especificidad por la diana más amplia, que puedan seleccionar como diana múltiples tipos de nociceptores que portan TRP, mejorando de ese modo el grado de desensibilización tisular. Además, también existe la necesidad de composiciones farmacéuticas que comprendan tales ligandos de TRPV1 adecuados para la administración sistémica además de la aplicación tópica y la liberación a largo plazo de tales ligandos de TRPV1 para inducir regulación por disminución crónica de TRPV1. La administración oral es altamente deseable para el uso sistémico de los medicamentos para el dolor.

[0006] Tales nuevos medicamentos orales también serían útiles para el tratamiento de diversas enfermedades asociadas con TRPV1 distintas del dolor. Aunque primero se mostró que los canales de TRP estaban implicados en el dolor y la nocicepción, ahora se sabe que tienen otros diversos papeles fisiológicos, lo que sugiere que pueden ser una diana para el tratamiento de otras enfermedades. Por ejemplo, se han identificado canales de TRP como diana para el tratamiento de la enfermedad cardiovascular; se ha demostrado que la inhibición farmacológica dirigida de TRPV1 disminuye significativamente la hipertrofia cardiaca en un modelo de ratón. Véase la patente estadounidense n.° 9.084.786. Por tanto, se esperaría que la regulación por disminución crónica de los niveles de TRPV1 mediante desensibilización de receptor con un agonista de TRPV1 protegiera de manera similar, y rescatara potencialmente, la hipertrofia cardiaca y sus síntomas y desenlaces asociados (remodelación cardiaca, fibrosis cardiaca, apoptosis, hipertensión o insuficiencia cardiaca).

[0007] Sin embargo, actualmente no hay ninguna composición oral ni ninguna otra composición farmacológica de agonista de TRP adecuado para la administración sistémica y la regulación por disminución crónica de TRP en un órgano visceral. Por tanto, existe la necesidad de desarrollar tales enfoques de manera análoga a los enfoques del dolor crónico descritos anteriormente.

[0008] La creación de nanopartículas es un modo eficaz de alterar las propiedades de superficie de las moléculas activas para hacer que sean más biodisponibles y para alterar la cinética de su liberación por vía sistémica. Pueden crearse nanopartículas orales que proporcionen formulaciones eficaces, liberadas a lo largo del tiempo, de diversos moduladores de canal de TRP, tales como terpenoides y cannabinoides. Tales formulaciones orales de ligandos de TRP y composiciones farmacológicas proporcionarían modos novedosos y más eficaces de tratamiento de diversas enfermedades asociadas con los canales de TRP, incluyendo trastornos del dolor y enfermedades cardiovasculares.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

[0009] El solicitante mostró recientemente que el mirceno es un nuevo agonista de TRPV1 que produce la desensibilización de TRPV1 tras la exposición prolongada. El solicitante mostró además que otros terpenoides y cannabinoides, incluyendo los que no demuestran actividad agonista de TRPV1 significativa por sí mismos, actúan en combinación para aumentar la eficacia del mirceno. Además, se identificaron múltiples canales de TRP además de TRPV1 como diana para mirceno, lo que sugiere que la eficacia del mirceno se extendería probablemente más allá de TRPV1 a otras neuronas nociceptivas en las que el canal de conducción del dolor principal es un receptor TRP distinto. Estos hallazgos se describen en la solicitud PCT, PCT/US2018/033956, que se incorpora por referencia en su totalidad en el presente documento.

[0010] Los nuevos hallazgos sugieren que el mirceno, así como otros terpenoides y cannabinoides, puede ser un ligando del receptor TRP terapéutico alternativo que puede afectar a múltiples canales de TRP además de a TRP VI, inducir menos malestar durante el tratamiento inicial que la capsaicina, y que es potencialmente adecuado para administración sistémica para efectos crónicos. Véase el documento PCT/US2018/033956. Se requiere el desarrollo adicional de una composición farmacéutica que comprenda mirceno y otros terpenoides y cannabinoides, en particular los que permitan administración sistémica y liberación a largo plazo y crónica de mirceno, otro terpenoide o cannabinoide, para el uso terapéutico del nuevo agonista de TRPV1 y mezclas de agonistas. Esto es particularmente importante porque los terpenoides y cannabinoides son altamente lipófilos y volátiles con un bajo punto de ebullición, y por tanto la administración de terpenoides y cannabinoides se ha limitado a la liberación rápida de medicamentos o en aplicaciones de productos naturales.

[0011] La presente invención responde a la necesidad de estabilizar terpenoides y cannabinoides y hacerlos más biodisponibles con liberación sostenida, proporcionando composiciones terapéuticas novedosas para administración sistémica (por ejemplo, administración oral) y liberación a largo plazo de terpenoides y cannabinoides, y métodos de obtención y uso de las composiciones terapéuticas. En particular, la presente invención usa una nanopartícula de PLGA que encapsula terpenoides y cannabinoides para administrar dichos terpenoides y cannabinoides a sujetos mamíferos. Adicionalmente, la presente divulgación proporciona composiciones terapéuticas que contienen más de un terpenoide o cannabinoide. Las composiciones terapéuticas pueden contener más de una población de nanopartículas, encapsulando cada población un terpenoide o cannabinoide individual, o una población de nanopartículas, encapsulando cada nanopartícula más de un terpenoide o cannabinoide. Los terpenoides o cannabinoides encapsulados en nanopartículas pueden ser compuestos sintetizados o compuestos aislados de mezclas químicas o naturales. En algunas realizaciones, los compuestos se aíslan de extractos de Cannabis sativa. En algunas realizaciones, se encapsula delta-9 tetrahidrocannabinol adicionalmente o por separado en nanopartículas.

[0012] Por consiguiente, en un primer aspecto, en el presente documento se proporcionan nanopartículas de PLGA que encapsulan terpenoides que comprenden una nanopartícula de PLGA y un primer terpenoide encapsulado en la nanopartícula de PLGA.

[0013] En algunas realizaciones, en las que la nanopartícula de PLGA comprende copolímero de PLGA y la razón en peso entre el primer terpenoide y el copolímero de PLGA es de entre 1 :50 y 1 : 10. En una realización, la razón en peso entre el primer terpenoide y el copolímero de PLGA es de aproximadamente 1 :14.

[0014] En algunas realizaciones, el primer terpenoide se selecciona del grupo que consiste en mirceno, b-cariofileno y nerolidol. En algunas realizaciones, en las que el primer terpenoide es mirceno, y la razón en peso entre el primer terpenoide y el copolímero de PLGA es de aproximadamente 1 :22. En algunas realizaciones, en las que el primer terpenoide es b -cari ofileno, y la razón en peso entre el primer terpenoide y el copolímero de PLGA es de entre 1 :5 y 1 :7. En algunas realizaciones, el primer terpenoide es nerolidol, y la razón en peso entre el primer terpenoide y el copolímero de PLGA es de entre 1 :5 y 1 :7.

[0015] En algunas realizaciones, la nanopartícula de PLGA tiene la superficie modificada con PEG. El peso molecular de PEG puede estar en el intervalo de 2.000-20.000 Da.

[0016] En algunas realizaciones, la nanopartícula encapsula además al menos un segundo compuesto, en la que el segundo compuesto encapsulado es (i) un cannabinoide o (ii) un segundo terpenoide distinto del primer terpenoide. En algunas realizaciones, el segundo compuesto encapsulado es ácido cannabigerólico (CBGA). En algunas realizaciones, el segundo compuesto encapsulado es cannabidiol (CBD). En algunas realizaciones, el segundo compuesto encapsulado es cannabinol (CBN). En algunas realizaciones, el segundo compuesto encapsulado es cannabidivarina (CBDV). En algunas realizaciones, el segundo compuesto encapsulado es cannabicromeno (CBC). En algunas realizaciones, el segundo compuesto encapsulado es ácido cannabidiólico (CBD A). En algunas realizaciones, el segundo compuesto encapsulado es cannabigerol (CBG). En algunas realizaciones, el segundo compuesto encapsulado es mirceno, b- cariofileno o nerolidol. En algunas realizaciones, el segundo compuesto encapsulado es limoneno. En algunas realizaciones, el segundo compuesto encapsulado es fitol. En algunas realizaciones, el segundo compuesto encapsulado es pineno. En algunas realizaciones, el segundo compuesto encapsulado es linalool.

[0017] En algunas realizaciones, las nanopartículas de PLGA tienen un diámetro promedio de entre 200-350 nm.

[0018] En algunas realizaciones, las nanopartículas de PLGA comprenden copolímero de PLGA que tiene una razón de ácido láctico con respecto a ácido glicólico de entre aproximadamente el 10-90% de ácido láctico y aproximadamente el 90-10% de ácido glicólico. En algunas realizaciones, la razón de ácido láctico con respecto a ácido glicólico es de aproximadamente el 10% de ácido láctico con respecto a aproximadamente el 90% de ácido glicólico. En algunas realizaciones, la razón de ácido láctico con respecto a ácido glicólico es de aproximadamente el 25% de ácido láctico con respecto a aproximadamente el 75% de ácido glicólico. En algunas realizaciones, la razón de ácido láctico con respecto a ácido glicólico es de aproximadamente el 50% de ácido láctico con respecto a aproximadamente el 50% de ácido glicólico. En algunas realizaciones, la razón de ácido láctico con respecto a ácido glicólico es de aproximadamente el 75% de ácido láctico con respecto a aproximadamente el 25% de ácido glicólico. En algunas realizaciones, la razón de ácido láctico con respecto a ácido glicólico es de aproximadamente el 90% de ácido láctico con respecto a aproximadamente el 10% de ácido glicólico.

[0019] En otro aspecto, la presente divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende una primera población de nanopartículas de PLGA que encapsulan terpenoides descritas en el presente documento, y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende además trehalosa. En algunas realizaciones, la composición está liofilizada. En algunas realizaciones, la composición comprende además una segunda población de nanopartículas de PLGA, en la que la segunda población de nanopartículas encapsula un tercer compuesto, en la que el tercer compuesto es un cannabinoide o terpenoide diferente de los cannabinoides y terpenoides encapsulados en la primera población de nanopartículas.

[0020] En algunas realizaciones, el tercer compuesto encapsulado es ácido cannabigerólico (CBGA). En algunas realizaciones, el tercer compuesto encapsulado es cannabidiol (CBD). En algunas realizaciones, el tercer compuesto encapsulado es cannabinol (CBN). En algunas realizaciones, el tercer compuesto encapsulado es cannabidivarina (CBDV). En algunas realizaciones, el tercer compuesto encapsulado es cannabicromeno (CBC). En algunas realizaciones, el tercer compuesto encapsulado es ácido cannabidiólico (CBDA). En algunas realizaciones, el tercer compuesto encapsulado es cannabigerol (CBG). En algunas realizaciones, el tercer compuesto encapsulado es mirceno, b-cariofileno o nerolidol. En algunas realizaciones, el tercer compuesto encapsulado es limoneno. En algunas realizaciones, el tercer compuesto encapsulado es fitol. En algunas realizaciones, el tercer compuesto encapsulado es pineno. En algunas realizaciones, el tercer compuesto encapsulado es linalool.

[0021] En algunas realizaciones, la composición comprende además una tercera población de nanopartículas de PLGA, en la que la tercera población de nanopartículas encapsula un cuarto compuesto, en la que el cuarto compuesto es un cannabinoide o terpenoide diferente de los cannabinoides y terpenoides encapsulados en la primera población de nanopartículas o la segunda población de nanopartículas. En algunas realizaciones, la composición comprende además una cuarta población de nanopartículas de PLGA, en la que la cuarta población de nanopartículas encapsula un quinto compuesto, en la que el quinto compuesto es un cannabinoide o terpenoide diferente de los cannabinoides y terpenoides encapsulados en la primera población de nanopartículas, la segunda población de nanopartículas o la tercera población de nanopartículas.

[0022] Aún en otro aspecto, la presente divulgación proporciona un método para obtener nanopartículas de PLGA que encapsulan terpenoides, en el que el método comprende las etapas de: (a) proporcionar una disolución orgánica que comprende terpenoide, un copolímero de PLGA y un disolvente, y una disolución acuosa que comprende un tensioactivo; (b) emulsionar las dos disoluciones para formar una suspensión de las nanopartículas de PLGA que encapsulan terpenoides; (c) evaporar el disolvente de la emulsión; y (d) obtener las nanopartículas de PLGA que encapsulan terpenoides.

[0023] En algunas realizaciones, la razón en peso del primer terpenoide con respecto al copolímero de PLGA en la disolución de la etapa (a) es de desde aproximadamente 1 :5 hasta aproximadamente 1 :1. En algunas realizaciones, la razón en peso del primer terpenoide con respecto al copolímero de PLGA en la disolución de la etapa (a) es de aproximadamente 1 :5. En algunas realizaciones, la razón en peso del primer terpenoide con respecto al copolímero de PLGA en la disolución de la etapa (a) es de aproximadamente 1 :4. En algunas realizaciones, la razón en peso del primer terpenoide con respecto al copolímero de PLGA en la disolución de la etapa (a) es de aproximadamente 1 :3. En algunas realizaciones, la razón en peso del primer terpenoide con respecto al copolímero de PLGA en la disolución de la etapa (a) es de aproximadamente 1 :2. En algunas realizaciones, la razón en peso del primer terpenoide con respecto al copolímero de PLGA en la disolución de la etapa (a) es de aproximadamente 1 :1.

[0024] En algunas realizaciones, la eficacia de atrapamiento del primer terpenoide en la etapa (b) es de entre aproximadamente el 4% y aproximadamente el 10%. En algunas realizaciones, la eficacia de atrapamiento es de al menos el 4%. En algunas realizaciones, la eficacia de atrapamiento es de al menos el 5%. En algunas realizaciones, la eficacia de atrapamiento es de al menos el 6%. En algunas realizaciones, la eficacia de atrapamiento es de al menos el 7%. En algunas realizaciones, la eficacia de atrapamiento es de al menos el 8%. En algunas realizaciones, la eficacia de atrapamiento es de al menos el 9%. En algunas realizaciones, la eficacia de atrapamiento es de al menos el 10%.

[0025] En algunas realizaciones, la razón en peso promedio entre el terpenoide encapsulado y el copolímero de PLGA en las nanopartículas de PLGA que encapsulan terpenoides de la etapa (d) es de entre aproximadamente 1 :50 y aproximadamente 1 :10. En algunas realizaciones, la razón en peso promedio entre el terpenoide encapsulado y el copolímero de PLGA en las nanopartículas de PLGA que en capsulan terpenoides es de al menos aproximadamente 1 :50. En algunas realizaciones, la razón en peso promedio entre el terpenoide encapsulado y el copolímero de PLGA en las nanopartículas de PLGA que encapsulan terpenoides es de al menos aproximadamente 1 :40. En algunas realizaciones, la razón en peso promedio entre el terpenoide encapsulado y el copolímero de PLGA en las nanopartículas de PLGA que encapsulan terpenoides es de al menos aproximadamente 1 :30. En algunas realizaciones, la razón en peso promedio entre el terpenoide encapsulado y el copolímero de PLGA en las nanopartículas de PLGA que encapsulan terpenoides es de al menos aproximadamente 1 :20. En algunas realizaciones, la razón en peso promedio entre el terpenoide encapsulado y el copolímero de PLGA en las nanopartículas de PLGA que encapsulan terpenoides es de al menos aproximadamente 1 :10.

[0026] En algunas realizaciones, el copolímero de PLGA tiene una razón de ácido láctico con respecto a ácido glicólico de entre aproximadamente el 10-90% de ácido láctico y aproximadamente el 90-10% de ácido glicólico. En algunas realizaciones, la razón de ácido láctico con respecto a ácido glicólico es de aproximadamente el 10% de ácido láctico con respecto a aproximadamente el 90% de ácido glicólico. En algunas realizaciones, la razón de ácido láctico con respecto a ácido glicólico es de aproximadamente el 25% de ácido láctico con respecto a aproximadamente el 75% de ácido glicólico. En algunas realizaciones, la razón de ácido láctico con respecto a ácido glicólico es de aproximadamente el 50% de ácido láctico con respecto a aproximadamente el 50% de ácido glicólico. En algunas realizaciones, la razón de ácido láctico con respecto a ácido glicólico es de aproximadamente el 75% de ácido láctico con respecto a aproximadamente el 25% de ácido glicólico. En algunas realizaciones, la razón de ácido láctico con respecto a ácido glicólico es de aproximadamente el 90% de ácido láctico con respecto a aproximadamente el 10% de ácido glicólico.

[0027] En algunas realizaciones, la disolución de la etapa (a) comprende además al menos un cannabinoide o terpenoide distinto del primer terpenoide. En algunas realizaciones, el al menos un cannabinoide o terpenoide se selecciona del grupo que consiste en: cannabidiol (CBD), cannabinol (CBN), cannabidivarina (CBDV), cannabicromeno (CBC), ácido cannabidiólico (CBDA) y cannabigerol (CBG). En algunas realizaciones, el al menos un cannabinoide o terpenoide se selecciona del grupo que consiste en: mirceno, b-cariofileno, nerolidol, fitol, limoneno, linalool y pineno. [0028] En algunas realizaciones, el disolvente es acetona, diclorometano o acetato de etilo. En algunas realizaciones, el tensioactivo es polietilenglicol, un poloxámero o poli(alcohol vinílico) (PVA). En algunas realizaciones, el tensioactivo es poli(alcohol vinílico) (PVA).

[0029] En algunas realizaciones, la etapa de emulsionamiento comprende homogeneización o sonicación. En algunas realizaciones, la etapa de emulsionamiento es homogeneización. En algunas realizaciones, la homogeneización se realiza a de 20.000 a 30.000 rpm. En algunas realizaciones, la homogeneización se realiza a 24.000 rpm. En algunas realizaciones, la disolución se homogeneiza durante de 30 s a 10 min. En algunas realizaciones, la disolución se homogeneiza durante 1 min.

[0030] En algunas realizaciones, la etapa de evaporar el disolvente comprende al menos uno de agitar el disolvente, aplicar corrientes de gas, aplicar calor, mantener una temperatura fría de l0°C o crear un vacío. En algunas realizaciones, la etapa de evaporar el disolvente comprende agitar la suspensión a temperatura ambiente. En algunas realizaciones, la suspensión se agita durante de 5 min a 120 min para evaporar el disolvente. En algunas realizaciones, la suspensión se agita durante 60 min.

[0031] En algunas realizaciones, la etapa de obtención de las nanopartículas de PLGA que encapsulan terpenoides comprende centrifugación, filtración, o centrifugación y filtración. En algunas realizaciones, la etapa de obtención comprende centrifugación. En algunas realizaciones, la centrifugación se realiza a entre 2.000 x g y 15.000 x g. En algunas realizaciones, la centrifugación es a 4.000 x g.

[0032] En algunas realizaciones, el método comprende además la etapa posterior de adición de un crioprotector a las nanopartículas de PLGA que encapsulan terpenoides. En algunas realizaciones, el crioprotector es trehalosa. En algunas realizaciones, el crioprotector se añade en una cantidad del 1-10% (p/v) de las nanopartículas de PLGA que encapsulan terpenoides. En algunas realizaciones, el crioprotector se añade en una cantidad del 5% (p/v) de las nanopartículas de PLGA que encapsulan terpenoides.

[0033] En algunas realizaciones, el método comprende además liofilizar las nanopartículas de PLGA que encapsulan terpenoides.

[0034] En un aspecto, la presente divulgación proporciona una nanopartícula de PLGA que encapsula terpenoides, obtenida mediante el método descrito en el presente documento. [0035] En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un método para efectuar desensibilización de TRPV1 en células de un sujeto mamífero que comprende: administrar al sujeto mamífero la composición farmacéutica descrita en el presente documento en una cantidad, por una vía de administración y durante un tiempo suficiente para producir desensibilización de TRPV1 en células dentro del sujeto mamífero. En algunas realizaciones, las células son nociceptores. En algunas realizaciones, los nociceptores son nociceptores periféricos. En algunas realizaciones, los nociceptores son nociceptores viscerales.

[0036] En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra por vía oral. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra por vía tópica. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra por vía sistémica. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra por vía subcutánea. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra mediante inhalación.

[0037] En un aspecto, la presente divulgación proporciona un método de tratamiento del dolor en un sujeto mamífero, comprendiendo el método la etapa de: administrar al sujeto la composición farmacéutica descrita en el presente documento en una cantidad, por una vía de administración y durante un tiempo suficiente para producir desensibilización de TRPV1 en nociceptores dentro del sujeto.

[0038] En algunas realizaciones, los nociceptores son nociceptores periféricos, y la composición farmacéutica se administra por vía tópica. En algunas realizaciones, los nociceptores son nociceptores viscerales, y la composición farmacéutica se administra por vía sistémica.

[0039] En algunas realizaciones, el dolor es dolor neuropático. En algunas realizaciones, el dolor neuropático es dolor neuropático periférico diabético. En algunas realizaciones, el dolor es neuralgia postherpética.

[0040] En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra al menos una vez al día durante al menos 3 días. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra al menos una vez al día durante al menos 5 días. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra al menos una vez al día durante al menos 7 días.

[0041] En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra a una dosis, por una vía de administración y en una pauta suficiente para mantener los niveles del primer terpenoide en los nociceptores durante al menos 3 días que son eficaces para desensibilizar TRPV1 en los nociceptores. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra a una dosis, por una vía de administración y en una pauta suficiente para mantener los niveles del primer terpenoide en los nociceptores durante al menos 5 días que son eficaces para desensibilizar TRPV1 en los nociceptores. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra a una dosis, por una vía de administración y en una pauta suficiente para mantener los niveles del primer terpenoide en los nociceptores durante al menos 7 días que son eficaces para desensibilizar TRPV1 en los nociceptores.

