噻吩磺隆水解難因 及其細

技术领域

本发明属于应用环境微生物和农业领域， 涉及噻吩磺隆水解酶基因 mE及其应用。

背景技术

除草剂的使用在减轻农业劳动强度、保证农业 正常生产的同时，其残留也带来了严重的作 物药害问题，据统计我国每年农田受除草剂药 害面积达到 3000万亩，其中严重药害面积达到 500 万亩， 每年造成几十亿元的损失， 而抗除草剂转基因是解决除草剂药害的最佳途 径。磺酰脲类 除草剂在中国使用量大， 研究和应用发展迅速， 已经成为继有机磷、 乙酰胺类除草剂后的第三 大除草剂， 全球年销售额达到 30亿美元以上， 我国磺酰脲类除草剂每年的应用面积已超过 200 万公顷， 并仍呈扩大的趋势， 噻吩磺隆是使用非常广泛的一类磺酰脲类除草 剂。磺酰脲类除草 剂残留期较长，在土壤中积累会对下茬作物产 生严重的药害作用，现已发现磺酰脲类除草剂 的 残留药害可伤及水稻、 大豆、 玉米、 油菜、 棉花、 甜菜、 亚麻和向日葵等多种重要作物。

获得磺酰脲类除草剂降解菌株和降解基因在治 理除草剂残留，消除其药害技术研发中具有 以下作用和功能， （一） 通过现代生物技术将降解基因导入作物构建相 应的除草剂抗性转基因 作物， （二） 通过现代微生物发酵技术将磺酰脲类除草剂降 解菌株和基因制成降解菌剂或酶制 剂将土壤中磺酰脲类除草剂残留降解。此外磺 酰脲类除草剂降解基因还可用于有用化工产品 及 药物合成的生物转化。因此噻吩磺隆降解基因 在消除该类除草剂药害及生物转化领域中具有 非 常重要的理论和应用价值。

磺酰脲类除草剂噻吩磺隆应用日益广泛， 但其残留期较长， 在土壤中积累会对下茬作物产 生严重的药害作用， 而构建和种植抗除草剂转基因是解决除草剂药 害的最佳途径。 目前能够降 解噻吩磺隆的基因还未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提 供一种噻吩磺隆水解酶基因， 该基因可用于 构建抗噻吩磺隆的转基因作物， 也可用于土壤、水体中除草剂噻吩磺隆和高效 盖草能残留的去 除及药物合成的生物转化。

本发明的另一目的是提供该基因的应用。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一种噻吩磺隆水解酶基因 t E, 其核苷酸序列为 SEQ ID N0.1。

本专利所用的出发菌株为一株能够降解噻吩磺 隆的细菌菌株 S113 ,在分类上属于嗜甲基菌 (Methylophilus sp. ) ， 保存在中国普通微生物菌种保藏管理中心， 保藏编号为 CGMCC 1479， 保藏日期为 2005年 10月 12日。质谱分析结果表明菌株 S113的粗酶液可以把噻吩磺隆水解为噻磺 酸。

克隆噻吩磺隆水解酶基因采取的策略为鸟枪法 （见图 1 )。 首先提取菌株 S113的总 DNA， 总 DNA采用 部分酶切后和用 BflmH/酶切的质粒 pUC118酶连， 酶连产物转化大肠杆菌 DH10B感受态细胞构建菌株 S113的总 DNA文库， 含有噻吩磺隆降解基因的克隆子能使培养基 中的噻吩磺隆降解， 生成的噻磺酸不抑制大肠杆菌生长， 解除对大肠杆菌的抑制而生长。不含 噻吩磺隆降解基因的克隆子则因受到噻吩磺隆 的抑制而不能生长。利用这种克隆方法可以对 文 库进行高通量的筛选。

用上面的策略筛选鸟枪法构建的基因文库获得 一个能在加入 lOppm噻吩磺隆的基础盐培 养基 (葡萄糖为碳源)上生长的阳性克隆子， 进一步的降解实验表明该阳性克隆子能降解噻 吩磺 隆。测序结果表明该阳性克隆子含有 5143个碱基对，其中包含有 18个潜在的 ORF (大于 150bp)， 对这些潜在的 ORF分别进行亚克隆和序列比对分析，最后确定 编码噻吩磺隆水解酶的基因的大 小为 1194kb， 命名为 nE。 这是首次克隆到能降解磺酰脲类除草剂的水解 酶基因。

