Nach Reiner Class et al. in Am. J. Clin. Oncol. (CCT) 19 (5) 1996, S. 552- 531 ist die Wirkung von Histon H1 auf Krebszellen dadurch erklärt, daß Krebszellen, welche von Histon H1 abgetötet werden, in ihrer Zellmembran ein sogenanntes Rezeptorprotein besitzen, welche das verabreichte Histon H1 binden kann. Das Rezeptorprotein wurde durch Affinitätschromatographie an immobilisiertem Histon H1 isoliert. Nach Ergebnissen der SDS-PAGE Elektrophoresetechnik besitzt das Rezeptorprotein eine phoretische Beweglichkeit, die einer Molmasse im Bereich von 33000 Da (33 kDa) 2000 Da entspricht.

Die Bindung von H1 mit dem membranständigen Rezeptorprotein führt zu einer Zerstörung der Membranintegrität, so daß lösliche Zellbestandteile, wie gelöste Proteine, lonen und andere Stoffe unkontrolliert aus der Krebszelle nach außen entweichen oder anderer Stoffe in die Zelle einströmen können und die Zelle dadurch abstirbt.

Die Erfindung geht von der Überlegung aus, daß Tumorzellen unterschiedlichen histologischen Ursprunges, z. B. Leukämien, Lymphome, Sarkome, Carcinome, Melanome u. a. besondere individuelle Eigenschaften besitzen und daß bei näherer Kenntnis dieser individuelien zellinienspezifischen Eigenschaften diese einen Ansatz für eine neue

wirksame Therapie bieten können. Es konnte gezeigt werden, daß das Rezeptorprotein überraschenderweise nicht charakteristisch ist für einen oder mehrere bestimmte Zelltypen, sondern eine individuelle zellinientypische Eigenschaft von Krebszellen darstellt, die einer gezielten Therapie zugänglich gemacht werden konnte.

Die Erfindung hat sich damit zum Ziel gesetzt, nähere Kenntnisse über das Rezeptorprotein zu erhalten, die eine neue Lehre zur therapeutischen und prophylaktischen Behandlung bzw. Unterdrückung von solchen individuellen Krebszellen mit derartigen Rezeptorproteinen zu vermitteln.

Die Erfindung umfaßt damit auch eine Diagnose zur Erkennung von Krebszellen, die als individuelle Eigenschaft solche Rezeptorproteine enthalten, so daß der Erfolg der neuen Lehre zur therapeutischen Behandlung solcher individueller Krebszellen auch vorherbestimmbar ist und damit gezielt zur Anwendung gebracht werden kann. Dies bedeutet, daß die Krebszellen nach Maßgabe des Erfolges einer Behandlung mit dem erfindungsgemäßen Therapeutikum auf eine neue Weise klassifizierbar sind. Sobald gesicherte Erkenntnisse vorliegen, die die Neigung von bestimmten Menschen zu derartigen individuellen Krebszellen vorhersehen lassen, ist das erfindungsgemäße Therapeutikum auch prophylaktisch anwendbar. Das wird vor allem dann der Fall sein, wenn bei diesen Menschen der natürliche Histonspiegel im Blut als zu niedrig erkannt ist.

Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, daß das vorstehende Rezeptorprotein in der Membran von individuellen Krebszellen, insbesondere Krebszellen des blutbildenden Systems, wie Leukämien, Lymphome, Myelome, verschiedene Histone oder histonähnliche Polypeptide und/oder deren Teile enthält oder aus ihnen im wesentlichen besteht, die eine Bindung oder Vernetzung mit zugeführten Histonen oder histonähnlichen Proteinen (Protamine oder bakterielle Histone) eingehen, wobei es sich um therapeutische oder diagnostische Maßnahmen handeln kann. Als diagnostische Mittel können auch geeignete Antikörper in Frage kommen, welche die Rezeptorproteine oder deren Strukturen erkennen.

Die Erfindung ist gekennzeichnet durch die Merkmale der nebengeordneten Ansprüche 1,24,25 und 26. Vorteilhafte Ausführungen ergeben sich aus den Merkmalen der Unteransprüche und der nachfolgenden Beschreibung.

Unter histonähnlichen Proteinen werden hier Protamine und bestimmte bakterielle Proteine verstanden. Einige histonähnliche Proteine bakterieller Herkunft sind unter Angaben der Literaturstellen nachstehend in Tabelle 1 aufgeführt, wobei die Histonähnlichkeit der bakterielien Proteine strukturell mittels Röntgenstrukturanalysen an kristallinen Proteinen, funktionell mittels DNA-Bindungs-und Transkriptionsstudien und biochemisch mittels Sequenzhomologien zu Histon H1 nachgewiesen wurde.

