Les ADN polymérases sont des enzymes impliquées dans la réplication et la réparation de l'ADN dans toute cellule vivante. On connaît aujourd'hui de nombreuses ADN polymérases isolées de micro-organismes tel que E. coli (ADN polymérase I) ou du phage T4. Des ADN polymérases ont aussi été identifiées et purifiées et à partir de micro-organismes thermophiles comme Thermus aquaticus (Taq polymérase, Chien, A. et al. J. Bact. 1976, 127:1550-1557 ; Kaladin et al. Biokhymiya 1980, 45:644- 651), Thermus thermophiius, ou encore des espèces du genre Bacillus (demande de brevet Européen publiée sous le No. 699 760), Thermococcus (demande de brevet Européen No. 455 430), Sulfolobus et Pyrococcus (demande de brevet Européen publiée sous le No. 547 359). Parmi ces ADN polymérases issues d'archaebactéries on peut citer la Pfu, isolées de Pyrococcus furiosus (18), la Vent polymerase de Thermococcus litoralis (10), la 90N de Pyrococcus sp. 90N (15) et la DeepVentTM de Pyrococcus GB- D, les deux premières provenant de souches du littoral (Baie de Naples), les deux suivantes de souches sous- marines profondes.

Le mécanisme d'action des ADN polymérases est aujourd'hui relativement bien connu et consiste en une réplication de l'ADN à l'identique selon un mode semi- conservatif. Le brin recopié sert de matrice et les quatre nucléotides triphosphates sont le substrat de cette polymérisation. Les enzymes ayant une activité ADN polymérase sont aujourd'hui de plus en plus utilisées in vitro afin de travailler en biologie moléculaire dans divers buts tels le clonage, la détection d'erreurs, le

séquençage, le marquage, et de façon générale, l'amplification de séquences d'acides nucléiques.

Cette amplification, in vitro, de séquences d'acide désoxyribonucléique fait appel à la technique de la réaction de polymérisation en chaine (PCR) décrite dans les brevets Européens No. 200 362 et 201 184. Le principe de cette technique est basé sur la réalisation de cycles successifs d'extension d'amorces mettant en oeuvre les quatre nucléotides triphosphates ainsi qu'une ADN polymérase et un ADN matrice à recopier. A chaque cycle, l'enzyme double le nombre de brins d'ADN disponibles et entre chaque cycle une thermodénaturation est nécessaire afin d'ouvrir la double hélice d'ADN pour le cycle suivant. Les températures utilisées pour cette étape de thermodénaturation ne sont pas compatibles avec la conservation de l'activité de la plupart des ADN polymérases connues, telle la Klenow. C'est ainsi que des nombreux efforts de recherche ont été réalisés afin de trouver des enzymes supportant ces températures.

Cependant, si les micro-organismes thermophiles sont aujourd'hui connus, il reste encore difficile d'obtenir ces enzymes thermostables avec des rendements de production suffisants. La biologie moléculaire et le génie génétique permettent de palier cet inconvénient.

Ainsi, une fois repéré dans le génome, le gène codant pour l'ADN polymérase est cloné, séquencé puis recloné dans un vecteur d'expression afin de produire la protéine dite alors recombinante, chez un hôte mésophile plus aisé à cultiver tel E. coli ou S. cerevisiae. Cette méthode d'expression chez E. coli a notamment été décrite dans la demande de brevet internationale PCT publiée sous le No.

W0 89/06691 pour produire l'ADN polymerase de Thermus aquaticus.

L'ADN polymérase de l'invention provient d'une archaebactérie de l'espèce Thermococcus fumicolans. Outre ses propriétés thermos tables la rendant particulièrement efficace notamment dans une processus de PCR, cette ADN

polymérase est remarquable en ce qu'elle présente deux "introns protéiques", encore appelés "intéines", au niveau de son polypeptide précurseur.

La séquence nucléotidique de ses intéines est insérée dans celle de 1'ADN polymérase, généralement au niveau de sites conservés impliqués, après traduction, dans les réactions catalytiques. Ces séquences sont transcrites et traduites en même temps que celle de l'ADN polymérase et l'épissage autocatalytique des intéines produit alors trois enzymes: deux intéines et une ADN polymérase.

On trouve de telles intéines également au sein d'autres molécules telles l'ATPase vacuolaire chez S. cerevisiae (4), GyrA chez Mycobacterium leprae (7), Rec A chez Mycobacterium tuberculosis (5, 6). Les intéines font partie pour leur majorité de la famille des endonucléases de type "homing endonucleases" puisqu'elles coupent l'ADN en un site reconnu, à l'endroit même où leur séquence nucléotidique vient s'insérer.

Le développement des biotechnologies tant dans la recherche que dans les domaines de la médecine ou de l'agro-alimentaire, nécessite de disposer de divers types d'ADN polymérases susceptibles d'améliorer quantitativement et qualitativement des techniques aussi diverses que le clonage, la détection, l'amplification de séquences d'ADN. La présente invention vise précisément à offrir une nouvelle ADN polymérase thermostable qui est issue d'une espèce récemment décrite: Thermococcus fumicolans (8). Cet isolat a été isolé à partir de fragments de cheminées prélevées dans le bassin Nord- Fidgien lors de la campagne franco-japonnaise STARMER en 1989. Cette espèce, anaérobie stricte, présente une température optimale de croissance de 900C, ce qui est relativement élevé pour un Thermococcus. Son pH optimum est de 8,8, et son taux de salinité de 20 g/l à 40 g/l.

L'invention a donc pour objet une ADN polymérase purifiée thermostable d'archaebacteries de

l'espèce Thermococcus fumicolans ayant un poids moléculaire de l'ordre de 89000 Da ainsi que ses intéines thermostables, dont le gène comportant les deux séquences codant pour lesdites intéines a été cloné.

Les travaux de recherche ayant permis d'identifier, de séquencer et d'étudier l'ADN polymérase de l'invention ont été réalisée à partir de la souche Thermococcus fumicolans ST557 déposée à la Collection de l'institut Pasteur (CIP) sous le numéro CIP 104680. Cette ADN polymerase sera dénommée dans ce qui suit Tfu. Sa séquence de 774 acides aminés est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO:2.

Un poids moléculaire de 89797 Da et un pI de 8.1 ont été déduits de cette séquence.

L'invention concerne donc l'ADN polymérase purifiée thermostable d'archaebactéries de l'espèce Thermococcus fumicolans ayant un poids moléculaire de l'ordre de 89 000 daltons ainsi que ses dérivés enzymatiquement équivalents. On entend par dérivés enzymatiquement équivalent, les polypeptides et protéines constitués par ou comprenant la séquence en acides aminés représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO:2 dès lors qu'ils présentent les propriétés de 1'ADN polymérase de Thermococcus fumicolans. A ce titre l'invention envisage plus particulièrement une ADN polymérase dont la séquence en acides aminés est représentée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID NO:1 ou un fragment de celle-ci ou encore un assemblage de tels fragments, comme la séquence de 774 acides aminés représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO:2.

En effet, la présence de deux intéines I-Tfu-l et I-Tfu-2 dans la séquence numéro SEQ ID NO:1, sont susceptibles de conduire lors de la préparation par synthèse chimique ou par génie génétique, à des séquences d'ADN polymérase de T. fumiculans tronquées dont les

propriétés enzymatiques sont équivalente à celle de lADN polymérase de T. fumicolans purifiée.

On entend aussi par dérivés, les séquences en acides aminés ci-dessus modifiées par insertion et/ou délétion et/ou substitution d'un ou plusieurs aminoacides, pour autant que les propriétés de 1'ADN polymérase de T. fumicolans qui en résultent ne soient pas significativement modifiées.

L'invention concerne également une séquence d'ADN constituée par ou comprenant la séquence codant pour une ADN polymérase de l'invention.

La séquence d'ADN représenté dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SED ID NO: 1 représente une telle séquence. L'ADN codant pour l'ADN polymérase de T. fumicolans et ses deux intéines est constituée par le nucléotides 357 à 5028. Les nucléotides 1 à 356 correspondent à la région promotrice de ce gène.

En conséquence, l'invention a pour objet une séquence d'ADN constituée par ou comprenant la séquence comprise entre les nucléotides 357 à 5028 de la SED ID NO: 1, ou un fragment de celle-ci ou encore un assemblage de tels fragments. l'invention se rapporte tout particulièrement à une séquence d'ADN constituée par ou comprenant les nucléotides 357 à 1674 et 2755 à 3156 et 4324 à 5028 de la séquence d'ADN représenté dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SED ID NO: 1.

Cette séquence code pour 1'ADN polymérase de T. fumicolans dont la séquence de 774 acides aminés est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SED ID NO: 2.

L'invention concerne autant l'ADN polymérase isolées et purifiées de la souche Thermococcus fumicolans que 1 'ADN polymérase préparées par synthèse chimique, par exemple par ligature de fragments polypeptidiques, ou encore par les méthodes du génie génétique.

Dans le cadre de ces méthodes du génie génétique, l'invention a aussi pour objet un vecteur comprenant une séquence d'ADN définie précédemment, ainsi qu'un procédé de production ou d'expression dans un hôte cellulaire des ADN thermostables de l'invention.

Un procédé de production d'une ADN polymérase conforme à l'invention consiste: - à transférer une séquence d'acide nucléique codant pour l'ADN polymérase ou un vecteur contenant ladite séquence dans un hôte cellulaire, - à cultiver l'hôte cellulaire obtenu à l'étape précédente dans des conditions permettant la production de l'ADN polymérase, - à isoler, par tous moyens appropriés, ladite ADN polymérase.

L'hôte cellulaire mis en oeuvre dans les procédés précédents peut être choisi parmi les procaryotes ou les eucaryotes et notamment parmi les bactéries, les levures, les cellules de mammifères, de plantes ou d'insectes.

Le vecteur utilisé est choisi en fonction de l'hôte dans lequel il sera transféré.

L'ADN polymérase thermostable de l'invention est utile notamment dans les procédés d'amplification enzymatique de séquences d'acides nucléiques. En conséquence, l'invention a pour objet, de tels procédés mettant en oeuvre 1'ADN polymérase thermostable décrite précédemment, ainsi que les kits d'amplification comprenant, outre les réactifs généralement utilisés, une quantité adéquate de cette ADN polymérase.

L'invention a également pour objet une intéine purifiée thermostable d'archaebactéries de l'espèce Thermococcus fumicolans.

Comme indiqué précédemment, les intéines sont aussi définies comme des introns protéiques qui sont non pas épissés au niveau de l'ARN méssager mais au niveau

d'une maturation protéique. Elles relèvent donc d'un seul gène traduit et transcrit en une seule étape, et constituent des sous produits de la maturation de la protéine codée par ce gène (Xu, M.G., Comb, D.G ., Paulus H., Noren C.J., Shao Y., Perler, F.,1994, Protein splicing : an analysis of the branched intermediate and its resolution by succinimidine formation. EMBO J . 13, 5517-5522.) Les intéines sont des endonucléases de restriction qui ont la propriété de couper l'ADN à l'endroit même où s'insère leur gène, et en conséquence, elles peuvent être considérées comme des séquences égoïstes.

Les intéines possèdent dans leur séquence toute l'information nécessaire à leur propre épissage puisqu'elles s'épissent dans E. coli . il est possible de distinguer quatre grandes étapes de maturation protéique - Une première étape de formation d'un intermédiaire linéaire qui possède une fonction ester.

Cette réaction est dépendante du pH et de l'environnement local de cette liaison (nature des acides aminés). Ce principe est utilisé dans les kits de clonage, d'expression ou de purification mettant en oeuvre des intéines, car un changement de l'environnement provoque ou non un épisssage. En effet, celui-ci serait inhibé à pH 11 et activé à pH 7,5.

- Une deuxième étape de transestérification qui permet de transformer l'intermédiaire précédent et de déplacer l'équilibre de la première étape.

- La troisième étape consiste en une cyclisation de l'asparagine libérant l'intéine.

- La quatrième étape est la stabilisation de la protéine mature et la formation d'une réelle liaison peptidique. il est donc possible de construire des mutants thermosensibles permettant de bloquer l'épissage

protéique aux températures d'expression (30°C) et de l'induire par chauffage.

Cette possibilité de contrôle de l'épissage protéique par la température peut-être utilisée dans des vecteurs de clonage avec une séquence codant pour l'intéine et des sites de clonage autour. Si la protéine à cloner et à exprimer est toxique pour l'hôte, on peut la cloner en deux fragments autour de la séquence d'intéine. Ainsi, globalement, le gène à cloner est complet mais il est interrompu par la séquence de l'intéine. Lors de l'expression, l'intéine se retrouve dans la protéine exprimée, la rendant ainsi inactive. il est alors possible par chauffage, à la fin de l'induction, de libérer l'intéine par épissage autocatalytique et ainsi retrouver la protéine clonée active.

