La présente invention est relative à des mutants thermosensibles de virus influenza.

Les virus influenza, agents de la grippe, sont parmi les principaux pathogènes respiratoires de l'homme et des animaux. Il existe trois types de virus influenza : A, B et C, les deux premiers, et notamment l' influenza A étant les plus important du point de vue de la pathologie humaine, de par sa fréquence et la gravité potentielle des pathologies associées .

Les virus influenza appartiennent à la famille des

Orthomyxoviridae . Ils ont un génome à ARN monocaténaire négatif segmenté, composé de 8 segments chez influenza A et B, et de 7 segments chez influenza C. Chez les virus influenza des types A et B, les segments 1, 2, et 3 codent respectivement pour les 3 sous-unités de l'ARN polymérase RNA dépendante : les 2 sous-unités acides PB2 et PBl, et la sous- unité acide PA ; le segment 4 code pour l'une des 2 glycoprotéines de surface, 1 ' hémagglutinine HA ; le segment 5 code pour la nucléoprotéine NP, qui s'associe aux ARNs viraux pour former la nucléocapside ; le segment 6 code pour l'autre glycoprotéine de surface, la neuraminidase NA ; le segment 7 code pour les protéines de matrice Ml et M2, et le segment 8 pour les protéines non-structurales NSI et NS2.

Chez les virus de type C, il n'y a qu'une seule glycoprotéine de surface : 1 ' hémagglutinine estérase (HE), qui est codée par le segment 4, et qui remplace 1 ' hémagglutinine et la neuraminidase.

La prévention de la grippe repose principalement sur la vaccination. Le type de vaccin le plus couramment commercialisé est le vaccin inactivé, basé sur des virus cultivés sur œufs embryonnés de poule, puis inactivés chimiquement. Plus récemment sont apparus des vaccins vivants atténués, construits à partir de souches virales donneuses présentant des mutations qui atténuent leur pathogénicité . Les souches vaccinales sont des virus dits « réassortants », dont les 6 gènes internes sont ceux de la souche donneuse, et les 2 gènes ΗΛ et NA sont ceux de la souche virale vis-à-vis de laquelle on souhaite induire une protection.

Les vaccins vivants atténués, qui sont administrés par voie intranasale, présentent l'avantage de simuler l'infection naturelle, et de permettre d'induire une réponse immune à la fois locale et systémique.

Ces vaccins vivants atténués ont été initialement développés à partir de souches donneuses dites « adaptées au froid », obtenues par une série de passages en culture à 25°C. Il a été observé que les mutants en résultant présentaient un phénotype particulier, associant adaptation au froid (ca) pour : « cold adapted », thermosensibilité ( ts) , et atténuation de la virulence (att) .

La thermosensibilité est une caractéristique très intéressante pour l'obtention de vaccins vivants atténués. En effet, les mutants thermosensibles sont capables de se multiplier normalement à des températures correspondant à celles rencontrées dans le tractus respiratoire supérieur des animaux infectés (généralement de 30 à 33°C selon la température de l'air inhalé), et de permettre ainsi l'initiation d'une réponse immunitaire muqueuse et sérique ; en revanche, leur thermosensibilité limite leur réplication au niveau des voies respiratoires inférieures et des poumons. A titre d'exemples, on citera la souche ca A/Ann Arbor/6/60, ou la souche ca B/Ann Arbor/1/ββ qui sont utilisées comme souches donneuses dans le vaccin atténué FluMist™ : la première de ces souches se réplique normalement jusqu'à 37 °C, mais sa réplication est inhibée à 39°C, contrairement aux souches sauvages d' influenza A, qui se répliquent efficacement jusqu'à 40-41°C ; la seconde se réplique normalement jusqu'à 33°C, mais, contrairement aux souches sauvages d' influenza B, sa capacité de réplication diminue à des températures supérieures, et est inhibée à 37 °C.

Des approches de génétique inverse ont permis d'identifier des déterminants génétiques impliqués dans la thermosensibilité de ces souches, et de les transférer à d'autres souches pour reproduire le phénotype thermosensible. Ainsi, il a été observé que la souche ca B/Ann Arbor/1/56 contenait 8 substitutions d'acides aminés, localisées dans PB2, NP, PA et Ml, et il a été montré que 3 d'entre elles (V114A et P410H sur NP et V431M sur PA) étaient impliquées dans sa thermosensibilité, et que 2 mutations supplémentaires dans Ml lui conféraient son caractère atténué; l'introduction de ces mutations dans la souche sauvage B/Yamanashi/166/98 a en outre permis de transférer à cette dernière les mêmes caractéristiques phénotypiques (HOFFMANN et al., Journal of Virology, 79, 11014-21, 2005 et Demande Internationale PCT WO 03/091401), De même, la souche ca A/Ann Arbor/6/60 contient 5 substitutions en acides aminés (N34G sur la nucléoprotéine NP, N265S sur PB2 , K391E, E581G, et A661T sur PB1) impliquées dans son caractère thermosensible et/ou dans l'atténuation de sa pathogénicité (JIN et al., Virology, 306, 18-24, 2003) ; l'introduction de ces mutations dans le génome de la souche A/Puerto Rico/8/34 a permis de conférer à cette dernière le phénotype thermosensible de la souche caA/Ann Arbor/6/60 (JIN et al., Journal of Virology, 78, 995-98, 2004) ; les mêmes mutations, introduites dans le génome de la souche A/New York/1682/2009 ont également permis l'acquisition par cette dernière d'un caractère thermosensible, qui a encore été accentué par l'introduction de mutations complémentaires (P112S, N556D, Y658H) dans PB2 (ZHOU et al., Vaccine, 30, 3691-702, 2012) .

Ces mutants thermosensibles constituent également des outils très utiles pour l'étude du cycle viral. Par exemple, l'étude d'un mutant thermosensible dans la protéine non-structurale NSI a permis de montrer que cette protéine était impliquée dans un événement tardif de la morphogénèse virale (GARAIGORTA et al., J Virol, 79, 15246-57, 2005). Plus récemment, l'étude d'une mutation thermosensible dans la nucléoprotéine NP a permis l'identification du rôle joué par NP dans la formation des particules infectieuses (NOTON et al., J Virol, 83, 562-71, 2009).