TABELLE 1 ProteinBakteriumLiteraturstelle HmfMethanothermusRonimusR.S.undMusgraveD.R.(1996) HAN1fervidusPurificationandcharacterizationofahiston-like HAN2proteinfromArchaeal isolateAN1,amemberof theThermococcales. Mol.Microbiol.20:77-86 HAN1ThermococcusRonimusR.S.undMusgraveD.R.(1996) spec.Agene,han1A,encodinganarchaealhistone- likeproteinfromtheThermococcusspecies AN1:homologywitheukaryalhistone consensussequencesandtheimplicationsfor delineationofthehistonefold. Biochim.Biophys.Acta,1307:1-7 HMfAMethanothermusDecanniereK.,SandmanK.,ReeveJ.N., HMfBfervidusHeinemannU.(1996) CrystallizationandpreliminaryX-ray characterizationoftheMethanothermus fervidushistonesMMfAandHMfB. Proteins,24:268-71 Hc1ChalmydiaPetersenL.B.,BirkelundS.undChristiansen Hc2trachomatisG.(1996) PurificationofrecombinantChlamydia trachomatishistoneH1-likeproteinHc2,and comparativefunctionalanalysisofHc2and Hc1. Mol.Microbiol.20:295-311 MC1MetanosarcinaTeyssierC.,ToulmeF.,TouzelJ.P.,Gervais spec.A.,MaurizotJ.C.undCulardF.(1996) Preferentialbindingofthearchaebacterial histone-likeMC1proteintonegatively supercolledDNAminicircles, Biochemistry,25:7954-7958 BpH1Bordetella ScarlatoV.,AricoB.,GoyardS.,RicciS., pertussisManettiR.,PrugnolaA.,Polverino-De-Laureto P.,UllmannA.undRappuoliR.(1995) Mol. Microbiol.,15:871-881

Es wurde erfinderseits zunächst das vorstehend erwähnte Rezeptorprotein in der Membran von individuellen Krebszellen charakterisiert.

Eine massenspektrometrische Analyse mittels der MALDI-MS Technik (matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry) ergab, daß die elektrophoretisch einheitliche Proteinbande drei Proteine mit den Molmassen 11,2 ; 13,7 und 15 kDa enthielt.

Im einzelnen ergaben sich folgende Mittelwerte : 11175 40 Da 13730 i 40 Da und 15035 80 Da Die Mittelwerte berechnen sich aus einfach-und doppelt geladenen Molekülionensignalen und vier bis sechs Summenspektren, die von der untersuchten Probe aufgenommen werden.

Im Vergleich zu den vorstehenden drei Molmassen der Polypeptide des Rezeptors weisen die nachstehenden humanen Histonsequenzen folgende Molmassen auf : H4 11282 Da H2B 13774 Da H3 15324 Da und H2 14004 Da Die Sequenzanalyse mittels automatisiertem Edman-Abbau identifizierte eine Peptidsequenz, welche dem Abschnitt 23-59 des humanen Histons H4 entspricht, sich aber in den Positionen 23 und 35 unterscheidet, was einer Homologie von 97,2% bezogen auf die bekannte Sequenz des Histons H4 in gesunden Zellen entspricht.

Diese Befunde lassen den überrschenden Schluß zu, daß das besagte Rezeptorprotein aus Proteinen besteht oder solche Proteine enhält, die den Histonen H4, H2B und H3 zugeordnet werden können oder ihnen sehr ähnlich sind. Ihr Vorkommen in der Membran von individuellen Krebszelien ist mit großer Wahrscheinlichkeit auf die tumorbedingte Entartung zurückzuführen, desgleichen ihre mengenmäßige Zusammensetzung und möglichen Strukturunterschiede zu den im Nucleosom befindlichen Histonen.