Les intéines permettent ainsi de réaliser des purifications et sont utilisés dans des kits selon le principe décrit ci-après. Certains résidus autour de site d'épissage de l'intéine sont modifiés. L'expression de la protéine recombinante est réalisée à basse température pour bloquer un éventuel épissage trop précoce. En C- terminal de l'intéine est fixé un site ayant une forte affinité pour la chitine. Lors de l'induction, la protéine clonée est exprimée ainsi que l'intéine et le site de fixation à la chitine. La purification est alors réalisée avec la chitine, sur des colonnes d'affinité, qui retiennent la chitine et aussi l'intéine et la protéine clonée, le tout faisant partie de la même pré- protéine. On hydrolyse alors l'extrémité N-terminale de l'intéine avec du DTT ou du -mercaptoéthanol pour libérer la protéine clonée.

Les intéines sont aussi des endonucléases de restrictions thermostables, qui ont pour site de reconnaissance l'endroit même où s'insère leur gène dans la séquence "hôte". Elles possèdent une séquence nucléique répétée deux fois (LAGLIDADG) dans la protéine,

séquence plus ou moins conservée et qui correspond au site actif de reconnaissance et de coupure de l'ADN. Ces enzymes semblent aussi avoir besoin de Mg++ pour leur activité. il convient de remarquer que les deux intéines de l'invention sont coexprimées dans E. coli et sont autoépissées. Ce qui signifie qu'elle n'ont pas de toxicité pour l'hôte, à la différence de l'une des intéines de Thermococcus litoralis (9), et en conséquence leur utilisation dans des kits d'expression ou de purification est aisée.

Une première séquence d'intéine selon l'invention est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO:3. Cette intéine, dénommée I-Tfu-l, présente un poids moléculaire de 41 409 Da et un pI de 9,13, déduits de la séquence de 360 acides aminés de la séquence SEQ ID NO:3.

Une seconde séquence d'intéine selon l'invention est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO:4. Cette intéine, dénommée I-Tfu-2, présente un poids moléculaire de 44 765 Da et pI de 9,6, déduits de la séquence de 389 acides aminés de la séquence SEQ ID NO:4.

Comme rappelé précédemment, les intéines thermostables de l'invention sont utiles notamment dans les procédés de restriction d'acides nucléiques et dans la mise au point de vecteurs d'expression permettant de réduire la toxicité de la protéine à exprimer en insérant l'une des deux séquences d'intéines dans la séquence de la protéine à exprimer. Ceci peut se faire sans manipulation de la séquence des intéines si le clonage s'effectue chez E. coil, les techniques d'expression utilisées ayant démontré leur inocuité pour cet organisme hôte. En conséquence, l'invention a pour objet, de tels procédés mettant en oeuvre l'une des deux ou les deux intéines thermostables décrites précédemment, ainsi que les kits d'expression ou de purification contenant l'une

ou les deux séquences codant pour les dites intéines thermos tables.

L'invention concerne également une séquence d'ADN constituée par ou comprenant la séquence codant pour une intéine de l'invention.

Une séquence d'ADN codant pour l'intéine I-Tfu- 1 est comprise entre les nucléotides 1675 et 2754 dans la séquence SED ID NO: 1 en annexe. Cette séquence d'ADN code pour l'intéine dont la séquence en acides aminés est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SED ID NO: 3.

Une séquence d'ADN codant pour l'intéine I-Tfu- 2 est comprise entre les nucléotides 3157 et 4323 dans la séquence SED ID NO: 1 en annexe. Cette séquence d'ADN code pour l'intéine dont la séquence en acides aminés est représentée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SED ID NO: 4.

L'invention concerne autant ces intéines thermos tables isolées et purifiées de la souche Thermococcus fumicolans que des intéines préparées par synthèse chimique, par exemple par ligature de fragments polypeptidiques, ou encore par les méthodes du génie génétique.

Dans le cadre de ces méthodes du génie génétique, l'invention a aussi pour objet un vecteur comprenant une séquence d'ADN définie précédemment, ainsi qu'un procédé de production ou d'expression dans un hôte cellulaire des ADN codant pour les intéines de l'invention. De tels procédés sont identiques à ceux rapportés précédemment pour 1'ADN polymérase de T. fumicolans.

D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaitront à la lecture des exemples qui suivent, donnés à titre non limitatifs et concernant le clonage, l'expression, la caractérisation et l'activité

de l'ADN thermostable de l'invention, et se référant aux dessins annexés dans lesquels - La figure 1 représente l'hybridation ADN-ADN de 1'ADN génomique de T. fumicolans digéré par diverses enzymes de restriction et hybridé avec les sondes GE23ClaI-HindIII et GE23XhoI-SalI.

- La figure 2 représente la stratégie de clonage, la structure du gène de l'ADN polymérase de T. fumiculans et les produits du gène.

- La figure 3 représente les résultats de purification de la polymérase recombinante de T. fumicolans après une colonne d'héparine sépharose, visualisés par SDS-PAGE.

- La figure 4 représente les résultats de purification de la polymérase recombinante de T. fumiculans après une colonne Bleue HTrap n02, visualisé par SDS-PAGE.

- La figure 5 représente les résultats de purification de la polymérase recombinante de T. fumicolans après une colonne de phosphocellulose, visualisés par SDS-PAGE.

- La figure 6 représente les résultats de purification de la polymérase recombinante de T. fumicolans après une colonne MonoQ, visualisés par SDS- PAGE.

- La figure 7 représente les résultats de PCR avec l'ADN polymérase de T. fumicolans avec les fractions d'exclusion de la colonne MonoQ.

I- Matériel et méthodes.

1) Conditions de culture. plasmides et souches utilisées.

Les souches Thermococcus litoralis (DSM 547ru et Pyrococcus furiosus (DSM 3638T) ont été obtenues auprès de la collection du Deutsche Sammlung von Microorganismen (DSM) Braunschweig-Stocheim, Allemagne.

La souche Pyrococcus sp. GE 23 a été isolée de cheminées de sources hydrothermales profondes et a été fournie par G Erauso (CNRS, Station Biologique de Roscoff, France).

La souche Thermococcus fumicolans à été obtenue auprès du laboratoire de Microbiologie Marine de G. Barbier (IFREMER-DRV-VP-CMM) à Brest, France. Cette souche, Thermococcus fumicolans à été obtenue par purification à partir de fragments de cheminées hydrothermales receuillies dans le bassin nord-Fidgien lors de la campagne franco-japonaise STARMER effectuée en 1989 à 2000 mètres de profondeur.

Pyrococcus sp.GE23 a été cultivée à 850C dans un milieu 2216S (DIFCO) à un pH de 6,5.

Thermococcus fumicolans, décrite en 1996 (Godfroy et al.) est cultivée en conditions anaérobies dans un milieu contenant les éléments suivants: peptone 2g/l; extraits de levure 0,5g/l; sel de mer (Sigma) 30g/l; tampon PIPES 6,05g/l, soufre élémentaire lOg/l, rézasurine lmg/l. Le pH est ajusté à 8,5 par de la soude 5N à 200C.

La souche de Escherichia coli SURE (Stratagene, La Jolla, Calif.) a été cultivée dans du milieu LB avec le ou les antibiotiques appropriés, à 370C sous agitation. Cette souche a été utilisée comme hôte pour recevoir les constructions primaires à partir des vecteurs pUC 18 ou pBluescript. Les souches NovaBlue, BL21(DE3) et BL21(DE3)pLysS (Novagen, Madison, Wi.) ont été cultivées dans du milieu 2xYT avec les antibiotiques appropriés à 370C ou 300C. Ces souches ont été utilisées commes hôtes pour les plasmides d'expression.

2) Isolement de l'ADN. hvbridation et ADN recombinants.

L'ADN de haut poids moléculaire de Thermococcus fumicolans a été isolé par la méthode de Charbonnier modifiée (3). Les cellules ont été resuspendues dans un tampon TE-Na 1X, puis lysées à 400C pendant trois heures

avec un mélange de N-Lauryl-sarcosine 1%, dodecyl sulfate de sodium 1% et 0,4 mg/ml de protéinase K. Après la lyse, une centrifugation à 5000g pendant 10 minutes permet d'éliminer les débris cellulaires. L'ADN est extrait par un traitement au Phenol-Chloroforme-alcool Isoamylique ou PCI (25-24-1), puis traité par la RNAse à 5Rg/ml à 600C pendant une heure. Ces étapes sont suivies de deux extractions additionelles par PCI et d'une extraction au chlorophorme. L'ADN est ensuite précipité à l'éthanol absolu à -20°C, puis centrifugé, sèché à l'air et repris dans un tampon TE-lx. La concentration et la pureté de cet ADN sont mesurées par spectrophotométrie à 230, 260 et 280nm avec un appareil GeneQuantII (Pharmacia, Upsalla, Sweden). Pour la construction de la mini-banque génomique en pUC 18 (17), l'ADN a été totalement digéré pendant une nuit à 370C par une série d'enzymes de restriction (BamHI, HindIII, EcoRI, EcoRV, PvuII, SalI, XbaI et XhoT) par simples et doubles digestions. Puis les fragments d'ADN sont fractionnés sur gel d'agarose à 0,8% dans de TBE-1X et transférés sous vide sur une membrane de nylon Hybond-N+ (Amersham, UK). Ces membranes ont été hybridées avec des sondes d'ADN préparées par PCR avec des amorces spécifiques sélectionnées à partir des gènes d'ADN polymérases de P. furiosus, T. litoralis et Pyrococcus sp. GE23. Ces sondes sont préalablement marquées au 32P par n random priming" conformément aux recommandations du fabricant (Megaprime, Amersham, UK).

Deux sondes de P. furiosus ont été utilisées, Pfu et Pfu F, couvrant respectivement les régions délimitées par les paires de bases 8 à 2316 et 819 à 1915 de la section codante du gène de la polymérase comme défini par Uemori et al. (18). Deux sondes de T. litoralis, Tli I et Tli T, couvrant respectivement les régions délimitées par les paires de bases 297 à 1768 et 4631 à 5378, comme défini par Hodges et ai. (9). Deux sondes de Pyrococcus sp GE23 ont été utilisées, l'une contenant la partie 5' du gène (fragment ClaI-HindIII

correspondant aux sites pb 8 et pb 1353 de la section codante) et l'autre contenant la partie terminale de ce même gène obtenu par PCR (amorces dites d'expression NdeI et SalI correspondant aux sites pb -1 et pb 2318, puis digestion par XhoI et SalI comprenant les bases du nO 1879 à 2318). Les fragments positifs ont été identifiés par hybridation ADN-ADN (14). Seules les hybridations avec les sondes de Pyrococcus sp. GE 23 ont fourni des signaux positifs à 550C en moins de 24 h d'exposition.

Les sondes issues de T. litoralis et de P. furiosus n'ont donné aucun résultat, même à 500C dans un tampon standard sans formamide. A partir des hybridations avec les sondes de Pyrococcus sp. GE 23, des fragments HindIII de 1,9 kb ont été sélectionnés, puis préparés par une digestion appropriée de 100lug d'ADN génomique, purifiés dans des sacs de dialyse à partir des gels d'agarose, et précipités à l'éthanol absolu après une extraction au PCI. Les fragments ont été ligaturés dans un pUC 18/HindIII déphosphorylé. Les transformations des souches hôtes ont été réalisées par électroporation (Gene Pulser, Biorad) . Le criblage des clones recombinants a été effectué par sélection à l'ampicilline, alpha- complémentation sur substrat X-Gal-IPTG puis hybridation de colonies selon les techniques standards (12) . La température des hybridations de colonies était de 550C avec les sondes de Pyrococcus sp GE23, dans un tampon standard sans formamide. L'ADN plasmidique a été isolé selon la méthode décrite par Birnboim et Doly (1), puis purifié par chromatographie échangeuse d'anions en phase solide (Quiagen, Chatsworth, Calif.). Les fragments de restriction des plasmides ont été purifiés sur gel d'agarose par la méthode du GeneClean (Bio 101, La Jolla, Calif.) pour un clonage ultérieur.

L'ARNr 16S et 23S de Thermococcus fumicolans a été amplifié par PCR en utilisant les amorces suivantes - amorce directe Aa: 5' TCCGGTTGATCCTGCCGGAA-3' - amorce réverse 23Sa: 5'-CTTTCGGTCGCCCCTACT-3'

- étape initiale 3 minutes à 940C suivi de 30 cycles ( 9 4 OC , lmin/ 490C, lmn/ 720C, 2mn) et, élongation finale de 5 mn à 720C.

Le produit de PCR a été cloné dans le vecteur pUC18 pour séquençage ultérieur.

3) Sécuencacre des ADN.

Les séquences d'ADN ont été obtenues par la méthode de terminaison de chaine (13) en utilisant un système d'analyses automatique d'ADN Applied Biosystems.