Les Inventeurs ont entrepris l'identification d'autres mutations pouvant conférer un phénotype thermosensible chez des virus influenza, et se sont plus particulièrement intéressés à la polymérase virale, et notamment à la sous-unité PA.

L'ARN polymérase ARN dépendante des virus influenza est un hétérotrimère constitué d'une sous-unité acide, PA, et de deux sous-unités basiques, PB1 et PB2 (pour revue, cf. BOIVIN et al., J Biol Chem, 285, 28411-7, 2010). Ces sous- unités sont codées par les trois segments les plus longs du génome viral. En association avec les protéines NP et NS2 (ROBB et al., J Gen Virol, 90, 1398-407, 2009), ces trois sous-unités assurent la transcription et la réplication du génome viral .

PB1, qui est codée par le segment 2, constitue la sous-unité catalytique de la polymérase, et contient les motifs caractéristiques des ARN polymérases ARN dépendantes (POCH et al., EMBO J, 8, 3867-74, 1989; MULLER et al-, J Gen Virol, 75 ( Pt 6), 1345-52, 1994). Deux produits de traduction mineurs du segment 2 ont également été décrits: l'un résultant d'un codon d'initiation interne, et produisant une forme de PBl tronquée en N-terminal, et l'autre résultant d'un décalage de cadre de lecture et produisant une forme dénommée PB1-F2 qui est associée à la virulence de certaines souches (WISE et al., J Virol, 83, 8021-31, 2009 ; CHEN et al., Nat Med, 7, 1306-12, 2001) . La sous-unité PB2, codée par le segment 1, est impliquée dans la liaison à la coiffe située à l'extrémité 5' des ARNs messagers de la cellule hôte (BLAAS et al., Nucleic Acids Res, 10, 4803-12, 1982; ÛLMANEN et al., Proc Natl Acad. Sci U S A, 78, 7355-9, 1981) . Cette coiffe sera ensuite clivée pour être utilisée comme amorce pour initier la synthèse des ARNs viraux.

La sous-unité PA, codée par le segment 3, a une longueur de 716 acides aminés chez influenza A, 726 acides aminés chez influenza B, 709 acides aminés chez influenza C ; elle contient deux domaines bien définis structurellement: un domaine N-terminal (acides aminés 1-196 chez influenza A, 1-195 chez influenza B, 1-178 chez influenza C) et un domaine C-terminal (acides aminés 258-716 chez influenza A, 255-726 chez influenza B, 239-709 chez influenza C) . Ces deux domaines sont séparés par une région charnière de 60 acides aminés .

Le domaine N-terminal de la sous-unité PA est apparenté à la famille de nucléases PD-(D/E}XK (DIAS et al., Nature, 458, 914-8, 2009; YUAN et al-, Nature, 458, 909-13, 2009} et possède une activité endonucléase impliquée dans le clivage de la coiffe des ARNm de la cellule-hôte. Le domaine C-terminal se lie aux 15 premiers résidus de la sous-unité PB1, et il est supposé être impliqué dans la transcription de l'ARN viral: il a été observé qu'une substitution dans ce domaine (His ~»Ala en position 510 de PA) inhibait fortement cette transcription, sans affecter la réplication virale (FODOR et al., J Virol, 76, 8989-9001, 2002).

Le segment 3 contient un second cadre ouvert de lecture accessible par décalage ribosomal ( JAGGER et al., Science, 337, 199-204, 2012). Le produit de traduction résultant, dénommé PA-X, contient le domaine endonucléase, suivi d'un domaine C-terminal de 61 résidus, codé par l'ORF X, et intervient dans la répression de l'expression des gènes de la cellule-hôte. L'ORF X se chevauche avec une grande partie du cadre de lecture codant pour la charnière séparant le domaine endonucléase du domaine de liaison à PB1 de PA.

La structure de la sous-unité PA est représentée sur la Figure 1 :

Haut de la figure : cadres de lecture du segment

3 : le cadre 0 correspond à la protéine PA, et le cadre 1 à PA-X ;

Milieu de la figure : Alignement des séquences en acides aminés des régions charnières des protéines PA des virus influenza A, B, et C ; les résidus conservés sont listés .

Bas de la figure : structure tri-dimensionnelle de la protéine PA, montrant le domaine endonucléase et le domaine de liaison à PB1 connectés par la région charnière.

A titre d'exemples, les séquences polypeptidiques complètes des sous-unités PA de virus influenza A (souche A/WSN/1933 (HlNl) ; GenBank ACF54605.1), B (souche B/Ann Arbor/1/1986 ; GenBank ABF21265.1), et C (souche C/Ann Arbor/1/50 ; GenBank YP___Q89654.1 ) sont respectivement représentées dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID NO: 1, 2, et 3. Les séquences des régions charnières représentées sur la Figure 1 correspondent respectivement aux acides aminés 197-257 de SEQ ID NO: 1, aux acides aminés 196-254 de SEQ ID NO: 2, et aux acides aminés 179-238 de SEQ ID NO: 3.

A l'heure actuelle, la plupart des mutations de la polymérase des virus influenza conférant un phénotype thermosensible ont été identifiées au niveau des sous-unités PB1 et PB2. En ce qui concerne la sous-unité PA, outre la mutation V431M, située dans le domaine de liaison à PB1 chez la souche B/Ann Arbor/1/66, deux autres mutations conférant un phénotype thermosensible ont récemment été identifiées chez des souches d' influenza A : l'une (L226P) est située dans la région charnière (KAWAGUCHI et al., J Virol, 79, 732-44, 2005), et l'autre (F35S) dans le domaine endonucléase { ZHANG et al., Virology Journal, 9, 97, 2012).