[0042] En un aspecto, la presente divulgación proporciona un método de tratamiento de la hipertrofia cardiaca en un sujeto mamífero, que comprende la etapa de: administrar al sujeto una cantidad antihipertrófica eficaz de la composición farmacéutica descrita en el presente documento. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra por vía oral. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra por vía sistémica. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra por vía subcutánea. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra mediante inhalación. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra por vía oral.

[0043] En un aspecto, la presente divulgación proporciona un método de tratamiento profiláctico de la hipertrofia cardiaca en un sujeto mamífero, que comprende la etapa de: administrar a un sujeto en riesgo de padecer hipertrofia cardiaca una cantidad antihipertrófica eficaz de la composición farmacéutica descrita en el presente documento.

[0044] En un aspecto, la presente divulgación proporciona un método de tratamiento de la vejiga hiperactiva en un sujeto mamífero, que comprende la etapa de: administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica proporcionada en el presente documento. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra por vía sistémica. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra mediante irrigación de la vejiga.

[0045] En un aspecto, la presente divulgación proporciona un método de tratamiento de la tos crónica resistente en un sujeto mamífero, que comprende la etapa de: administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica descrita en el presente documento. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra por vía sistémica. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra mediante inhalación. [0046] En otro aspecto, la presente divulgación proporciona una nanopartícula de PLGA que encapsula cannabinoides, que comprende: una nanopartícula de PLGA y un primer cannabinoide encapsulado en la nanopartícula de PLGA.

[0047] En algunas realizaciones, la nanopartícula de PLGA comprende copolímero de PLGA y la razón en peso entre el primer cannabinoide y el copolímero de PLGA es de entre 1 :50 y 1 :4. En algunas realizaciones, la razón en peso entre el primer cannabinoide y el copolímero de PLGA es de entre 1 :25 y 1 :5. En algunas realizaciones, el primer cannabinoide se selecciona del grupo que consiste en cannabidiol, cannabidivarina, cannabinol, cannabigerol y cannabicromeno.

[0048] En algunas realizaciones, el primer cannabinoide es cannabidiol, y la razón en peso entre el primer cannabinoide y el copolímero de PLGA es de aproximadamente 1 :14. En algunas realizaciones, el primer cannabinoide es cannabidiol, y la razón en peso entre el primer cannabinoide y el copolímero de PLGA es de entre 1 :5 y 1 :7. En algunas realizaciones, el primer cannabinoide es cannabidiol, y la razón en peso entre el primer cannabinoide y el copolímero de PLGA es de entre 1 :5 y 1 :7.

[0049] En algunas realizaciones, la nanopartícula encapsula además al menos un segundo compuesto, en la que el segundo compuesto encapsulado es (i) un terpenoide o (ii) un segundo cannabinoide distinto del primer cannabinoide. En algunas realizaciones, el segundo compuesto encapsulado es ácido cannabigerólico (CBGA). En algunas realizaciones, el segundo compuesto encapsulado es cannabidivarina (CBV). En algunas realizaciones, el segundo compuesto encapsulado es cannabinol (CBN). En algunas realizaciones, el segundo compuesto encapsulado es cannabidivarina (CBDV). En algunas realizaciones, el segundo compuesto encapsulado es cannabicromeno (CBC). En algunas realizaciones, el segundo compuesto encapsulado es ácido cannabidiólico (CBDA). En algunas realizaciones, el segundo compuesto encapsulado es cannabigerol (CBG). En algunas realizaciones, el segundo compuesto encapsulado es mirceno, b- cariofileno o nerolidol. En algunas realizaciones, el segundo compuesto encapsulado es limoneno. En algunas realizaciones, el segundo compuesto encapsulado es fitol. En algunas realizaciones, el segundo compuesto encapsulado es pineno. En algunas realizaciones, el segundo compuesto encapsulado es linalool. En algunas realizaciones, el segundo compuesto encapsulado es mirceno.

[0050] En algunas realizaciones, las nanopartículas de PLGA tienen un diámetro promedio de entre 200-350 nm. En algunas realizaciones, las nanopartículas de PLGA comprenden copolímero de PLGA que tiene una razón de ácido láctico con respecto a ácido glicólico de entre aproximadamente el 10-90% de ácido láctico y aproximadamente el 90-10% de ácido glicólico. En algunas realizaciones, la razón de ácido láctico con respecto a ácido glicólico es de aproximadamente el 10% de ácido láctico con respecto a aproximadamente el 90% de ácido glicólico. En algunas realizaciones, la razón de ácido láctico con respecto a ácido glicólico es de aproximadamente el 25% de ácido láctico con respecto a aproximadamente el 75% de ácido glicólico. En algunas realizaciones, la razón de ácido láctico con respecto a ácido glicólico es de aproximadamente el 50% de ácido láctico con respecto a aproximadamente el 50% de ácido glicólico. En algunas realizaciones, la razón de ácido láctico con respecto a ácido glicólico es de aproximadamente el 75% de ácido láctico con respecto a aproximadamente el 25% de ácido glicólico. En algunas realizaciones, la razón de ácido láctico con respecto a ácido glicólico es de aproximadamente el 90% de ácido láctico con respecto a aproximadamente el 10% de ácido glicólico.

[0051] Un aspecto de la presente divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende una primera población de nanopartículas de PLGA que encapsulan cannabinoides proporcionadas en el presente documento, y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende además trehalosa.

[0052] En algunas realizaciones, la composición está liofilizada. En algunas realizaciones, la composición comprende además una segunda población de nanopartículas de PLGA, en la que la segunda población de nanopartículas encapsula un tercer compuesto, en la que el tercer compuesto es un terpenoide o un cannabinoide diferente de los terpenoides y cannabinoides encapsulados en la primera población de nanopartículas. En algunas realizaciones, el tercer compuesto encapsulado es ácido cannabigerólico (CBGA). En algunas realizaciones, el tercer compuesto encapsulado es cannabidiol (CBD). En algunas realizaciones, el tercer compuesto encapsulado es cannabinol (CBN). En algunas realizaciones, el tercer compuesto encapsulado es cannabidivarina (CBDV). En algunas realizaciones, el tercer compuesto encapsulado es cannabicromeno (CBC). En algunas realizaciones, el tercer compuesto encapsulado es ácido cannabidiólico (CBDA). En algunas realizaciones, el tercer compuesto encapsulado es cannabigerol (CBG). En algunas realizaciones, el tercer compuesto encapsulado es mirceno, b-cariofileno o nerolidol. En algunas realizaciones, el tercer compuesto encapsulado es limoneno. En algunas realizaciones, el tercer compuesto encapsulado es fitol. En algunas realizaciones, el tercer compuesto encapsulado es pineno. En algunas realizaciones, el tercer compuesto encapsulado es linalool. En algunas realizaciones, el tercer compuesto encapsulado es mirceno.

[0053] En algunas realizaciones, la composición comprende además una tercera población de nanopartículas de PLGA, en la que la tercera población de nanopartículas encapsula un cuarto compuesto, en la que el cuarto compuesto es un cannabinoide o un terpenoide diferente de los cannabinoides y terpenoides encapsulados en la primera población de nanopartículas o la segunda población de nanopartículas. En algunas realizaciones, la composición comprende además una cuarta población de nanopartículas de PLGA, en la que la cuarta población de nanopartículas encapsula un quinto compuesto, en la que el quinto compuesto es un cannabinoide o un terpenoide diferente de los cannabinoides y terpenoides encapsulados en la primera población de nanopartículas, la segunda población de nanopartículas o la tercera población de nanopartículas.

[0054] Otro aspecto de la presente divulgación proporciona un método para obtener nanopartículas de PLGA que encapsulan cannabinoides, en el que el método comprende las etapas de: (a) proporcionar una disolución orgánica que comprende terpenoide, un copolímero de PLGA y un disolvente, y una disolución acuosa que comprende un tensioactivo; (b) emulsionar las dos disoluciones para formar una suspensión de las nanopartículas de PLGA que encapsulan cannabinoides; (c) evaporar el disolvente de la emulsión; y (d) obtener las nanopartículas de PLGA que encapsulan cannabinoides.

[0055] En algunas realizaciones, la razón en peso del primer cannabinoide con respecto a copolímero de PLGA en la disolución de la etapa (a) es de desde aproximadamente 1 :5 hasta aproximadamente 1 :1. En algunas realizaciones, la razón en peso del primer cannabinoide con respecto a copolímero de PLGA en la disolución de la etapa (a) es de aproximadamente 1 :5. En algunas realizaciones, la razón en peso del primer cannabinoide con respecto a copolímero de PLGA en la disolución de la etapa (a) es de aproximadamente 1 :4. En algunas realizaciones, la razón en peso del primer cannabinoide con respecto a copolímero de PLGA en la disolución de la etapa (a) es de aproximadamente 1 :3. En algunas realizaciones, la razón en peso del primer cannabinoide con respecto a copolímero de PLGA en la disolución de la etapa (a) es de aproximadamente 1 :2. En algunas realizaciones, la razón en peso del primer cannabinoide con respecto a copolímero de PLGA en la disolución de la etapa (a) es de aproximadamente 1 :1.

[0056] En algunas realizaciones, la eficacia de atrapamiento del primer cannabinoide en la etapa (b) es de entre aproximadamente el 4% y aproximadamente el 10%. En algunas realizaciones, la eficacia de atrapamiento es de al menos el 4%. En algunas realizaciones, la eficacia de atrapamiento es de al menos el 5%. En algunas realizaciones, la eficacia de atrapamiento es de al menos el 6%. En algunas realizaciones, la eficacia de atrapamiento es de al menos el 7%. En algunas realizaciones, la eficacia de atrapamiento es de al menos el 8%. En algunas realizaciones, la eficacia de atrapamiento es de al menos el 9%. En algunas realizaciones, la eficacia de atrapamiento es de al menos el 10%.

[0057] En algunas realizaciones, la razón en peso promedio entre cannabinoide encapsulado y copolímero de PLGA en las nanopartículas de PLGA que encapsulan cannabinoides de la etapa (d) es de entre aproximadamente 1 :50 y aproximadamente 1 : 10. En algunas realizaciones, la razón en peso promedio entre cannabinoide encapsulado y copolímero de PLGA en las nanopartículas de PLGA que encapsulan cannabinoides es de al menos aproximadamente 1 :50. En algunas realizaciones, la razón en peso promedio entre cannabinoide encapsulado y copolímero de PLGA en las nanopartículas de PLGA que encapsulan cannabinoides es de al menos aproximadamente 1 :40. En algunas realizaciones, la razón en peso promedio entre cannabinoide encapsulado y copolímero de PLGA en las nanopartículas de PLGA que encapsulan cannabinoides es de al menos aproximadamente 1 :30. En algunas realizaciones, la razón en peso promedio entre cannabinoide encapsulado y copolímero de PLGA en las nanopartículas de PLGA que encapsulan cannabinoides es de al menos aproximadamente 1 :20. En algunas realizaciones, la razón en peso promedio entre cannabinoide encapsulado y copolímero de PLGA en las nanopartículas de PLGA que encapsulan cannabinoides es de al menos aproximadamente 1 :10.

[0058] En algunas realizaciones, el copolímero de PLGA tiene una razón de ácido láctico con respecto a ácido glicólico de entre aproximadamente el 10-90% de ácido láctico y aproximadamente el 90-10% de ácido glicólico. En algunas realizaciones, la razón de ácido láctico con respecto a ácido glicólico es de aproximadamente el 10% de ácido láctico con respecto a aproximadamente el 90% de ácido glicólico. En algunas realizaciones, la razón de ácido láctico con respecto a ácido glicólico es de aproximadamente el 25% de ácido láctico con respecto a aproximadamente el 75% de ácido glicólico. En algunas realizaciones, la razón de ácido láctico con respecto a ácido glicólico es de aproximadamente el 50% de ácido láctico con respecto a aproximadamente el 50% de ácido glicólico. En algunas realizaciones, la razón de ácido láctico con respecto a ácido glicólico es de aproximadamente el 75% de ácido láctico con respecto a aproximadamente el 25% de ácido glicólico. En algunas realizaciones, la razón de ácido láctico con respecto a ácido glicólico es de aproximadamente el 90% de ácido láctico con respecto a aproximadamente el 10% de ácido glicólico.

[0059] En algunas realizaciones, la disolución de la etapa (a) comprende además al menos un cannabinoide o terpenoide distinto del primer cannabinoide. En algunas realizaciones, el al menos un cannabinoide o terpenoide se selecciona del grupo que consiste en: cannabinol (CBN), cannabidivarina (CBDV), cannabicromeno (CBC), ácido cannabidiólico (CBDA) y cannabigerol (CBG). En algunas realizaciones, el al menos un cannabinoide o terpenoide se selecciona del grupo que consiste en: mirceno, b-cariofileno, nerolidol, fitol, limoneno, linalool y pineno.

[0060] En algunas realizaciones, el disolvente es acetona, diclorometano o acetato de etilo. En algunas realizaciones, el tensioactivo es polietilenglicol, un poloxámero o poli(alcohol vinílico) (PVA). En algunas realizaciones, el tensioactivo es poli(alcohol vinílico) (PVA).

[0061] En algunas realizaciones, la etapa de emulsionamiento comprende homogeneización o sonicación. En algunas realizaciones, la etapa de emulsionamiento es homogeneización. En algunas realizaciones, la homogeneización se realiza a de 20.000 a 30.000 rpm. En algunas realizaciones, la homogeneización se realiza a 24.000 rpm. En algunas realizaciones, la disolución se homogeneiza durante de 30 segundos a 10 min. En algunas realizaciones, la disolución se homogeneiza durante 1 min.

[0062] En algunas realizaciones, la etapa de evaporar el disolvente comprende al menos uno de agitar el disolvente, aplicar corrientes de gas, aplicar calor, mantener una temperatura fría de l0°C o crear un vacío. En algunas realizaciones, la etapa de evaporar el disolvente comprende agitar la suspensión a temperatura ambiente. En algunas realizaciones, la suspensión se agita durante de 5 min a 120 min para evaporar el disolvente. En algunas realizaciones, la suspensión se agita durante 60 min.

[0063] En algunas realizaciones, la etapa de obtención de las nanopartículas de PLGA que encapsulan cannabinoides comprende centrifugación, filtración, o centrifugación y filtración. En algunas realizaciones, la etapa de obtención comprende centrifugación. En algunas realizaciones, la centrifugación se realiza a entre 2.000 x g y 15.000 x g. En algunas realizaciones, la centrifugación es a 4.000 x g.

[0064] En algunas realizaciones, el método comprende además la etapa posterior de adición de un cri oprotector a las nanopartículas de PLGA que encapsulan cannabinoides. En algunas realizaciones, el crioprotector es trehalosa. En algunas realizaciones, el crioprotector se añade en una cantidad del 1-10% (p/v) de las nanopartículas de PLGA que encapsulan cannabinoides. En algunas realizaciones, el crioprotector se añade en una cantidad del 5% (p/v) de las nanopartículas de PLGA que encapsulan cannabinoides.

[0065] En algunas realizaciones, el método comprende además liofilizar las nanopartículas de PLGA que encapsulan cannabinoides.

[0066] En un aspecto, la presente divulgación proporciona una nanopartícula de PLGA que encapsula cannabinoides, obtenida mediante el método descrito en el presente documento.

[0067] En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un método para efectuar desensibilización de TRPV1 en células de un sujeto mamífero que comprende: administrar al sujeto mamífero la composición farmacéutica proporcionada en el presente documento en una cantidad, por una vía de administración y durante un tiempo suficiente para producir desensibilización de TRPV1 en células dentro del sujeto mamífero. En algunas realizaciones, las células son nociceptores. En algunas realizaciones, los nociceptores son nociceptores periféricos. En algunas realizaciones, los nociceptores son nociceptores viscerales.

[0068] En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra por vía oral. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra por vía tópica. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra por vía sistémica. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra por vía subcutánea. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra mediante inhalación.

[0069] Aún en otro aspecto, la presente divulgación proporciona un método de tratamiento del dolor en un sujeto mamífero, comprendiendo el método la etapa de: administrar al sujeto la composición farmacéutica proporcionada en el presente documento en una cantidad, por una vía de administración y durante un tiempo suficiente para producir desensibilización de TRPV1 en nociceptores dentro del sujeto.

[0070] En algunas realizaciones, los nociceptores son nociceptores periféricos, y la composición farmacéutica se administra por vía tópica. En algunas realizaciones, los nociceptores son nociceptores viscerales, y la composición farmacéutica se administra por vía sistémica.

[0071] En algunas realizaciones, el dolor es dolor neuropático. En algunas realizaciones, el dolor neuropático es dolor neuropático periférico diabético. En algunas realizaciones, el dolor es neuralgia postherpética. [0072] En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra al menos una vez al día durante al menos 3 días. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra al menos una vez al día durante al menos 5 días. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra al menos una vez al día durante al menos 7 días. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra al menos una vez al día durante más de 7 días. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra a una dosis, por una vía de administración y en una pauta suficiente para mantener los niveles de cannabinoide en los nociceptores durante al menos 3 días que son eficaces para desensibilizar TRPV1 en los nociceptores. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra a una dosis, por una vía de administración y en una pauta suficiente para mantener los niveles de cannabinoide en los nociceptores durante al menos 5 días que son eficaces para desensibilizar TRPV1 en los nociceptores. El cannabinoide, la composición farmacéutica se administra a una dosis, por una vía de administración y en una pauta suficiente para mantener los niveles de cannabinoide en los nociceptores durante al menos 7 días que son eficaces para desensibilizar TRPV1 en los nociceptores.

[0073] Un aspecto de la presente divulgación proporciona un método de tratamiento de la hipertrofia cardiaca en un sujeto mamífero, que comprende la etapa de: administrar al sujeto una cantidad antihipertrófica eficaz de la composición farmacéutica proporcionada en el presente documento.

[0074] En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra por vía oral. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra por vía sistémica. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra por vía subcutánea. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra mediante inhalación. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra por vía oral.

[0075] Otro aspecto de la presente divulgación proporciona un método de tratamiento profiláctico de la hipertrofia cardiaca en un sujeto mamífero, que comprende la etapa de: administrar a un sujeto en riesgo de padecer hipertrofia cardiaca una cantidad antihipertrófica eficaz de la composición farmacéutica proporcionada en el presente documento.

[0076] Aún en otro aspecto, la presente divulgación proporciona un método de tratamiento de la vejiga hiperactiva en un sujeto mamífero, que comprende la etapa de: administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica proporcionada en el presente documento.

[0077] En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra por vía sistémica. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra mediante irrigación de la vejiga.

[0078] En un aspecto, la presente divulgación proporciona un método de tratamiento de la tos crónica resistente en un sujeto mamífero, que comprende la etapa de: administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica proporcionada en el presente documento.

[0079] En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra por vía sistémica. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra mediante inhalación.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0080] Estas y otras características, aspectos y ventajas de la presente invención se entenderán mejor con respecto a la descripción y los dibujos adjuntos siguientes, donde:

[0081] La figura 1 proporciona un esquema del método de nanoprecipitación.

[0082] La figura 2 proporciona un esquema de nanocápsulas de PLGA obtenidas usando un sistema de microemulsión.

[0083] La figura 3 proporciona un esquema del método de emulsificación (homogeneizador de alta velocidad) para la evaporación del disolvente.

[0084] La figura 4A muestra el cromatograma de gases del mirceno, la figura 4B el espectro de masas del mirceno, y la figura 4C muestra la curva de calibración del mirceno con concentraciones que oscilan entre 1 -60 ppm tal como se mide y se analiza mediante el instrumento de CG-EM de Thermo Scientific Instrument Delta V.

[0085] La figura 5A muestra el cromatograma de gases del b-cariofileno, la figura 5B el espectro de masas de b-cariofileno, y la figura 5C muestra la curva de calibración del b-cariofileno con concentraciones que oscilan entre 1 -60 ppm tal como se mide y se analiza mediante el instrumento de CG-EM de Thermo Scientific Instrument Delta V.

[0086] La figura 6 muestra el cromatograma de gases tanto del cis como del trans-nerolidol tal como se mide y se analiza mediante el instrumento de CG-EM Thermo Scientific Instrument Delta V. [0087] La figura 7A muestra el espectro de masas del cis-nerolidol, la figura 7B muestra la curva de calibración del cis-nerolidol con concentraciones de entre 1-60 ppm tal como se mide y se analiza mediante el instrumento de CG-EM de Thermo Scientific Instrument Delta V. De manera similar, la figura 7C y la figura 7D muestran el espectro de masas y la curva de calibración del trans-nerolidol, respectivamente, tal como se mide y se analiza en las mismas condiciones que el isómero cis.

[0088] Las figuras 8A-8F muestran las mediciones del diámetro medio (figuras 8A, 8C y 8E) y el potencial zeta (figuras 8B, 8D y 8F) de nanopartículas (NP) preparadas usando nanoprecipitación.

[0089] Las figuras 9A-9B muestran las mediciones del diámetro medio (figura 9A) y el potencial zeta (figura 9B) de NP preparadas usando microemulsificación.

[0090] Las figuras 10A-10B muestran las mediciones del diámetro medio (figura 10 A) y el potencial zeta (figura 10B) de NP preparadas usando emulsificación con un homogeneizador.

[0091] Las figuras 11A-11D muestran las mediciones del diámetro medio (figuras l lA y 11 C) y el potencial zeta (figuras 11B y 11D) de NP preparadas mediante emulsificación (figuras 11A y 11B) y nanoprecipitación (figuras 11C y 11D).

[0092] Las figuras 12A-12B muestran las mediciones del diámetro medio (figura 12 A) y el potencial zeta (figura 12B) de una emulsión preparada mediante la adición de mirceno disuelto en acetona a una disolución del 0,5% (p/p) de PVA.