Les deux brins des gènes codant pour l'ADN polymérase et les deux intéines ont été séquencés en utilisant des amorces universelles localisées sur des vecteurs ainsi que des amorces internes.

La séquence d'ADNr 16S a été réalisée sur les deux brins, après clonage (SureClone, Pharmacia, Uppsala, Sweeden), en utilisant le kit Hot-Tub (Amersham, UK.) afin de lever les compressions.

L'analyse de séquence a été réalisée avec le logiciel DNASTAR (Madison, Wis., USA) et le programme de Genetic Computer Group (University of Wisconsin Biotechnology Center, Wis., USA) accessible en ligne sur INFOBIOGEN. Les recherches informatisées de similitude ont été réalisées avec le programme BLAST, les alignements multiples avec CLUSTAL V, et les arbres phylogénétiques ont été établis selon la méthode dite de "Neighbour-joining" (11).

4) Construction du recombinant exprimant 1'ADN solvmérase de Thermococcus fumicolans.

L'ADN polymérase de Thermococcus fumicolans ainsi que ses deux intéines, ont été exprimées en même temps chez E. coli avec le vecteur d'expression PARHS2 qui appartient à la famille des systèmes d'expression T7 (16) acquis auprès d'Eurogentec.

La PCR a été utilisée pour préparer le fragment complet de 1ADN polymérase et des deux intéines en

utilisant des amorces contenant les sites de restriction NdeI et BamHI : - amorce Tfu Dir 5'-TGG GGA TCC ATA TGA TCC TCC ATA CAG ACT ACA TC-3' - amorce Tfu Rev 5'-AAG CTT GGA TCC TCA TTT CTT CCC CAT TTT GAG CC-3' Le mélange réactionnel contenait 1'ADN polymérase GOLDSTAR (Eurogentec, B), l'enzyme Taq Extender (contenant la Pfu de Stratagene) le tampon d'extension avec les quatre dNTP (chacun à 0,2mM) et les amorces Tfu Dir et Tfu Rev à 50 pmoles dans un volume de 50ul final. L'amplification a été effectuée sur 20 cycles 1 mn 940C, 1 mn à 540C et 6 mn à 720C en utilisant un thermocycleur Stratagene 96-gradient. Les fragments de PCR ont ensuite été digérés par les enzymes NdeI et BamHI puis ligaturés aux mêmes sites du vecteur, rétablissant ainsi le codon d'initiation. La construction ainsi obtenue a été nommée PARHS2TFU1. Cette construction a été séquencée aux sites de jonction afin de vérifier son intégrité par rapport à la séquence de l'ADN génomique.

Les tests d'expression ont été réalisés selon le protocole suivant: sélection des clones recombinants dans la souche E. coli Novablue, expression avec la souche BL21(DE3)pLysS dans un milieu 2xYT et induction de quatre heures à lmM d'IPTG.

Les premiers essais d'induction ont été réalisés sur des cultures de 5 ml, induites ou non. Des précultures de nuit sont réalisées sans inducteur et relancées dans un milieu frais le matin (au dizième), jusqu'à ce que la densité optique (mesurée à 600nm) soit de 0,6, puis soit induites pendant 4 heures, soit non induites et arrêtées au bout de 2, 4 ou 14 heures. Quatre ml de cultures sont alors centrifugés à 40C, 5000rpm pendant 10 minutes. Le culot est ensuite repris dans un tampon de lyse (Tris-HCl 10mM pH 7,5; NaCl l0mM, MgCl2 2 mM). Les cellules ainsi reprises sont alors lysées, soit avec du triton X-100 1% v/v, soit du lysozyme à lmg/ml de

lyse et laissées sur glace environ 5 à 10 min. Les cellules sont ensuite thermodénaturées par une exposition de 20 min à 720C. Ceci permet de détruire en grande partie les cellules de l'hôte mésophile sans détruire les protéines recombinantes. Le produit de lyse est ensuite centrifugé 20 min à 10 000rpm à 40C. Le surnageant est récupéré afin de le tester en incorporation, en PCR ou sur gel. Les incorporations sont réalisées suivant deux techniques - Avec de la thymidine tritiée comme traceur.

L'incorporation est réalisée sur du thymus de veau activé (SIGMA Aldrich, F) dans le milieu de réaction suivant: Tris-HCl 50mM pH 8,8 ; DTT lmM ; MgC12 10mM ; KCl 10mM BSA 0,4 mg/ml; chaque dNTP à 0,4 mM.

- Avec du 32P -dATP (Amersham) comme traceur.

L'incorporation est réalisée sur de l'ADN thymus de veau activé (Appligene) dans le milieu de réaction suivant: Tris-HCl pH 9 50mM; KCl 50mM; MgCl2 7mM; BSA 0,2mg/ml et (NH4+>SO4 (filtré) 16mM, avec un mélange des 4 dNTP à 500uM final chacun. Cette seconde méthode permet d'estimer avec précision le nombre d'unités d'enzyme.

5) Purification. a) Culture.

Après des essais en petits volumes, les cultures destinées à l'expression de l'enzyme recombinante ont été réalisées comme suit: production d'un inoculum de 700 ml (milieu 2x YT complémenté en ampicilline et chloramphénicol) cultivé à 300C jusqu'à DO = 0,8; ensemencement d'un fermenteur contenant 16 1 du même milieu; culture pendant 4 h jusqu'à DO= 0,6, puis induction à l'iPTG 1 mM et culture pendant 4 h. La biomasse résultante est centrifugée 20 mn à 6 000 rpm à 40C (Centrifugeuse JOUAN).

b) Lvse cellulaire et première étate de surification.

20 g de biomasse sont repris dans 80 ml de tampon (20 mM Tris-Cl pH 7,5; 10 mM NaCl; 2 mM MgCl2; 1 mM EGTA; 1% Triton x100; 2,2 mM PMSF) . Le mélange résultant, maintenu à 40C maximum, est soniqué à 12 reprises successives (cycle de 15 s) jusqu'à obtention d'une solution liquide. Le surnageant est ensuite centrifugé 20 mn à 40C à 20 000 rpm (SORVALL Ti45). Le surnageant est récupéré et traité par la chaleur (700C pendant 10 mn) afin de thermodénaturer l'essentiel des protéines natives de E. coil, puis centrifugé à nouveau. c) Chromatoarathie.

Les 70 ml de surnageant issus de l'étape précédente sont chargés sur une colonne Pharmacia Héparine Sépharose (30 ml de résine), après équilibration avec un tampon A (10 mM Tris-Cl pH 7,5; 0,5 mM EGTA; 5 mM MgCl2; 10 mM -mercaptoéthanol; 0,2% Triton x100 et 10% glycérol. Un lavage est effectué avec un tampon B (idem tampon A + 2 M NaCl) à raison de 0,3 ml/mn sur un système FPLC Pharmacia. Les différentes fractions sont récupérées en gradient de NaCl.

Les fractions actives ainsi récupérées sont dialysées pendant 5 h contre un tampon C: 10 mM Tris-Cl pH 7,5; 0,5 mM EGTA; 5 mM MgCl2; 10 mM -mercaptoéthanol; 0,2% Triton x100; 10% glycérol; 50 mM NaCl. Les produits issus de dialyse sont successivement chargés sur une colonne d'affinité pour les protéines se liant à l'ADN (Pharmacia, Bleue HiTrap) et élués en gradient de NaCl avec les mêmes tampons que précédemment.

30ml de fractions actives obtenues précédemment sont chargées sur une colonne de phosphocellulose avec de la résine P11 de Whatmann ( volume:20ml; diamètre: 2,5cm). Ces fractions ont été dialysées 5 heures contre le tampon suivant : KPO4 pH7 20mM, EDTA 0,1mM, DTT lmM, Glycérol 5%, Triton X-100 0,1% et KCl 0,1M. Le débit de

la colonne est réglé à 0,2ml/min, le tampon A de chargement est composé de KPO4 pH7 20mM, EDTA 0,lmM, DTT lmM, Glycérol 5%, Triton X-100 0,1% et le gradient (entre 0% et 50% deB) est réalisé par le KCl présent dans tampon B à 2M.

Ayant déjà mis en évidence que cette polymérase ne se fixe pas sur une MonoQ ou une ressource Q et ce, quel que soit le pH utilisé, nous avons essayé de la récupérer en exclusion en faisant l'hypothèse d'une fixation de l'ADN contaminant par la colonne.

Tout d'abord un essai a été réalisé en sortie de la deuxième Bleue HiTrap avec un aliquot de 5ml et dialysé selon la même méthode que pour un passage sur une Bleue HiTrap.

Une deuxième tentative a été réalisée après la phosphocellulose et après deux dialyses des fractions les plus actives 45, 46 et 49. Les fractions sont tout d'abord chauffées 40 min à 850C. Une première dialyse est alors réalisée contre le tampon KCl 0,1mM, K2HPO4 1M pH7,5 pendant 3 heures. La deuxième dialyse est réalisée avec le tampon suivant : K2HPO4 pH 7,5 10mM, K2PO4 10mM, KCl 25rem, DTT lmM, Triton X-100 0,1%, Glycérol 10%, pendant 1 heure. La solution est alors chargée sur une colonne MonoQ à 0,5min avec un gradient en NaCl de 0 à 20% (tampons utilisés pour l'Héparine).

6) Activités exonucléasioues.

Les tests d'exonuclease 3'-5' sont quantifiés par la libération de nucléotides marqués au32P A cette fin, une première étape permet de réaliser le marquage: l'ADN de est digéré par HindIII puis, le fragment de Klenow recopie l'ADN à partir des extrémités 3'-OH libres , dans un milieu contenant outre le tampon, 1'ADN et l'enzyme, du 32P dATP et du 32P dTTP, les dGTPet dCTP étant froids. Après une heure à 370C, les quatre dNTP froids sont rajoutés en excès pour une demi-

heure. La Klenow et les dNTP sont éliminés par une extraction au phénol et précipités à l'éthanol.

Les tests exonucléasiques sont effectués dans des solutions contenant les tampons des enzymes, 0,02mg/ml d'ADN marqué, et incubées toute la nuit à 720C, 800C et 950C. Différents tampons contenant du MgCl2 ou du MnSO4 sont testés. Le même test est réalisé avec la Vent en témoin positif. 101 de solution de réaction sont alors déposés sur papier DE81 (Watmann), séchés puis comptés avant et après lavage (3 fois 5 min avec du Na2HPO4, 1 fois à l'eau puis à l'éthanol à 95%) en utilisant la technique de Cerenkov.

Pour le test d'actvité exonucléasique 5'-3', la réaction de marquage utilise la polynucléotide kinase afin de marquer le substrat en 5'.

II - Résultats.

1) Isolement du aène de 1'ADN nolymérase de Thermococcus fumicolans ainsi pue des deux aènes d'intéines.

L'ADN de Thermococcus fumicolans, digéré par une série d'enzymes de restriction, a été hybridé à des sondes de P. furiosus et T. litoralis, préparées par PCR et aux sondes de Pyrococcus sp. GE23 obtenues lors du clonage de cette autre ADN polymérase (Dépôt de brevet n096 08631 auprès de 1'INPI). Comme montré dans les figures la et lb, l'hybridation de type Southern blot a révélé des fragments de deux types : un fragment HindIII- HindIII de 1,9 kb et un fragment Xhoi-Xhoi de 5 kb. Ces deux fragments ont été révélés uniquement avec la sonde Clai-Hindili du gène de Pyrococcus sp. GE23, marquée au 32p avec une exposition de deux heures. Les deux fragments repérés ont ensuite été récupérés et purifiés comme décrit précédemment dans Matériel et Méthodes puis clonés dans le vecteur pUC18 déphosphorylé et digéré par HindIII ou dans le vecteur pBluescript déphosphorylé et

digéré par XhoI. Environ 400 recombinants (E. Coli SURE) ont été criblés avec la sonde ClaI-HindIII. Sur ces 400 colonies, deux ont donné un signal positif lors de l'hybridation. (nO 9.26 et 12.79). Les deux clones ont été mis en culture en milieu LB-Amp et leurs profils de restriction étaient identiques, avec un insert de 1,8 kb.

Le séquençage ultérieur de l'un de ces clones (désigné 557MACa) et la comparaison de séquence (Megalign, programme DNASTAR) ont montré qu'il correspond à la région promotrice et aux 1404 premières paires de base d'un gène d'une ADN polymérase appartenant à la famille B (2).

En ce qui concerne le fragment XhoI-XhoI de 5 kb, 700 recombinants ont été criblés sans aucun signal positif lors de l'hybridation. Cette absence de réussite pourrait être due à la présence d'une intéine au sein de ce fragment, le rendant alors instable dans un vecteur à haut nombre de copies de type pBluescript.