Les Inventeurs ont maintenant effectué diverses mutations synthétiques dans les gènes d'influenza, toutes localisées dans une région flexible de la protéine correspondante, telle que par exemple la région 197-225 chez influenza A (correspondant à la région 196-222 de la sous- unité PA chez influenza B, et à la région de la sous-unité PA 179-205 chez influenza C) , et conférant aux souches virales qui les portent un phénotype thermosensible.

On définit ici comme mutation synthétique, par opposition à une mutation naturelle ou induite, une mutation non-préalablement identifiée dans une souche thermosensible de virus influenza.

On définit comme région flexible d'une protéine, une région ne possédant pas de structure secondaire stable. Cette région peut être définie à partir de la structure atomique de la protéine, lorsque celle-ci a été caractérisée. Par exemple, la structure de la protéine NP du virus influenza (souche A/WSN/1933 (H1N1 ) } est décrite dans Ye et al., Nature, 444, 1078-1082, 2006) . Lorsque la structure atomique de la protéine n'est pas connue, on peut déterminer la structure secondaire de la protéine ou d'une région de cette protéine par les techniques classiques connues de l'Homme du métier, telles que par exemple l'analyse en dichroïsme circulaire.

On définit ici comme mutant thermosensible d'un virus influenza, un mutant dont la température permissive maximale (c'est-à-dire la température jusqu'à laquelle il peut se répliquer normalement) est plus faible que celle du virus sauvage dont il est issu. En deçà de la température permissive maximale, ce mutant thermosensible a une réplication similaire à celle du virus sauvage dont il est issu ; au-delà de la température permissive maximale, sa réplication est réduite d'au moins 2 fois, de préférence au moins 5 fois, avantageusement au moins 10 fois, et de manière tout à fait préférée au moins 100 fois par rapport au virus sauvage dont il est issu.

La présente invention a en conséquence pour objet un procédé de préparation d'un mutant thermosensible d'un virus influenza, caractérisé en ce que l'on introduit au moins une mutation synthétique dans une région d' un gène dudit virus correspondant à une région flexible de la protéine codée par ledit gène, et ladite mutation générant un mutant thermosensible dudit virus.

Conformément au procédé de l'invention, on introduit une ou plusieurs mutations dans une ou plusieurs régions d'un ou plusieurs gènes dudit virus influenza, de préférence lesdites mutations induisent la substitution ou la délétion d'un acide aminé.

Conformément au procédé de l'invention, la ou les dites mutations sont introduites dans n'importe qu'elle protéine virale (PA, PB1, PB2, HA, NA, HE, NP, Ml, M2 , NSI, NS2 } .

Selon un mode de mise en œuvre avantageux dudit procédé, la ou lesdites mutations sont localisées dans un gène codant pour une protéine associée au complexe réplicatif, c'est-à-dire la protéine PA, PB1, PB2 ou NP, de préférence la protéine PA ou NP.

La ou les mutations dans le gène PA sont de préférence localisées dans la région du gène codant pour la protéine PA correspondant à la région 197-257 de la protéine PA du virus influenza A. De manière préférée, la ou lesdites mutations dans le gène codant pour la sous-unité PA de la polymérase dudit virus sont localisée (s) dans la région dudit gène codant pour la région de la sous-unité PA correspondant à la région 197-225 de la sous-unité PA d' influenza A. De manière encore plus préférée, ladite ou lesdites mutation (s) sont choisie (s) parmi : - une mutation résultant dans la substitution de l'acide aminé correspondant à la position 210 de la sous-unité PA d' influenza A, par un acide aminé autre qu'une thréonine, de préférence par un acide aminé choisi parmi la proline, la phénylalanine, l'histidine, le tryptophane, la tyrosine, la glycine, 1 ' isoleucine , la leucine, la valine, l'acide aspartique, l'acide glutamique, la lysine et l'arginine et de façon tout à fait préférée par une proline ;

- une mutation résultant dans la substitution de l'acide aminé correspondant à la position 213 de la sous-unité

PA d' influenza A, par un acide aminé autre qu'une arginine ou une lysine, de préférence par un acide aminé choisi parmi la proline, la phénylalanine, l'histidine, le tryptophane, la tyrosine, la glycine, l' isoleucine , la leucine, la valine, l'acide aspartique et l'acide glutamique, et de façon tout à fait préférée par une proline ;

- une mutation résultant dans la substitution de l'acide aminé correspondant à la position 216 de la sous-unité PA d' influenza A, par un acide aminé autre qu'une asparagine ou un acide aspartique, de préférence par un acide aminé choisi parmi la proline, la phénylalanine, l'histidine, le tryptophane, la tyrosine, la glycine, 1 ' isoleucine , la leucine, la valine, la lysine et l'arginine, et de façon tout à fait préférée par une proline ;

- une mutation résultant dans la substitution de l'acide aminé correspondant à la position 219 de la sous-unité PA d' influenza A, par un acide aminé autre qu'une leucine ou une valine, de préférence par un acide aminé choisi parmi l'alanine, la proline, la cystéine, 1 ' asparagine , la glutamine, la sérine, la thréonine, la tyrosine, et de façon tout à fait préférée par une alanine ou une proline ;

- une mutation résultant dans la substitution de l'acide aminé correspondant à la position 221 de la sous-unité PA d' influenza A, par un acide aminé autre qu'une proline dans le cas d' Influenza A, une alanine dans le cas d' influenza B, et une leucine dans le cas d' influenza C ; de préférence, cet acide aminé sera choisi parmi l' alanine, la glycine, 1 ' isoleucine , la leucine, la méthionine, la phénylalanine, la valine, le tryptophane, la cystéine, 1 ' asparagine , la glutamine, la sérine, la thréonine, et la tyrosine dans le cas d' influenza A ; parmi la proline, la phénylalanine, la glycine, l'histidine, le tryptophane, la tyrosine, la glycine, 1' isoleucine, la leucine, la valine, la cystéine, 1' asparagine, la glutamine, la sérine, la thréonine, et la tyrosine dans le cas d' influenza B ; et parmi l' alanine, la proline, la cystéine, 1 ' asparagine, la glutamine, la sérine, la thréonine, la phénylalanine, la glycine, l'histidine, le tryptophane, et la tyrosine dans le cas d' influenza C ; de manière tout à fait préférée il s'agira d'une alanine dans le cas d' influenza A, d'une proline dans le cas d' influenza B, et d'une alanine ou d'une proline dans le cas d' influenza C ;