[0093] Las figuras 13A y 13B muestran las imágenes del microscopio electrónico de barrido (SEM) de nanopartículas (NP) que contienen mirceno.

[0094] Las figuras 14A y 14B muestran las imágenes del microscopio electrónico de barrido (SEM) de nanopartículas (NP) que contienen b-cariofileno.

[0095] Las figuras 15 A y 15B muestran las imágenes del microscopio electrónico de barrido (SEM) de nanopartículas (NP) que contienen nerolidol.

[0096] La figura 16 muestra una representación esquemática de una nanocápsula.

[0097] La figura 17 muestra cambios de fluorescencia medidos usando un ensayo de señalización de calcio tras el tratamiento de células HEK TRPV1 con terpenoides tanto libres como encapsulados, incluyendo mirceno, nerolidol y b-cariofileno, e ionomicina tal como se representa en un único gráfico. [0098] Las figuras 18A-18C muestran representaciones individuales de cambios de fluorescencia medidos usando un ensayo de señalización de calcio tras el tratamiento de células HEK TRPV1 con mirceno (figura 18 A), nerolidol (figura 18B) y b-cariofileno (figura 18C) encapsulados y sin encapsular.

[0099] Las figuras 19A-19D muestran cambios de fluorescencia medidos usando un ensayo de señalización de calcio tras el tratamiento de células HEK TRPV1 de terpenoides sin encapsular individuales en comparación con sus combinaciones correspondientes, concretamente la figura 19A muestra mirceno, nerolidol y su combinación sin encapsular; la figura 19B muestra mirceno, b-cariofileno y su combinación sin encapsular; la figura 19C muestra b-cariofileno, nerolidol y su combinación sin encapsular; y la figura 19D muestra mirceno, nerolidol, b-cariofileno, y su combinación sin encapsular.

[0100] Las figuras 20A-20D muestran cambios de fluorescencia medidos usando un ensayo de señalización de calcio tras el tratamiento de células HEK TRPV1 de terpenoides encapsulados en nanopartículas (NP) individuales en comparación con sus combinaciones correspondientes, concretamente la figura 20A muestra resultados de NP de mirceno, NP de nerolidol, y su combinación; la figura 20B muestra resultados de NP de mirceno, NP de b -cari ofileno, y su combinación; la figura 20C muestra resultados de NP de nerolidol, NP de b-cariofileno, y su combinación; y la figura 20D muestra resultados de NP que contienen mirceno, nerolidol y b- cariofileno, NP que contienen mirceno y nerolidol, NP que contienen mirceno y b-cariofileno, y NP que contienen nerolidol y b-cariofileno.

[0101] Las figuras 21A-21D muestran cambios de fluorescencia medidos usando un ensayo de señalización de calcio tras el tratamiento de células HEK TRPV1 de nanopartículas de terpenoide encapsulado individualmente en comparación con sus correspondientes combinaciones de terpenoide sin encapsular. La figura 21 A muestra los resultados de las combinaciones de mirceno y nerolidol encapsulados y sin encapsular; la figura 21B muestra los resultados de las combinaciones de mirceno y b-cariofileno encapsulados y sin encapsular; la figura 21 C muestra los resultados de las combinaciones de nerolidol y b-cariofileno encapsulados y sin encapsular; y la figura 21D muestra los resultados de las combinaciones de mirceno, nerolidol y b-cari ofileno encapsulados y sin encapsular. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Definiciones

[0102] Los términos usados en las reivindicaciones y en la memoria descriptiva se definen tal como se expone a continuación, a menos que se especifique otra cosa.

[0103] El término,“mirceno” o“b-mirceno” tal como se usa en el presente documento, se refiere a 7-metil-3-metilidenocta-l,6-dieno y se ilustra mediante la fórmula estructural

[0104] El término“a-ocimeno” tal como se usa en el presente documento, se refiere a cis- 3,7- dimetil-l,3,7-octatrieno y se ilustra mediante la fórmula estructural

[0105] El término“c s-P-ocimeno” tal como se usa en el presente documento, se refiere a (Z)-3,7- dimetil-l,3,6-octatrieno y se ilustra mediante la fórmula estructural

[0106] El término“fra«s-P-ocimeno” tal como se usa en el presente documento, se refiere a (E)-

3,7-dimetil-l,3,6-octatrieno y se ilustra mediante la fórmula estructural

[0107] El término“linalool” tal como se usa en el presente documento, se refiere a 3,7-dimetil-

,OH

l,6-octadien-3-ol y se ilustra mediante la fórmula estructural ^ ^ ^* ^^*^-^' .

[0108] El término“nerolidol” tal como se usa en el presente documento, se refiere a 3,7,11- trimetil-l,6,l0-dodecatrien-3-ol y se ilustra mediante la fórmula estructural

[0109] El término“c s-nerolidol” tal como se usa en el presente documento, se refiere al isómero

cis de nerolidol y se ilustra mediante la fórmula estructural

[0110] El término“fra«s-nerolidol” tal como se usa en el presente documento, se refiere al isómero trans de nerolidol y se ilustra mediante la fórmula estructural [0111] El término“bisabolol” tal como se usa en el presente documento, se refiere a 6-metil-2- (4-metilciclohex-3-en-l-il)hept-5-en-2-ol y se ilustra mediante la fórmula estructural

[0112] El término“b-cariofileno” tal como se usa en el presente documento, se refiere a (\R,4E,9S)-4,\ \,\ \ -trimetil-8-metilidenbiciclo[7.2.0]undec-4-eno y se ilustra mediante la fórmula

estructural

[0113] El término grupo“dimetilalilo” se refiere a un sustituyente de alquilo C5H9 insaturado tal como se ilustra mediante la fórmula

[0114] El término“terpenoides” tal como se usa en el presente documento, se refiere a una clase de compuestos orgánicos producidos por plantas, que comprende alfa-bisabolol (a-bisabolol), alfa- humuleno (a-humuleno), alfa-pineno (a-pineno), b-cariofileno (b-cariofileno), mirceno, (+)-beta- pineno (b-pineno), camfeno, limoneno, linalool, fitol y nerolidol.

[0115] El término,“cannabinoide” tal como se usa en el presente documento, se refiere a una clase de compuestos químicos que comprenden ácido cannabigerólico (CBGA), cannabidiol (CBD), cannabidivarina (CBDV), cannabicromeno (CBC), ácido cannabidiólico (CBDA) y cannabigerol (CBG).

[0116]“Principio farmacéuticamente activo” (de manera sinónima, principio farmacéutico activo) significa cualquier sustancia o mezcla de sustancias destinadas a usarse en la fabricación de un producto terminado y que, cuando se usa en la producción de un fármaco, se convierte en principio activo en el producto farmacéutico. Se pretende que tales sustancias proporcionen actividad farmacológica u otro efecto directo en el diagnóstico, la cura, la mitigación, el tratamiento o la prevención de una enfermedad o que afecten a la estructura y la función del organismo. Tales sustancias o mezclas de sustancias se generan preferiblemente de acuerdo con las normativas de las Buenas Prácticas de Fabricación Actuales (BPFa) en virtud de la Sección 501(a)(2)(B) de la Ley Federal de Alimentos, Medicamentos y Cosméticos. [0117] Un principio farmacéuticamente activo está“sustancialmente libre de THC” si el principio contiene menos del 0,3% (p/p) de delta-9 tetrahidrocannabinol. Una composición farmacéutica está“sustancialmente libre de THC” si la composición farmacéutica contiene menos del 0,3% (p/v) de delta-9 tetrahidrocannabinol.

[0118] Un“extracto de Cannabis sativa” es una composición obtenida de materiales vegetales de Cannabis sativa mediante extracción con fluido y/o gas, por ejemplo mediante extracción con fluido supercrítico (SFE) con C0 _2. El extracto de Cannabis sativa normalmente contiene mirceno, cannabinoides y terpenoides, y también puede contener fitocannabinoides y otros metabolitos secundarios.

[0119] Los términos“tratamiento,”“tratar,” y similares se usan en el presente documento para referirse en general a obtener un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico, en lo que se refiere a prevenir completa o parcialmente una enfermedad, estado o síntomas de los mismos, y/o puede ser terapéutico en lo que se refiere a una cura parcial o completa para una enfermedad o estado y/o efecto adverso, tal como un síntoma, atribuible a la enfermedad o el estado.“Tratamiento” tal como se usa en el presente documento, cubre cualquier tratamiento de una enfermedad o estado de un mamífero, particularmente un ser humano, e incluye: (a) prevenir que se produzca la enfermedad o el estado en un sujeto que puede estar predispuesto a padecer la enfermedad o el estado, pero al que todavía no se ha diagnosticado que lo tiene; (b) inhibir la enfermedad o el estado (por ejemplo, deteniendo su desarrollo); o (c) aliviar la enfermedad o el estado (por ejemplo, produciendo regresión de la enfermedad o el estado, proporcionando mejoría en uno o más síntomas). Las mejorías en cualquier estado pueden evaluarse fácilmente según métodos y técnicas convencionales conocidos en la técnica. La población de sujetos tratados mediante el método incluye sujetos que padecen el estado o la enfermedad no deseados, así como sujetos que están riesgo de desarrollar el estado o la enfermedad.

[0120] Mediante el término“dosis terapéuticamente eficaz” o“cantidad terapéuticamente eficaz” quiere decirse una dosis o cantidad que produce el efecto deseado para el que se administra. La dosis o cantidad exacta dependerá del fin del tratamiento, y la podrá determinar un experto en la técnica usando técnicas conocidas (véase, por ejemplo, Lloyd (2012) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding, Cuarta Edición). Una cantidad terapéuticamente eficaz puede ser una“cantidad profilácticamente eficaz” ya que la profilaxis puede considerarse terapia.

[0121] El término“cantidad suficiente” significa una cantidad suficiente para producir un efecto deseado.

[0122] El término“mejoría” se refiere a cualquier resultado terapéuticamente beneficioso en el tratamiento de un estado patológico, por ejemplo, un trastorno inmunitario, incluyendo profilaxis, disminución en la gravedad o progresión, remisión o cura del mismo.

[0123] El término“mamífero” tal como se usa en el presente documento, incluye tanto seres humanos como no humanos e incluye, pero no se limita a, seres humanos, primates no humanos, animales caninos, felinos, murinos, bovinos, equinos y porcinos.

[0124] El término“nanopartícula de PLGA” tal como se usa en el presente documento, se refiere a una nanopartícula que comprende copolímeros de PLGA y que engloba tanto una nanocápsula de PLGA como una nanoesfera de PLGA. Lina nanocápsula de PLGA se caracteriza por una membrana polimérica exterior de PLGA (cubierta) que rodea un núcleo interior de una sustancia, tal como un compuesto farmacológico como mirceno, otros terpenoides, o cannabinoides. Una nanoesfera de PLGA se caracteriza por una matriz esférica polimérica de PLGA en la que está dispersa o incluida una sustancia o compuesto farmacológico.

[0125] El término“nanopartícula de PLGA que encapsula mirceno” tal como se usa en el presente documento, se refiere a una nanopartícula compuesta por copolímeros de PLGA que encapsula o contiene mirceno. La nanopartícula puede ser una nanoesfera de PLGA o una nanocápsula de PLGA. El mirceno puede encapsularse como un núcleo interior líquido dentro de una membrana exterior de PLGA (cubierta), formando una nanocápsula; o el mirceno puede dispersarse o incluirse en una matriz de PLGA, formando una nanoesfera.

[0126] El término“nanopartícula de PLGA que encapsula cannabinoides” tal como se usa en el presente documento, se refiere a una nanopartícula compuesta por copolímeros de PLGA que encapsula o contiene un cannnabinoide. La nanopartícula puede ser una nanoesfera de PLGA o una nanocápsula de PLGA. El cannabinoide puede encapsularse como un núcleo interior líquido dentro de una membrana exterior de PLGA (cubierta), formando una nanocápsula; o el cannabinoide puede dispersarse o incluirse en una matriz de PLGA, formando una nanoesfera.

[0127] El término“nanopartícula de PLGA que encapsula terpenoides” tal como se usa en el presente documento, se refiere a una nanopartícula compuesta por copolímeros de PLGA que encapsula o contiene un terpenoide. La nanopartícula puede ser una nanoesfera de PLGA o una nanocápsula de PLGA. El terpenoide puede encapsularse como un núcleo interior líquido dentro de una membrana exterior de PLGA (cubierta), formando una nanocápsula; o el terpenoide puede dispersarse o incluirse en una matriz de PLGA, formando una nanoesfera.

[0128] El término“nanopartícula de PLGA que encapsula terpenoides/cannabinoides” tal como se usa en el presente documento, se refiere a una nanopartícula de PLGA que encapsula terpeno o una nanopartícula de PLGA que encapsula cannabinoides.

[0129] Los términos“terpenoides libres” y“terpenoides sin encapsular” tal como se usan en el presente documento, se refieren a terpenoides que no están encapsulados dentro de una nanopartícula y que están en disolución a granel. Estos términos se usan de manera intercambiable a lo largo de la memoria descriptiva.

[0130] El término“polímero de PLGA” tal como se usa en el presente documento, se refiere a poli(ácido láctico-co-glicólico).

[0131] El término“liofilización” tal como se usa en el presente documento, se refiere a un procedimiento de deshidratación a baja temperatura, en el que se retira agua de un material congelando el material a baja presión o a vacío. El agua se congela y después se retira del material por medio de sublimación. Términos alternativos para el procedimiento incluyen secado por congelación.

[0132] El término“eficacia de atrapamiento” o“EE%” tal como se usa en el presente documento, se refiere al porcentaje de la masa del compuesto en las nanopartículas en comparación con la masa de partida del compuesto. El porcentaje de EE se calcula usando la siguiente ecuación. “CPD” es una abreviatura de“compuesto” e indica el compuesto farmacológico encapsulado en las nanopartículas, tal como un mirceno u otros terpenoides o cannabinoides.

[0133] El término“carga de fármaco” o“DL%” tal como se usa en el presente documento, se refiere a la masa de compuesto incorporada en las nanopartículas en comparación con la masa total de las nanopartículas incluyendo el compuesto. El porcentaje de DL se calcula usando la siguiente ecuación.“CPD” indica el compuesto farmacológico encapsulado en las nanopartículas, tal como un mirceno u otros terpenoides o cannabinoides. masa de CPD incorporados ( mq )

DL (%) = - - - — i - * 100

masa de nanopartículas ( mg ) [0134] Debe indicarse que, tal como se usa en la memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares“un”,“una” y“el/la” incluyen los referentes en plural, a menos que el contexto indique claramente otra cosa.

[0135] Se entiende que los intervalos citados en el presente documento son resúmenes de todos los valores dentro del intervalo, inclusive de los puntos finales citados. Por ejemplo, se entiende que un intervalo de 1 a 50 incluye cualquier número, combinación de números o subintervalo del grupo que consiste en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 y 50.

[0136] A menos que se indique otra cosa, la referencia a un compuesto que tiene uno o más estereocentros pretende referirse a cada estereoisómero, y a todas las combinaciones de estereoisómeros, del mismo.

Nanopartículas de PLGA que encapsulan terpenoides/cannabinoides

Nanopartículas de PLGA que encapsulan terpenoides

[0137] En un aspecto, la presente invención proporciona una nanopartícula de PLGA que encapsula terpenoides que comprende una nanopartícula de PLGA y un primer terpenoide encapsulado en la nanopartícula de PLGA. La nanopartícula de PLGA que encapsula terpenoides puede encapsular compuestos distintos del primer terpenoide, tal como otros terpenoides y/o cannabinoides.

[0138] El primer terpenoide encapsulado en la nanopartícula de PLGA puede ser un terpenoide que puede extraerse de Cannabis sativa.

[0139] El primer terpenoide puede ser mirceno, b-cariofileno o nerolidol.

[0140] En diversas de tales realizaciones, el primer terpenoide, cannabinoides opcionales y terpenoides opcionales distintos del primer terpenoide constituyen colectivamente al menos el 75% en peso, pero menos del 100% en peso, de los compuestos totales encapsulados en las nanopartículas de PLGA. En realizaciones específicas, el primer terpenoide, cannabinoides opcionales y terpenoides opcionales distintos del primer terpenoide constituyen colectivamente al menos el 80%, al menos al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94% o al menos el 95% en peso, pero menos del 100% en peso, de los compuestos totales encapsulados en las nanopartículas de PLGA. En realizaciones particulares, el primer terpenoide, cannabinoides opcionales y terpenoides opcionales distintos del primer terpenoide constituyen colectivamente al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99% en peso, pero menos del 100% en peso, de los compuestos totales encapsulados en las nanopartículas de PLGA.

[0141] En realizaciones en las que el primer terpenoide, cannabinoides opcionales y terpenoides opcionales distintos del primer terpenoide constituyen colectivamente menos del 100% en peso (% en peso) de los compuestos totales encapsulados en las nanopartículas de PLGA, las nanopartículas de PLGA pueden encapsular adicionalmente compuestos distintos del primer terpenoide, cannabinoides opcionales o terpenoides opcionales. En tales realizaciones, el compuesto adicional puede extraerse de Cannabis sativa. En realizaciones específicas, todos o algunos de los compuestos encapsulados en la nanopartícula de PLGA están presentes en un extracto compuesto por Cannabis sativa.

[0142] La cantidad del primer terpenoide encapsulado en la nanopartícula de PLGA puede cuantificarse como una razón en peso entre el peso del copolímero de PLGA en la nanopartícula y la cantidad del primer terpenoide encapsulado dentro de la nanopartícula. La razón en peso entre el primer terpenoide y el copolímero de PLGA puede ser de entre 1:50 y 1:1. La razón en peso entre el primer terpenoide y el copolímero de PLGA puede ser de entre 1 :l00 y 1 :5, 1 :75 y 1 :l0, 1:50 y 1:10, l:40y 1:10, l:30y 1:10, l:20y 1:10, 1:50 y 1:40, 1:40 y 1:30, 1:30 y 1:20, 1:20 y 1:10, l:l0yl:5yl:5yl:l.La razón en peso entre el primer terpenoide y el copolímero de PLGA puede ser de 1:50, 1:45, 1:40, 1:35, 1:30, 1:25, 1:20, 1:19, 1:17, 1:18, 1:16, 1:15, 1:14, 1:13, 1:12, 1:11, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1 :5, 1:4, 1 :3, 1 :2 ó 1:1. En una realización particular, la razón es de aproximadamente 1 : 14. En una realización particular, la razón es de aproximadamente 1 :22.

[0143] En algunas realizaciones, la razón en peso entre el primer terpenoide y el copolímero de PLGA es de entre 1 :50 y 1 :10. En una realización, la razón en peso entre el primer terpenoide y el copolímero de PLGA es de aproximadamente 1:14. En una realización, la razón en peso entre el primer terpenoide y el copolímero de PLGA es de aproximadamente 1 :22.

[0144] En una realización, el terpenoide encapsulado en la nanopartícula es mirceno. La cantidad de mirceno encapsulado en la nanopartícula de PLGA puede cuantificarse como una razón en peso entre el peso del copolímero de PLGA en la nanopartícula de PLGA y la cantidad del mirceno encapsulado dentro de la nanopartícula. La razón en peso entre el mirceno y el copolímero de PLGA puede ser de entre 1 :50 y 1 : 1. La razón en peso entre el mirceno y el copolímero de PLGA puede ser de entre 1:100 y 1:5, 1:75 y 1:10, 1:50 y 1:10, 1:40 y 1:10, 1:30 y 1:10, 1:20 y 1:10, 1:50 y 1:40, 1:40 y 1:30, 1:30 y 1:20, 1:20 y 1:10, 1:10 y 1:5 y 1:5 y 1:1. La razón en peso entre el mircenoyel copolímero de PLGA puede ser de 1:50, 1:45, 1:40, 1:35, 1:30, 1:25, 1:20, 1:19, 1:17, 1:18, 1:16, 1:15, 1:14, 1:13, 1:12, 1:11, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2 ó 1:1. En una realización particular, la razón es de aproximadamente 1 :22.

[0145] En algunas realizaciones, la razón en peso entre mirceno y copolímero de PLGA es de entre 1:50 y 1:10. En una realización, la razón en peso entre mirceno y copolímero de PLGA es de aproximadamente 1:14 o aproximadamente 1:22.

[0146] También pueden encapsularse compuestos distintos del primer terpenoide (“segundo compuesto encapsulado”) en las nanopartículas de PLGA. En diversas realizaciones, los segundos compuestos encapsulados son cannabinoides y/o terpenoides distintos del primer terpenoide. En una realización, el segundo compuesto encapsulado es ácido cannabigerólico (CBGA). En una realización, el segundo compuesto encapsulado es cannabidiol (CBD). En una realización, el segundo compuesto encapsulado es cannabinol (CBN). En una realización, el segundo compuesto encapsulado es cannabidivarina (CBDV). En una realización, el segundo compuesto encapsulado es cannabicromeno (CBC). En una realización, el segundo compuesto encapsulado es ácido cannabidiólico (CBD A). En una realización, el segundo compuesto encapsulado es cannabigerol (CBG). En una realización, el segundo compuesto encapsulado es mirceno. En una realización, el segundo compuesto encapsulado es cariofdeno. En una realización, el segundo compuesto encapsulado es nerolidol. En una realización, el segundo compuesto encapsulado es limoneno. En una realización, el segundo compuesto encapsulado es fitol. En una realización, el segundo compuesto encapsulado es pineno. En una realización, el segundo compuesto encapsulado es linalool.

Nanopartículas de PLGA que encapsulan cannabinoides

[0147] En otro aspecto, la presente invención proporciona una nanopartícula de PLGA que encapsula cannabinoides que comprende una nanopartícula de PLGA y un primer cannabinoide encapsulado en la nanopartícula de PLGA. La nanopartícula de PLGA que encapsula cannabinoides puede en capsular compuestos distintos del primer cannabinoide, tales como otros terpenoides y/o cannabinoides. [0148] El primer terpenoide encapsulado en la nanopartícula de PLGA puede ser un cannabinoide que puede extraerse de Cannabis sativa.