Après 12 heures d'exposition, un deuxième fragment HindIII-HindIII de 2 kb a été repéré par hybridation de type Southern sur la même membrane que précédemment, en utilisant comme sonde marquée la fin du gène de Pyrococcus sp. GE23 entre les sites XhoI et SalI (fragment obtenu par digestion de produit de PCR). Ce fragment a été cloné comme précédemment. Environ 200 clones recombinants ont été criblés et quatre d'entre eux ont donné un signal positif. Les quatres clones ont un profil identique après digestion par l'enzyme de restriction HindIII. L'un d'entre eux, 557MACc, a été séquencé et la comparaison de séquence a démontré qu'il s'agissait de la fin du gène de 1'ADN polymérase précédemment identifiée.

Supposant que les fragments de gènes obtenus appartenaient à la même ADN polymérase, des oligonucléotides ont été utilisés afin d'amplifier la zone manquante. Ce fragment de PCR a ensuite été purifié sur gel comme décrit dans Matériel et Méthodes, et

utilisé comme sonde marquée radioactivement pour repérer sur la membrane le fragment manquant. Après deux heures de révélation un fragment HindIII-HindIII a été révélé, de 2 kb environ. Cloné comme précédemment, 600 colonies ont alors été criblées, donnant quatre clones positifs.

Les quatre clones avaient le même profil et l'un d'entre eux, nommé 557MACb a été séquencé et les comparaisons de séquences ont démontré qu'il s'agit de la partie intermédiaire de 1'ADN polymérase et ce fragment, délimité par deux sites HindIII, s'insère parfaitement entre 557MACa et 557MACc. L'ensemble de ces trois clones donne la séquence complète de l'ADN polymérase de T. fumicolans.

2) Position thvlocénétioue de Thermococcus fumicolans Thermococcus fumicolans est une nouvelle espèce de Thermococcales décrite par Godfroy et al (8).

3) Séauences nucléotidicues et colynentidiaues de 1'ADN solvmérase de Thermococcus fumicolans. a) Séouences nucléotidicues Les trois fragments délimités par des sites HindIII ont été assemblés (figures 2 et 3). Ils forment à eux trois un fragment de 5039 paires de bases. Le premier fragment, issu du clone 557MACa, contient le codon de départ ATG en position 457 pb. La phase ouverte de lecture est alors ininterrompue sur 4572 paires de bases jusqu'à rencontrer un codon STOP sur le fragment issu du clone 557MACc en position 5028 pb, six paires de bases avant le dernier site HindIII. Par alignement, avec les autres gènes d'ADN polymérases disponibles en banques (Pfu, Tli, GB-D, KOD, .), avec la méthode CLUSTAL V, complétée par un alignement manuel final nécessaire pour restituer les sites d'autoépissage des intéines, deux séquences d'insertions ont été mises en évidence.

- La première est insérée à la paire de base nO 1675 et se termine à 2754, étant ainsi répartie entre le fragment issu du clone 557MACa et celui du clone 557MACb.

- La deuxième est insérée à la base nO 3157 et se termine à 4323. Elle est, de même, répartie entre le clone 557MACb et 557MACc.

Ces deux séquences d'insertions forment, avec le reste de la séquence codant pour l'ADN polymérase, un seul cadre de lecture. b) Séquences polvsentidioues.

La section codante du gène de 1'ADN polymérase est donc constituée de trois parties disjointes. La première partie du gène, portée par 557MACa, comporte la zone codant pour l'exonucléase 3'- 5', où après traduction, on reconnait le motif FDIET. La deuxième partie, portée par 557MACb et la troisième partie portée par 557MACc comprennent les sites conservés SLYPSI, et YG.DTD.

Les deux séquences d'insertion sont situées sur des zones conservées de l'ADN polymérase, la première au site DFR/SLYPSII comme I-KOD-1 de Pyrococcus sp. KOD1 et la deuxième au site D/TDG comme I-Tli-l de T. litoralis. Ces deux protéines sont libérées par autoépissage protéique. Elles comportent les sites de type LAGLIDADG répétés deux fois à 100 paires de bases de distance environ. Les alignements avec les autres intéines déposées dans les banques de séquences permettent de les assimiler à des endonucléases de restriction de type archaebactérien, endonucléases qui coupent 1'ADN à l'endroit précis où leur gène s'insère. c) Comnaraison avec les autres séquences d'ADN solvmérases.

L'alignement des différentes séquences polypeptidiques des ADN polymérases de Thermococcales disponibles en banque, P. abyssi strain GE5, Pyrococcus

sp. GE23, Pyrococcus sp. KOD1, Pyrococcus sp. GB-D, P. furiosus, Pyrococcus sp 90N, T. litoralis avec la séquence de T. fumicolans (sans intéines) , réalisé avec le programme CLUSTAL utilisant la matrice PAM250, donne les niveaux de similarité entre ces diverses polymérases figurant au tableau 1 ci-dessous.

Tableau 1 Espèce 1 2 3 4 5 6 7 8 i - T. fumicolans xxx 81,7 89,3 77,6 77,3 80,0 79,3 90,6 2 - P. ss. GB-D xxx 81,3 85,1 76,9 89,0 88,1 82,6 3 - P. sp. KOD1 xxx 78,8 77,5 80,7 79,9 90,3 4 - P. furiosus xxx 73,9 83,3 82,5 79,6 5 - T. litoralis xxx 75,9 75,0 76,5 6 - P. sp. GE23 xxx 98,7 80,9 7 - P. abyssi xxx 80,2 8 - P. s . 90N xxx Le niveau de similarité le plus proche est celui observé avec Pyrococcus sp. 90N (90,6%), ce qui indique clairement que l'ADN polymérase de T. fumicolans est originale au niveau de sa séquence et constitue de ce fait une nouvelle ADN polymérase. d) Comparaison des intéines avec les autres intéines disponibles dans les banales.

Les séquences disponibles en banque ont été alignées selon les mêmes méthodes que précédemment. Les comparaisons de l'ensemble des intéines démontrent que celles-ci sont réparties en trois groupes correspondant aux sites d'insertion des motifs A (R/SLYPSI), B (KILAN/S) et C (D/TDG). L'analyse des niveaux de similarité et la recherche de relations phylogénétiques n'ont de sens que pour des intéines appartenant à la même classe, c'est à dire s'insérant dans un motif donné. Les niveaux de similarités pour I-Tfu-1 (classe A) et I-Tfu-2 (classe C) avec leurs intéines homologues déjà décrites sont donnés respectivement aux tableaux 2 et 3 ci- dessous.

Tableau 2

1 2 3 1 ( I-Tfu-l xxx 41, 4 75,3 2 I-Mja-l xxx 51,7 3 I-KOD-1 xxx Tableau 3 2 1 | I-Tfu-l xxx | 62,2 2 I-I-Tfli-2 xxx I-Tfu-l et I-Tfu-2 semblent représenter deux nouveaux "allèles" des "homing" endonucléases archaebactériennes des classes A et C.

I-Tfu-1 est le troisième allèle connu d'intéine s'insérant au site A des ADN polymérase d'Archaea, tandis que I-Tfu-2 est le second de sa classe.

5) ExDression,caractérisation et activité de 1'ADN colvmérase de T. fumicolans. a) Clonaae et exoression.

Un insert de 4595 pb obtenu par PCR longue- distance avec les amorces TfuDir et TfuRev et couvrant la totalité du gène de 1'ADN polymérase de Thermococcus fumicolans, avec les deux intéines, a été cloné aux sites NdeI et BamHI d'un vecteur pour transformer la souche E. coli Novablue. Des mini-préparations d'ADN plasmidique ont été réalisées sur une dizaine de clones transformants et ont toutes donné un signal positif à l'hybridation.

Deux clones ont été retenus sur la base de leur profil après une digestion par NdeI et SalI ou par HindIII. Ces deux plasmides ont ensuite été transformés dans la souche E. coli BL21(DE3)pLysS.

Des essais d'expression ont été réalisés en culture de 5 ml afin de déterminer les conditions optimales de culture et d'induction. Tout d'abord les essais de cultures ont été réalisés à 370C, où l'on observe une lyse cellulaire trop importante, puis à 300C où la culture ne lyse pratiquement pas. La culture est

réalisée en milieu 2xYT, où le rendement de production est meilleur et la lyse réduite, supplémenté avec de l'ampicilline (lOORg/ml) et du chloramphenicol (15RgJml).

L'expression est alors induite en phase exponentielle de croissance (D0600nm = 0,6 à 0,7) avec une concentration en IPTG de lmM, concentration qui s'est avérée optimale.

Des échantillons sont prélevés avant induction puis 2 heures, 4 heures et 6 heures après induction, ainsi qu'après une nuit. Des prélèvemments sont aussi réalisés sur les cultures non induites après 6, 8, 12 et 24 heures de culture.

Les échantillons sont alors traités comme indiqué au chapitre Matériel et Methodes, afin de tester le niveau d'activité de 1'ADN polymérase recombinante par incorporation de thymidine tritiée ou de 32P dCTP. Cette première technique, qui permet une approche qualitative, nous donne deux types de comportement. Un des clones est non inductible et la meilleure activité est obtenue après une nuit de culture (clone rTful-l). Un second clone est inductible et présente une activité maximale après quatre heures d'induction, activité qui diminue par la suite (clone rTfu100-2). Deux autres clones, aussi testés sont faiblement inductibles et expriment très peu l'ADN polymérase.

Les clones rTful-l et rTful00-2 sont ensuite testés en erlenmeyer de 50 ml dans les conditions décrites précédemment. Seul le clone inductible rTful00-2 a une expression constante en volume de 50 ml. La suite des travaux a donc été réalisée sur ce clone. b) Fermentation et extraction des cellules.

La culture du clone Tfu100-2 à été réalisée dans un fermenteur de 16 litres, dans le milieu 2xYT supplémenté en ampicilline et chloramphénicol. La préculture, de 750ml a été réalisée la veille et arrêtée en phase exponentielle (DO 600nm= 0,7-0,8) et laissée à 40C pour la nuit. Le fermenteur a été préparé et mis en

température à 300C avec le milieu de culture. La préculture a été remise à 300C une heure avant son transfert dans le fermenteur. Le volume final de culture est de 15 litres. Les conditions sont les suivantes: température = 300C ; agitation = 300 rpm. L'induction avec 1 mM d'IPTG a été réalisée à DO 600 = 0,58. Le pH de la culture a été régulé à 7 pendant la phase d'acidification puis laissé libre lors de la phase alcaline. Les bactéries ont été prélevées après quatre heures d'induction, alors que le pH était de 8,3. La culture a ensuite été centrifugée puis les cellules ont été divisées en trois lots. L'un d'eux, 20 g de pâte, a été repris dans 80 ml de tampon de lyse pour un traitement ultérieur indiqué au chapitre Matériel et méthodes. c) Purification de l'ADN solvmérase de T. fumicolans.

La purification a été effectuée comme indiqué précédemment (Matériel et Méthodes). . Pour la colonne Héparine -Sépharose, un gradient de 3 à 50% de tampon B, correspondant aux volume 365 ml à 1363 ml, permet de récupérer 73 fractions de 6 ml. Le pic d'activité de la polymérase est obtenu pour une valeur de gradient de 0,5 M environ, et correspond aux fractions 55/56 (dosées à 10 et 12 unités respectivement) comme indiqué à la figure 7. Ces fractions, incubées à 370C pendant la nuit en présence d'ADN de pBR322, dégradent 1'ADN et présentent en conséquence des traces de nucléase de l'hôte, non visibles sur gel. Leur élimination, ou tout au moins une réduction substancielle de leur concentration a été réalisée par un passage sur colonne d'affinité (Bleue Hitrap).

Les fractions 54 à 60, regroupées et dialysées, sont chargées à raison de 0,25 ml/mn. L'élution permet de récupérer 65 fractions de 5 ml avec des pics d'activité pour les fractions 36 à 56. Le dosage de

l'activité fait apparaître une concentration de 3 à 5 unités pour les fractions 36 à 40. Ces fractions, mises en présence d'ADN à 370C, préssentent une faible activité nucléasique.

Néanmoins, l'activité sur le plasmide pBR322 à 370C toute la nuit montre une nette amélioration de la pureté de l'enzyme. Une deuxième colonne Bleue HiTrap a été réutilisée en prenant les fractions 36 à 44 et dialysées comme précédemment. 25ml sur les 3Oml de fraction ont été injectés sur la colonne avec un débit de 0,25ml/min (5 ml étant gardés pour essayer une MonoQ).