- une mutation résultant dans la substitution de l'acide aminé correspondant à la position 222 de la sous-unité PA d' influenza A, par un acide aminé autre qu'une asparagine dans le cas d' influenza A, une glycine dans le cas d' influenza B, et une proline dans le cas d' influenza C ; de préférence, cet acide aminé sera choisi parmi la proline, l' alanine, la glycine, l' isoleucine, la leucine, la méthionine, la phénylalanine, la valine, le tryptophane, l'acide aspartique, l'acide glutamique, l'histidine, la lysine et l'arginine dans le cas d' influenza A ; parmi la proline, l' alanine, la cystéine, 1 ' asparagine , la glutamine, la sérine, la thréonine, 1 ' isoleucine , la leucine, la valine, la phénylalanine, l'histidine, le tryptophane, et la tyrosine dans le cas d' influenza B ; et parmi l' alanine, la glycine, 1 ' isoleucine , la leucine, la méthionine, la phénylalanine, la valine, le tryptophane, la cystéine, l' asparagine, la glutamine, la sérine, la thréonine, et la tyrosine dans le cas d' influenza C ; de manière tout à fait préférée il s'agira d'une alanine ou d'une proline dans le cas d' influenza A et d'influenza B, et d'une alanine dans le cas d'influenza C ;

- une mutation résultant dans la substitution de l'acide aminé correspondant à la position 223 de la sous-unité

PA d'influenza A, par un acide aminé autre qu'une phénylalanine, de préférence par un acide aminé choisi parmi 1' alanine, la proline, la cystéine, 1 ' asparagine , la glutamine, la sérine, la thréonine, la tyrosine, la glycine, 1 ' isoleucine , la leucine, et la valine, et de façon tout à fait préférée par une alanine ou une proline.

- une mutation résultant dans la substitution de l'acide aminé correspondant à la position 225 de la sous-unité PA d'influenza A, par un acide aminé autre qu'une sérine dans le cas d' influenza A, une asparagine dans le cas d' influenza B, et une thréonine dans le cas d'influenza C, de préférence par un acide aminé choisi parmi l' alanine, la proline, l'acide aspartique, l'acide glutamique, l'histidine, la lysine, l'arginine, la glycine, 1 ' isoleucine , la leucine, la méthionine, la phénylalanine , la valine, et le tryptophane dans le cas d'influenza A ; parmi l' alanine, la proline, l'acide aspartique, l'acide glutamique, l'histidine, la lysine, l'arginine, la glycine, 1 ' isoleucine, la leucine, la méthionine, la phénylalanine, la valine, et le tryptophane dans le cas d'influenza B ; et parmi l' alanine, la proline, la phénylalanine, l'histidine, le tryptophane, la tyrosine, l'acide aspartique, l'acide glutamique, la lysine et l'arginine dans le cas d'influenza C, et de façon tout à fait préférée par une alanine ou une proline.

Les acides aminés correspondant aux positions 207,

208, 209, 210, 213, 216, 219, 221, 222, 223 et 225 de la sous- unité PA de la polymérase du virus influenza A sont respectivement situés aux positions 204, 205, 206, 207, 210, 213, 216, 218, 219 220 et 222 de la sous-unité PA de la polymerase du virus influenza B, et aux positions 187, 188, 189, 190, 193, 196, 199, 201, 202, 203 et 205 de la polymérase du virus influenza C.

Des mutations particulièrement préférées dans le gène PA sont celles induisant la substitution d'au moins l'un des acides aminés correspondant aux positions 210, 216, 219, 221, 222, 223 et 225 et de manière tout à fait préférée d'au moins l'un des acides aminés correspondant aux positions 216 et 219 de ladite sous-unité PA chez influenza A.

D'autres mutations particulièrement préférées dans le gène PA sont celles induisant la délétion d'au moins l'un des acides aminés correspondant aux positions 207, 208, 209 ou 210 de la protéine PA du virus influenza A,

La ou les mutations dans le gène NP sont de préférence localisées dans la région du gène codant pour la protéine NP correspondant à la région 73 à 92, 203 à 212, 230 et 231, 297 à 301, 429 à 436 ou 490 à 498 de la protéine NP du virus influenza A. De manière préférées, lesdites mutations sont localisées dans l'une desdites régions du gène codant pour la protéine NP d'un virus influenza A ou dans la région du gène codant pour la protéine NP d'un virus influenza B correspondant à la région 203 à 212 de la protéine NP du virus influenza A.

Lesdites positions dans la protéine NP du virus influenza A (A/Wilson-Smith/1933 (HlNl ) sont indiquées en référence à la séquence SWISSPROT Pl5682/GenBank M30746.1.

Des mutations préférées dans le gène NP sont celles induisant la délétion ou la substitution d'au moins l'un des acides aminés correspondant à la position 205, 206, 209, 210 ou 211 de la protéine NP du virus influenza A. La substitution est par exemple le remplacement de l'acide aminé en position 206 ou 210 par une alanine ou une proline, de préférence une proline. Alternativement, la substitution est le remplacement de l'acide aminé en position 205, 209 ou 211 par une proline. Les acides aminés correspondant aux positions 73 à 92, 203 à 212, 230 et 231, 297 à 301, 429 à 436 et 490 à 498 de la protéine NP du virus influenza A sont respectivement situés aux positions 125 à 147, 264 à 270, 288 et 289, 454 à 457, 485 à 492, 553 à 560 de la protéine NP du virus influenza B, et aux positions 66 à 87, 207 à 216, 234 et 235, 409 à 412, 440 à 447, 530 à 537 de la de la protéine NP du virus influenza C.