Nach der Erfindung lassen sich die auf der Zelimembran von Krebszellen in vergleichsweiser hoher Konzentration vorkommenden Histone der Klassen H2A, H2B, H3 und/oder H4 (die sog. Core-Histone) durch äußere Zugabe von Histonen, insbesondere Histon H1 oder wirksamen Sequenzteilen derselben zu größeren Aggregaten vernetzen, wodurch die Membranintegrität zerstört wird und die Krebszellen abgetötet werden. Bei den Histonen kann es sich um natürliche Histone, z. B. aus bovinem Material oder auch um rekombinante Histone handeln. Es kann sich auch um kovalent modifizierte Histone oder Histonabschnitte oder funktionell und strukturell ähnliche Proteine handeln. Als geeignete kovalente Modifikationen können z. B. Derivate mit Polyoxyethylenketten ("PEGylierung") dienen. Funktionell oder strukturell ähnliche Proteine sind z. B. Protamine oder histonähnliche Proteine aus Prokaryonten oder Arche.

Es ist bekannt, daß die Histon H1-Moleküle die zu den sog. Nucleosomen organisierten Aggregate der Core-Histone weiter verknüpfen können, wodurch die kondensierte Form des Chromatins entsteht. Dazu sind weitgehend intakte H1-Moleküle notwendig, welche einen kompakt gefalteten Mittelteil (den"globulären"Teil) und die angeschlossenen flexiblen, N-und C-terminalen Domänen aufweisen.

Aus dieser Erkenntnis ließ sich erfindungsgemäß eine Methode ableiten, den zytotoxisch wirksamen Bereich des Histon H1 Moleküls zu ermitteln, der eine Vernetzung oder Bindung mit dem Core-Histonen in Zellmembranen von individuellen Krebszelien weitgehend sicherstellt.

Hierzu wurden in Zytotoxizitätsstudien als wirksame Substanzen teils das rekombinant gewonnene Histon H5 aus Hühnererythrozyten eingesetzt, welches eine erythrozytenspezifische Variante des H1 darstellt. Teils wurden Fragmente dieses Histons eingesetzt, bei welchen entweder beide der terminalen Domänen stark gekürzt wurden, oder die C-terminale Domäne sukzessive verkürzt wurde. Diese Fragmente und ihre gentechnische Herstellung wurden von Gerchman et al in Protein Expression & Purification, 5 (1994), Seiten 242-251 beschrieben.

Die nachstehende Abbildung zeigt die verwendeten H5 Fragmente und ihren strukturellen Aufbau und zwar das vollständige Molekül H5, im wesentlichen nur seinen globularen Abschnitt (GH5), den globularen Abschnitt in Verbindung mit der N-terminalen Domäne (NGH5), den globulären Abschnitt in Verbindung mit der N-terminalen Domäne und demC-terminalen Abschnitt 98-131 (NGC1 H5) und schließlich den globulären Abschnitt in Verbindung mit der N-terminalen Domäne und dem C-terminalen Abschnitt 98-151 (NGC2H5). Alle eingesetzten Proteine und Kulturmedien waren auf Endotoxinfreiheit getestet. gtobutäre Domine N-terminale Domine 24-97 C-terminale Domane

Die vorstehende schematische Darstellung der 3 strukturellen Domänen des Moleküls Histon H5, GH5, NGH5, NGC1 H5 und NGC2H5 bezeichnen rekombinant gewonnene Histonfragmente.

Zur Untersuchung möglicher Struktur-Funktionsbeziehungen der Wirkung von H1 aus Kalbsthymus auf entartete Zellen wurden Vergleichsexperimente mit den zur Verfügung stehenden, rekombinant gewonnenen Histonteilsequenzen aus H5 gemacht. Es wurden die primären Leukämiezellen einer Patientin mit AML, die Leukämiezellen der Linie IM9 und die Lymphomzellen der Zellinie OH77 getestet. In allen Ansätzen wirkte H1 in einer Konzentration von 250 pg/ml zytotoxisch. Die längeren Teilsequenzen NGC1H5 und NGC2H5 hatten im Fall der AML und der Lymphomzellen zu H1 vergleichbare, bei den Zellen der Zellinie IM9 sogar stärkere Wirkung als Histon H1. Der globuläre Teil GH5 und die Teilsequenz NGH5 provozierten bei allen Zelltypen die geringsten, wachstumshemmenden Effekte. Die Teilsequenzen wurden jeweils in zu H1 aquimolaren Mengen eingesetzt. Die Ergebnisse sind nachstehend in den Beispielen 1 bis 5 zusammengefaßt.

Zytotoxlzitätsinndex

Das vorstehende Diagramm zeigt die Zytotoxizität von Histon H1 und Histonteilsequenzen für Primäre Leukämiezellen einer Patientin mit AML (akute myelomische Leukämie).