[0149] El primer cannabinoide puede ser cannabidiol, cannabidivarina, cannabinol, cannabigerol o cannabicromeno.

[0150] En diversas de tales realizaciones, el primer cannabinoide, cannabinoides opcionales y terpenoides opcionales distintos del primer cannabinoide constituyen colectivamente al menos el 75% en peso, pero menos del 100% en peso, de los compuestos totales encapsulados en las nanopartículas de PLGA. En realizaciones específicas, el primer cannabinoide, cannabinoides opcionales y terpenoides opcionales distintos del primer cannabinoide constituyen colectivamente al menos el 80%, al menos al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94% o al menos el 95% en peso, pero menos del 100% en peso, de los compuestos totales encapsulados en las nanopartículas de PLGA. En realizaciones particulares, el primer cannabinoide, cannabinoides opcionales y terpenoides opcionales distintos del primer cannabinoide constituyen colectivamente al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99% en peso, pero menos del 100% en peso, de los compuestos totales encapsulados en las nanopartículas de PLGA.

[0151] En realizaciones en las que el primer cannabinoide, cannabinoides opcionales y terpenoides opcionales distintos del primer cannabinoide constituyen colectivamente menos del 100% en peso (% en peso) de los compuestos totales encapsulados en las nanopartículas de PLGA, las nanopartículas de PLGA pueden encapsular adicionalmente compuestos distintos del primer cannabinoide, cannabinoides opcionales o terpenoides opcionales. En tales realizaciones, el compuesto adicional puede extraerse de Cannabis sativa. En realizaciones específicas, todos o algunos de los compuestos encapsulados en la nanopartícula de PLGA están presentes en un extracto compuesto por Cannabis sativa.

[0152] La cantidad del primer cannabinoide encapsulado en la nanopartícula de PLGA puede cuantificarse como una razón en peso entre el peso del copolímero de PLGA en la cubierta de la nanopartícula de PLGA y la cantidad del primer cannabinoide encapsulado dentro de la nanopartícula. La razón en peso entre el primer cannabinoide y el copolímero de PLGA puede ser de entre 1 :50 y 1 : 1. La razón en peso entre el primer cannabinoide y el copolímero de PLGA puede ser de entre 1 :100 y 1 :5, 1 :75 y 1 :10, 1 :50 y 1 :10, 1 :40 y 1 :10, 1 :30 y 1 :10, 1 :20 y 1 :10, 1 :50 y 1 :40, 1 :40 y 1 :30, 1 :30 y 1 :20, 1 :20 y 1 :10, l :l0 y l :5 y l :5 y l :l . La razón en peso entre el primer cannabinoide y el copolímero de PLGA puede ser de 1 :50, 1 :45, 1 :40, 1 :35, 1 :30, 1 :25, 1 :20, 1 :19, 1 :17, 1 :18, 1 :16, 1 :15, 1 :14, 1 :13, 1 :12, 1 :1 1, 1 :10, 1 :9, 1 :8, 1 :7, 1 :6, 1 :5, 1 :4, 1 :3, 1 :2 ó 1 :1. En una realización particular, la razón es de aproximadamente 1 :14. En una realización particular, la razón es de aproximadamente 1 :22.

[0153] En algunas realizaciones, la razón en peso entre el primer cannabinoide y el copolímero de PLGA es de entre 1 :50 y 1 :10. En una realización, la razón en peso entre el primer cannabinoide y el copolímero de PLGA es de aproximadamente 1 :14.

[0154] También pueden encapsularse compuestos distintos del primer cannabinoide (“segundo compuesto encapsulado”) en las nanopartículas de PLGA. En diversas realizaciones, los segundos compuestos encapsulados son cannabinoides y/o terpenoides distintos del primer cannabinoide. En una realización, el segundo compuesto encapsulado es ácido cannabigerólico (CBGA). En una realización, el segundo compuesto encapsulado es cannabidiol (CBD). En una realización, el segundo compuesto encapsulado es cannabinol (CBN). En una realización, el segundo compuesto encapsulado es cannabidivarina (CBDV). En una realización, el segundo compuesto encapsulado es cannabicromeno (CBC). En una realización, el segundo compuesto encapsulado es ácido cannabidiólico (CBD A). En una realización, el segundo compuesto encapsulado es cannabigerol (CBG). En una realización, el segundo compuesto encapsulado es mirceno. En una realización, el segundo compuesto encapsulado es cariofdeno. En una realización, el segundo compuesto encapsulado es nerolidol. En una realización, el segundo compuesto encapsulado es limoneno. En una realización, el segundo compuesto encapsulado es fitol. En una realización, el segundo compuesto encapsulado es pineno. En una realización, el segundo compuesto encapsulado es linalool.

Contenido de delta-9-tetrahidrocannabinol ( THC )

[0155] En realizaciones típicas, las nanopartículas de PLGA que encapsulan terpenoides/cannabinoides están o bien complemente libres o bien sustancialmente libres de delta- 9-tetrahidrocannabinol (THC), y por tanto carecen de efectos psicoactivos, lo que ofrece determinadas ventajas normativas y otras ventajas fisiológicas.

[0156] En determinadas realizaciones, la nanopartícula de PLGA que encapsula terpenoides/cannabinoides no está sustancialmente libre de delta-9-THC. En determinadas de estas realizaciones, las nanopartículas de PLGA que encapsulan terpenoides/cannabinoides comprenden el 1-10 por ciento en peso (% en peso) de THC. En realizaciones específicas, la nanopartícula de PLGA que encapsula terpenoides/cannabinoides comprende el 2 - 9 % en peso de THC, el 3 - 8 % en peso de THC, el 4 - 7 % en peso de THC. En determinadas realizaciones, la nanopartícula de PLGA que encapsula terpenoides/cannabinoides comprende el 1, el 2, el 3, el 4, el 5, el 6, el 7, el 8, el 9 o el 10 % en peso de THC.

Nanopartículas de PLGA

[0157] Las nanopartículas comprenden el copolímero poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA), que se sabe que tiene alta biocompatibilidad, baja toxicidad y alto control de la administración de fármacos. Un copolímero de PLGA adecuado para su uso en las nanopartículas descritas en el presente documento está disponible comercialmente, por ejemplo, los disponibles de fuentes comerciales que incluyen Sigma-Aldrich con la marca Resomer.

[0158] Las razones del ácido láctico y el ácido glicólico en el copolímero de PLGA pueden ajustarse, dando como resultado diversas cantidades de cada componente en la composición del polímero de PLGA y de la nanopartícula de PLGA. El porcentaje en peso (p/p) de ácido láctico en el polímero de PLGA puede ser de entre aproximadamente el 10%-90%, el 10%-20%, el 20%- 30%, el 30%-40%, el 40%-50%, el 50%-60%, el 60%-70%, el 70%-80% o el 80%-90%. El porcentaje en peso (p/p) de ácido láctico en el polímero de PLGA puede ser de aproximadamente el 10%, el 15%, el 20%, el 30%, el 35%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85% o el 90%. El porcentaje en peso (p/p) de ácido glicólico en el polímero de PLGA puede ser de entre aproximadamente el 10%-90%, el 10%-20%, el 20%-30%, el 30%-40%, el 40%-50%, el 50%-60%, el 60%-70%, el 70%-80% o el 80%-90%. El porcentaje en peso (p/p) de ácido glicólico en el polímero de PLGA puede ser de aproximadamente el 10%, 15%, el 20%, el 30%, el 35%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85% o el 90%. La razón en peso (p/p) de ácido láctico con respecto a ácido glicólico en el polímero puede ser de entre aproximadamente el 10% de ácido láctico y aproximadamente el 90% de ácido glicólico a aproximadamente el 90% de ácido láctico y aproximadamente el 10% de ácido glicólico. La razón en peso (p/p) de ácido láctico con respecto a ácido glicólico en el polímero puede ser de entre aproximadamente el 10%, el 15%, el 20%, el 30%, el 35%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85% o el 90% de ácido láctico y aproximadamente el 90%, el 85%, el 80%, el 75%, el 70%, el 65%, el 60%, el 55%, el 50%, el 45%, el 40%, el 35%, el 30%, el 25%, el 20%, el 15% o el 10% de ácido glicólico.

[0159] En diversas realizaciones, la razón en peso (p/p) de ácido láctico con respecto a ácido glicólico es de entre aproximadamente el 10-90% de ácido láctico y aproximadamente el 90-10% de ácido glicólico. En algunas realizaciones, la razón en peso (p/p) de ácido láctico con respecto a ácido glicólico es de aproximadamente el 10% de ácido láctico con respecto a aproximadamente el 90% de ácido glicólico. En algunas realizaciones, la razón en peso (p/p) de ácido láctico con respecto a ácido glicólico es de aproximadamente el 25% de ácido láctico con respecto a aproximadamente el 75% de ácido glicólico. En algunas realizaciones, la razón en peso (p/p) de ácido láctico con respecto a ácido glicólico es de aproximadamente el 50% de ácido láctico con respecto a aproximadamente el 50% de ácido glicólico. En algunas realizaciones, la razón en peso (p/p) de ácido láctico con respecto a ácido glicólico es de aproximadamente el 75% de ácido láctico con respecto a aproximadamente el 25% de ácido glicólico. En algunas realizaciones, la razón en peso (p/p) de ácido láctico con respecto a ácido glicólico es de aproximadamente el 90% de ácido láctico con respecto a aproximadamente el 10% de ácido glicólico.

[0160] Además, las nanopartículas de PLGA pueden estar modificadas en superficie o funcionalizadas con polímeros adicionales, tales como polietilenglicol (PEG) o copolímeros tales como poloxámeros. Diversos reactivos de PEG y poloxámero disponibles comercialmente de una variedad de fuentes incluyendo Sigma-Aldrich y Thermo Fisher Scientific son adecuados para este fin.

[0161] El tamaño y el diámetro de las nanopartículas de PLGA pueden depender del método usado para fabricar las nanopartículas, tales como nanoprecipitación o emulsión. En todos los casos, el tamaño y la carga de superficie de las nanopartículas pueden cuantificarse a través de mediciones de la dispersión dinámica de la luz (DLS) y el potencial zeta (potencial z), respectivamente. Un instrumento común usado para realizar estas mediciones es el dispositivo Zetasizer Nano ZS de Malvem; a menos que se especifique otra cosa, todas las mediciones citadas en el presente documento son las obtenidas usando este dispositivo. Estas mediciones pueden usarse para determinar el diámetro promedio de las partículas, la carga de superficie de las partículas (potencial z), y la polidispersidad de las partículas en una población (el índice de polidispersidad, Pdl).

[0162] En diversas realizaciones, las nanopartículas de PLGA que encapsulan mirceno tienen un diámetro promedio de aproximadamente 150-500 nm, 150-200 nm, 200-250 nm, 200-350 nm, 250-300 nm, 300-350 nm, 350-400 nm, 400-450 nm o 450-500 nm. En algunas realizaciones, las nanopartículas tienen un diámetro promedio de aproximadamente 150 nm, 175 nm, 200 nm, 225 nm, 250 nm, 275 nm, 300 nm, 325 nm, 350 nm, 375 nm, 400 nm, 450 nm, 475 nm o 500 nm. En algunas realizaciones, las nanopartículas tienen un diámetro promedio de no más de aproximadamente 150-500 nm, 150-200 nm, 200-250 nm, 250-300 nm, 300-350 nm, 350-400 nm, 400-450 nm o 450-500 nm. En algunas realizaciones, las nanopartículas tienen un diámetro promedio de no más de aproximadamente 150 nm, 175 nm, 200 nm, 225 nm, 250 nm, 275 nm, 300 nm, 325 nm, 350 nm, 375 nm, 400 nm, 450 nm, 475 nm o 500 nm.

[0163] El diámetro de las nanopartículas en una población también puede describirse usando distribución del tamaño de partícula (valores de D). Los valores de D reflejan la masa de las nanopartículas en una población como porcentaje cuando las partículas se ordenan por masa de forma ascendente. Por ejemplo, el valor D10 es el diámetro en el que el 10% de la masa de la población de nanopartículas está compuesta por partículas menores del valor de diámetro indicado. En tal caso, la población de nanopartículas está compuesta principalmente por partículas más grandes que el valor de diámetro indicado. El valor D50 es el diámetro en el que el 50% de la masa de la población de nanopartículas está compuesta por partículas menores del valor de diámetro indicado y el 50% de la masa de la población de nanopartículas está compuesta por partículas más grandes que el valor indicado. En tal caso, la población de nanopartículas está compuesta por igual por partículas más grandes que el valor de diámetro indicado y más pequeñas que el diámetro indicado. El valor D90 es el diámetro en el que el 90% de la masa de población de nanopartículas está compuesta por partículas menores del valor de diámetro indicado. En este caso, la población de nanopartículas está compuesta principalmente por partículas más pequeñas que el valor de diámetro indicado.

[0164] En diversas realizaciones, el valor de diámetro D10 de las nanopartículas de PLGA que encapsulan terpenoides/cannabinoides es de aproximadamente 150 nm, 175 nm, 200 nm, 225 nm, 250 nm, 275 nm, 300 nm, 325 nm, 350 nm, 375 nm, 400 nm, 450 nm, 475 nm o 500 nm. El valor de diámetro D50 de las nanopartículas de PLGA que encapsulan terpenoides/cannabinoides puede ser de aproximadamente 150 nm, 175 nm, 200 nm, 225 nm, 250 nm, 275 nm, 300 nm, 325 nm, 350 nm, 375 nm, 400 nm, 450 nm, 475 nm o 500 nm. El valor de diámetro D90 de las nanopartículas de PLGA que encapsulan terpenoides/cannabinoides puede ser de aproximadamente 150 nm, 175 nm, 200 nm, 225 nm, 250 nm, 275 nm, 300 nm, 325 nm, 350 nm, 375 nm, 400 nm, 450 nm, 475 nm o 500 nm.

[0165] En determinadas realizaciones, las nanopartículas comprenden polímeros adicionales conocidos en la técnica. Tales polímeros incluyen poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico), gelatinas, dextranos, quitosanos, lípidos, fosfolípidos, policianoacrilatos, poliésteres y poli( - caprolactona). Los polímeros pueden escogerse basándose en sus características de degradación, dando como resultado formulaciones de composiciones farmacéuticas para la administración prolongada de fármacos. Los polímeros pueden seleccionarse por su capacidad para afectar a la persistencia en un sujeto durante un periodo de tiempo prolongado, permitiendo una liberación sostenida del fármaco durante el tratamiento.

Composiciones farmacéuticas

[0166] En otro aspecto, en el presente documento se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden una población de nanopartículas de PLGA que encapsulan terpenoides/cannabinoides tal como se describe en el presente documento, y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica está liofilizada. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se liofiliza en presencia de trehalosa.

[0167] En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende además otra población de nanopartículas de PLGA (es decir,“la segunda población de nanopartículas de PLGA”), en la que la segunda población de nanopartículas encapsula al menos un compuesto (es decir,“el tercer compuesto encapsulado”). El compuesto encapsulado en la segunda población de nanopartículas puede ser un cannabinoide o terpenoide. En algunas realizaciones, el cannabinoide o terpenoide en la segunda población de nanopartículas es diferente de los cannabinoides y terpenoides encapsulados en la primera población de nanopartículas de PLGA que encapsulan terpenoides/cannabinoides.

[0168] En una realización, el tercer compuesto encapsulado es ácido cannabigerólico (CBGA). En una realización, el tercer compuesto encapsulado es cannabidiol (CBD). En una realización, el tercer compuesto encapsulado es cannabinol (CBN). En una realización, el tercer compuesto encapsulado es cannabidivarina (CBDV). En una realización, el tercer compuesto encapsulado es cannabicromeno (CBC). En una realización, el tercer compuesto encapsulado es ácido cannabidiólico (CBDA). En una realización, el tercer compuesto encapsulado es cannabigerol (CBG). En una realización, el tercer compuesto encapsulado es mirceno. En una realización, el tercer compuesto encapsulado es b-cariofileno. En una realización, el tercer compuesto encapsulado es nerolidol. En una realización, el tercer compuesto encapsulado es limoneno. En una realización, el tercer compuesto encapsulado es fitol. En una realización, el tercer compuesto encapsulado es pineno. En una realización, el tercer compuesto encapsulado es linalool. En algunas realizaciones, la segunda población de nanopartículas encapsula un compuesto distinto de cannabinoides o terpenoides.

[0169] En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende además una población adicional de nanopartículas de PLGA (es decir,“la tercera población de nanopartículas de PLGA”), en la que la tercera población de nanopartículas encapsula al menos un compuesto (es decir,“el cuarto compuesto encapsulado”). El compuesto encapsulado en la tercera población de nanopartículas puede ser un cannabinoide o terpenoide. En algunas realizaciones, el cannabinoide o terpenoide en la tercera población de nanopartículas es diferente de los cannabinoides y terpenoides encapsulados en la primera o la segunda población de nanopartículas de PLGA que encapsulan terpenoides/cannabinoides.

[0170] En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende además una o más poblaciones adicionales de nanopartículas de PLGA (es decir, “la cuarta población de nanopartículas de PLGA”,“la quinta población de nanopartículas de PLGA”, etc.), en la que la una o más poblaciones adicionales de nanopartículas encapsulan al menos un compuesto. El compuesto encapsulado en la una o más poblaciones adicionales de nanopartículas puede ser un cannabinoide o terpenoide. En algunas realizaciones, el cannabinoide o terpenoide en la una o más poblaciones adicionales de nanopartículas es diferente de los cannabinoides y terpenoides encapsulados en la otra población de nanopartículas de PLGA que encapsulan terpenoides/cannabinoides.

[0171] En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende más de una población de nanopartículas, en la que cada población de nanopartículas comprende un único terpenoide o cannabinoide. En una realización, la composición farmacéutica comprende una primera población de nanopartículas que encapsulan un terpenoide, y una segunda población de nanopartículas que encapsulan un cannabinoide. En una realización, la composición farmacéutica comprende una primera población de nanopartículas que encapsulan un primer terpenoide y una segunda población de nanopartículas que encapsulan un segundo terpenoide. La composición farmacéutica puede comprender además una tercera población de nanopartículas que encapsulan un tercer terpenoide, una cuarta población de nanopartículas que encapsulan un cuarto terpenoide, etc. En otra realización, la composición farmacéutica comprende una primera población de nanopartículas que encapsulan un primer cannabinoide y una segunda población de nanopartículas que encapsulan un segundo cannabinoide. La composición farmacéutica puede comprender además una tercera población de nanopartículas que encapsulan un tercer cannabinoide, una cuarta población de nanopartículas que encapsulan un cuarto cannabinoide, etc.

[0172] En una realización específica, la composición farmacéutica comprende una nanopartícula que encapsula b-mirceno. En una realización, la composición farmacéutica comprende una nanopartícula que encapsula b-cariofileno. En una realización, la composición farmacéutica comprende una nanopartícula que encapsula nerolidol. En una realización, la composición farmacéutica comprende una primera población de nanopartículas que encapsulan b-mirceno, una segunda población de nanopartículas que encapsulan b-cariofileno y/o una tercera población de nanopartículas que encapsulan nerolidol.

[0173] En una realización, la composición farmacéutica comprende una nanopartícula que encapsula cannabidiol. En una realización, la composición farmacéutica comprende una primera población de nanopartículas que encapsulan cannabidiol y una segunda población de nanopartículas que encapsulan terpenoides, por ejemplo, b-mirceno, b-cariofileno, nerolidol y/u otro(s) terpenoide(s). En una realización, cada uno de los terpenoides se encapsula en una población independiente de nanopartículas.

Intervalos de dosis, en general

[0174] Pueden emplearse opcionalmente ensayos in vivo y/o in vitro para ayudar a identificar intervalos de dosificación óptimos para su uso. La dosis precisa que ha de emplearse en la formulación también dependerá de la vía de administración, y de la gravedad del estado, y debe decidirse según el criterio del médico y de las circunstancias de cada sujeto. Pueden extrapolarse dosis eficaces de curvas de dosis-respuesta derivadas de sistemas de prueba in vitro o con modelos animales. Formas de dosificación unitaria

[0175] Las composiciones farmacéuticas que comprenden una nanopartícula de PLGA que contiene terpenoide/cannabinoide pueden presentarse de manera conveniente en una forma de dosificación unitaria.

[0176] La forma de dosificación unitaria normalmente se adaptará a una o más vías de administración específicas de la composición farmacéutica de nanopartículas.

[0177] En diversas realizaciones, la forma de dosificación unitaria está adaptada para la administración por inhalación. En determinadas de estas realizaciones, la forma de dosificación unitaria está adaptada para la administración mediante un vaporizador. En determinadas de estas realizaciones, la forma de dosificación unitaria está adaptada para la administración mediante un nebulizador. En determinadas de estas realizaciones, la forma de dosificación unitaria está adaptada para la administración mediante un aerosol.

[0178] En diversas realizaciones, la forma de dosificación unitaria está adaptada para la administración oral, para la administración bucal o para la administración sublingual.

[0179] En algunas realizaciones, la forma de dosificación unitaria está adaptada para la administración intravenosa, intramuscular o subcutánea.

[0180] En algunas realizaciones, la forma de dosificación unitaria está adaptada para la administración intratecal o intracerebroventricular.

[0181] En algunas realizaciones, la forma de dosificación unitaria está adaptada para la administración tópica incluyendo, por ejemplo, administración transdérmica.