Après cette deuxième colonne Bleue HiTrap, l'activité sur le plasmide pBR322 fermé et incubé toute la nuit avec des fractions de la colonne, est nulle. L'incubation d'une heure à 720C de fractions avec l'ADN de Lambda digéré par HindIII montre une très nette dégradation, mettant en évidence l'activité exonucléase 3'-5' associée à notre ADN polymérase. Le pic d'activité se situe entre les fractions 27 et 32. L'ADN polymérase plus pure est donc sortie plus tôt sur le gradient de NaCl. Sur les fractions les plus actives, un comptage a été réalisé donnant une activité supérieure à 5U/ul pour les fractions 29, 30 et 31. La figure 4 montre le résultat sur gel SDS-PAGE. Suite à ces trois colonnes, la pureté de la polymérase est nettement améliorée. Néanmoins, il reste des traces d'ADN de E. coii fixé à la polymérase et mises en évidence par PCR. Deux colonnes supplémentaires vont donc être mis en oeuvre. 30ml de fractions actives obtenues précédemment sont chargées sur une colonne de phosphocellulose (celle-ci devrait fixer différemment 1'ADN et la polymérase). L'activité de la polymérase est repérée par son activité exonucléasique 3'-5' elevée à 720C sur 1'ADN de Lambda digéré par HindIII. L'activité la plus forte se situe entre les fractions 40 et 49 avec un pic net en 46 et 47. Sur ces fractions 40 à 49 l'ADN de pBR322 est intact après une nuit à 370C. La figure 5 nous montre les résultats sur gel avec des activités

mesurées de 6U/ul pour la fraction 46, 4,5U/ul pour la 47 et 3U/pl pour la 48. Néanmoins il reste encore des traces d'ADN de E. coli.

Ayant déjà mis en évidence que cette polymérase ne se fixe pas sur une MonoQ ou une ressource Q et ce quel que soit le pH utilisé, nous avons essayé de la récupérer en exclusion en espérant une fixation de l'ADN contaminant par la colonne.

Tout d'abord un essai a été réalisé en sortie de la deuxième Bleue HiTrap avec 5ml dialysés Les résultats ont été décevants, les fractions d'exclusion étant peu actives en incorporation.

Une deuxième tentative a été réalisée après la phosphocellulose et après deux dialyses des fractions les plus actives 45, 46 et 49. Les fractions sont tout d'abord chauffées 40 min à 850C en raison d'une détection de contaminant dégradant le pBR322 à 720C en une nuit.

Aucune floculation n'est alors visible et l'extrait est mis sur glace. Un nouveau test démontre que la contamination semble réduite. Après les dialyses et le passage sur colonne, l'activité exonucléasique est mise en évidence sur les fractions d'exclusion 3 à 7.

L'activité est dosée à 2U/ul et l'enzyme est visualisée sur la figure 10. Suite a cette dernière étape de purification, nous avons obtenu des résultats positifs en PCR et comparables à ceux obtenus pour la Vent. d) Caractérisation des activité des fractions purifiées.

L'activité de l'ADN polymérase des différentes fractions a été dosée par incorporation au 32P dATP selon le protocole décrit en Matériel et Méthodes.

- Amtlification de gènes in vitro.

Un fragment de 459 pb a été amplifié à partir d'un ADN génomique d'Archaebactérie (Thermococcus sp. GE

8) avec des amorces spécifiques. Différents tampons ont été utilisés: - tampon lOx R: Tris HCl pH 8,8: 300mM; KCl: 500mM; MgC12: 30mM; Tween 20: 0,1% - tampon lOx H: Tris HCl: pH 8,8: 300 mM; KC1: 500mM; MgC12: 15mM; Tween 20: 0,1% - tampon lOx T: Tris HCl pH 8,8: 600mM; KCl: 500mM; MgCl2: 15mM; Tween 20: 0,1% - tampon lOx S: Tris Hcl pH 8,8: 200mM; KCl: 250mM; MgCl2: 20mM; Tween 20: 0,1% Trente cycles ont été réalisés, chacun comprenant une étape de dénaturation à 940C pendant 30 sec., une étape d'hybridation des amorces à 510C pendant 1 min. puis une étape d'élongation à 720C pendant 2 min.

La figure 8 présente les résultats obtenus avec un volume réactionnel de 50 41 pour des quantités d'ADN polymérase de Thermococcus fumicolans de 2,7 unités. En l'état actuel, les meilleurs résultats avec la Tfu sont obtenus avec le tampon R.

La figure 9 représente les résultats de l'amplification d'un fragment de 1,6 kb avec la Tfu purifiée sur colonnes d'héparine puis de séphacryl-bleue, et un tampon réactionnel lOx ayant la composition suivante: Tris HCl pH 8,8: 200mM; KC1: 100mM; (NH4)2S04: 100mM; MgS04: 20mM; Triton X-100: 1.

- Activité exonucléasiaue.

Les tests d'activité, selon le protocole détaillé en Matériels et Méthodes, ne révèlent pas d'activité exonucléasique 5'-3' chez la Tfu. Ceci est en conformité avec la structure de l'enzyme déduite de l'analyse de la séquence polypeptidique qui ne fait pas apparaître de domaine fonctionnel exonucléase 5'-3', contrairement à ce qui est observé pour DNA poli de E. coli et la Taq.

Les tests d'activité, selon le protocole détaillé au chapitre Matériels et Méthodes, font

apparaître une activité exonucléasique 3'-5' (activité proof-reading ou de correction d'erreurs) chez la Tfu, à un niveau sensiblement égal à celui de la Vent comme montré dans le tableau 4 ci-dessous. Le tableau 4 rapporte la mesure de l'actvité exonucléasique 3'-5' de la Tfu en fonction de la concentration en dNTP, et en comparaison avec la Vent.

Tableau 4 Conc. dNTP Tfu Témoin + Témoin - (mM) (Vent ) (Pab exo-) 0 30 000 25 000 100 000 0,1 40 000 0,2 40 000 56 000 0,3 40 000 58 000 0,4 40 000 70 000 0,5 0,75 40 000 84 000 1 90 000 106 000 ~ 100 000 Ces résultats sont en conformité avec la structure de l'enzyme déduite de l'analyse de la séquence polypeptidique qui révèle la présence d'un domaine exonucléasique 3'-5' en position N-terminale, ainsi que la présence des motifs catalytiques caractéristiques de ce domaine. La Tfu est sensible à une concentration de l'ordre de 0,8 mM de dNTP, tandis que la Vent manifeste une sensibilité dès 0,5 mM. Cette activité est connue pour améliorer in vitro la fidélité des polymérases utilisées en PCR.

En outre, cette activité exonucléasique est confirmée par un test plus simple. Les fractions purifiées, dépourvues d'activité nucléasique à 370C, mises en présence d'ADN de digéré par HindIII puis exposé à 720C pendant la nuit, dégradent complètement cet ADN, mettant ainsi en évidence la présence de l'activité 3'-5' exonucléase de la Tfu ainsi que sa thermostabilité.

- Thermostabilité.

La thermostabilité mesurée selon le protocole décrit précédemment (Matériel et Méthodes), ou mieux, l'activité résiduelle en incorporation à 720C après exposition de l'enzyme à des températures élevées pendant des temps variables, est donnée dans le tableau 5 ci- dessous.

Tableau 5 Température Demi-vie Activité exo (OC) polymérase après 3h 92 92 100% 95 4 h 100 2 h Cette thermostabilité, inférieure à celle des polymérases issues d'organismes plus hyperthermophiles tels que les Pyrococcus, n'en demeure pas moins très largement supérieure à celles des polymérases issues des Thermus et en particulier toutes les Taq. La thermostabilité de l'enzyme recombinante purifiée, tant pour le domaine polymérase que pour l'exonucléase, est de toute manière très largement supérieure à tous les besoins connus en PCR.

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES.

1. Birnboim, H. C., and J. Doly. 1979. A rapid extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Research. 7:1503.

2. Braithwaite, D. K., and J. Ito. 1993.

Compilation, alignment, and phylogenetic relationships of DNA polymerases. Nucleic Acids Research. 21(4):787-802.

3. Charbonnier, F. 1993. Paris Sud.

4. Chong, S. R., Y. Shao, H. Paulus, J. Benner, F. B. Perler, and M. Q. Xu. 1996. Protein splicing involving the Saccharomyces cerevisiae VMA intein - The steps in the splicing pathway, side reactions leading to protein cleavage, and establishment of an in vitro splicing system. Journal of Biological Chemistry.

271(36):22159-22168.

5. Davis, E. O., S. G. Sedgwick, and J.

Coîston. 1991. Novel structure of Mycobacterluin tuberculosis implies processing of the gene product.

Journal of Bacteriology. 173(18):5653-5662.

6. Davis, E. O., S. G. Sedgwick, and M. J.

Colston. 1991. Novel structure of the recA locus of Mycobacterium tuberculosis implies processing of the gene product. Journal of Bacteriology. 173(18):5653-5662.

7. Fsihi, H., V. Vincent, and S. T. Cole. 1996.

Homing events in the gyrA gene of some mycobacteria.

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93(8):3410-3415.

8. Godfroy, A., J. R. Meunier, J. Guézennec, F.

Lesongeur, G. Raguénès, A. Rimbault, and G. Barbier.

1996. Thermococcus fumicolans sp. nov., a new hyperthermophilic archaeon isolated from a deep-sea hydrothermal vent in the North Fiji Basin. International Journal of Systematic Bacteriology. 46(4):1113-1119.

9. Hodges, R. A., F. B. Perler, C. J. Noren, and W. E. Jack. 1992. Protein Splicing Removes

Intervening Sequences in an Archaea DNA Polymerase.

Nucleic Acids Res. 20(23):6153-6157.

10. Kong, H. M., R. B: Kucera, and W. E.

Jack. 1993. Characterization of a DNA Polymerase from the Hyperthermophile Archaea Thermococcus litoralis - Vent DNA Polymerase, Steady State Kinetics, Thermal Stability, Processivity, Strand Displacement, and Exonuclease Activities. J Biol Chem. 268(3):1965-1975.

11. Saitou, N., and M. Nei. 1987. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol. Biol. Evol. 4(4):406-425.

12. Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T.

Maniatis. 1989. Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor.

13. Sanger, F., S. Nicklen, and A. R.

Coulson. 1977. DNA sequencing with chain terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 74:5467-5473.

14. Southern, E. M. 1975. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. Journal of molecular biology. 98:503.

15. Southworth, M. W., H. Kong, R. B.

Kucera, J. Ware, H. W. Jannasch, and F. B. Perler. 1996.

Cloning of thermos table DNA polymerases from hyperthermophilic marine Archaea with emphasis on Thermococcus sp. 90N-7 and mutations affecting 3'-5' exonuclease activity. Proc. Ntl. Acad. Sci. USA. 93:5281- 5285.

16. Studier, F. W., A. H. Rosenberg, F. J.

Dunn, and J. W. Dubendorff. 1990. Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes. Methods Enzymol. 185:60-89.

17. Sutherîand, K. J., C. M. Henneke, P.

Towner, and D. W. Hough. 1990. Citrate synthase from the thermophilic archaebacterium Thermoplasma acidophilum.

Cloning and sequencing of the gene. European Journal of Biochemistry. 194:839-844.

18. Uemori, T., Y. Ishino, H. Toh, K.

Asada, and I. Kato. 1993. Organization and nucleotide sequence of the DNA polymerase gene from the archaeon Pyrococcus furiosus. Nucleic Acids Research. 21(2):259- 265.