De façon à limiter la fréquence de révertants, on introduit avantageusement plusieurs substitutions ou une délétion dans ledit virus telles que par exemple les substitutions D216P et T210P ou bien l'une des délétions d207, d208, d209 ou d210 dans PA. Alternativement, on choisit la mutation de façon à ce que pour obtenir la substitution du codon désirée on change plusieurs nucléotides dudit codon. On peut également introduire plusieurs mutations dont une de délétion pour diminuer la fréquence de révertants.

Une ou lusieurs des mutations conformes à l'invention décrites ci-dessus peu{ven)t éventuellement être combinée (s) avec d'autres mutations, afin d'améliorer encore les propriétés phénotypiques du virus muté dans le cadre d' une utilisation vaccinale, par exemple afin d'augmenter sa thermosensibilité et/ou d'accroître l'atténuation de sa virulence. Ces mutations peuvent être localisées dans d'autres régions de la sous-unité PA, et/ou dans une ou plusieurs des autres protéines virales, notamment PBl, PB2, NP ou NSI.

On peut par exemple introduire une mutation conforme à l'invention dans le génome d'une souche d' influenza A ou B, de préférence une souche atténuée, telle que la souche A/Ann Arbor/6/60, ou B/Ann Arbor/1/66 mentionnées ci-dessus.

Cependant, les mutations conformes à l'invention ne peuvent généralement pas être combinées avec certaines mutations additionnelles dites de réversion qui ont été identifiées par les Inventeurs. En effet, ces mutations de réversion compensent les effets phénotypiques des mutations conformes à 1 ' invention, et ont donc pour conséquence la restauration totale ou partielle d'un phénotype sauvage.

Il s'agit des mutations suivantes :

- une combinaison de mutations identifiées sur le virus thermosensible possédant la substitution T210P : l'une de ces mutations localisée sur le codon 377 du gène PA, induit la substitution d'un acide glutamique en lysine dans le domaine d'interaction de PA à PB1, et l'autre, localisée sur le codon 20 du gène PA induit la substitution d'une alanine en thréonine dans 1 ' endonucléase de PA ;

- une mutation de réversion également identifiée sur le virus thermosensible possédant la substitution T210P est localisée sur le codon 287 du gène PB1, et induit la substitution d'une arginine en méthionine ; chez le mutant thermosensible D216P, cette substitution R287M n'induit qu'une réversion partielle vers le phénotype sauvage.

Le procédé conforme à l'invention peut être mis en œuvre en utilisant les techniques classiques de production de virus influenza recombinants par génétique inverse. Ces techniques sont bien connues en elles-mêmes de l'homme du métier (cf. par exemple (NEUMANN & KAWAOKA, Virology, 287, 243- 50, 2001; FODOR et al., Journal of Virology, 73, 9679-82, 1999; JACKSON et al., Journal of General Virology, 92, 1-17, 2011; NEUMANN et al., Influenza Virus : Methods and Protocols, 865, 193-206, 2012; ZHOU & WENTWORTH, Methods Mol Biol, 865, 175-92, 2012 ; LeGoff et al., PLoS One., 2012, 7(8)e37095).

La présente invention a également pour objet les virus influenza recombinants mutants obtenus par un procédé conforme à l'invention. Ces virus sont caractérisés en ce qu'ils contiennent au moins une mutation conforme à l'invention telle que définie ci-dessus, notamment une mutation dans le gène codant pour la sous-unité PA de la polymérase . Des virus influenza recombinants mutants conformes à l'invention peuvent être utilisés notamment comme souches donneuses pour l'obtention de vaccins vivants atténués antigrippaux. Les virus réassortants obtenus à partir de ces souches donneuses, ainsi que les vaccins vivants atténués contenant ces virus réassortants font également partie de l'objet de la présente invention.

La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples illustrant l'obtention de virus influenza thermosensibles conformes à l'invention.

EXEMPLES :

Matériel et méthodes :

Souches virales :

Les souches virales A/WSN/1933 (H1N1 ) et A(HlNl)pdm09 ont été utilisées comme support pour réaliser les mutations dans PA.

Cultures de cellules : Les cellules 293 T ont été cultivées en milieu DMEM (Dulbecco's modified Eagle médium) supplémenté de 10% de sérum de veau foetal. Les cellules MDCK (Madin-Darby canine kidney) ont été cultivées en milieu essentiel minimum, contenant 5% de sérum de veau fœtal (FCS). Mutagenèse des protéines virales :

Les plasmides mutés dans le gène PA ou NP ont été construits en utilisant le kit « QuickChange mutagenesis kit » (Stratagene) pour muter les codons des régions flexibles de la protéine correspondante. Les mutations introduites ont été confirmées par séquençage des plasmides générés.

Plasmides utilisés :

Le plasmide pPolI-WSN-NA-luciferase produit un ARN similaire à l'ARN viral du segment 6, dans lequel la région codant pour la neuraminidase est remplacée par la séquence codant pour la luciférase de luciole. Génération des virus recombinés :

Les virus utilisés ont été générés par génétique inverse. Les mutants issus de la souche A/WSN/1933 (H1N1) , ont été générés à partir de plasmides portant les 8 segments génomiques de la souche A/WSN/1933 (H1N1) , et 4 plasmides codant pour les 4 protéines du complexe de réplication (PA, PB1, PB2 et NP) , en utilisant le protocole décrit par (FODOR et al., Journal of Virology, 73, 9679-82, 1999). Ces plasmides ont été utilisés pour transfecter des co-cultures de cellules 293T et MDCK. 48 heures après la transfection, les virus ont été récoltés, et utilisés pour inoculer des cellules MDCK pour la production du stock viral. Les mutants issus de la souche A (HlNl) pdm09, ont été générés en utilisant le système de génétique inverse du virus influenza A(HlNl)pdm09 décrit dans LeGoff et al., PLoS One, 2012, 7(8) : e37095. Les gènes PA des virus obtenus ont été séquencés pour confirmer la présence des mutations souhaitées et l'absence de mutations non désirées. Essais de réplication virale :

Des cellules MDCK ont été infectées à 33°C, 37°C et 39,5°C, avec le virus WSN sauvage ou chacun des mutants PA, à une multiplicité d'infection (MOI) de 0,01.