Métodos para obtener nanopartículas de PLGA que encapsulan terpenoides/cannabinoides

[0182] En otro aspecto, se proporcionan métodos para obtener nanopartículas de PLGA que encapsulan terpenoides/cannabinoides. En diversas realizaciones, el método para obtener nanopartículas de PLGA que encapsulan terpenoides/cannabinoides comprende las etapas de (a) proporcionar una disolución orgánica que comprende un primer terpenoide o un primer cannabinoide, un copolímero de PLGA y un disolvente, y una disolución acuosa que comprende un tensioactivo, (b) emulsionar las dos disoluciones para formar una suspensión de las nanopartículas de PLGA que encapsulan terpenoides/cannabinoides, (c) evaporar el disolvente de la emulsión, y (d) obtener las nanopartículas de PLGA que encapsulan terpenoides/cannabinoides. Disoluciones para obtener nanopartículas de PLGA que encapsulan terpenoides/cannabinoides

[0183] Pueden usarse diversas razones de terpenoide/cannabinoide y copolímero de PLGA en la disolución de la etapa (a). Estas razones pueden ser cantidades iguales del primer terpenoide o cannabinoide y el copolímero de PLGA (por ejemplo, una razón en peso de 1 :1, o una razón del 100% (p/p) del primer terpenoide/cannabinoide con respecto al copolímero de PLGA), cantidades inferiores del primer terpenoide/cannabinoide en comparación con el copolímero de PLGA (por ejemplo, una razón en peso de 1 :2, 1 :3 ó 1 :5, o una razón del 50%, el 33%, el 20% (p/p) del primer terpenoide/cannabinoide con respecto al copolímero de PLGA), o cantidades superiores del primer terpenoide/cannabinoide en comparación con el copolímero de PLGA (por ejemplo, una razón en peso de 2:1, 3:1 ó 5:1, o una razón del 200%, el 300%, el 500% (p/p) del primer terpenoide/cannabinoide con respecto al copolímero de PLGA). La razón en peso del terpenoide/cannabinoide con respecto al copolímero de PLGA puede ser de entre aproximadamente 1 :1 y 1 :20, 1 :1 y 1 :10, 1 :1 y 1 :5, 1 :5 y 1 :10, l :l0 y 1 :15 o 1 :15 y 1 :20. La razón en peso del primer terpenoide/cannabinoide con respecto al copolímero de PLGA puede ser de al menos aproximadamente 1 :l , 1 :2, 1 :3, 1 :4, 1 :5, 1 :6, 1 :7, 1 :8, 1 :9, 1 :10, 1 :11, 1 :12, 1 :13, 1 :14, 1 :15, 1 :16, 1 :17, 1 :18, 1 :19, 1 :20. En diversas realizaciones, la razón en peso del primer terpenoide/cannabinoide y el copolímero de PLGA en disolución es de desde aproximadamente 1 :5 hasta aproximadamente 1 :1. En diversas realizaciones, la razón en peso del primer terpenoide/cannabinoide y el copolímero de PLGA en disolución es de aproximadamente 1 :5. En diversas realizaciones, la razón en peso del primer terpenoide/cannabinoide y el copolímero de PLGA en disolución es de aproximadamente 1 :4. En diversas realizaciones, la razón en peso del primer terpenoide/cannabinoide y el copolímero de PLGA en disolución es de aproximadamente 1 :3. En diversas realizaciones, la razón en peso del primer terpenoide/cannabinoide y el copolímero de PLGA en disolución es de aproximadamente 1 :2. En diversas realizaciones, la razón en peso del primer terpenoide/cannabinoide y el copolímero de PLGA en disolución es de aproximadamente 1 :1.

[0184] La disolución puede incluir terpenoides y/o cannabinoides adicionales distintos del primer terpenoide o cannabinoide. En una realización, la disolución comprende al menos un cannabinoide o terpenoide distinto del primer terpenoide o cannabinoide, y está sustancialmente libre de THC. En algunas realizaciones, el al menos un cannabinoide o terpenoide distinto del primer terpenoide o cannabinoide se selecciona del grupo que consiste en: cannabidiol (CBD), cannabinol (CBN), cannabidivarina (CBDV), cannabicromeno (CBC), ácido cannabidiólico (CBD A) y cannabigerol (CBG). En otras realizaciones, el al menos un cannabinoide o terpenoide distinto del primer terpenoide o cannabinoide se selecciona del grupo que consiste en: mirceno, b-cariofileno, nerolidol, fitol, limoneno, linalool y pineno.

[0185] La disolución usada en la etapa (a) del método para fabricar las nanopartículas de PLGA que encapsulan terpenoides/cannabinoides también comprende un disolvente y un tensioactivo.

[0186] Se conocen en la técnica diversos disolventes. Puede usarse cualquier disolvente apropiado para fabricar las nanopartículas de PLGA que encapsulan terpenoides/cannabinoides. Los disolventes a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, acetona, acetato de etilo, etanol, metanol, dietil éter, tolueno, hexano, benceno, diclorometano, tetrahidrofurano, acetonitrilo, dimetilformamida, dimetilsulfóxido, ácido acético, n-butanol, isopropanol, n-propanol y ácido fórmico, o cualquier combinación de los mismos. En una realización, el disolvente es acetona, diclorometano o acetato de etilo. En otra realización, el disolvente es acetato de etilo.

[0187] Se conocen en la técnica diversos tensioactivos y puede usarse cualquier tensioactivo apropiado para fabricar las nanopartículas de PLGA que encapsulan terpenoides/cannabinoides. Los tensioactivos a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, tensioactivos aniónicos tales como laurilsulfato de amonio, laurilsulfato de sodio o dodecilsulfato de sodio, lauril éter sulfato de sodio, miristil éter sulfato de sodio, estearato de sodio y otras sales de carboxilato; tensioactivos catiónicos tales como compuestos con aminas primarias, secundarias, terciarias o cuaternarias tales como diclorhidrato de octenidina; bromuro de cetrimonio, cloruro de benzalconio y cloruro de bencetonio; o tensioactivos no iónicos tales como etoxilatos incluyendo etoxilatos de ácidos grasos, etoxilatos de alquilfenol tales como nonoxinoles, poloxámeros, éster de glicerol de ácidos grasos tal como monoestearato de glicerol y monolaurato de glicerol, polietilenglicol (PEG) y poli(alcohol vinílico) (PVA), o cualquier combinación de los mismos. Los tensioactivos pueden ser hidrófilos o liófdos. En una realización, el tensioactivo es polietilenglicol, un poloxámero o poli(alcohol vinílico) (PVA). En una realización, el tensioactivo es poli(alcohol vinílico) (PVA).

Emulsificación

[0188] Las nanopartículas que encapsulan terpenoides/cannabinoides se forman en la etapa (b) mezclando dos fases de disolvente que, dependiendo del método escogido, producen o bien nanocápsulas o bien nanoesferas. Métodos tales como nanoprecipitación dan como resultado la formación de nanoesferas, mientras que la microemulsión y la emulsificación con un homogeneizador de alta velocidad produce nanocápsulas.

[0189] En diversas realizaciones, el método de emulsificación es homogeneización o sonicación. En determinadas realizaciones, la etapa de emulsionamiento se realiza usando homogeneización.

[0190] La homogeneización puede realizarse con un homogeneizador de alta velocidad, tal como un homogeneizador Polytron, disponible de Thomas Scientific. La homogeneización puede realizarse a aproximadamente de 10.000 a 50.000 rpm. En algunas realizaciones, la homogeneización se realiza a entre aproximadamente 10.000 y 50.000 rpm, 10.000 y 15.000 rpm, 15.000 y 20.000 rpm, 20.000 y 25.000 rpm, 25.000 y 30.000 rpm, 30.000 y 35.000 rpm, 35.000 y 40.000 rpm, 40.000 y 45.000 rpm o 45.000 y 50.000 rpm. En algunas realizaciones, la homogeneización se realiza a aproximadamente 10.000 rpm, 15.000 rpm, 20.000 rpm, 21.000 rpm, 22.000 rpm, 23.000 rpm, 24.000 rpm, 25.000 rpm, 26.000 rpm, 27.000 rpm, 28.000 rpm, 29.000 rpm, 30.000 rpm, 35.000 rpm, 40.000 rpm, 45.000 rpm o 50.000 rpm. En una realización, la homogeneización se realiza a de 20.000 a 30.000 rpm. En otra realización, la homogeneización se realiza a 24.000 rpm.

[0191] En algunas realizaciones, la disolución se homogeneiza durante al menos aproximadamente de 10 segundos a 10 minutos. En algunas realizaciones, la disolución se homogeneiza durante al menos aproximadamente 10 s, 15 s, 20 s, 30 s, 40 s, 45 s, 50 s, 55 s, 1 min, 1,5 min, 2 min, 2,5 min, 3 min, 3,5 min, 4 min, 4,5 min, 5 min, 5,6 min, 6 min, 6,5 min, 7 min, 7,5 min, 8 min, 8,5 min, 9 min, 9,5 min o 10 min. En una realización, la disolución se homogeneiza durante aproximadamente de 30 s a 10 min. En una realización, la disolución se homogeneiza durante 1 min. Evaporación del disolvente

[0192] Tras la etapa de emulsificación, la disolución comprende una suspensión de nanopartículas de PLGA que encapsulan terpenoides/cannabinoides. En la etapa (c), se retira entonces el disolvente en la suspensión de nanopartículas a través de evaporación. Las técnicas de evaporación incluyen, pero no se limitan a, agitar la suspensión y el disolvente, aplicar corrientes de gas, aplicar calor, mantener la temperatura a l0°C, y crear un vacío. Puede usarse un evaporador rotatorio para evaporar el disolvente en la suspensión de nanopartículas a temperatura ambiente o a temperaturas más frías. En tal caso, puede colocarse la muestra en hielo durante la evaporación, en una nevera o sala fría, o el evaporador rotatorio puede tener una unidad de refrigeración unida. El disolvente también puede evaporarse agitando la suspensión de nanopartículas. En algunas realizaciones, evaporar el disolvente comprende agitar la suspensión a temperatura ambiente. La suspensión puede agitarse durante aproximadamente de 5 min a 120 min. En algunas realizaciones, la suspensión se agita durante entre aproximadamente 5-10 min, 10-15 min, 15-30 min, 30-45 min, 45-60 min, 60-75 min, 75-90 min, 90-105 min o 105-120 min. En algunas realizaciones, la suspensión se agita durante aproximadamente 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 25 min, 30 min, 35 min, 40 min, 45 min, 50 min, 55 min, 60 min, 65 min, 70 min, 75 min, 80 min, 85 min, 90 min, 95 min, 100 min, 105 min, 110 min, 115 min o 120 min. En una realización, la suspensión se agita durante de 5 min a 120 min para evaporar el disolvente. En una realización, la suspensión se agita durante 60 min.

Centrifugación

[0193] En algunas realizaciones, la evaporación del disolvente en la etapa (c) basta para permitir que se obtengan las nanopartículas de PLGA. En una realización particular, la centrifugación se realiza a l0°C.

[0194] En algunas realizaciones, tras evaporar el disolvente, se obtienen las nanopartículas de PLGA que encapsulan terpenoides/cannabinoides mediante centrifugación, filtración, o centrifugación y filtración adicionales. En una realización particular, la obtención de las nanopartículas comprende centrifugación. La suspensión de nanopartículas puede centrifugarse a entre 2.000 x g y 15.000 x g. En algunas realizaciones, la suspensión de nanopartículas se centrifuga a entre 2.000 y 4.000 x g, 2.000 y 10.000 x g, 2.000 y 15.000 x g, 4.000 y 10.000 x g, 4.000 y 15.000 x g, 7.000 y 10.000 x g, 7.000 y 15.000 x g, o 10.000 y 15.000 x g. La suspensión de nanopartículas puede centrifugarse a entre 2.000 rpm y 15.000 rpm. En algunas realizaciones, la suspensión de nanopartículas se centrifuga a entre 2.000 y 4.000 rpm, 2.000 y 10.000 rpm, 2.000 y 15.000 rpm, 4.000 y 10.000 rpm, 4.000 y 15.000 rpm, 7.000 y 10.000 rpm, 7.000 y 15.000 rpm, o 10.000 y 15.000 rpm. En una realización, la centrifugación es a 4.000 x g.

[0195] La suspensión puede centrifugarse durante entre aproximadamente 5 min y 60 min. La suspensión puede centrifugarse durante entre aproximadamente 5 y 10 min, 10 y 15 min, 15 y 20 min, 20 y 25 min, 25 y 30 min, 30 y 35 min, 35 y 40 min, 40 y 45 min, 45 y 50 min, 50 y 55 min, o 55 y 60 min. La suspensión puede centrifugarse durante aproximadamente 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 25 min, 30 min, 35 min, 40 min, 45 min, 50 min, 55 min o 60 min. En algunas realizaciones, la centrifugación se realiza durante 10 min, 15 min, 30 min, 45 min o 10-45 min. En una realización, la centrifugación se realiza durante 30 min. En algunas realizaciones, la suspensión puede centrifugarse durante más tiempo. Por ejemplo, la suspensión puede centrifugarse durante aproximadamente de 30 min a 1 hora, de 30 min a 2 horas, o de 3 min a 3 horas.

Liofílización

[0196] Lina vez que se han obtenido las nanopartículas que encapsulan terpenoides/cannabinoides, las nanopartículas pueden liofdizarse opcionalmente. En este caso, puede añadirse un crioprotector o crioconservante a las nanopartículas de PLGA que encapsulan terpenoides/cannabinoides. Puede usarse cualquier crioprotector apropiado conocido en la técnica incluyendo, pero sin limitarse a, trehalosa, etilenglicol, propilenglicol, glicerol y dimetilsulfóxido, y cualquier combinación de los mismos. En una realización, el crioprotector es trehalosa. El crioprotector puede añadirse a una concentración de entre aproximadamente el 1 -25% (p/v) de las nanopartículas de PLGA que encapsulan terpenoides/cannabinoides. El crioprotector puede añadirse a concentraciones de entre aproximadamente el 1-2% (p/v), el 2-5% (p/v), el 5-10% (p/v), el 10-15% (p/v), el 15-20% (p/v), o el 20-25 % (p/v) a las nanopartículas. El crioprotector puede añadirse a una concentración de al menos aproximadamente el 1% (p/v), el 2% (p/v), el 3% (p/v), el 4% (p/v), el 5% (p/v), el 6% (p/v), el 7% (p/v), el 8% (p/v), el 9% (p/v), el 10% (p/v), el 12% (p/v), el 15% (p/v), el 17% (p/v), el 20% (p/v), el 22% (p/v) o el 25% (p/v) a las nanopartículas. En algunas realizaciones, el crioprotector se añade en una concentración del 1-10% (p/v) de las nanopartículas de PLGA que encapsulan terpenoides/cannabinoides. En una realización, el crioprotector se añade a una concentración del 5% (p/v) de las nanopartículas de PLGA que encapsulan terpenoides/cannabinoides.

[0197] Las nanopartículas pueden bofilizarse durante entre aproximadamente 10 y 240 min, 10 y 30 min, 30 y 45 min, 45 y 60 min, 60 y 75 min, 75 y 90 min, 90 y 105 min, 105 y 120 min, 120 y 135 min, 135 y 150 min, 150 y 165 min, 165 y 180 min, 180 y 195 min, 195 y 210 min, 210 y 225 min, 225 y 240 min, o más de 240 min tal como durante la noche. Las nanopartículas pueden liofdizarse durante aproximadamente 10 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min, 75 min, 90 min, 105 min, 120 min, 135 min, 150 min, 165 min, 180 min, 195 min, 210 min, 225 min, 240 min o durante la noche. En algunas realizaciones, las nanopartículas de PLGA que encapsulan terpenoides/cannabinoides se liofilizan durante 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 150 min, 180 min, o 30-180 min. En una realización, las nanopartículas de PLGA que encapsulan terpenoides/cannabinoides se liofdizan durante 120 min.

[0198] En algunas realizaciones, las nanopartículas se liofdizan durante más tiempo. Por ejemplo, las nanopartículas se liofdizan durante aproximadamente 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, o más tiempo (por ejemplo, 24-72 horas) dependiendo del volumen de agua usado.

Eficacias de carga de fármaco y encapsulación

[0199] Puede cuantificarse la cantidad de terpenoide/cannabinoide u otros compuestos encapsulados en las nanopartículas. El contenido de compuesto farmacológico puede expresarse como la eficacia de atrapamiento (EE, %) y carga de fármaco (DL, %), tal como se define en la sección 4.1 anterior.

[0200] En algunas realizaciones, la eficacia de atrapamiento (EE, %) del método es de entre aproximadamente el 1% y el 100%. En algunas realizaciones, la eficacia de atrapamiento es de entre aproximadamente el 1-5%, el 5-10%, el 4-7%, el 4-10%, el 10-15%, el 15-20%, el 20-25%, el 25-30%, el 30-35%, el 35-40%, el 40-45%, el 45-50%, el 50-55%, el 60-65%, el 65-70%, el 70- 75%, el 75-80%, el 80-85%, el 85-90% o el 95-100%. En algunas realizaciones, la eficacia de atrapamiento es de al menos aproximadamente el 1%, el 2%, el 3%, el 4%, el 5%, el 6%, el 7%, el 8%, el 9%, el 10%, el 12%, el 15%, el 17%, el 20%, el 25%, el 30%, el 35%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 99% o el 100%. En algunas realizaciones, la eficacia de atrapamiento es de aproximadamente el 1%, el 2%, el 3%, el 4%, el 5%, el 6%, el 7%, el 8%, el 9%, el 10%, el 12%, el 15%, el 17%, el 20%, el 25%, el 30%, el 35%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 99% o el 100%. En una realización, la eficacia de atrapamiento es de al menos el 4%. En una realización, la eficacia de atrapamiento es de al menos el 5%. En una realización, la eficacia de atrapamiento es de al menos el 6%. En una realización, la eficacia de atrapamiento es de al menos el 7%. En una realización, la eficacia de atrapamiento es de al menos el 8%. En una realización, la eficacia de atrapamiento es de al menos el 9%. En una realización, la eficacia de atrapamiento es de al menos el 10%.

[0201] En algunas realizaciones, la carga de fármaco (DL %) del método es de entre aproximadamente el 1% y el 40%. En algunas realizaciones, la carga de fármaco es de entre aproximadamente el 1-5%, el 5-10%, el 4-7%, el 4-10%, el 10-15%, el 15-20%, el 20-25% o el 25-30%. En algunas realizaciones, la carga de fármaco es de al menos aproximadamente el 1%, el 2%, el 3%, el 4%, el 5%, el 6%, el 7%, el 8%, el 9%, el 10%, el 12%, el 15%, el 17%, el 20%, el 25% o el 30%. En algunas realizaciones, la carga de fármaco es de aproximadamente el 1%, el 2%, el 3%, el 4%, el 5%, el 6%, el 7%, el 8%, el 9%, el 10%, el 12%, el 15%, el 17%, el 20%, el 25% o el 30%.

[0202] En algunas realizaciones, la carga de fármaco se expresa como la razón en peso promedio del terpenoide/cannabinoide encapsulado y el copolímero de PLGA en las nanopartículas. En algunas realizaciones, la razón en peso promedio entre el terpenoide/cannabinoide encapsulado y el copolímero de PLGA en las nanopartículas de PLGA que encapsulan terpenoides/cannabinoides es de entre aproximadamente 1 :50 y aproximadamente 1 : 10. En algunas realizaciones, la razón en peso promedio es de entre aproximadamente 1 :50 y 1 :40, 1 :40 y 1 :30, 1 :30 y 1 :20, y 1 :20 y 1 :10. En algunas realizaciones, la razón en peso promedio es de al menos aproximadamente 1 :50, 1 :45, 1 :40, 1 :35, 1 :30, 1 :25, 1 :20, 1 :15, 1 :14, 1 :13, 1 :12, 1 :1 1, 1 :10. En algunas realizaciones, la razón en peso promedio es de al menos aproximadamente 1 :50. En algunas realizaciones, la razón en peso promedio es de al menos aproximadamente 1 :40. En algunas realizaciones, la razón en peso promedio es de al menos aproximadamente 1 :30. En algunas realizaciones, la razón en peso promedio es de al menos aproximadamente 1 :20. En algunas realizaciones, la razón en peso promedio es de al menos aproximadamente 1 :10. Métodos de tratamiento usando nanopartículas de PLGA que encapsulan terpenoides/cannabinoides

[0203] Aún en otro aspecto, se proporcionan métodos de tratamiento de diversos síntomas o enfermedades en sujetos mamíferos. Los métodos comprenden administrar la nanopartícula de PLGA que contiene terpenoides/cannabinoides descrita en el presente documento. Estos métodos están dirigidos particularmente a tratamientos terapéuticos y profilácticos de mamíferos, y más particularmente, de seres humanos. [0204] La cantidad real administrada, y la velocidad y la pauta de administración, dependerán de la naturaleza y la gravedad de los síntomas o la enfermedad que va a tratarse. La prescripción del tratamiento, por ejemplo las decisiones sobre dosificación etc., está dentro de la experiencia de los médicos de cabecera y otros profesionales sanitarios, y normalmente tiene en cuenta el trastorno que va a tratarse, el estado del paciente individual, la vía de administración, el sitio que va a tratarse, y otros factores conocidos por los médicos.

[0205] Pueden emplearse opcionalmente ensayos in vivo y/o in vitro para ayudar a identificar los intervalos de dosificación óptimos para su uso y las vías y tiempos de administración. La dosis precisa que ha de emplearse en la formulación también dependerá de la vía de administración, y de la gravedad del estado, y debe decidirse según el criterio del médico y de las circunstancias de cada sujeto. Pueden extrapolarse dosis y métodos de administración eficaces de curvas de dosis- respuesta derivadas de sistemas de prueba in vitro o con modelos animales.

[0206] En algunas realizaciones, el terpenoide o cannabinoide encapsulado se administra en una cantidad de menos de 1 g, menos de 500 mg, menos de 100 mg, menos de 10 mg por dosis.