LISTE DE SÉQUENCES (1) INFORMATION GÉNÉRALES (i) DEPOSANT . APPLIGENE - ONCOR (ii) TITRE DE L'INVENTION: ADN POLYMERASE THERMOSTABLE D'ARCHAEBACTÉRIES DE L'ESPECE THERMOCOCCUS fumicolans (iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 4 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:1 (i) CARACTRERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 5039 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRIN: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (ix) CARACTERISTIQUES (A) NOM/CLE: séquence codante de 1'ADN polymérase de THERMOCOCCUS fumicolans Tfu (B) EMPLACEMENT:de 457 à 5028 (ix) CARACTERISTIQUES (A) NOM/CLE: séquence codante de l'intéine I-Tfu-l (B) EMPLACEMENT: de 1675 à 2754 (ix) CARACTERISTIQUES (A) NOM/CLE: séquence codante de l'intéine I-Tfu-2 (B) EMPLACEMENT: de 3157 à 4323 (ix) CARACTERISTIQUES (A) NOM/CLE: codon stop (B) EMPLACEMENT: de 5026 à 5028 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCES: SEQ ID NO:1 AGCTTAAAGC GTCCGCCACT ACTTCCTGAA AGCTCACGCG GTAAAACAGC TCCATGCTCG 60 GCTCTTCGAT GGGAGGTTTA AAAAGGTGGT GGTGAGGTTT ATTAGGAAGA AGGCTCAACT 120 AGAGACGGTG GGAGTATGGA AGAGGTCGAC AGGCTCGTGT TCAACTTTCC CCTCTTCAAA 180 GATTACTGGG AAAAGGAGCG GTTCCTCAAG GTCGTTGGGC TTCTGGTGAG CCACCAGATA 240 ACGTTTGAGA AAGCTGCCGA GCTTCTGGAC ATGAGGCTCG AAGAGCTGGC GTTCCTCCTT 300 GACAAGCTCG GCGTTGAGTA CTCGCTTCTT GATGATGAAG AGGCCAGACT TGAGAGAGAA 360 GAGGCCAATA AGCTCATGGG GGAAATGAAG GGTGGAGCGT TTGTCTGATT CTTCTGAGCT 420 GTTATTGGTG TTTCACAGGC TGGGAGGTGG TGGATT ATG ATC CTC GAT ACA GAC 474 Met Ile Leu Asp Thr Asp 1 5 TAC ATC ACC GAA GAC GGA AGG CCC GTC ATC AGG GTG TTC AAG AAG GAG 522 Tyr Ile Thr Glu Asp Gly Arg Pro Val Ile Arg Val Phe Lys Lys Glu 10 15 20 AAC GGC GAG TTC AAA ATC GAG TAC GAC AGG GAC TTC GAG CCT TAC ATC 570 Asn Gly Glu Phe Lys Ile Glu Tyr Asp Arg Asp Phe Glu Pro Tir île 25 30 35 TAC GCT CTC CTG AAG GAC GAT TCC GCG ATC GAG GAC GTC AAG AAG ATA 618 Tyr Ala Leu Leu Lys Asp Asp Ser Ala Ile Glu Asp Val Lys Lys Ile 40 45 50 ACT GCA AGC CGG CAC GGT ACC ACC GTC AGG GTC GTC AGG GCC GGG AAG 666 Thr Ala Ser Arg His Gly Thr Thr Val Arg Val Val Arg Ala Gly Lys 55 60 65 70 GTG AAG AAG AAG TTC CTC GGC AGG CCG ATA GAG GTC TGG AAG CTC TAC 714 Val Lys Lys Lys Phe Leu Gly Arg Pro Ile Glu Val Trp Lys Leu Tyr 75 80 85 TTC ACC CAT CCC CAG GAC GTT CCG GCA ATC AGG GAC AAA ATC AGG GAG 762 Phe Thr His Pro Gln Asp Val Pro Ala Ile Arg Asp Lys Ile Arg Glu 90 95 100 CAC CCT GCC GTG GTC GAC ATA TAT GAG TAC GAC ATA CCC TTT CCC AAG 810 His Pro Ala Val Val Asp Ile Tyr Glu Tyr Asp Ile Pro Phe Ala Lys 105 110 115 CGC TAC CTC ATC GAT AAG GGC CTC ATC CCG ATG GAG GGC GAC GAG GAG 858 Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Gly Leu Ile Pro Met Glu Gly Asp Glu Glu 120 125 130 CTC AAG ATG CTC GCC TTC GAC ATC GAG ACG CTC TAC CAC GAG CCC GAG 906 Leu Lys Met Leu Ala Phe Asp Ile Glu Thr Leu Tyr His Glu Gly Glu 135 140 145 150 GAG TTC GCC GAG CGC CCT ATT CTT ATG ATA AGC TAT GCC GAC GAG GAA 954 Glu Phe Ala Glu Gly Pro Ile Leu Met Ile Ser Tyr Ala Asp Glu Glu 155 160 165 GGG CCC AGG GTA ATA ACC TGG AAG AAG ATC GAC CTT CCC TAC GTT GAC 1002 Gly Ala Arg Val Ile Thr Trp Lys Lys Ile Asp Leu Pro Tyr Val Asp 170 175 180 GTC GTT TCA ACG GAG AAG GAG ATG ATA AAG CGC TTC CTG AAG GTT GTC 1050 Val Val Ser Thr Glu Lys Glu Met Ile Lys Arg Phe Leu Lys Val Val 185 190 195 AAG GAG AAG GAC CCC GAT GTC CTC ATA ACC TAC AAC GGC GAC AAC TTC 1098 Lys Glu Lys Asp Pro Asp Val Leu Ile Thr Tyr Asn Gly Asp Asn Phe 200 205 210 GAC TTC GCT TAC CTC AAG AAG CCC TCC GAG AAG CTC CCC GTT AAG TTC 1146 Asp Phe Ala Tyr Leu Lys Lys Arg Ser Glu Lys Leu Gly Val Lys Phe 215 220 225 230 ATC CTC GGA AGG GAC GGC AGC GAG CCC AAG ATA CAG AGG ATG GGC GAC 1194 Ile Leu Gly Arg Asp Gly Ser Glu Pro Lys Ile Gln Arg Met Gly Asp 235 240 245 CGC TTC GCC GTC GAG GTG AAG GGA AGA ATA CAC TTC GAC CTC TAC CCC 1242 Arg Phe Ala Val Glu Val Lys Gly Arg Ile His Phe Asp Leu Tyr Pro 250 255 260 GTC ATA AGA CAC ACC ATC AAC CTG CCC ACC TAC ACG CTG GAG GCC GTC 1290 Val Ile Arg His Thr Ile Asn Leu Pro Thr Tyr Thr Leu Glu Ala Val 265 270 275 TAC GAG GCG ATT TTT GGG CAG CCA AAG GAG AAG GTC TAC GCT GAG GAG 1338 Tyr Glu Ala Ile Phe Gly Gln Pro Lys Glu Lys Val Tyr Ala Glu Glu 280 285 290 ATA GCG CAG GCC TGG GAA ACG GGC GAG GGG CTT GAG CGC GTC GCG CGC 1386 Ile Ala Gln Ala Trp Glu Thr Gly Glu Gly Leu Glu Arg Val Ala Arg 295 300 305 310 TAC TCG ATG GAG GAC GCC AAG GTA ACC TAC GAG CTG GGA AGG GAG TTC 1434 Tyr Ser Met Glu Asp Ala Lys Val Thr Tyr Glu Leu Gly Arg Glu Phe 315 320 325 TTC CCG ATG GAG GCC CAA CTT TCT CGG CTG GTC GGT CAG AGC TTC TGG 1482 Phe Pro Met Glu Ala Gln Leu Ser Arg Leu Val Gly Gln Ser Phe Trp 330 335 340 GAC GTC TCG CGC TCC AGC ACC GGC AAC CTC GTC GAG TGG TAC CTC CTC 1530 Asp Val Ser Arg Ser Ser Thr Gly Asn Leu Val Glu Trp Tyr Leu Leu 345 350 355 AGG AAG GCC TAC GAG AGG AAC GAG CTG GCA CCG AAC AAG CCC TCC GGC 1578 Arg Lys Ala Tyr Glu Arg Asn Glu Leu Ala Pro Asn Lys Pro Ser Gly 360 365 370 AGA GAA CTT GAG AGG CGC CGC GGG GGC TAC GCC GGC GGC TAC GTC AAG 1626 Arg Glu Leu Glu Arg Arg Arg Gly Gly Tyr Ala Gly Gly Tyr Val Lys 375 400 405 410 GAG CCG GAG AGG GGA CTT TGG GAG AAC ATA GCT TAT TTA GAT TTT AGG 1674 Glu Pro Glu Arg Gly Leu Trp Glu Asn Ile Ala Tyr Leu Asp Phe Arg 415 420 425 TGT CAT CCT GCC GAC ACT AAA GTC ATT GTC AAA GGG AAG GGC GTT GTA 1722 Cys His Pro Ala Asp Thr Lys Val Ile Val Lys Gly Lys Gly Val Val 430 435 440 AAC ATC AGC GAA GTT AGG GAG GGG GAC TAC GTT CTC GGC ATA GAC GGC 1770 Asn Ile Ser Glu Val Arg Glu Gly Asp Tyr Val Leu Gly Ile Asp Gly 445 450 455 TGG CAG AAG GTT CAA AGG GTC TGG GAG TAT GAT TAC GAG GGA GAA CTC 1818 Trp Gln Lys Val Gln Arg Val Trp Glu Tyr Asp Tyr Glu Gly Glu Leu 460 465 470 GTA AAT ATA AAC GGC CTT AAG TGC ACA CCG AAC CAT AAG CTT CCG GTC 1866 Val Asn Ile Asn Gly Leu Lys Cys Thr Pro Asn His Lys Leu Pro Val 475 480 485 490 GTT AGG AGG ACT GAG AGG CAG ACT GCG ATA AGG GAC AGC CTT GCA AAG 1914 Val Arg Arg Thr Glu Arg Gln Thr Ala Ile Arg Asp Ser Leu Ala Lys 495 500 505 TCT TTT CTC ACG AAA AAA GTT AAA GGT AAG CTG ATA ACC ACG CCT CTC 1962 Ser Phe Leu Thr Lys Lys Val Lys Gly Lys Leu Ile Thr Thr Pro Leu 510 515 520 TTT GAA AAA ATC GGG AAG ATC GAG CGA GAG GAC GTG CCA GAA GAG GAG 2010 Phe Glu Lys Ile Gly Lys Ile Glu Arg Glu Asp Val Pro Glu Glu Glu 525 530 535 ATA CTC AAA GGA GAA CTC GCC GGA ATA ATC CTG GCT GAG GGC ACA CTC 2058 Ile Leu Lys Gly Glu Leu Ala Gly Ile Ile Leu Ala Glu Gly Thr Leu 540 545 550 CTG AGA AAG GAT GTC GAG TAC TTT GAC TCT TCC AGA GGG AAG AAG AGA 2106 Leu Arg Lys Asp Val Glu Tyr Phe Asp Ser Ser Arg Gly Lys Lys Arg 555 560 565 570 GTA TCA CAC CAG TAC AGG GTT GAA ATA ACC GTT GGG GCG CAG GAG GAG 2154 Val Ser His Gln Tyr Arg Val Glu Ile Thr Val Gly Ala Gln Glu Glu 575 580 585 GAC TTC CAG AGG AGG ATC GTT TAC ATT TTC GAA CGC CTC TTT GGG GTA 2202 Asp Phe X Arg Arg Ile Val Tyr Ile Phe Glu Arg Leu Phe Gly Val 590 595 600 ACT CCC AGT GTT TAC CGG AAA AAG AAC ACA AAC GCA ATA ACG TTC AAA 2250 Thr Pro Ser Val Tyr Arg Lys Lys Asn Thr Asn Ala Ile Thr Phe Lys 605 610 615 GTT GCC AAA AAA GAG GTT TAT CTT AGG GTT AGG GAA ATT ATG GAT GGC 2298 Val Ala Lys Lys Glu Val Tyr Leu Arg Val Arg Glu Ile Met Asp Gly 620 625 630 ATT GAG AAC CTC CAC GCT CCT TCT GTG TTA AGG GGC TTT TTT GAA GGA 2346 Ile Glu Asn Leu His Ala Pro Ser Val Leu Arg Gly Phe Phe Glu Gly 635 640 645 650 GAC GGA AGC GTC AAC AAG GTC CGG AAG ACA GTG GTA GTG AAT CAG GGC 2394 Asp Gly Ser Val Asn Lys Val Arg Lys Thr Val Val Val Asn Gln Gly 655 660 665 ACC AAT AAT GAA TGG AAA ATT GAA GTG GTG TCA AAA CTC CTC AAC AAG 2442 Thr Asn Asn Glu Trp Lys Ile Glu Val Val Ser Lys Leu Leu Asn Lys 670 675 680 TTG GGG ATT CCG CAT AGA AGG TAC ACA TAC GAT TAC ACC GAA AGA GAA 2490 Leu Gly Ile Pro His Arg Arg Tyr Thr Tyr Asp Tyr Thr Glu Arg Glu 685 690 695 AAA ACC ATG ACA ACG CAT ATA CTT GAG ATA GCC GGC AGG GAT GGG TTA 2538 Lys Thr Met Thr Thr His Ile Leu Glu Ile Ala Gly Arg Asp Gly Leu 700 705 710 ATC CTT TTC CAG ACC ATT GTG GGA TTC ATA AGC ACT GAG AAG AAC ATG 2586 Ile Leu Phe Gln Thr Ile Val Gly Phe