In den Beispielen 1 bis 5 wurden 1 x 106 Zellen/ml für 48h unter Standardbedingungen wie folgt inkubiert : H1 : Histon H1 ; rekombinante Teilsequenzen von Histon H5 : GH5 : Teilsequenz GH5 ; NGH5 : Teilsequenz NGH5 ; C1 : Teilsequenz NGC1 H5 ; C2 : Teilsequenz NGC2H5. H1, bzw. die Histonteilsequenzen wurden 12 uM eingesetzt. Die Vitalität der Zellen wurde mit der MTT-Methode bestimmt.

Dargestellt sind die Mittelwerte aus je 4 Parallelexperimenten.

Die nachstehenden Beispiele 6 bis 10 Zytotoxtzitätsindex zeigen die Zytotoxizität von Histon H1 und Histonteilsequenzen für die Zellen einer myelomischen Leukämie der Zellinie IM9.

Weiterhin zeigen die nachstehenden Beispiele 11 bis 15

Zytotoxizitätsindex die Zytotoxizität von Histon H1 und Histonteilsequenzen für die Zellen eines Lymphoms der Zellinie OH77.

In den Beispielen 6 bis 15 wurden 5 x 104 Zellen/ml für 48h unter Standardbedingungen wie folgt inkubiert : H1 : Histon H1 ; rekombinante Teilsequenzen von Histon H5 : GH5 : Teilsequenz GH5 ; NGH5 : Teilsequenz NGH5 ; C1 : Teilsequenz NGC1H5 ; C2 : Teilsequenz NGC2H5. H1, bzw. die Histonteilsequenzen wurden 12 pM eingesetzt. Die Vitalität der Zellen wurde mit der MTT- Methode bestimmt. Dargestellt sind die Mittelwerte aus je 4 Parallelexperimenten.

Aus den Beispielen geht hervor, daß die globuläre Domäne des H1 (oder H5) Moleküls GH5 eine nur geringe oder keine zytotoxische Wirkung aufweist (Cytotoxizitätsindex unter 20). Ahnliches gilt für das Fragment

NGH5, bei welchem die C-terminale Domäne fast völlig fehit. Wenn diese Domäne mit wenigstens den Resten 108-131 vertreten ist und die N terminale Domäne intakt ist (NGC1 H5), dann liegt ein Fragment vor, dessen Wirksamkeit die des intakten Histonmoleküls erreichen oder übertreffen kann (Beispiele 4 und 9). Ein Gleiches gilt für das Fragment NGc2H5 in welchem nur noch 38 Aminosäuren der C-terminalen Domäne fehlen.

Ähnliche Beziehungen gelten entsprechend für Fragmente mit verkürzter N- terminale Domäne und intakter C-Domäne.

Es liegt nahe, statt Histon H5 humane Subtypen von H1, z. B. insbesondere H1.1 ; H1.2 ; H1.3 ; H1.4 und H1.0 oder deren Teile erfindungsgemäß einzusetzen.

Beispiele 16 bis 18 CYTOTOXIZITATSINDEX HISTONKONZENTRATION g/ml

Die Beispiele 16 und 17 zeigen die Wirksamkeit der rekombinant (rh) gewonnen humanen Subtypen H1.0 und H1.2 im Vergleich zu den aus Kalbsthymus (bov) gewonnenen Histonen H1 auf Zellen eines Burkitt- Lymphoms der Zellinie Daudi (Beispiel 18).

Die nachstehende Tabelle 2 zeigt die genannten humanen H 1-Subtypen mit ihren N-und C-terminalen Domänen jeweils in Verbindung mit der hier nicht genannten globulären Domäne zwischen den N-und C-terminalen Domänen sowie den notwendigen N-und C-terminalen Abschnitten, bei denen in Analogie zu den vorstehenden Ergebnissen mit dem Histon H5 vom Huhn zytotoxische Wirkung gegenüber Krebszellen mit membranständigen Core- Histonrezeptoren zu erwarten sind.

TABELLE 2 N-termin. C-termin. notwendige. notwendige.

Domäne Domäne N-Domäne C-Domäne H 1.1.1-40 118-214 ab 16 ; 20-26 118-138 H 1.2.1-38 105-212 ab 16 ; 20-26 105-125 H 1.3.1-39 117-220 ab 16 ; 20-26 117-137 H 1.4.1-38 116-218 ab 16 ; 20-26 116-136 H 1.0.1-25 99-193 ab 11 ; 16-20 99-119 In der hier vorgenommenen Einteilung wurden als C-und N-terminale Bereiche diejenigen definiert, welche in ihren Sequenzen Prolin (P) enthalten, weil Prolin die Ausbildung von Helices verhindert, da es eine Streckung der Polypeptid-Kette bewirkt.