[0207] En los métodos de tratamiento descritos en el presente documento, la composición farmacéutica que comprende nanopartícula de PLGA que contiene terpenoides/cannabinoides puede administrarse sola o en combinación con otros tratamientos administrados o bien simultáneamente o bien secuencialmente con la composición que contiene terpenoides/cannabinoides.

Métodos de efectuar desensibilización de TRPV1 en células de un sujeto mamífero

[0208] Se presentan métodos para efectuar desensibilización de TRPV1 en células de un sujeto mamífero, comprendiendo el método administrar al sujeto las composiciones farmacéuticas que contienen terpenoides/cannabinoides descritas en el presente documento en una cantidad, por una vía de administración y durante un tiempo suficiente para producir desensibilización de TRPV1 en células dentro del sujeto. En algunas realizaciones, las células que van a someterse a desensibilización de TRPV1 son nociceptores, tales como nociceptores periféricos y nociceptores viscerales.

[0209] En diversas realizaciones, la composición farmacéutica se administra por vía sistémica. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra por vía oral, mediante administración bucal, o por vía sublingual. [0210] En diversas realizaciones, la composición farmacéutica se administra por vía tópica. En realizaciones particulares, la composición farmacéutica se administra por vía tópica para efectuar administración transdérmica.

[0211] En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra por vía parenteral. En determinadas realizaciones, la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra por vía subcutánea. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra mediante inhalación.

Métodos de tratamiento del dolor

[0212] En algunas realizaciones, los receptores que van a someterse a desensibilización de TRPV 1 son nociceptivos, y el método comprende administrar al sujeto las composiciones farmacéuticas que contienen terpenoides/cannabinoides descritas en el presente documento en una cantidad, por una vía de administración y durante un tiempo suficiente para producir desensibilización de TRPV1 en nociceptores dentro del sujeto.

[0213] En algunas realizaciones, los nociceptores son nociceptores periféricos. En determinadas de estas realizaciones, la composición farmacéutica se administra por vía tópica. En algunas realizaciones, las neuronas de detección del dolor son viscerales. En determinadas de estas realizaciones, la composición farmacéutica se administra por vía sistémica.

[0214] En un aspecto relacionado, se proporcionan métodos para tratar el dolor en un sujeto mamífero. El método comprende administrar al sujeto las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento en una cantidad, por una vía de administración y durante un tiempo suficiente para reducir el dolor.

[0215] En determinadas realizaciones, el dolor es dolor neuropático. En realizaciones particulares, el dolor neuropático es dolor neuropático periférico diabético. En realizaciones particulares, el dolor es neuralgia postherpética. En realizaciones particulares, el dolor es neuralgia del trigémino.

[0216] En algunas realizaciones, el sujeto tiene dolor relacionado con o producido por torceduras, esguinces, artritis u otro dolor articular, moretones, dolores de espalda, fibromialgia, endometriosis, cirugía, migraña, cefaleas en brotes, psoriasis, síndrome del intestino irritable, cistitis intersticial crónica, vulvodinia, traumatismo, trastornos musculoesqueléticos, zóster, anemia de células falciformes, enfermedad cardiaca, cáncer, accidente cerebr ovascular o llagas o ulceración en la boca debido a quimioterapia o radiación. [0217] En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra al menos una vez al día durante al menos 3 días. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra al menos una vez al día durante al menos 5 días. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra al menos una vez al día durante al menos 7 días. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra al menos una vez al día durante más de 7 días.

[0218] En diversas realizaciones, la composición farmacéutica se administra a una dosis, por una vía de administración y en una pauta suficiente para mantener niveles eficaces del terpenoide o cannabinoide en los nociceptores durante al menos 3 días, al menos 5 días o al menos 7 días.

Métodos de tratamiento de la hipertrofia cardiaca

[0219] En otro aspecto, se proporcionan métodos de tratamiento de la hipertrofia cardiaca en un sujeto mamífero. Los métodos comprenden administrar al sujeto una cantidad antihipertrófica eficaz de las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento.

[0220] En realizaciones típicas, la composición farmacéutica se administra por vía sistémica. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra por vía oral. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra por vía subcutánea. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra mediante inhalación.

Métodos de tratamiento profiláctico para la hipertrofia cardiaca

[0221] En otro aspecto, se proporcionan métodos de tratamiento profiláctico para la hipertrofia cardiaca en un sujeto mamífero. Los métodos comprenden administrar a un sujeto en riesgo de padecer hipertrofia cardiaca una cantidad antihipertrófica eficaz de las composiciones que contienen terpenoides/cannabinoides descritas en el presente documento.

Métodos de tratamiento de la vejiga hiperactiva

[0222] En otro aspecto, se proporcionan métodos de tratamiento de la vejiga hiperactiva en un sujeto mamífero. Los métodos comprenden administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de las composiciones que contienen terpenoides/cannabinoides descritas en el presente documento. [0223] En realizaciones típicas, la composición farmacéutica se administra por vía sistémica. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra mediante irrigación de la vejiga.

Métodos de tratamiento de la tos crónica resistente

[0224] En otro aspecto, se proporcionan métodos de tratamiento de la tos crónica resistente, comprendiendo los métodos administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica que contiene terpenoides/cannabinoides descrita en el presente documento.

[0225] En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra por vía sistémica.

[0226] En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra mediante inhalación.

Métodos de tratamiento de trastornos con etiología de TRPV1

[0227] En otro aspecto, las enfermedades o los trastornos que se tratan con las composiciones farmacéuticas que contienen terpenoides/cannabinoides descritas en el presente documento incluyen enfermedades relacionadas con la función anómala de TRPV1. Las enfermedades pueden estar relacionadas con la activación anómala, la supresión o la desregulación de TRPV1. En algunas realizaciones, las enfermedades están relacionadas con la expresión anómala o la mutación del gen que codifica para TRPV1.

[0228] En algunas realizaciones, las enfermedades tratadas con las composiciones farmacéuticas que contienen terpenoides/cannabinoides descritas en el presente documento son enfermedades relacionadas con la síntesis anómala de un agonista endógeno de TRPV1.

EJEMPLOS

[0229] A continuación se muestran ejemplos de realizaciones específicas para llevar a cabo la presente invención. Los ejemplos se ofrecen únicamente para fines ilustrativos, y no se pretende que limiten el alcance de la presente invención en modo alguno. Se han realizado esfuerzos para garantizar la exactitud con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperaturas, etc.), pero naturalmente debe permitirse algún error experimental y desviación.

[0230] La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique otra cosa, métodos convencionales de química de proteínas, bioquímica, técnicas de ADN recombinante y farmacología, dentro de la experiencia en la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la bibliografía. Abreviaturas

DCM Diclorometano

DL Carga de fármaco

EE Eficacia de atrapamiento

NP Nanopartículas

PEG Polietilenglicol

PLGA Copolímero de ácido láctico y glicólico

PVA Poli(alcohol vinílico) z Potencial zeta

Metodología

Métodos de caracterizaciones de nanopartículas que contienen terpenoides

[0231] Se midieron el diámetro medio y las distribuciones de tamaño de las nanopartículas que contienen terpenoides sintetizadas y purificadas, por triplicado, a 25,0 ± 0,5°C mediante dispersión dinámica de la luz (Nanosizer ZS, Malvern Instruments Ltd., REÍ).

[0232] El potencial zeta de las NP a base de PLGA-PEG (que contienen terpenoides y libres de terpenoides) se caracterizó mediante electroforesis de láser Doppler (Nanosizer ZS, Malvern Instruments Ltd., REÍ), y se efectuaron mediciones de z, realizadas por triplicado, en las NP tras el lavado final con agua MQ a 25°C.

[0233] La caracterización morfológica de las nanopartículas se realizó mediante análisis de imagen mediante microscopía electrónica de barrido en un microscopio FEI TENEO. Se prepararon las muestras diluyendo suspensiones de nanopartículas que contienen terpenoides (libres de trehalosa) hasta aproximadamente 0,8 mg/ml y se cubrieron con una cubierta de 8-9 nm de Pd/Pt a vacío (Leica EM SCD500). [0234] Se midieron las cantidades de mirceno, b-cariofileno o nerolidol encapsulado en nanopartículas mediante un método de espectrometría de CG-EM. Los análisis se realizaron usando un sistema de cromatografía de gases Trace 1300 GC, dotado de una columna de capilaridad ZB-1MS (30 m x 0,25 mm x 0,25 pm, Thermo Scientific), en tándem con un espectrómetro de masas TSQ8000 (Thermo Scientific), y la adquisición de datos y los análisis se realizaron usando un dispositivo Xcalibur.

[0235] Para la detección por espectrometría de masas, se llevó a cabo ionización mediante impacto electrónico (El) con una tensión de 70 eV y modo de barrido completo en el intervalo de m/z de 20-300 con una temperatura de la fuente de iones de 200°C en el modo de ion positivo. Para la cuantificación de mirceno, cariofileno y nerolidol, se monitorizaron los iones característicos para los terpenoides a m/z 69, 93 y 133 respectivamente mediante el modo de monitorización selectiva de iones (SIM). Para el fin de generar una curva de calibración, se prepararon mirceno, cariofileno o nerolidol con una serie de concentraciones que oscilan entre 1 -60 ppm (1 , 2, 5, 10, 20, 40 y 60 ppm) en diclorometano (DCM) y se midieron en el instrumento de CG-EM.

[0236] Las capacidades de encapsulación de fármaco de las nanopartículas de PLGA-PEG pueden expresarse como la eficacia de atrapamiento (EE, %) y la carga de fármaco (DL, %) según las Ecuaciones 1 y 2 respectivamente.

EE (%) (Ecuación 1)

DL (%) (Ecuación 2)

Células

[0237] El laboratorio de Helen Tumer en la Chaminade University of Honolulú proporcionó células HEK TRPV1 y se mantuvieron en medio esencial MEM complementado con FBS al 10%, penicilina-estreptomicina a 50 unidades/ml-50 pg/ml y geneticina a 0,6 mg/ml.

Procedimiento del ensayo de señalización de calcio [0238] Se recogieron células HEK TRPV1 con tripsina, se desactivaron con medio y se contaron. Se centrifugaron las células a 1000 rpm, durante 5 min a temperatura ambiente. Se lavaron las células dos veces con tampón de ensayo de Ca 1 mM (Na Ringers [NaCl 140 mM, KC1 2,8 mM, MgCh 2 mM, glucosa 11 mM, HEPES 10 mM], Probenecid 2M, CaCh 1 mM; pH 7,4), y se recogieron mediante centrifugación a 1000 rpm, durante 5 min, a temperatura ambiente. Se resuspendieron las células en Fluo-4 1 mM (1 mΐ de Fluo-45 mM, se mezclaron con 1 mΐ de Pluronic F-127 al 20% en DMSO, entonces se añadieron 5 ml de tampón de ensayo de Ca 1 mM y se incubó la mezcla a 37°C durante 10 min en la oscuridad), y se incubó durante 30 min a 37°C en la oscuridad. Entonces se lavaron las células dos veces con tampón de ensayo de Ca 1 mM, luego se resuspendieron en el tampón de ensayo y se pipetearon en placas de 96 pocillos de paredes opacas a una densidad de 150.000 células/l 80 pl/pocillo. Se midió la fluorescencia usando un lector de placas (Synergy HTX, BioTek, EE.ETU.), a una longitud de onda de excitación de 485 nm y una longitud de onda de emisión de 528 nm. Una vez que se estableció el nivel inicial (3 mediciones), se añadieron 20 mΐ de la disolución estimulante (terpenoides libres, NP cargadas con terpenoides y controles) a cada uno de los pocillos y se continuó con la medición durante 1 h con una lectura cada 40 segundos.

Preparación de las disoluciones estimulantes

[0239] Todas las disoluciones se prepararon en un tampón de ensayo de Ca 1 mM. Primero se disolvieron terpenoides libres en DMSO, luego se diluyó un volumen específico con tampón de ensayo para producir la concentración requerida. Se prepararon nanopartículas (NP) de PLGA- PEG o poli(etilenglicol)metil éter-bloque-poli(lactida-co-glicolida) cargadas con terpenoides mediante el método de emulsificación y se diluyeron directamente usando el tampón de ensayo. También se prepararon controles negativos del tampón de ensayo que contenía DMSO y NP blanco. Se usó ionomicina 4 mM como control positivo. Se prepararon terpenoides libres y encapsulados a una concentración de 400 pg/ml (para dar una concentración final de 40 pg/ml tras la adición a las células) o bien solos o bien en combinaciones, tales como mirceno más nerolidol, mirceno más cariofileno, nerolidol más cariofileno, y mirceno más nerolidol más b-cariofileno).

[0240] Se realizaron los experimentos por triplicado, se dedujeron respuestas de controles negativos y se calcularon promedios y se usaron para representar gráficamente los perfiles de respuestas al calcio. Ejemplo 1 - Método de nanoprecipitación para producir partículas que encapsulan mirceno

[0241] Se sometió a prueba un método de nanoprecipitación basado en un desplazamiento de disolvente (figura 1) para determinar la generación de nanopartículas de PLGA que contienen mirceno. La formación de nanopartículas mediante el método de nanoprecipitación está regida por el denominado efecto Marangoni, que se somete a turbulencias interfaciales que se producen en la superficie de contacto del disolvente y el no disolvente y resulta de fenómenos complicados y acumulados como variaciones de flujo, difusión y tensión superficial. La presencia de un estabilizador es muy importante para evitar la formación de agregados y para conferir estabilidad a las nanopartículas durante la técnica de nanoprecipitación.

Formulación

[0242] Se prepararon nanopartículas (NP) a base de PLGA usando un método de nanoprecipitación según las fórmulas (Fl-Fl 1) en la Tabla 1. Se usó una mezcla de tensioactivos hidrófilos y liófilos (Pluronic y Span) para garantizar la estabilidad del sistema. Se evaporó acetona usando diferentes condiciones experimentales, a temperatura ambiente, o usando un evaporador rotatorio en ausencia o en presencia de succinato de tocoferilo-polietilenglicol (TPGS).

* % p/p basado en el peso de PLGA

Método de preparación usando evaporación de disolvente orgánico a temperatura ambiente ÍF1-F6)

[0243] Se disolvieron PLGA (22,5 mg) y Span® 60 (7,5 mg) en 1,5 ml de acetona. Se añadió mirceno (10 - 100% p/p) a la disolución orgánica. A 4,5 ml de la disolución acuosa de Pluronic® F-68 (0,5% p/v), se les añadió gota a gota la fase orgánica usando una bomba de jeringa a una velocidad de 5 ml/h con agitación continua. Se continuó con la agitación durante 2 h a temperatura ambiente para permitir que se evaporara la acetona. Para retirar los compuestos sin encapsular así como el tensioactivo en exceso, se ajustó la suspensión hasta 45 ml con agua MQ y se centrifugó a 10.000 rpm a 4°C durante 30 min. Se resuspendió el sedimento en 45 ml de agua MQ y se centrifugó de nuevo usando las mismas condiciones. Se resuspendió el sedimento de NP en agua MQ para obtener 1 ml de suspensión de NP. Entonces se secó esta suspensión en la estufa para medir el mirceno cargado. [0244] Para medir el peso y el rendimiento de las NP producidas, se prepararon NP usando el mismo método. Tras la centrifugación final se resuspendió el sedimento de NP en 2 ml de agua MQ y la preparación se secó por congelación. Las NP liofilizadas se recogieron como un material similar a algodón blanco. También se recogió y se liofilizó el sobrenadante para medir el mirceno sin encapsular.

[0245] Se prepararon muestras para el análisis de CG-EM. Se secaron completamente en la estufa 100 mΐ de NP recién preparadas (retirada de agua) durante 30 - 40 min a 40°C. Se añadió DCM (2 ml) para disolver el residuo seco. A continuación, se transfirieron 1,5 ml de la disolución de DCM a viales adecuados y se sellaron. Se pesaron los sobrenadantes liofilizados almacenados a -20°C y se prepararon muestras para el análisis de CG-EM tal como se describe para las NP. En resumen, se disolvieron 5 mg de muestras de NP en DCM y se transfirieron 1,5 ml de disolución a un vial adecuado y se selló.

Método de preparación usando evaporación de disolvente orgánico usando evaporador rotatorio en ausencia de TPGS ÍF7-8)

[0246] Se disolvieron PLGA (22,5 mg) y Span® 60 (7,5 mg) en 1,5 ml de acetona. Se añadió mirceno (40 o 60% p/p) a la disolución orgánica. A 4,5 ml de la disolución acuosa de Pluronic® F-68 (0,5% p/v), se le añadió gota a gota la fase orgánica usando una bomba de jeringa a una velocidad de 5 ml/h. Durante el mezclado, se mantuvo la mezcla en un baño de agua fría para reducir la evaporación del fármaco. Se retiró la acetona usando un evaporador rotatorio sin calentamiento a lo largo de un periodo de 20 min. Para retirar los compuestos sin encapsular así como el tensioactivo en exceso, se ajustó la suspensión hasta 45 ml con agua MQ y se centrifugó a 10.000 rpm a 4°C durante 30 min. Se resuspendió el sedimento en 45 ml de agua MQ y se centrifugó de nuevo usando las mismas condiciones. Se resuspendió el sedimento de NP en 2 ml de agua MQ, y la preparación se secó por congelación. Las NP liofilizadas se recogieron como un material similar a algodón blanco. También se recogió y se liofilizó el sobrenadante para medir el mirceno sin encapsular.

[0247] Se prepararon muestras para el análisis de CG-EM. Se disolvieron las NP liofilizadas en DCM. Para facilitar la disolución, se sonicaron las muestras en el sonicador de baño durante 5 min. Se filtraron las muestras usando un filtro de jeringa de 1 pm (compatible con DCM). Se transfirieron 1,5 ml de disoluciones de muestra a viales adecuados y se sellaron. Se pesaron los sobrenadantes liofilizados almacenados a -20°C y se prepararon muestras para el análisis de CG- EM tal como se describe para las NP. En resumen, se disolvieron 5 mg de muestras de NP en DCM y se transfirieron 1,5 ml de disolución a un vial adecuado y se selló. Método de preparación usando evaporación de disolvente orgánico usando evaporador rotatorio en presencia de TPGS (F9-11)

[0248] El succinato de tocoferilo-polietilenglicol (TPGS), vitamina E-TPGS, es un derivado soluble en agua de la vitamina E natural. Se seleccionó como emulsionante en las formulaciones debido a sus varias ventajas, incluyendo sus características de estructura voluminosa y gran área superficial, que lo convierten en un emulsionante excelente. Se prepararon NP a base de PLGA usando un método de nanoprecipitación en presencia de succinato de tocoferilo-polietilenglicol (TPGS) según las fórmulas, F9-F11 (tabla 1).

[0249] Se disolvieron PLGA (22,5 mg), Span® 60 (5, 2,5 ó 0 mg) y TPGS (2,5, 5 ó 7,5 mg) en 1,5 ml de acetona. Se añadió mirceno (9 mg; 40% p/p) a la disolución orgánica. A 4,5 ml de la disolución acuosa de Pluronic® F-68 (0,5% p/v), se le añadió gota a gota la fase orgánica usando una bomba de jeringa a una velocidad de 5 ml/h. Durante el mezclado, se mantuvo la mezcla en un baño de agua fría para reducir la evaporación del fármaco. Se retiró la acetona usando un evaporador rotatorio sin calentamiento a lo largo de un periodo de 20 min. Para retirar los compuestos sin encapsular así como el tensioactivo en exceso, se ajustó la suspensión hasta 45 ml con agua MQ y se centrifugó a 10.000 rpm a 4°C durante 30 min. Se resuspendió el sedimento en 45 ml de agua MQ y se repitió la centrifugación usando las mismas condiciones. Se resuspendió el sedimento de NP en 2 ml de agua MQ, y la preparación se secó por congelación. Las NP liofdizadas se recogieron como un material similar a algodón blanco. También se recogió y se liofilizó el sobrenadante para medir el mirceno sin encapsular.

[0250] Se prepararon muestras para el análisis de CG-EM. Se disolvieron los liofilizados de NP en DCM. Para facilitar la disolución, se sonicaron las muestras en el sonicador de baño durante 5 min. Se filtraron las muestras usando un filtro de jeringa de 1 pin (compatible con DCM). Se transfirieron 1,5 ml de disoluciones de muestra a viales adecuados y se sellaron. Se pesaron los sobrenadantes liofilizados almacenados a -20°C y se prepararon muestras para el análisis de CG- EM tal como se describe para las NP. En resumen, se disolvieron 5 mg de muestras de NP en DCM y se transfirieron 1,5 ml de disolución a un vial adecuado y se selló. Caracterización de nanopartículas preparadas mediante nanoprecipitación

[0251] La tabla 2 presenta el diámetro medio, la distribución de tamaño, el potencial zeta, el peso, el rendimiento, las cantidades de mirceno cargado, la EE% y la DL% de NP preparadas mediante nanoprecipitación.

* % p/p basado en PLGA

[0252] El tamaño de partícula de las NP producidas mediante nanoprecipitación osciló entre 200 - 240 nm con buena polidispersidad (Pdl) de 0,2 o menos y un potencial zeta negativo de alrededor de -30 (tabla 2). Las figuras 8A y 8B muestran la distribución de tamaño por intensidad y distribución de potencial zeta, respectivamente, para la muestra F6. Las figuras 8C y 8D muestran la distribución de tamaño por intensidad y distribución de potencial zeta, respectivamente, para la muestra F8. Las figuras 8E y 8F muestran la distribución de tamaño por intensidad y distribución de potencial zeta, respectivamente, para la muestra F9.

[0253] Se produjeron de manera satisfactoria NP estables con concentraciones de mirceno de hasta el 60%. A concentraciones de mirceno por encima del 60% (p/p), las NP no fueron físicamente estables y se formaron agregaciones durante la etapa de mezclado inicial.