Ile Ser Thr Glu Lys Asn Met 715 720 725 730 GCG CTG GAG GAG GCA ATC AGG AAC AGG GAA GTG AAC CGC CTA GAA AAC 2634 Ala Leu Glu Glu Ala Ile Arg Asn Arg Glu Val Asn Arg Leu Glu Asn 735 740 745 AAT GCC TTC TAT ACC CTA GCC GAC TTT ACG GCG AAG ACA GAG TAC TAC 2682 Asn Ala Phe Tyr Thr Leu Ala Asp Phe Thr Ala Lys Thr Glu Tyr Tyr 750 755 780 AAG GGC AAA GTT TAC GAC TTA ACC CTT GAG GGA ACG CCC TAT TAC TTC 2730 Lys Gly Lys Val Tyr Asp Leu Thr Leu Glu Gly Thr Pro Tyr Tyr Phe 785 790 795 GCC AAT GGC ATA CTG ACC CAC AAT TCG CTA TAT CCT TCG ATT ATA ATT 2778 Ala Asn Gly Ile Leu Thr His Asn Ser Leu Tyr Pro Ser Ile Ile Ile 800 805 810 TCC CAC AAC GTC TCC CCC GAT ACC CTC AAC CGC GAG GGC TGC GGG GAG 2826 Ser His Asn Val Ser Pro Asp Thr Leu Asn Arg Glu Gly Cys Gly Glu 815 820 825 830 TAC GAC GAG GCT CCG CAG GTA GGG CAT CGC TTT TGT AAG GAC TTC CCC 2874 Tyr Asp Glu Ala Pro Gln Val Gly His Arg Phe Cys Lys Asp Phe Pro 835 840 845 GGC TTC ATC CCC AGC CTC CTC GGT GAC CTG CTC GAC GAG AGG CAG AAG 2922 Gly Phe Ile Pro Ser Leu Leu Gly Asp Leu Leu Asp Glu Arg Gln Lys 855 860 865 GTA AAG AAG CAC ATG AAG GCC ACG CTC GAC CCG ATA GAG AAG AAG CTC 2970 Val Lys Lys His Met Lys Ala Thr Val Asp Pro Ile Glu Lys Lys Leu 870 875 880 CTC GAT TAC AGG CAG CGC GCA ATT AAA ATC CTC GCC AAC AGC TTC TAC 3018 Leu Asp Tyr Arg Gln Arg Ala Ile Lys Ile Leu Ala Asn Ser Phe Tyr 885 890 895 GGC TAC TAT GGC TAC GCA AAG GCC CGC TGG TAC TGC AAG GAG TGC GCC 3066 Gly Tyr Tyr Gly Tyr Ala Lys Ala Arg Trp Tyr Cys Lys Glu Cys Ala 900 905 910 915 GAG AGC GTT ACC GCC TGG GGC AGG CAG TAC ATT GAG ACC ACC ATG AGG 3114 Glu Ser Val Thr Ala Trp Gly Arg Gln Tyr Ile Glu Thr Thr Met Arg 920 925 930 GAA ATA GAG GAA AAA TTT GGC TTT AAA GTG CTG TAC GCG GAT AGT GTT 3162 Glu Ile Glu Glu Lys Phe Gly Phe Lys Val Leu Tyr Ala Asp Ser Val 935 940 945 ACA GGG GAC ACA GAG GTA ACC ATC AGA AGA AAC GGC AGG ATT GAG TTC 3210 Thr Gly Asp Thr Glu Val Thr Ile Arg Arg Asn Gly Arg Ile Glu Phe 950 955 960 GTT CCA ATC GAG AAA CTC TTT GAG CGC GTT GAT CAC CGT GTT GGT GAG 3258 Val Pro Ile Glu Lys Leu Phe Glu Arg Val Asp His Arg Val Gly Glu 965 970 975 AAG GAG TAC TGC GTT CTT GGA GGG GTT GAG GCA CTG ACA CTC GAC AAC 3306 Lys Glu Tyr Cys Val Leu Gly Gly Val Glu Ala Leu Thr Leu Asp Asn 980 985 990 995 AGG GGC AGG CTC GTG TGG AAG AAG GTT CCG TAC GTC ATG AGA CAT AAA 3354 Arg Gly Arg Leu Val Trp Lys Lys Val Pro Tyr Val Met Arg His Lys 1000 1005 1010 ACG GAC AAA AGA ATC TAT AGG GTA TGG TTC ACC AAC TCT TGG TAC CTT 3402 Thr Asp Lys Arg Ile Tyr Arg Val Trp Phe Thr Asn Ser Trp Tyr Leu 1015 1020 1025 GAC GTG ACG GAG GAT CAC TCG CTA ATA GGC TAC CTG AAC ACA AGC AAA 3450 Asp Val Thr Glu Asp His Ser Leu Ile Gly Tyr Leu Asn Thr Ser Lys 1030 1035 1040 GTC AAA CCC GGA AAG CCC TTG AAA GAG CGT CTC GTC GAG GTC AAG CCA 3498 Val Lys Pro Gly Lys Pro Leu Lys Glu Arg Leu Val Glu Val Lys Pro 1045 1050 1055 GAA GAA TTG GGG GGT AAG GTC AAG TCT CTC ATT ACG CCC AAT CGG CCA 3546 Glu Glu Leu Gly Gly Lys Val Lys Ser Leu Ile Thr Pro Asn Arg Pro 1060 1065 1070 1075 ATT GCC CGT ACC ATC AAG GCC AAC CCC ATT GCC GTC AAG CTC TGG GAG 3594 Ile Ala Arg Thr Ile Lys Ala Asn Pro Ile Ala Val Lys Leu Trp Glu 1080 1085 1090 TTA ATT GGC CTG CTG GTG GGA GAT GGC AAC TGG GGT GGA CAA TCG AAC 3642 Leu Ile Gly Leu Leu Val Gly Asp Gly Asn Trp Gly Gly Gln Ser Asn 1095 1100 1105 TGG GCC AAA TAC TAC GTT GGC CTC TCC TGT GGG CTG GAT AAA GCC GAA 3690 Trp Ala Lys Tyr Tyr Val Gly Leu Ser Cys Gly Leu Asp Lys Ala Glu 1110 1115 1120 ATA GAG AGA AAA GTC CTG AAC CCT TTA AGA GAG GCA AGC GTC ATC TCC 3738 Ile Glu Arg Lys Val Leu Asn Pro Leu Arg Glu Ala Ser Val Ile Ser 1125 1130 1135 AAC TAC TAC GAC AAG AGC AAG AAG GGC GAC GTT TCC ATA CTC TCC AAG 3786 Asn Tyr Tyr Asp Lys Ser Lys Lys Gly Asp Val Ser Ile Leu Ser Lys 1140 1145 1150 1155 TGG CTC GCC GGA TTC ATG GTC AAA TAC TTC AAA GAT GAA AAT GGG AAC 3834 Trp Leu Ala Gly Phe Met Val Lys Tyr Phe Lys Asp Glu Asn Gly Asn 1160 1165 1170 AAG GCC ATT CCC AGC TTC ATG TTC AAC CTT CCA AGG GAA TAC ATA GAG 3882 Lys Ala Ile Pro Ser Phe Met Phe Asn Leu Pro Arg Glu Tyr Ile Glu 1175 1180 1185 GCC TTT CTA CGG GGG CTG TTT TCA GCG GAC GGA ACG GTA AGC TTG CGT 3930 Ala Phe Leu Arg Gly Leu Phe Ser Ala Asp Gly Thr Val Ser Leu Arg 1190 1195 1200 AGA GGA ATC CCA GAA ATT AGA CTG ACA AGC GTT AAC AGA GAG CTT AGT 3978 Arg Gly Ile Pro Glu Ile Arg Leu Thr Ser Val Asn Arg Glu Leu Ser 1205 1210 1215 GAT GCC GTG AGA AAG TTG CTG TGG CTG GTT GGG GTC TCC AAC TCA CTA 4026 Asp Ala Val Arg Lys Leu Leu Trp Leu Val Gly Val Ser Asn Ser Leu 1220 1225 1230 1235 TTC ACC GAA ACC AAG CCA AAC CGG TAC CTG GAG AAA GAA AGT GGA ACG 4074 Phe Thr Glu Thr Lys Pro Asn Arg Tyr Leu Glu Lys Glu Ser Gly Thr 1240 1245 1250 CAT TCG ATT CAC GTG AGG ATA AAG AAC AAG CAT CGC TTT GCC GAT AGA 4122 His Ser Ile His Val Arg Ile Lys Asn Lys His Arg Phe Ala Asp Arg 1255 1260 1265 ATA GGC TTT CTC ATA GAC AGA AAA TCC ACC AAA CTC TCC GAG AAC CTG 4170 Ile Gly Phe Leu Ile Asp Arg Lys Ser Thr Lys Leu Ser Glu Asn Leu 1270 1275 1280 GGG GGA CAT ACA AAC AAG AAG AGG GCT TAC AAA TAT GAT TTT GAC TTG 4218 Gly Gly His Thr Asn Lys Lys Arg Ala Tyr Lys Tyr Asp Phe Asp Leu 1285 1290 1295 GTA TAC CCC AGA AAA ATC GAA GAG ATA ACC TAC GAC GGC TAC GTC TAT 4266 Val Tyr Pro Arg Lys Ile Glu Glu Ile Thr Tyr Asp Gly Tyr Val Tyr 1300 1305 1310 1315 GAC ATC GAG GTT GAG GGA ACC CAC AGG TTC TTC GCC AAC GGA ATA CTC 4314 Asp Ile Glu Val Glu Gly Thr His Arg Phe Phe Ala Asn Gly Ile Leu 1320 1325 1330 GTT CAC AAC ACA GAC GGC TTT TTC GCA ACA ATC CCC GGA GCG GAC GCC 4362 Val His Asn Thr Asp Gly Phe Phe Ala Thr Ile Pro Gly Ala Asp Ala 1335 1340 1345 GAG ACG GTC AAA AAG AAG GCC AGG GAG TTC CTT AAC TAC ATT AAC CCC 4410 Glu Thr Val Lys Lys Lys Ala Arg Glu Phe Leu Asn Tyr Ile Asn Pro 1350 1355 1360 AAG CTG CCC GGT CTC CTC GAA CTC GAG TAC GAG GGC TTC TAC AGG CGC 4458 Lys Leu Pro Gly Leu Leu Glu Leu Glu Tyr Glu Gly Phe Tyr Arg Arg 1365 1370 1375 GGT TTC TTC GTA ACC AAG AAG AAG TAC GCG GTG ATA GAC GAG GAG GGC 4506 Gly Phe Phe Val Thr Lys Lys Lys Tyr Ala Val Ile Asp Glu Glu Gly 1380 1385 1390 1395 AAG ATA ACG ACG CGC GGG CTT GAG ATC GTC CGG CGC GAC TGG AGT GAG 4554 Lys Ile Thr Thr Arg Gly Leu Glu Ile Val Arg Arg Asp Trp Ser Glu 1400 1405 1410 GTG GCT AAG GAG ACG CAG GCG AGG GTC TTC GAG GCC ATA CTG CGG CAC 4602 Val Ala Lys Glu Thr Gln Ala Arg Val Leu Glu Ala Ile Leu Arg His 1415 1420 1425 GGT GAC GTC GAG GAG GCC GTG AGG ATT GTC AAG GAA GTG ACG GAA AAG 4650 Gly Asp Val Glu Glu Ala Val Arg Ile Val Lys Glu Val Thr Glu Lys 1430 1435 1440 CTG AGC AAG TAC GAG GTT CCG CCA GAG AAG CTC GTC ATC CAC GAG CAG 4698 Leu Ser Lys Tyr Glu Val Pro Pro Glu Lys Leu Val Ile His Glu Gln 1445 1450 1455 ATT ACC AGG GAG CTG AAG GAC TAC AAG GCC ACC GGC CCC CAC GTG GCC 4746 Ile Thr Arg Glu Leu Lys Asp Tyr Lys Ala Thr Gly Pro His Val Ala 1460 1465 1470 1475 ATA CCC AAG CGC CTC GCC CCC AGG CGC ATT AAG GTT CGC CCT CGC ACA 4794 Ile Ala Lys Arg Leu Ala Ala Arg Gly Ile Lys Val Arg Pro Gly Thr 1480 1485 1490 GTC ATC AGC TAC ATC GTC CTG AAA GGT TCC GGC AGG ATA GGG GAC AGG 4842 Val Ile Ser Tyr Ile Val Leu Lys Gly Ser Gly Arg Ile Gly Asp Arg 1495 1500 1505 ACG ATA CCC TTC GAC GAG TTC GAC CCC ACG AAG CAC AGG TAC GAT GCG 4890 Thr Ile Pro Phe Asp Glu Phe Asp Pro Thr Lys His Arg Tyr Asp Ala 1510 1515 1520 GAG TAC TAC ATC GAG AAC CAG GTT CTG CCG GCG GTG GAG AGA ATC CTC 4938 Glu Tyr Tyr Ile Glu Asn Gln Val Leu Pro Ala Val Glu Arg Ile Leu 1525 1530 1535 AAG GCC TTC GGC TAC AAG AAG GAG GAT TTG CGC TAC CAG AAG ACG CGG 4986 Lys Ala Phe Gly Tyr Lys Lys Glu Asp Leu Arg Tyr Gln Lys Thr Arg 1540 1545 1550 1555 CAG GTT GGG CTG GGG GCG TGG CTC AAA ATG GGG AAG AAA TGA 5028 Gln Val Gly Leu Gly Ala Trp Leu Lys Met Gly Lys Lys 1560 1565 1568 AGGCCAAGCT T 5039 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:2 (i) CARACTRERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 774 acides aminés (il) TYPE DE MOLECULE: protéine (ix) CARACTERISTIQUES (A) NOM/CLE: ADN polymérase de THERMOCOCCUS fumicolans Tfu (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCES: SEQ ID NO:2 Met Ile Leu Asp