A différents temps après l'infection, les surnageants de culture ont été récoltés, et le titre viral a été déterminé sur plaques de cellules MDCK.

Essais d'activité luciferase :

Des cellules 293T mises à pousser dans des puits de plaques P96 ont été transfectées avec des plasmides dérivant du plasmide pcDNA3 (Invitrogen) et exprimant les protéines PB1, PB2, NP et PA (type sauvage ou mutants} et le plasmide pPolI-WSN-NA-luciferase . Les quantités de plasmide pour les transfection ont été de 50 μg/puits pour pcDNA3-PA et pcDNA3- PA mutés, pcDNA3-PBl et pcDNA3-PB2, 85 pg/puits pour pcDNA-NP et 133 μg/puits pour pPolI-WSN-NA-luciferase . Le plasmide pRSV-p-Gal (Promega) a été co-transfecté (50 pg/puits) et le dosage de l'activité β-Gal utilisé comme contrôle interne et normalisation de l'efficacité de transfection . A titre de contrôle négatif, les cellules 293T ont été transfectées avec les mêmes plasmides, à l'exception de celui exprimant PA, Après transfection les cellules ont été incubées à 33°C ou 39,5°C pendant 48 h, puis lysées, et l'activité luciférase dans le lysat a été mesurée en présence de luciferine, substrat de luciférase, à l'aide d'un luminomètre TECAN, en suivant les instructions du fabricant.

Essais de pathogénicité :

Des souris C57B1/6 (n=10) ont reçu par voie intranasale des dilutions successives de 10 en 10 de virus A/WSN/1933 ou des virus mutants D216P et L219P (de 10 ⁶ à 10 ² unités formant plaque/souris, dans 50μ1 de tampon PBS) , et ont été pesées quotidiennement. Les souris ayant une perte de poids supérieure à 25% ont été considérées comme mortes, et euthanasiées .

Infections et prélèvements de sang suite à l'infection

Des souris C57B1/6 (n=5) anesthésiées par un mélange de kétamine et de xylazine (1 et 0, 2 mg par souris, respectivement) ont été infectées par voie intranasale avec 50 μΐ de PBS contenant 10 ⁴ à 10 ² unités formant plage/souris de virus A/WSN/1933 ou des virus mutants D216P et L219P. Au jour 18, les souris ont été euthanasiées et leur sang prélevé.

Dosage des anticorps anti-infliienza

Les anticorps spécifiques du virus influenza A (Ig totales} ont été testés par ELISA dans les sérums individuels de souris infectées par les virus mutants. L'antigène du virus influenza A (200 ng par puits dans 100 μL de tampon carbonate- bicarbonate 0.1 M pH 9,5) a été déposé dans des microplaques de titration {Immulon 2HB, ThermoLabsystems ) , puis les plaques ont été incubées une nuit à 4°C. Les plaques ont été lavées cinq fois avec du PBS 0,05% Tween® 20 entre chaque étape du test. Après l'étape d' adsorption de l'antigène, les sites résiduels de liaison aux protéines ont été saturés avec du tampon PBS-T-FCS (5% FCS dans PBS 0.05% Tween® 20) pendant une heure à 37°C. Les échantillons ont été dilués successivement de 3 en 3 dans du tampon PBS-T-FCS en commençant par une dilution 1:30, puis distribués dans les plaques qui ont été incubées pendant 2h à 37°C. Les anticorps liés à l'antigène ont été détectés en utilisant un anticorps de chèvre anti IgH+L de souris conjugué à la peroxidade de raifort (P.A.R.I.S. ; Ing/mL) incubé pendant une 1 hr à 37 °C. Le substrat TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc.) a été ajouté pendant 10 min, puis la réaction a été stoppée par l'addition d'acide phosphorique 1M. L'absorbance a été mesurée à 450 nm avec un lecteur de plaques ELISA (Dynex, MRX révélation) . Les résultats ont été exprimés par les titres limites en anticorps calculés par analyse de régression de la dilution en fonction de A450 (courbe de régression y = (b+cx) / (1+ax) ) . Les titres limites ont été déterminés par la dilution la plus élevée donnant une absorbance deux fois supérieure à celle du contrôle négatif.

EXEMPLE 1 : GÉNÉRATION ET CARACTÉRISÂTION DES MUTANTS.

Des mutations ont été effectuées dans la région charnière de la protéine PA en sélectionnant les acides aminés conservés entre les virus influenza A, B, et C, ainsi que ceux situés à proximité de ces résidus. Au total, 25 positions d'acides aminés ont été sélectionnées. Deux types de substitutions ont été effectuées : des substitutions par un résidu proline pour perturber la structuration potentielle de ce domaine (sauf pour les positions 220 et 221 où figure déjà une proline) , ou des substitutions par un résidu alanine, à cause de son groupement fonctionnel méthyle, peu encombrant et chimiquement inerte. Comme le cadre de lecture de PA et l'ORF- X se chevauchent, plusieurs des substitutions effectuées dans la charnière de PA engendraient également des mutations dans PA-X. Dans ce cas, afin de déterminer si le phénotype observé résultait d'une mutation dans PA ou dans PA-X, des modifications ont été introduites dans le motif de décalage du cadre de lecture ribosomal, de UUU CGU (codons 191 et 192) à UUC AGA afin de réduire l'efficacité du décalage de phase du ribosome et en conséquence l'expression de PA-X. Les mutants contenant ces modifications sont désignés ci-après 191FS. En outre, des délétions d'un seul résidu d'acide aminé ont été réalisées en position 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211 et 212 de PA mutants d205, d206, d207, d208, d209, d210, d211 et

30 virus mutants, avec ou sans modifications du motif de décalage du cadre de lecture ribosomal, ont ainsi été générés. Les 3 mutants définis par des substitutions et restants n'ont pas pu être produits, suggérant que les mutations correspondantes (L214P, S218P, et E237P) sont létales pour le virus. Les mutants de délétion avec une délétion en position 205, 206, 211 et 212 n'ont pu être produits, suggérant que les mutations correspondantes (d205, d206, d211 et d212) sont létales pour le virus.