[0254] La evaporación de acetona usando el evaporador rotatorio, sin calentamiento, ha aumentado significativamente la cantidad de mirceno cargado 5 veces o más, desde 0,036 mg y 0,042 mg en F5 y F6, respectivamente, hasta 0,155 mg y 0,275 mg en F7 y F8, respectivamente (tabla 2).

[0255] El TPGS es un compuesto anfífilo sintético de la vitamina E, y está aprobado por la FDA como complemento nutricional de vitamina E soluble en agua y vehículo para la administración de fármacos. Funciona como tensioactivo, solubilizador, con potencial para mejorar la carga de fármaco en las NP. Además, el derivado de a-tocoferilo puede potenciar la absorción oral de materiales hidrófobos. El uso de TPGS no parece mejorar la cantidad de mirceno cargado en las NP de PLGA y en cambio se encontró que el mirceno cargado se reducía cuando aumentaba el porcentaje de TPGS (F9 y F10; Tabla 2).

Ejemplo 2 - Método de microemulsificación para producir nanopartículas que encapsulan mirceno

[0256] La formación de microemulsiones también se usó para obtener nanopartículas de PLGA. Lina microemulsión es un sistema de agua, aceite y un compuesto anfífilo que es una única disolución líquida ópticamente isotrópica y termodinámicamente estable. Su formación es espontánea (figura 2). La lecitina de soja, que es un lípido natural que contiene una mezcla de fosfolípidos, se ha usado previamente como compuesto anfífilo para la preparación de diversos nanosistemas de administración como nanoemulsiones, liposomas, micelas y nanopartículas. Este método permite la formación de nanocápsulas esféricas donde el núcleo aceitoso compuesto por mirceno queda atrapado y retenido en una delgada pared densa formada por polímero de PLGA y fosfatidilcolina. Formulación

[0257] Se prepararon NP a base de PLGA usando un método de microemulsificación según las fórmulas en la Tabla 3.

[0258] Se prepararon NP cargadas con mirceno según un método descrito anteriormente por Iannitelli et al (Int. J. Mol. Sci. 2011, 12, 5039-5051). En resumen, se disolvieron PLGA (11 mg) y Epikuron 200 (13 mg) en 2,5 ml de acetona. Se añadió mirceno (48 mg) a la disolución orgánica. Se añadió la fase orgánica que contenía el fármaco de una vez a la fase acuosa (5 ml de Pluronic® F-68 (0,5% p/v o 5% p/v) o poli(alcohol vinílico) (PVA) (0,5% p/v)) con agitación continua. Se cubrió el vaso de precipitados que contenía la mezcla con Parafilm para impedir la evaporación de mirceno y se continuó con la agitación durante 10 min. Se retiró la acetona usando un evaporador rotatorio sin calentamiento a lo largo de un periodo de 40 min. Para retirar los compuestos sin encapsular, así como el tensioactivo en exceso, se ajustó la suspensión hasta 45 ml con agua MQ y se centrifugó a 10.000 rpm a 4°C durante 30 min. Se resuspendió el sedimento en 45 ml de agua MQ y se centrifugó de nuevo usando la misma condición. Se resuspendió el sedimento de NP en 2 ml de agua MQ, y la preparación se secó por congelación. Las NP liofilizadas se recogieron como un material similar a algodón blanco. También se recogió y se liofilizó el sobrenadante para medir el mirceno sin encapsular.

[0259] Se prepararon muestras para el análisis de CG-EM. Se disolvieron las NP liofilizadas en DCM. Para facilitar la disolución, se sonicaron las muestras en el sonicador de baño durante 5 min. Se filtraron las muestras usando un filtro de jeringa de 1 pm (compatible con DCM). Se transfirieron 1,5 ml de disoluciones de muestra a viales adecuados y se sellaron. Se pesaron los sobrenadantes liofdizados almacenados a -20°C y se prepararon muestras para el análisis de CG- EM tal como se describe para las NP. En resumen, se disolvieron 5 mg de muestras de NP en DCM y se transfirieron 1,5 ml de disolución a un vial adecuado y se selló.

Caracterización de nanopartículas preparadas mediante microemulsificación

[0260] El método de microemulsificación de preparación de NP implica la preparación de una microemulsión intermedia que se forma espontáneamente cuando se usa una alta concentración y una correcta combinación de tensioactivos (normalmente un tensioactivo y un cotensioactivo; en este trabajo, Pluronic® F-68 y Epikuron 200). Entonces se difunde el disolvente de las gotitas de la emulsión y se elimina por evaporación dejando las NP.

[0261] El diámetro medio, la distribución de tamaño, el potencial zeta, el peso, el rendimiento, las cantidades de mirceno cargado, la EE% y la DL% de NP preparadas mediante microemulsificación se presentan en la Tabla 4. La figura 9 A muestra la distribución de tamaño por intensidad y la figura 9B muestra la distribución de potencial zeta de la muestra F17.

[0262] Las NP preparadas usando el 0,5% de PVA (como fase acuosa) no fueron físicamente estables y se formaron agregados durante la preparación (F12). El tamaño de partícula de las NP blanco fue de alrededor de 150 nm (F13, F14) mientras que las NP cargadas de mirceno fueron aproximadamente 100 nm más grandes con un diámetro de alrededor de 250 nm. Todas las NP mostraron buena polidispersidad de menos de 0,2 y un potencial zeta negativo de entre -30 y -35.

[0263] En todos los casos se obtuvieron partículas en el intervalo nanométrico con una estrecha distribución de tamaño (Pdl < 0,2) y el potencial zeta de alrededor de -32 mV. No se observaron diferencias entre las nanopartículas cargadas y blanco (-30 mV). Por tanto, casi no queda fármaco retenido sobre la superficie.

Ejemplo 3 - Método de emulsificación (homogeneizador de alta velocidad) para producir nanopartículas que encapsulan mirceno

[0264] Se usó un método basado en la emulsificación de la disolución orgánica de polímero en una fase acuosa, seguido por evaporación del disolvente orgánico (figura 3) para la preparación de nanopartículas que encapsulan mirceno. Se vierte la fase orgánica en la fase continua (fase acuosa) en la que se disuelve un tensioactivo para conferir estabilidad a la emulsión. La emulsificación se lleva a cabo bajo una fuerza de alta cizalladura para reducir el tamaño de la gotita de emulsión. Este procedimiento determinará en gran medida el tamaño de partícula final. Formulación

[0265] Se prepararon NP a base de PLGA usando un método de emulsión individual según las fórmulas en la Tabla 5. La emulsificación se realizó con un homogeneizador Polytron®.

* % p/p basado en el peso de PLGA

[0266] Se disolvió PLGA (40 mg) en 1 ml de acetato de etilo. Se añadió mirceno (10 - 100% p/p basado en PLGA) a la disolución orgánica. La preparación de las NP se realizó usando un homogeneizador de alta velocidad). Se sumergió la sonda del homogeneizador dentro de un tubo Falcon que contenía 5 ml de PVA (0,5% p/v). Se añadió la fase orgánica que contenía el fármaco gota a gota usando una pipeta con el homogeneizador fijado a 24.000 rpm y se continuó la homogeneización durante 1 min. Se realizó la homogeneización en hielo para reducir la temperatura generada durante el procedimiento. Se retiró el disolvente orgánico usando un evaporador rotatorio sin calentamiento a lo largo de un periodo de 1 h. Para retirar los compuestos sin encapsular así como el tensioactivo en exceso, se ajustó la suspensión hasta 45 ml con agua MQ y se centrifugó a 10.000 rpm a 4°C durante 30 min. Se resuspendió el sedimento en 45 ml de agua MQ y se centrifugó de nuevo usando las mismas condiciones. Se resuspendió el sedimento de NP en 2 ml de agua MQ, y la preparación se secó por congelación. Las NP liofilizadas se recogieron como un material similar a algodón blanco. También se recogió y se liofilizó el sobrenadante para medir el mirceno sin encapsular.

[0267] Se prepararon muestras para el análisis de CG-EM. Se disolvieron las NP liofilizadas en DCM. Para facilitar la disolución, se sonicaron las muestras en el sonicador de baño durante 5 min. Se filtraron las muestras usando un filtro de jeringa de 1 mih (compatible con DCM). Se transfirieron 1,5 ml de disoluciones de muestra a viales adecuados y se sellaron. Se pesaron los sobrenadantes liofdizados almacenados a -20°C y se prepararon muestras para el análisis de CG- EM tal como se describe para las NP. En resumen, se disolvieron 5 mg de muestras de NP en DCM y se transfirieron 1,5 ml de disolución a un vial adecuado y se selló.

Caracterización de nanopartículas producidas mediante emulsificación

[0268] El diámetro medio, la distribución de tamaño, el potencial zeta, el peso, el rendimiento, las cantidades de mirceno cargado, la EE% y la DL% de NP preparadas mediante el método de emulsificación se presentan en la Tabla 6. La figura 10A muestra la distribución de tamaño por intensidad y la figura 10B muestra la distribución de potencial zeta de la muestra F20.

* % p/p basado en el peso de PLGA

[0269] El tamaño de partícula fue de 225 nm para las NP blanco, -265 nm para las NP cargadas de mirceno con una concentración de fármaco de entre el 10-40%, y entre 350 - 400 nm para las NP cargadas de mirceno con una concentración de fármaco de entre el 80-100%. Sin embargo, las NP en F22, F23 y F24 parecieron dañarse durante la centrifugación, dando como resultado un sobrenadante turbio. Fa polidispersidad de todas las NP fue buena (0,2 o menos) y con un potencial zeta negativo ligeramente menor que el de otros métodos (de alrededor de -25 mV). No se observaron diferencias entre las nanopartículas cargadas y blanco (-25 mV). Por tanto, casi no queda retenido fármaco sobre la superficie.

[0270] El método de emulsificación mostró una mayor eficacia de carga de fármaco en comparación con otros métodos usados en este trabajo: los mayores valores de DF% se obtuvieron para F23 (1 ,29%) y F20 (1,20%). Sin embargo, ha habido signos de NP dañadas o explotadas durante la centrifugación, tal como se muestra por el sobrenadante turbio y una proporción del polímero se queda pegado en la pared del tubo Falcon cerca de la parte superior del sobrenadante. Puede reducirse el daño de las NP y puede dar como resultado una mayor eficacia de carga de fármaco al realizar la centrifugación a una velocidad de centrifugación menor o sustituyendo la centrifugación por otro método de purificación tal como diálisis. Ejemplo 4 -Optimización del disolvente

[0271] A continuación, se optimizó el volumen del disolvente usado para reducir el tiempo de la etapa de evaporación para minimizar la evaporación potencial del mirceno durante la etapa de evaporación del disolvente. Se examinó el efecto de reducir el volumen de disolvente usando dos métodos de preparación: nanoprecipitación (acetona) y emulsificación (acetato de etilo).

Método de emulsificación

[0272] Se determinó el efecto de variar el volumen del disolvente orgánico usando el método de emulsión individual. Fas nanopartículas se prepararon y liofilizaron tal como se describió anteriormente en el ejemplo 3.

* % p/p basado en el peso de PLGA

Método de nanoprecipitación

[0273] Se determinó el efecto de variar el volumen del disolvente orgánico usando el método de nanoprecipitación. Las nanopartículas se prepararon y liofilizaron tal como se describió anteriormente en el ejemplo 1.

* % p/p basado en el peso de PLGA

Caracterización de nanopartículas producidas usando cantidades inferiores de disolvente

[0274] Se comenzó primero con el volumen mínimo de disolvente para disolver los componentes de la fase orgánica. En general, se encontró que el tamaño de partícula disminuía a medida que aumentaba el volumen del disolvente (tabla 9). La figura 11A muestra la distribución de tamaño por intensidad y la figura 11B muestra la distribución de potencial zeta de la muestra F28. La figura 11C muestra la distribución de tamaño por intensidad y la figura 11D muestra la distribución de potencial zeta de la muestra F31.

[0275] En el método de emulsión individual, bajos volúmenes de acetato de etilo de 0,125 (F25) y 0,25 ml (F26) dieron como resultado NP con un gran diámetro que no pudieron volver a utilizarse tras la centrifugación. Con 0,5 ml de acetato de etilo, las NP producidas fueron físicamente estables. F27 mostró el diámetro más grande entre las NP estables pero también la mayor eficacia de carga de fármaco de 0,486 mg (EE%: 6,08, DL%: 2,02). Es importante señalar que esta fórmula se centrifugó a 6.000 rpm y pudo recogerse a esta velocidad debido a su gran diámetro « 670 nm, mientras que el resto de las fórmulas se centrifugaron a 10.000 rpm. Es posible que la mayor velocidad de centrifugación produjera deformación de las NP, dando como resultado el escape del fármaco. Aunque el mirceno no es soluble en agua, pudo estabilizarse por el tensioactivo, PVA o Pluronic.

[0276] De manera similar, en el método de nanoprecipitación, las fórmulas de F31 con diámetro más grande (« 400 nm) mostraron mayor eficacia de carga de mirceno de hasta 0,188 mg en F31 (EE%: 2,09, DL%: 1,04). El uso del baño frío durante la adición de la fase orgánica pareció aumentar el tamaño de partícula, pero no pudo concluirse que pudiera aumentar la carga de fármaco (impidiendo/reduciendo la evaporación del fármaco durante la preparación).

Ejemplo 5 - Medición de mirceno en el sobrenadante

[0277] Debido a la cantidad relativamente baja de mirceno cargado en las NP, se buscó medir el fármaco en el sobrenadante para entender cómo se pierde el fármaco. La tabla 10 muestra que la cantidad total de mirceno detectado, que incluye tanto el mirceno cargado en las NP como el mirceno libre no cargado que está presente en el sobrenadante, era de entre el 0,06 - 3,44% de la cantidad de partida del fármaco. Los resultados mostrados en la tabla 10 indican que la mayoría del mirceno se pierde en alguna fase; durante la preparación de las NP, durante la preparación de la muestra para el análisis, o durante el almacenamiento.

[0278] Es probable que la pérdida de mirceno se produzca mediante evaporación durante la producción y no durante el almacenamiento, puesto que las muestras secadas por congelación se almacenaron en el congelador en recipientes bien cerrados que deben impedir la evaporación del fármaco.

Ejemplo 6 - Factores que dan como resultado pérdida de mirceno

Filtración durante la preparación de la muestra para el análisis de CG-EM

[0279] Se estudió el efecto de la filtración sobre la posible pérdida de mirceno en NP cargadas de mirceno preparadas usando el método de emulsificación (F27, F28, F29 y F30). Se usó filtración para retirar los componentes no disueltos de las NP en DCM, tal como PVA, durante la preparación de las muestras para el análisis de CG-EM. Fas impurezas insolubles en las muestras pueden dar como resultado obstrucción del inyector durante el análisis y pueden impedir la medición. Se disolvieron 5 mg de las NP liofdizadas en DCM. Para facilitar la disolución, se sonicaron las muestras en el sonicador de baño durante 5 min. Se filtraron las muestras usando un filtro de jeringa de 1 pm (compatible con DCM). Se transfirieron disoluciones de las muestras (1,5 ml cada una) a viales adecuados y se sellaron. Se preparó otro conjunto de muestras (que pesaba cada una 5 mg de NP) en DCM sin filtración.

[0280] Las cantidades de mirceno cargado en las NP, la EE% y la DL% antes y después de la filtración usando un filtro de jeringa de 1 pm se representan en la tabla 11.

[0281] La filtración dio como resultado una reducción relativa en las cantidades de mirceno medidas. La mayoría de las muestras mostraron poca reducción de la concentración, sin embargo este efecto fue más significativo en F27 que tiene la mayor concentración de mirceno cargado. La cantidad de mirceno se redujo en aproximadamente el 25% desde 0,486 mg antes de la filtración hasta 0,368 mg después de la fdtración. Esto puede deberse a una interacción entre el fármaco y el fdtro, dando como resultado el atrapamiento de una proporción del fármaco. Basándose en estos hallazgos, la filtración no fue la principal causa de pérdida de mirceno durante la preparación.

Evaporación del disolvente orgánico

[0282] Para estudiar el efecto de la evaporación realizada usando un evaporador rotatorio sobre la pérdida de mirceno, se prepararon dos muestras diferentes como en la tabla a continuación. En la primera muestra, se disolvieron 40 mg de Resomer 502 en 1 ml de acetato de etilo, luego se añadieron 8 mg de mirceno. En la segunda muestra, se mezclaron 8 mg de mirceno con 1 ml de acetato de etilo sin el polímero. Las dos muestras se sometieron a evaporación bajo presión usando el evaporador rotatorio sin calentamiento durante 1 h. Las fórmulas se muestran en la tabla 12.

[0283] La cantidad de mirceno retenida en la muestra y el porcentaje de pérdida de mirceno se muestran en la tabla 13.

[0284] La evaporación rotatoria de la muestra de mirceno y acetato de etilo sin PLGA (F38) dio como resultado la pérdida completa del mirceno. Sin embargo, cuando se añadió PLGA al mirceno (F37), se mantuvo aproximadamente el 40% del fármaco de partida, lo que puede deberse a la adsorción del fármaco al polímero. Este resultado puede indicar de manera importante que el mirceno atrapado en el polímero (en las NP) puede protegerse de la evaporación mientras que cualquier fármaco libre puede someterse a pérdida durante la etapa de evaporación.

Evaporación, centrifugación y secado por congelación

[0285] Para investigar la posible pérdida de mirceno durante las diferentes etapas de la producción de NP, se prepararon muestras usando el método de nanoprecipitación tal como se describe en el ejemplo 1 y según las fórmulas en la Tabla 14. [0286] F39 se centrifugó a 10.000 rpm a 4°C durante 30 min. Se resuspendió el sedimento de NP en 2 ml de agua MQ, y la preparación se secó por congelación. F40 y F41 se secaron por congelación inmediatamente después de la evaporación del disolvente sin centrifugación. La cantidad de mirceno en las muestras se midió usando espectrometría CG-EM. Se disolvieron 5 mg de cada muestra en 2 ml de DCM, y se filtró la disolución usando un filtro de jeringa de 1 pm, se llenó en un vial adecuado y se selló.

* % p/p basado en el peso de PLGA

[0287] El diámetro medio, la distribución de tamaño, el potencial zeta, el peso del liofdizado, la cantidad de mirceno que queda en la muestra, y el porcentaje de pérdida de mirceno de las diferentes formulaciones se muestran en la tabla 15. La figura 9A muestra la distribución de tamaño por intensidad y la figura 9B muestra la distribución de potencial zeta de la muestra F41.

[0288] F41 se preparó mediante la adición de mirceno disuelto en acetona, sin el polímero, a la fase acuosa. El tamaño medido de 357 nm indica la formación de una emulación de mirceno en presencia del PVA como tensioactivo. Estas no son nanopartículas poliméricas porque no se usó PLGA, solo micelas de PVA. F39 se preparó para examinar si la centrifugación podría ser responsable de la pérdida de fármaco de las NP durante la centrifugación. Sin embargo, incluso F40 en la que las NP se prepararon sin centrifugación mostró una baja retención del fármaco. De manera similar, F3 que es una emulsión de mirceno (sin la adición de PLGA) también mostró una retención similar del fármaco después de la liofilización. Estos hallazgos indican que una gran proporción del fármaco puede perderse durante la liofdización. Existe la posibilidad de que parte del fármaco se escape de las NP durante la centrifugación, pero esto no pudo examinarse con el método de preparación actual, puesto que la medición del fármaco debe realizarse inmediatamente después de la centrifugación, no después del secado por congelación.

[0289] Se usaron varios métodos para encapsular mirceno en NP de PLGA incluyendo: (i) nanoprecipitación, (ii) emulsificación usando un homogeneizador de alta velocidad y (iii) microemusificación. Para mejorar la eficacia de carga, también se han desarrollado y estudiado varias formulaciones. Para reducir la posible evaporación de mirceno, se optimizó el método de preparación, con respecto a la temperatura durante la producción de NP, y el uso de un evaporador rotatorio sin calentar las muestras, lo que dio como resultado una capacidad mejorada de carga de fármaco.

[0290] Se obtuvieron partículas en el intervalo nanométrico con una estrecha distribución de tamaño (Pdl < 0,2) y potencial zeta negativo (desde -25 hasta -35 mv). La mayor capacidad de carga se logró con el método de emulsión individual, con una eficacia de atrapamiento de hasta el 6 % del fármaco de partida (F27). La baja cantidad de mirceno medida en los sobrenadantes, recogida tras la centrifugación de NP, indica que el fármaco se pierde durante el procedimiento de producción, y no debido a un fallo del PLGA para encapsular el mirceno.

[0291] El mirceno tiene bajo peso molecular (136,23 g/mol), baja presión de vapor (2,09 mm Hg a 25 °C) y aunque tiene un punto de ebullición de l67°C, es un líquido volátil a temperatura ambiente, lo que hace difícil mantenerlo dentro de las NP e impedir su evaporación. Aunque el mirceno puede evaporarse durante la etapa de evaporación del procedimiento de producción, al realizarse en el evaporador rotatorio sin calentamiento, su evaporación se reduce significativamente por la presencia de PLGA. Por tanto, la carga del fármaco en las NP puede proteger el mirceno de la evaporación en gran medida. También se optimizó la cantidad de disolvente y el tiempo de evaporación y se redujo desde 1 h hasta 25 min para minimizar la posible evaporación del fármaco. También se perdió mirceno durante el secado por congelación. No está claro si la pérdida se debe a la evaporación o la sublimación. Sin embargo, el mirceno no se congeló ni siquiera a -80°C.

Ejemplo 7 - Optimización de la liofilización y centrifugación de nanopartículas

Liofilización

[0292] Para investigar si se pierde mirceno durante la liofilización, se prepararon 3 muestras de o bien mirceno libre, una mezcla de mirceno y agua, o bien una mezcla de mirceno, agua y PLGA por duplicado, tal como se ilustra en la tabla 16. Las muestras se liofilizaron durante 24 h. Los viales que contenían las muestras se pesaron antes y después de la liofilización para calcular el peso de la muestra seca.