Thr Asp Tyr Ile Thr Glu Asp Gly Arg Pro Val Ile 1 5 10 15 Arg Val Phe Lys Lys Glu Asn Gly Glu Phe Lys Ile Glu Tyr Asp Arg 20 25 30 Asp Phe Glu Pro Tyr Ile Tyr Ala Leu Leu Lys Asp Asp Ser Ala Ile 35 40 45 Glu Asp Val Lys Lys Ile Thr Ala Ser Arg His Gly Thr Thr Val Arg 50 55 60 Val Val Arg Ala Gly Lys Val Lys Lys Lys Phe Leu Gly Arg Pro Ile 65 70 75 80 Glu Val Trp Lys Leu Tyr Phe Thr His Pro Gln Asp Val Pro Ala Ile 85 90 95 Arg Asp Lys Ile Arg Glu His Pro Ala Val Val Asp Ile Tyr Glu Tyr 100 105 110 Asp Ile Pro Phe Ala Lys Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Gly Leu Ile Pro 115 120 125 Met Glu Gly Asp Glu Glu Leu Lys Met Leu Ala Phe Asp Ile Glu Thr 130 135 140 Leu Tyr His Glu Gly Glu Glu Phe Ala Glu Gly Pro Ile Leu Met Ile 145 150 155 160 Ser Tyr Ala Asp Glu Glu Gly Ala Arg Val Ile Thr Trp Lys Lys Ile 165 170 175 Asp Leu Pro Tyr Val Asp Val Val Ser Thr Glu Lys Glu Met Ile Lys 180 185 190 Arg Phe Leu Lys Val Val Lys Glu Lys Asp Pro Asp Val Leu Ile Thr 195 200 205 Tyr Asn Gly Asp Asn Phe Asp Phe Ala Tyr Leu Lys Lys Arg Ser Glu 210 215 220 Lys Leu Gly Val Lys Phe Ile Leu Gly Arg Asp Gly Ser Glu Pro Lys 225 230 235 240 Ile Gln Arg Met Gly Asp Arg Phe Ala Val Glu Val Lys Gly Arg Ile 245 250 255 His Phe Asp Leu Tyr Pro Val Ile Arg His Thr Ile Asn Leu Pro Thr 260 265 270 Tyr Thr Leu Glu Ala Val Tyr Glu Ala Ile Phe Gly Gln Pro Lys Glu 275 280 285 Lys Val Tyr Ala Glu Glu Ile Ala Gln Ala Trp Glu Thr Gly Glu Gly 290 295 300 Leu Glu Arg Val Ala Arg Tyr Ser Met Glu Asp Ala Lys Val Thr Tyr 305 310 315 320 Glu Leu Gly Arg Glu Phe Phe Pro Met Glu Ala Gln Leu Ser Arg Leu 325 330 335 Val Gly Gln Ser Phe Trp Asp Val Ser Arg Ser Ser Thr Gly Asn Leu 340 345 350 Val Glu Trp Tyr Leu Leu Arg Lys Ala Tyr Glu Arg Asn Glu Leu Ala 355 360 365 Pro Asn Lys Pro Ser Gly Arg Glu Leu Glu Arg Arg Arg Gly Gly Tyr 370 375 380 Ala Gly Gly Tyr Val Lys Glu Pro Glu Arg Gly Leu Trp Glu Asn Ile 385 390 395 400 Ala Tyr Leu Asp Phe Arg Ser Leu Tyr Pro Ser Ile Ile Ile Ser His 405 405 410 Asn Val Ser Pro Asp Thr Leu Asn Arg Glu Gly Cys Gly Glu Tyr Asp 415 420 425 Glu Ala Pro Gln Val Gly His Arg Phe Cys Lys Asp Phe Pro Gly Phe 430 435 440 Ile Pro Ser Leu Leu Gly Asp Leu Leu Asp Glu Arg Gln Lys Val Lys 445 450 455 Lys His Met Lys Ala Thr Val Asp Pro Ile Glu Lys Lys Leu Leu Asp 460 465 470 475 Tyr Arg Gln Arg Ala Ile Lys Ile Leu Ala Asn Ser Phe Tyr Gly Tyr 480 485 490 Tyr Gly Tyr Ala Lys Ala Arg Trp Tyr Cys Lys Glu Cys Ala Glu Ser 495 500 505 Val Thr Ala Trp Gly Arg Gln Tyr Ile Glu Thr Thr Met Arg Glu Ile 510 515 520 Glu Glu Lys Phe Gly Phe Lys Val Leu Tyr Ala Asp Thr Asp Gly Phe 525 530 535 Phe Ala Thr Ile Pro Gly Ala Asp Ala Glu Thr Val Lys Lys Lys Ala 540 545 555 560 Arg Glu Phe Leu Asn Tyr Ile Asn Pro Lys Leu Pro Gly Leu Leu Glu 565 570 575 Leu Glu Tyr Glu Gly Phe Tyr Arg Arg Gly Phe Phe Val Thr Lys Lys 580 585 590 Lys Tyr Ala Val Ile Asp Glu Glu Gly Lys Ile Thr Thr Arg Gly Leu 595 600 605 Glu Ile Val Arg Arg Asp Trp Ser Glu Val Ala Lys Glu Thr Gln Ala 610 615 620 Arg Val Leu Glu Ala Ile Leu Arg His Gly Asp Val Glu Glu Ala Val 625 630 635 640 Arg Ile Val Lys Glu Val Thr Glu Lys Leu Ser Lys Tyr Glu Val Pro 645 650 655 Pro Glu Lys Leu Val Ile His Glu Gln Ile Thr Arg Glu Leu Lys Asp 660 665 670 Tyr Lys Ala Thr Gly Pro His Val Ala Ile Ala Lys Arg Leu Ala Ala 675 680 685 Arg Gly Ile Lys Val Arg Pro Gly Thr Val Ile Ser Tyr Ile Val Leu 690 695 700 Lys Gly Ser Gly Arg Ile Gly Asp Arg Thr Ile Pro Phe Asp Glu Phe 705 710 715 720 Asp Pro Thr Lys His Arg Tyr Asp Ala Glu Tyr Tyr Ile Glu Asn Gln 725 730 735 Val Leu Pro Ala Val Glu Arg Ile Leu Lys Ala Phe Gly Tyr Lys Lys 740 745 750 Glu Asp Leu Arg Tyr Gln Lys Thr Arg Gln Val Gly Leu Gly Ala Trp 755 760 765 Leu Lys Met Gly Lys Lys 770 774 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:3 (i) CARACTRERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 360 acides aminés (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine (ix) CARACTERISTIQUES (A) NOM/CLE: intéine I-Tfu-l (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCES: SEQ ID NO:3 Cys His Pro Ala Asp Thr Lys Val Ile Val Lys Gly Lys Gly Val Val 1 5 10 15 Asn Ile Ser Glu Val Arg Glu Gly Asp Tyr Val Leu Gly Ile Asp Gly 20 25 30 Trp Gln Lys Val Gln Arg Val Trp Glu Tyr Asp Tyr Glu Gly Glu Leu 35 40 45 Val Asn Ile Asn Gly Leu Lys Cys Thr Pro Asn His Lys Leu Pro Val 50 55 60 Val Arg Arg Thr Glu Arg Gln Thr Ala Ile Arg Asp Ser Leu Ala Lys 65 70 75 80 Ser Phe Leu Thr Lys Lys Val Lys Gly Lys Leu Ile Thr Thr Pro Leu 85 90 95 Phe Glu Lys Ile Gly Lys Ile Glu Arg Glu Asp Val Pro Glu Glu Glu 100 105 110 Ile Leu Lys Gly Glu Leu Ala Gly Ile Ile Leu Ala Glu Gly Thr Leu 115 120 125 Leu Arg Lys Asp Val Glu Tyr Phe Asp Ser Ser Arg Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Val Ser His Gln Tyr Arg Val Glu Ile Thr Val Gly Ala Gln Glu Glu 145 150 155 160 Asp Phe X Arg Arg Ile Val Tyr Ile Phe Glu Arg Leu Phe Gly Val 165 170 175 Thr Pro Ser Val Tyr Arg Lys Lys Asn Thr Asn Ala Ile Thr Phe Lys 180 185 190 Val Ala Lys Lys Glu Val Tyr Leu Arg Val Arg Glu Ile Met Asp Gly 195 200 205 Ile Glu Asn Leu His Ala Pro Ser Val Leu Arg Gly Phe Phe Glu Gly 210 215 220 Asp Gly Ser Val Asn Lys Val Arg Lys Thr Val Val Val Asn Gln Gly 225 230 235 240 Thr Asn Asn Glu Trp Lys Ile Glu Val Val Ser Lys Leu Leu Asn Lys 245 250 255 Leu Gly Ile Pro His Arg Arg Tyr Thr Tyr Asp Tyr Thr Glu Arg Glu 260 265 270 Lys Thr Met Thr Thr His Ile Leu Glu Ile Ala Gly Arg Asp Gly Leu 275 280 285 Ile Leu Phe Gln Thr Ile Val Gly Phe Ile Ser Thr Glu Lys Asn Met 290 295 300 Ala Leu Glu Glu Ala Ile Arg Asn Arg Glu Val Asn Arg Leu Glu Asn 305 310 315 320 Asn Ala Phe Tyr Thr Leu Ala Asp Phe Thr Ala Lys Thr Glu Tyr Tyr 325 330 335 Lys Gly Lys Val Tyr Asp Leu Thr Leu Glu Gly Thr Pro Tyr Tyr Phe 340 345 350 Ala Asn Gly Ile Leu Thr His Asn 355 360 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:4 (i) CARACTRERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 389 acides aminés (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine (ix) CARACTERISTIQUES (A) NOM/CLE: intéine I-Tfu-2 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCES: SEQ ID NO:4 Ser Val Thr Gly Asp Thr Glu Val Thr Ile Arg Arg Asn Gly Arg Ile 1 5 10 15 Glu Phe Val Pro Ile Glu Lys Leu Phe Glu Arg Val Asp His Arg Val 20 25 30 Gly Glu Lys Glu Tyr Cys Val Leu Gly Gly Val Glu Ala Leu Thr Leu 35 40 45 Asp Asn Arg Gly Arg Leu Val Trp Lys Lys Val Pro Tyr Val Met Arg 50 55 60 His Lys Thr Asp Lys Arg Ile Tyr Arg Val Trp Phe Thr Asn Ser Trp 65 70 75 80 Tyr Leu Asp Val Thr Glu Asp His Ser Leu Ile Gly Tyr Leu Asn Thr 85 90 95 Ser Lys Val Lys Pro Gly Lys Pro Leu Lys Glu Arg Leu Val Glu Val 100 105 110 Lys Pro Glu Glu Leu Gly Gly Lys Val Lys Ser Leu Ile Thr Pro Asn 115 120 125 Arg Pro Ile Ala Arg Thr Ile Lys Ala Asn Pro Ile Ala Val Lys Leu 130 135 140 Trp Glu Leu Ile Gly Leu Leu Val Gly Asp Gly Asn Trp Gly Gly Gln 145 150 155 160 Ser Asn Trp Ala Lys Tyr Tyr Val Gly Leu Ser Cys Gly Leu Asp Lys 165 170 175 Ala Glu Ile Glu Arg Lys Val Leu Asn Pro Leu Arg Glu Ala Ser Val 180 185 190 Ile Ser Asn Tyr Tyr Asp Lys Ser Lys Lys Gly Asp Val Ser Ile Leu 195 200 205 Ser Lys Trp Leu Ala Gly Phe Met Val Lys Tyr Phe Lys Asp Glu Asn 210 215 220 Gly Asn Lys Ala Ile Pro Ser Phe Met Phe Asn Leu Pro Arg Glu Tyr 225 230 235 240 Ile Glu Ala Phe Leu Arg Gly Leu Phe Ser Ala Asp Gly Thr Val Ser 245 250 255 Leu Arg Arg Gly Ile Pro Glu Ile Arg Leu Thr Ser Val Asn Arg Glu 260 265 270 Leu Ser Asp Ala Val Arg Lys Leu Leu Trp Leu Val Gly Val Ser Asn 275 280 285 Ser Leu Phe Thr Glu Thr Lys Pro Asn Arg Tyr Leu Glu Lys Glu Ser 290 295 300 Gly Thr His Ser Ile His Val Arg Ile Lys Asn Lys His Arg Phe Ala 305 310 315 320 Asp Arg Ile Gly Phe Leu Ile Asp Arg Lys Ser Thr Lys Leu Ser Glu 325 330 335 Asn Leu Gly Gly His Thr Asn Lys Lys Arg Ala Tyr Lys Tyr Asp Phe 340 345 350 Asp Leu Val Tyr Pro Arg Lys Ile Glu Glu Ile Thr Tyr Asp Gly Tyr 355 360 365 Val Tyr Asp Ile Glu Val Glu Gly Thr His Arg Phe Phe Ala Asn Gly 370 375 380 Ile Leu Val His Asn 385 389