Les mutations de substitution effectuées sont représentées sur la Figure 2A. La séquence d'acides aminés du domaine charnière de PA d' influenza A, et les résidus conservés entre les virus A, B, et C sont indiqués. Les positions choisies pour les mutations de substitution sont indiquées par des carrés gris foncé. Les substitutions conférant un phénotype thermosensible sont indiquées par un carré gris clair. Les substitutions n'ayant pas permis la production de virus sont indiquées par un carré noir, et les substitutions ne conférant pas de phénotype thermosensible aux virus produits sont indiquées par un carré blanc.

Les propriétés de réplication en cultures cellulaires des virus mutants ont été examinées par titration sur plaques de cellules MDCK.

Les résultats obtenus avec les mutants T210P, K213P, D216P, F223P, L226P et E227P sont illustrés par la Figure 2B. Plusieurs des mutants testés {T210P, K213P, D216P, F223P, S225P et L226P) montrent une thermosensibilité marquée. Alors qu' ils ne lysent pas ou ne lysent que faiblement les cellules MDCK à 39,5°C, ils ont une efficacité lytique comparable à celle du virus sauvage WSN à 33°C et 37°C. Seul le mutant E227P présente une efficacité lytique comparable à celle du virus sauvage aux 3 températures testées.

Les résultats obtenus avec les mutants d207, d208, d209 et d210 sont illustrés par la Figure 2C. Les mutants d207, d208, d209 et d210 montrent une thermosensibilité marquée. Ces mutants de délétion ont une activité lytique plus marquée à 33°C qu'à 37°C et qu'à 39,5°C.

Pour mieux caractériser la thermosensibilité des mutants, des essais de réplication virale sur cellules MDCK ont été effectués, à 37°C et 39,5°C pour les virus T210P, K213P, D216P, F223P, L226P et E227P, ainsi qu'à 33°C, 37°C et 39,5°C pour les virus L219P et d209. La production virale (en Unités Formant Plaque (UFP) /ml) a été quantifiée à différents temps après infection {MOI 0,01) . Les résultats sont illustrés par la Figure 3 (A : virus T210P, K213P, D216P, F223P, L226P et E227P ; B ; virus L219P) et la Figure 4 (d209) .

Tous les mutants ont à 37 °C une cinétique de réplication similaire à celle de la souche sauvage WSN, à l'exception du mutant F223P et L219P dont la réplication apparaît ralentie. A 39,5°C, la réplication est ralentie pour tous les mutants, à l'exception de E227P, par rapport au virus sauvage. Cette inhibition de la réplication apparaît modérée pour K213P et L226P pour lesquels on observe, 56 heures après infection un titre viral équivalent à celui observé avec le virus sauvage. En revanche, elle est importante pour T210P, D216P et d209, et on observe même un blocage complet de la réplication dans le cas des mutants F223P et L219P.

Les effets des mutations effectuées sont résumés dans le Tableau I ci-dessous : d209 +

d210 ·*· ++ d211 - d212 -

Le phénotype thermosensible apparaît nettement plus marqué dans le cas des substitutions par une proline que dans le cas des substitutions par une alanine. En outre, le phénotype thermosensible peut également être obtenu avec des délétions d'un codon.

EXEMPLE 2 : ACTIVITE POLYMERASE DES COMPLEXES DE REPLICATION CONTENANT UNE PROTÉINE PA MUTÉE.

Pour étudier les effets des substitutions sur la transcription des ARNs viraux, l'activité des protéines PA mutées a été testée à l'aide d'un système de miniréplicon . Le plasmide pPoll-WSN-NA-luciferase produit un ARN viral modifié, dans lequel la région codant pour la neuraminidase est remplacée par la séquence codant pour la luciférase de luciole. Lors de la co-transfection de ce plasmide avec des plasmides exprimant les protéines virales PBl, PB2 , NP et PA, la production de luciférase reflète l'activité de transcription et de réplication du complexe de réplication formé par ces protéines.

48 heures après la co-transfection des cellules 293T, celles-ci ont été lysées, et l'activité luciférase dans le lysat a été quantifiée.

Les résultats sont illustrés par la Figure 5 et la Figure 6. Ces résultats représentent l'activité luciférase moyenne (+/- écart type) , mesurée sur 3 expérimentations, et normalisée par rapport à l'activité β-Galactosidase . Figure 5 ; panneau du haut : substitutions par une proline ; panneau du bas : substitution par une alanine.

Les mutants portant une substitution par une proline montrent toujours des effets plus importants sur la capacité réplicative que leurs homologues substitués par une alanine. Presque toutes les mutations ont un effet moindre à 33°C qu'à 37°C et 39,5°C, ce qui suggère que la conformation de la région charnière de PA a une influence sur l'activité polymérase. Contrairement à tous les autres mutants substitués par une proline, le mutant E227P montre une activité similaire à 33°C, 37°C et 39,5°C, en accord avec l'absence de thermosensibilité du virus portant la même mutation.

Toutes les mutations induisant un phénotype viral thermosensible (210P, 213P, 216P, 221A, 222P, 223P, 226P, d207, d208, d209 et d210) montrent une activité polymérase efficace à 33°C, et une activité plus faible à 39,5°C, et même à 37 °C. La mutation d207 induit un phénotype viral thermosensible et montre une activité polymérase très faible à 33°C, ainsi qu'à 37°C et 39.5°C. Plusieurs variants (E198P, I201P, L214P, S218P, P220A, Y232P, M249P) ne montrent pas ou peu d'activité luciférase à 33°C, 37°C and 39.5°C. Ces mutations entraînent probablement la perte de l'activité polymérase, induisant le défaut de réplication observé chez les virus mutants correspondants. Le variant P220A qui ne possède pas le phénotype viral thermosensible a néanmoins pu être produit .

EXEMPLE 3 : PATHOGÉNICITÉ DES VIRUS MUTANTS.

La pathogénicité des virus mutants par rapport au virus sauvage a été évaluée sur des souris, après administration intranasale des virus testés, par le suivi de la courbe de poids et la prédiction de mortalité.