[0293] Los resultados del ensayo de liofilización se muestran en la tabla 17.

[0294] Los resultados demuestran que la mayor parte del mirceno se pierde durante el procedimiento de liofilización a lo largo de 24 h, ya esté libre o en combinación con el polímero y agua. El mirceno no se congela a la temperatura de liofdización (alrededor de -80°C), lo que puede indicar que se pierde por la evaporación a vacío en el dispositivo de secado por congelación, en lugar de por la sublimación.

[0295] Dado que la liofilización era una etapa crucial en la pérdida de mirceno de las NP, se planteó la hipótesis de que la reducción del tiempo de liofdización podría reducir la pérdida de mirceno durante este procedimiento. Se transfirió una alícuota de 100 mΐ de suspensión de NP de las fórmulas F49 (mirceno: 100% p/p; centrifugación: tubos Falcon, 10.000 rpm, 30 min, 4°C) y F54 (mirceno: 100% p/p; centrifugación: tubos Amicon, 4.000 xg, 30 min, l2°C) a un tubo Eppendorf, se congelaron y se liofilizaron durante solo 2 h; este tiempo fue suficiente para retirar 100 mΐ de agua. Entonces de disolvió el producto seco en DCM y se analizó el contenido de mirceno usando un instrumento de CG-EM tal como se describió anteriormente. Las muestras se prepararon por duplicado.

Centrifugación

[0296] Tras confirmar que se pierde mirceno durante la liofilización, se midió la cantidad de mirceno cargado en las NP antes de la etapa de liofilización. Se compararon dos protocolos de centrifugación diferentes para determinar las condiciones óptimas. Se prepararon NP de PLGA usando el método de homogeneización de emulsión individual descrito en el ejemplo 3. Las fórmulas de las muestras están presentes en las Tablas 18 y 19. Las fórmulas F45 - F49 se centrifugaron en tubos Falcon a 10.000 rpm a 4°C durante 30 min para recoger las NP. Las fórmulas F50 - F54 se centrifugaron en tubos Amicon a 4.000 xg a l2°C durante 30 min. Las muestras se prepararon por duplicado.

* % (p/p) basado en PLGA

* % (p/p) basado en PLGA

[0297] Los resultados de aumentar la cantidad de partida de mirceno se presentan en la tabla 20. Se encontró que aumentar la cantidad de partida de mirceno potenciaba la cantidad de fármaco cargado en las NP hasta una carga de fármaco de alrededor del 5% cuando se usó el 100% (p/p, mirceno con respecto a PLGA; 40 mg de mirceno y 40 mg de PLGA) de mirceno. La cantidad de mirceno cargado es ligeramente mayor cuando las nanopartículas se recogen mediante centrifugación en un tubo Falcon a 10.000 rpm en comparación con las recogidas mediante un tubo Amicon a 4.000 xg.

* % (p/p) basado en PLGA

Comparación de los métodos de producción

[0298] Una vez que se confirmó la pérdida de mirceno durante la liofilización, se repitió la preparación de NP usando los tres métodos de preparación descritos anteriormente en el presente documento para seleccionar el mejor método para la carga de fármaco óptima. Se midió el contenido de mirceno en la NP tras la centrifugación pero antes de la liofilización, para seleccionar el método que proporciona la mayor eficacia de carga y cantidad de mirceno.

[0299] Se prepararon NP usando emulsificación inducida por un homogeneizador de alta velocidad, tal como se describe en el ejemplo 3; nanoprecipitación, tal como se describe en el ejemplo 1 ; y microemulsión, tal como se describe en el ejemplo 2; según fórmulas presentadas en la tabla 21. Tras la centrifugación de las preparaciones, se suspendieron las NP en un volumen total de 1 ml de agua MQ. Se prepararon muestras para el análisis de CG-EM tal como se describió anteriormente. Se transfirieron 100 pL de cada suspensión de NP a un tubo Eppendorf, y se centrifugó a 10.000 rpm a 4°C durante 30 min. Se desechó el sobrenadante y se añadió 1 ml de DCM para disolver las NP y el mirceno. Entonces se diluyó la disolución de DCM y se analizó el contenido de mirceno usando un instrumento de CG-EM tal como se describió anteriormente. Las muestras se prepararon por duplicado.

[0300] Tal como se demuestra en la tabla 22, la emulsificación usando un homogeneizador, en particular tras la centrifugación con un tubo Falcon, dio como resultado la mayor carga de fármaco con una EE% del 9%. La nanoprecipitación también produjo NP con una carga relativamente buena, aunque la concentración máxima del mirceno de partida fue del 60%, puesto que concentraciones mayores promovían la agregación de las NP. En cambio, la microemulsificación dio NP con escasa carga de fármaco. En ambos métodos de emulsificación usando un homogeneizador y de microemulsificación se espera que el fármaco líquido quedara atrapado dentro de las NP dando como resultado las denominadas nanocápsulas, que son nanopartículas con un núcleo líquido rodeado por una cubierta de polímero. En el método de nanoprecipitación, se producen NP sólidas conocidas como nanoesferas, una matriz del polímero en el que se dispersa el fármaco. En el caso del mirceno líquido, puede esperarse más carga de fármaco cuando se carga en nanocápsulas en comparación con nanoesferas. Esto puede explicar la mayor carga de fármaco lograda mediante emulsificación usando un homogeneizador y sugiere que la fórmula usada en la preparación de microemulsificación puede necesitar optimización para producir partículas estables con capacidad para atrapar el fármaco.

* % (p/p) basado en PLGA

Uso de un crioprotector para estabilizar las nanopartículas

[0301] Las NP cargadas de mirceno parecieron dañarse durante la congelación y el secado por congelación, dando como resultado una pérdida aumentada del fármaco durante el procedimiento de liofdización. Para someter a prueba el efecto de un crioprotector, la trehalosa, sobre la estabilización de las NP, se prepararon muestras usando el método de emulsificación tal como se describió anteriormente usando dos métodos de centrífuga descritos en la sección 5.8.2. Se mezclaron 50 pL de suspensión de NP con 50 pL de disolución al 10% de trehalosa (para dar una mezcla final de trehalosa al 5%). Se congeló el producto, seguido por liofilización durante 2 h. Entonces se disolvió el producto seco en DCM y se analizó el contenido de mirceno usando un instrumento de CG-EM tal como se describió anteriormente. Las muestras se prepararon por duplicado. Los resultados del ensayo se muestran en la tabla 23.

* % (p/p) basado en PLGA Conclusión

[0302] Se encontró que se perdía mirceno durante la liofilización. La medición del mirceno en la suspensión de NP antes de la liofilización indica que el mejor método de preparación es emulsificación con un homogeneizador de alta velocidad. Este método puede producir nanocápsulas que atrapan el mirceno líquido en su núcleo. La optimización de las condiciones de liofilización, incluyendo la duración y la adición de un cri oprotector, dio como resultado condiciones óptimas para potenciar la carga de fármaco. Factores tales como la velocidad de centrifugación y la congelación pueden producir daño a las NP y pueden contribuir significativamente a la pérdida de mirceno durante la liofilización. La duración de la liofilización también afectó a la pérdida de mirceno.

[0303] Las NP preparadas mediante emulsificación con homogeneizador, centrifugadas en un tubo Amicon a 4.000 xg, crioprotegidas con el 5% de trehalosa y liofilizadas durante 2 h mostraron satisfactoriamente la mayor carga de fármaco en las NP liofilizadas de aproximadamente el 7%. Estas condiciones permitieron la producción de NP liofilizadas con una carga de fármaco relativamente alta de hasta el 8% cuando se usó el 100% (p/p, mirceno con respecto a PLGA; 40 mg de mirceno y 40 mg de PLGA) de mirceno.

Ejemplo 8 - La síntesis y las caracterizaciones de nanopartículas que contienen b-mirceno, b-cariofileno o nerolidol

[0304] Este ejemplo muestra las síntesis y caracterizaciones de nanopartículas de PLGA-PEG que contienen b-mirceno, b-cariofileno o nerolidol.

[0305] Se prepararon nanopartículas de PLGA-PEG o poli(etilenglicol) metil éter-bloque- poli(lactida-co-glicolida) que contenían b-mirceno, b-cariofileno y nerolidol mediante el método de emulsificación y evaporación del disolvente usando un homogeneizador de alta velocidad (homogeneizador Kinematica Polytron™ PT 2500E, Fisher Scientific). Este método se basa en la emulsificación de la disolución orgánica de polímero en una fase acuosa, seguido por la evaporación del disolvente orgánico, tal como se ilustra en la figura 3. Se vierte la fase orgánica en la fase continua o acuosa en la que se disuelve un tensioactivo para conferir estabilidad a la emulsión. La emulsificación se lleva a cabo bajo una fuerza de alta cizalladura para reducir el tamaño de la gotita de emulsión. Este procedimiento determinará en gran medida el tamaño de partícula final de las nanopartículas. Esta etapa de emulsificación va seguida por la evaporación del disolvente a presión reducida hasta obtener el rendimiento las nanopartículas deseadas.

La síntesis de las nanopartículas de PLGA-PEG que contienen terpenoides

[0306] Las fórmulas de nanopartículas de PLGA-PEG blanco y que contienen terpenoides, tal como se preparan usando el método de emulsificación, se resumen en la tabla 24.

[0307] En un recipiente, se disolvieron 40 mg de PLGA-PEG (M _n promedio de PEG 2.000, M _n promedio de PLGA 11.500; lactida:glicolida 50:50) en 1 ml de acetato de etilo, seguido por la adición de 10 mg de o bien mirceno, b-cariofileno o bien nerolidol (basado en el 12,5% p/p del peso de PLGA) para dar la disolución de fase orgánica. En un tubo Falcón independiente que contenía 5-ml de PVA (0,5% p/v) y la sonda del homogeneizador, se añadió gota a gota la disolución orgánica que contenía terpenoides usando una pipeta durante 1 min en condiciones de homogeneización operando a 24.000 rpm y 0°C. Entonces se retiró el disolvente usando un evaporador rotatorio sin calentamiento durante al menos 30 minutos para dar una mezcla que comprende las nanopartículas que contienen terpenoides. Con el fin de retirar los terpenoides sin encapsular y el tensioactivo restante (PVA), se diluyó la mezcla con 10 ml de agua desionizada y purificada, se transfirió a los tubos Amicon (membrana de celulosa regenerada de 100 kDa, Ultracel, 15 ml de volumen de muestra), y se evaporó en condiciones de centrifugación (4.000 xg a l2°C durante 30 min); se repitió este procedimiento durante un total de tres veces. La suspensión concentrada de nanopartículas resultante, como mezcla con al menos 1 ml de agua desionizada y purificada, se mezcla adicionalmente con 1 ml de disolución de trehalosa (10 p/v) y la mezcla resultante se liofilizó o se secó por congelación a - 80°C y <0,100 mbar (TESLAR Cryodos). Se recogieron las nanopartículas liofilizadas que contenían terpenoides como sólidos similares a algodón blanco. Para cada terpenoide, se prepararon tres muestras de nanopartículas por triplicado para pruebas y estudios adicionales.

Preparaciones de muestra para análisis de CG-EM

[0308] Para las caracterizaciones y el análisis de CG-EM, se disolvieron liofilizados de nanopartículas que contenían terpenoides en 1 ml de diclorometano (DCM) y la mezcla resultante se sonicó durante al menos 5 minutos. Entonces se centrifugaron las muestras durante 4 minutos para precipitar los materiales no disueltos, tales como trehalosa y trazas de tensioactivo de PVA. A partir del sobrenadante, se diluyeron entonces o bien 0,25 o bien 0,5 ml de esta disolución hasta un volumen final de 2 ml con diclorometano (DCM), de los que 1,5 ml de la disolución final se transfirieron a un vial adecuado para el análisis de CG-EM.

Diámetro medio y distribuciones de tamaño

[0309] En la tabla 25 se presentan el diámetro medio, la distribución de tamaño, el potencial zeta, el peso, el rendimiento de NP de PLGA-PEG cargadas de terpenoides preparadas mediante emulsificación. Los terpenoides encapsulados dentro de las nanopartículas dieron como resultado un aumento en los tamaños de partícula. Este aumento en el tamaño de partícula fue más significativo con las nanopartículas que contenían b -cari ofileno y nerolidol que tuvieron un tamaño de partícula de aproximadamente 350 y 323 nm, respectivamente, en comparación con las nanopartículas que contenían mirceno con un diámetro de 266 nm.

[0310] Aunque la encapsulación de los terpenoides ha aumentado la polidispersidad de las nanopartículas, el índice de polidispersidad (PDI) fue < 0,3 para todas las nanopartículas. Las nanopartículas también mostraron una carga superficial negativa con un potencial zeta medido de aproximadamente -35 mV. Además, se recuperó entre el 77-92% de los materiales de partida, tal como se mide en peso.

Imágenes de microscopio electrónico de barrido (SEM)

[0311] Las imágenes de SEM confirmaron la estructura globular de la nanopartículas que contienen terpenoides, tal como se ilustra en las figuras 13A-B (mirceno) la figura 14A-B (b- cariofileno) y la figura 15A-B (nerolidol). Además, se observaron estructuras y distribución de tamaño similares de las nanopartículas independientemente de qué terpenoide se encapsulara. Tal como se ilustra en las figuras 13A y 15B, se detectaron grandes nanopartículas rotas y pueden proporcionar pruebas de que las nanopartículas que contienen terpenoides eran de la clase de nanocápsula con núcleo-cubierta tal como se muestra en la figura 16. Una posible explicación es que las nanopartículas se rompieron mientras se aplicaba un vacío durante la preparación de la muestra para la obtención de imágenes por SEM.

Análisis de cromatografía de gases-espectrometría de masas (CG-EM)

[0312] Mediante el uso del método de CG-EM y condiciones tal como se describe en el presente documento, se midió que los tiempos de retención para mirceno (figura 4A), b-cariofileno (figura 5A), cv.v-nerolidol (figura 6) y /ra«.s-nerolidol (figura 6) eran de 6,93, 5,72, 6,77 y 7,16 minutos respectivamente, y sus espectros de masas se muestran en las figuras 4B, 5B, 6A y 6C, respectivamente. Las curvas de calibración de mirceno (figura 4C) y b-cariofileno (figura 5C) dentro de un intervalo de concentración de 1-60 ppm fueron lineales con valores de r ² de 0,9990 y 0,9993, respectivamente. Se encontró que la razón de isómero cis con respecto a trans de nerolidol era de 1 ,02:0,98, o aproximadamente 1 :1, y las curvas de calibración del isómero cis (figura 7B) y trans (figura 7D) de nerolidol dentro de un intervalo de concentración de 0,5-30 ppm fueron lineales con valores de r ² de 0,9998, y 0,9997, respectivamente. Encapsulaciones de terpenoides

[0313] Los resultados de encapsulaciones de terpenoides se presentan en la tabla 26. La masa de partida para todos los terpenoides fue 10 mg. La cantidad de mirceno encapsulado fue de 1,8 mg con EE = 18,1% y DL = 4,7%, debido posiblemente a su bajo punto de ebullición y naturaleza volátil. Tanto el b-cariofileno como el nerolidol mostraron cantidades encapsuladas superiores de 6,3 (EE = 64,9% y DL = 15,1%) y 5,7 mg (EE = 55,7% y DL = 13,9%), respectivamente. El aumento en la eficacia de encapsulación de b-cariofileno y nerolidol en comparación con mirceno puede deberse a aumentos en los diámetros de la nanopartícula que contienen terpenoides respectiva, tal como se resume en la tabla 25.

Ejemplo 9 -Respuestas a calcio en células HEK TRPV1 inducida por nanopartículas de PLGA que encapsulan terpenoides

[0314] Este ejemplo muestra la investigación de la capacidad de nanopartículas (NP) de PLGA- PEG o poli(etilenglicol)metil éter-bloque-poli(lactida-co-glicolida) que contienen terpenoides para mejorar la interacción de las especies encapsuladas con receptores TRPV1 , como una evaluación in vitro de su posible aplicación en el tratamiento del dolor.

[0315] Se utilizó un ensayo de señalización de calcio para evaluar el flujo de entrada de iones en células HEK TRPV1. Se dispersaron células en tampón de ensayo de calcio 1 mM y se midieron los niveles de calcio intracelular usando un lector de placas en presencia de Fluo-4, como fluoróforo. Fluo-4 muestra un aumento en la fluorescencia tras la unión de iones Ca ²⁺ y se usa para medir las concentraciones de Ca ²⁺ intracelular en células vivas. Los experimentos realizados se llevaron a cabo durante 1 hora para proporcionar tiempo suficiente para que los terpenoides encapsulados se liberen de las nanopartículas. Se detectaron y se compararon los cambios de fluorescencia en respuesta a los terpenoides libres, los terpenoides encapsulados y combinaciones de terpenoides libres y encapsulados.

Terpenoides individuales sin encapsular frente a encapsulados

[0316] Tal como se muestra en la figura 17, todos los terpenoides sin encapsular indujeron una respuesta al calcio, dando el mirceno libre la respuesta más intensa, seguido por el nerolidol libre y el b-cariofileno libre. Sorprendentemente, todas las formulaciones de nanopartículas que contenían terpenoides aumentaron de manera notable la intensidad de fluorescencia en comparación con los terpenoides sin encapsular en disolución a granel. Aunque tanto el b- cariofileno libre como el encapsulado mostraron las respuestas a calcio más bajas en comparación con el resto (figura 18C), el nerolidol demostró un aumento notable pero retardado en su respuesta al calcio en TRPV1 cuando estaba en capsulado dentro de la nanopartícula, en comparación con cuando estaba en disolución a granel (figura 18B). Las respuestas al calcio del mirceno libre y encapsulado se muestran en la figura 18A.

Combinación de terpenoides sin encapsular

[0317] También se investigaron las respuestas al calcio en células HEK TRPV1 para combinaciones de terpenoides sin encapsular. Se llevaron a cabo un total de 4 combinaciones, concretamente mirceno más nerolidol (figura 19A), mirceno más b-cariofileno (figura 19B), nerolidol más b-cariofileno (figura 19C) y mirceno más nerolidol más b-cariofileno (figura 19D), con una concentración de 40 pg/ml de cada terpenoide. Sorprendentemente, todas las combinaciones de terpenoides sin encapsular han mejorado el flujo de entrada del calcio en comparación con el uso de terpenoides individuales en disolución a granel.

Combinaciones de diferentes nanopartículas que encapsulan terpenos

[0318] También se sometieron a prueba combinaciones de diversas poblaciones de nanopartículas, encapsulando cada población de nanopartículas un terpenoide diferente, y se compararon con tratamientos con una población de nanopartículas individual, a una concentración de 40 pg/ml de cada terpenoide. Tal como se ilustra mediante las figuras 20A-20D, las combinaciones de diferentes poblaciones de nanopartí culas condujeron a respuestas al calcio superiores y mejoradas en comparación con una población de nanopartículas individual que contenía terpenoides individuales. Combinaciones de terpenoides encapsulados en comparación con combinaciones de terpenoides sin encapsular

[0319] Por último, se sometieron a prueba combinaciones de nanopartículas que encapsulan terpenoides y se compararon con combinaciones de terpenoides sin encapsular a una concentración de 40 pg/ml de cada terpenoide. En todas las combinaciones sometidas a prueba, concretamente mirceno más nerolidol (figura 21 A), mirceno más b-cariofileno (figura 21B), nerolidol más b- cariofileno (figura 21C) y mirceno más b-cariofileno más nerolidol (figura 2 ID), las combinaciones de nanopartículas que encapsulan terpenoides condujeron a respuestas al calcio muy mejoradas en comparación con las combinaciones de terpenoides sin encapsular. Conclusión

[0320] Se examinaron las respuestas al calcio de células HEK TRPV1 en presencia de terpenoides libres en disolución a granel, nanopartículas de PLGA-PEG que contenían terpenoides, y combinaciones de terpenoides tanto sin encapsular como encapsulados en nanopartículas usando el ensayo de señalización de calcio descrito en el presente documento. Tal como se demuestra en las figuras 17, 18-18C, 19A-19D, 20A-20D, 21A-21D, y se describió anteriormente, las combinaciones de terpenoides mejoraron las respuestas al calcio independientemente de la encapsulación dentro de nanopartículas. Y lo que es más importante, ya se administraran individualmente o en combinaciones, se encontró que las nanopartículas que contienen terpenoides producen flujos de entrada celulares de calcio superiores y mejorados en comparación con los terpenoides sin encapsular en disoluciones a granel. Estos datos y resultados proporcionan pruebas fehacientes de que la encapsulación de terpenoides dentro de nanopartículas mejora significativamente la actividad farmacológica in vitro de dichos terpenoides. Además, estos resultados destacan las ventajas de las formulaciones y composiciones farmacéuticas que comprenden combinaciones de terpenoides para su uso en estudios in vivo futuros y como posibles agentes terapéuticos. [0321] Aunque la invención se ha mostrado y descrito en particular con referencia a una realización preferida y diversas realizaciones alternativas, los expertos en la técnica relevante entenderán que pueden realizarse en ella diversos cambios en la forma y los detalles sin apartarse del espíritu y el alcance de la invención.

[0322] Todas las referencias, patentes expedidas y solicitudes de patente citadas dentro del conjunto de la presente memoria descriptiva se incorporan por el presente documento como referencia en su totalidad, para todos los fines.

[0323] Se entenderá que cuando un aspecto de la invención está redactado como un método para tratar una enfermedad o estado que comprende administrar a un sujeto la composición farmacéutica de la invención, también se pretende englobar una composición faramacéutica de la invención para su uso en el tratamiento de dicha enfermedad o estado.