Die Grenzen für die Domänen werden in der Literatur unterschiedlich angegeben. Beim H5 des Huhns zählen manche Autoren den N-Terminus von 1-18 und die globuläre Domäne 19-108, während Gerchman et al. in der vorstehenden Literaturstelle diese als die Sequenz 24-96 definieren.

Zusammenfassend ergibt sich, daß die Proteine des individuellen Krebszellenrezeptors nach derzeitigen Erkenntnissen ein Aggregat aus den Core-Histonen H2A, H2B, H3 und/oder H4 darstellt oder solche Histone oder coreähnliche Histone enhält. Ob auch DNA an der Membranoberfläche vorkommt kann derzeit nicht mit Bestimmtheit gesagt werden.

Ausgeschlossen ist es nicht.

Es ist ebenfalls nicht ausgeschlossen, daß infolge der neoplastischen Entartung in der Krebszelle Protamine synthetisiert werden können und statt der Core-Histone oder gemeinsam mit ihnen in der Zellmembran lokalisiert werden, die mit Histonen oder histonähnlichen Proteinen vernetzbar oder bindbar sind.

Die dem Kern des Nukleosoms angehörenden Histone (Core-Histone) sind durch nichtkovalente Kräfte stark aneinander gebunden und täuschen somit ein höheres Molekulargewicht vor. Auch auf der Zellmembran, in die sie durch eine tumorbedingte Fehlregulation gelangen, sind sie miteinander assoziiert.

Der Wirkungsmechanismus des erfindungsgemäßen Therapeutikums beruht auf einer weiteren Vernetzung der membranständigen Histone durch (a) von außen angebotene Histone, insbesondere H1 und deren vernetzbaren Teile, (b) durch wirksame kovalent modifizierte Histone oder (c) durch funktionell und/oder strukturell histonähnliche Proteine. Durch die Vernetzung oder Bindung entstehen in der Zellmembran größere Aggregate, die Porencharakter besitzen oder zu Porenbildung in der Membran Anlaß geben oder auch mechanische Deformationen von Zellmembrankomponenten, die mit den Strukturen des Zytoskeletts assoziiert sind, hervorrufen, was zu einer Zerstörung der Membranintegritat und letztlich zum Zelltod führt. Die Beteiligung von Signalweiterleitungsmechanismen und apoptotischen Progressen ist möglich, ist aber nicht der maßgebliche Prozeß, der zum Zelltod führt.

Die Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Therapeutikums ist in den nachfolgenden Photografien A bis D verdeutlicht :

Die Fotografie A zeigt unbehandelte Zellen der Lymphomzellinie OH77 in 2000-facher Vergrößerung, die Fotografie B zeigt einen Ausschnitt aus A in 20.000-facher Vergrößerung. Hierdurch wird die typische Oberflächenstruktur einer intakten lymphatischen Tumorzelle verdeutlicht.

Die Photografie D zeigt in 20.000-facher Vergrößerung eine drastische Veränderung dieses Zellausschnittes nach einer 12 Std. Einwirkzeit mit 200pg/ml Histon H1. Es zeigt sich hier, das die Zellen zu einer kugeligen Gestalt kontrahieren, bis sie nach einer Behandlungszeit mit Histon H1 nach 24 Std. disintegrieren wie die Photografie C zeigt.

Verwendet wurde das zugesetzte reine Histon H1 in der oben angegebenen Konzentration jeweils in einem normalen Medium für die Kultivierung von Zellen, wie es in der eingangs genannten Literaturstelle beschrieben ist.

Die Erfindung umfaßt auch ein Verfahren zur Diagnose von individuellen Krebszellen mit den besagten Rezeptorproteinen in den Membranen dieser Krebszellen. Zur Diagnose werden erfindungsgemäß Histone, insbesondere H1 oder deren wirksamen Teile oder geeignete Antikörper verwendet, die an das Reszeptorprotein binden, wodurch erstmals eine Klassifizierung von individuellen Krebszellen ermöglicht ist, die die besagten Rezeptoren aufweisen. Die hierbei zu verwendenden Diagnosetechniken gehören zum Stand der Technik. Zum Stand der Technik gehört auch die Auffindung geeigneter Antikörper, welche die Rezeptorproteine in der Membran der Krebszellen oder die durch die Aggregation entstehenden Strukturen erkennen.