Les résultats sont illustrés par la Figure 7.

A des doses de 10 ³ et 10 ⁴ unités formant plaque/souris, le virus WSN induit une perte de poids marquée alors que les deux virus mutants ne provoquent aucune perte de poids. A une dose de 10 ⁵ unités formant plaque/souris, alors que le virus WSN provoque une baisse de poids rapide et le mutant D216P une baisse de poids moins rapide et transitoire, le mutant L219P n'a encore aucun effet le poids des animaux infectés. A 10 ⁶ unités formant plaque/souris, les virus WSN et D216P induisent une perte de poids rapide et le mutant L219P une perte de poids transitoire.

La dose léthale 50 (DL50), basée sur la prédiction de mort ou de survie des animaux est estimée à 3,5 (en Log d'unités formant plaque) pour le virus sauvage, >6 pour le mutant L219P, et 5,5 pour D216P.

Ces résultats montrent que le phénotype thermosensible s'accompagne d'une atténuation de la pathogénicité, particulièrement importante dans le cas du virus L219P.

EXEMPLE 4 : EXPRESSION DES MUTATIONS DE THERMOSENSIBILITE DANS D'AUTRES SOUCHES DU VIRUS INFLUENZA,

Pour déterminer si le phénotype thermosensible (ts) des mutations identifiées peut être exprimé dans un autre fond génétique, la mutation D216P a été introduite dans le segment génomique PA du virus A (H1N1 ) pdmO 9 , en utilisant un système de génétique inverse préalablement décrit (LeGoff et al., PLoS One, 2012, 7 ( 8 ) : e370952012 ) . Un virus mutant portant la mutation D216P a été produit (HINlp (2009) -D216P) . Les propriétés de réplication en cultures cellulaires du virus mutant ont été examinées par titration sur plaques de cellules MDCK. Les résultats obtenus sont illustrés par la Figure 8. La mutation D216P induit un phénotype ts dans le virus A(H1N1) pdm09. Alors que le virus HINlp (2009) -D216P ne lyse pas ou ne lyse que faiblement les cellules MDCK à 37°C et 39,5°C, il a une efficacité lytique comparable à celle du virus sauvage HlNlp(2009)à 33°C. Ces résultats démontrent que ce caractère ts peut s'exprimer sur d'autres souches que le virus WSN. EXEMPLE 5 : INDUCTION D'ANTICORPS ANTI-INFLUENZA PAR LES VIRUS MUTANTS .

L'induction d'une réponse immune adaptative par les virus mutants de PA a été analysée chez les souris survivantes de l'exemple 3, deux semaines et quatre jours après l'infection. Les titres en anticorps anti-influenza virus induits par les virus mutants de PA ont été mesurés par un test ELISA classique, de façon à évaluer le potentiel de ces mutants à se comporter comme des vaccins vivants efficaces. Les résultats sont illustrés par la figure 9. A une dose infectieuse de 10 ² ou 10 ³ UFP, le mutant D216P et le virus sauvage mais pas le mutant L219P, induisent une forte réponse en anticorps, suggérant que la thermosensibilité du mutant L219P est trop marquée pour se répliquer et induire une réponse immune efficace. A une dose infectieuse de 10 ⁴ UFP, le mutant L219P est capable d'induire la synthèse d'anticorps. Ces résultats indiquent que les deux mutants thermosensibles D216P et L219P sont fortement atténués et capables d'induire une réponse en anticorps efficace. EXEMPLE 6 : CORRELATION ENTRE LE PHENOTYPE THERMOSENSIBLE DES MUTANTS D' INFLUENZA ET L'INTRODUCTION D'UNE MUTATION DANS UN DOMAINE FLEXIBLE D'UNE PROTEINE D' INFLUENZA.

La corrélation entre l'introduction d'une mutation dans une zone flexible d'une protéine d' influenza et l'obtention d'un virus mutant thermosensible a été étudiée sur deux protéines différentes d'influenza, PA et NP.

La région charnière de la protéine PA du virus influenza A/WSN/1933 (H1N1 ) (acides aminés 197 à 256) a été exprimée dans E. coli et purifiée à homogénéité, selon les protocoles standards d'expression et de purification de protéines recombinantes dans E. coli. La structure secondaire de cette région a été analysée en dichroïsme circulaire. Le spectre obtenu montre l'absence de structure secondaire stable sur ce segment (figure 10). Ces résultats indiquent que la région charnière de la protéine PA qui permet d'obtenir des virus thermosensibles correspond à un domaine flexible de la protéine PA d'influenza.

Des domaines flexibles de la protéine NP ont été identifiés à partir de la structure atomique de la protéine NP de WSN, précédemment caractérisée (Ye et al., Nature, 444, 1078-82, 2006). Des domaines de NP sont apparus non-structurés dans le cristal : les positions des résidus 73 à 92, 203 à 212, 230 et 231, 297 à 301, 429 à 436 et 490 à 498 ne sont pas définies. Des substitutions pour des codons alanine ont été réalisées sur les résidus 203, 204, 205, 206, 207, 209, 210 et 211, comme décrit à l'exemple 1. Des virus mutants ont pu être isolés pour les mutations 205, 206, 209, 210 et 211. Les virus mutants D203A, R204A et W207A n'ont pu être produits.

Les propriétés de réplication en cultures cellulaires des virus mutants qui ont pu être obtenus ont été examinées par titration sur plaques de cellules MDCK. Deux mutants, F206A et E210A ont un phénotype ts. Les résultats sont illustrés par la Figure 11. Les mutations F206A et E210A induisent un phénotype ts dans le virus WSN. Alors que les virus NP-F206A et NP-E2101A ne lysent pas ou ne lysent que faiblement les cellules MDCK à 39,5°C, ils ont une efficacité lytique comparable à celle du virus sauvage WN à 33 °C.

Ces résultats indiquent que les domaines flexibles des protéines d'influenza représentent des domaines cibles préférentiels pour l'obtention de virus mutants thermosensibles .