所述的噻吩磺隆水解酶酶基因 mE核苷酸序列所编码的噻吩磺隆水解酶蛋白质 TsmE，其 氨基酸序列为： SEQ ID N0.2。

含有所述的噻吩磺隆水解酶基因 t E的重组表达载体。

所述的重组表达载体优选将所述的噻吩磺隆水 解酶基因 tsmE插入 pET-29a(+)的 NcM和

H /¾flII位点之间所得。

含有所述的噻吩磺隆水解酶基因 t E的基因工程菌。

所述的基因工程菌优选以大肠杆菌 BL21(DE3) 为出发菌株。

所述噻吩磺隆水解酶基因 mE在构建抗噻吩磺隆的转基因作物中的应用。

所述噻吩磺隆水解酶基因 mE在降解噻吩磺隆和高效盖草能中的应用。

所述噻吩磺隆水解酶蛋白质 TsmE在降解噻吩磺隆和高效盖草能中的应用。

所述噻吩磺隆水解酶蛋白质 TsmE在去除土壤、水体中除草剂噻吩磺隆残留� �高效盖草能 中的应用。

本发明的有益效果如下：

1. 本发明用鸟枪法成功的从菌株 S113 ( CGMCC 1479) 中克隆出噻吩磺隆水解酶基因 mE。 在 GenBank比对结果表明该基因为一个新的基因， 全长 （从起始密码子到终止密码子） 为 1194 bp, G+C含量为 51.09%， 编码 398个氨基酸。 2. 本发明提供的噻吩磺隆水解酶 TsmE能在 lhr内完全降解 100 mg/L的噻吩磺隆，并将噻吩 磺隆水解为无除草活性的产物噻吩磺酸（见图 4和图 5)，此外 还能在位 内完全降解 优 的除草剂高效盖草能 （见图 6和图 7)。 mE可用于构建抗噻吩磺隆的转基因作物， 也可 用于土壤、水体中除草剂噻吩磺隆和高效盖草 能残留的去除及药物合成的生物转化， 具有非常 重要的理论和应用价值。 附图说明

图 1 噻吩磺隆水解酶基因 mE克隆的策略图。

图 2 噻吩磺隆水解酶基因 tsmE在 BL21 (pET-29a(+) ) 中表达策略图。

图 3 噻吩磺隆水解酶 TsmE蛋白电泳图谱；

其中泳道 1为蛋白质 marker,泳道 2为纯化的噻吩磺隆水解酶 TsmE蛋白。

图 4 噻吩磺隆和高效盖草能水解酶 TsmE降解噻吩磺隆 LC-MS图；

A: 噻吩磺隆和高效盖草能水解酶 TsmE降解噻吩磺隆的液相色谱图；

B : 噻吩磺隆和高效盖草能水解酶 TsmE降解噻吩磺隆的一级质谱图；

C: 噻吩磺隆和高效盖草能水解酶 TsmE降解噻吩磺隆的子离子二级质谱图。

图 5 噻吩磺隆和高效盖草能水解酶 TsmE降解噻吩磺隆的途径。

图 6 噻吩磺隆和高效盖草能水解酶 TsmE降解高效盖草能 MS/MS图。

A: 噻吩磺隆和高效盖草能水解酶 TsmE降解高效盖草能的一级质谱图。

B : 噻吩磺隆和高效盖草能水解酶 TsmE降解高效盖草能的二级质谱图。

图 7 噻吩磺隆和高效盖草能水解酶 TsmE降解高效盖草的途径。 生繊料纖信息

嗜甲基菌 S113 (Methylophilus sp. )，保存在中国普通微生物菌种保藏管理中心� �CGMCC) , 地址为北京市朝阳区北辰西路 1号院 3号中国科学院微生物研究所， 保藏编号为 CGMCC 1479, 保藏日期为 2005年 10月 12日。 具体实fc^:

实施例 1. 噻吩磺隆水解 1 ¾因的克隆

1.1细菌基因组总 DNA的提取

S113 ( CGMCC 1479) 大量培养后， 采用 CTAB法提取高纯度、 大片段的 S113的基因组 总 DNA， 溶于 TE缓冲液 （pH8.0)中， 置于 -20°C保藏， 具体方法参考 F_奥斯伯等编的 《精编 分子生物学实验指南》。

1.2总 DNA的酶切 S113 (CGMCC 1479)总 DNA采用 "3AI部分酶切。

1.3 DNA的回收

酶切后的总 DNA通过电泳 （TAE缓冲液）进行纯化， 采用 axygen biosciences(China;0收试剂盒 进行回收， 回收的 DNA溶于 10 mmol/L的 Tris_Cl (pH8.0)中， 置于 -20°C保藏。

1.4麟

建立如下反应体系：

pUC118(£腿 HI) 0.1

总 DNA片段 0.1 μg

lOx连接酶缓冲液 1 μΐ

T4DNA连接酶 0.5 μΐ

加双蒸水至 10 μΐ

16°C温育 12小时。

1.5制备大肠杆菌 DH10B髙效感受态细胞

大肠杆菌 DH10B购自上海英骏生物技术有限公司。高效感� ��态细胞制备的具体方法参照 F. 奥斯伯等编的 《精编分子生物学实验指南》 P 22-23。

1.6转化

取 10 μ耀每连产物转化 200 μΐ大肠杆菌 DH10B感受态细胞，具体方法参照 F.奥斯伯等编的《精 编分子生物学实验指南》 Ρ 23。 涂布含有 10mg/kg的噻吩磺隆， 100 mg/kg氨苄青霉素的基础 培养基平板， 培养 24 h后挑取生长的菌落， 进一步验证获得一个能将噻吩磺隆转化为噻磺 酸的 转化子。 基础盐培养基配方为 5.0 glucose, 1.0 NhkNC , 1.0 Nad, 1.5 ½HP0 ₄ , 0.5 HHPO^ 0.2 Mg8D ₄ -7H ₂ 0, pH 7.0。

1.7基因核苷酸序列测定

将 1.6中获得的能将噻吩磺隆转化为噻磺酸的转化 子送交上海英骏生物技术有限公司进行 序列测定， 噻吩磺隆水解酶基因的核苷酸序列为 SEQ ID N0.1 , 根据噻吩磺隆水解酶基因核苷 酸序列所推到的 398个氨基酸序列为 SEQ ID N0.2。 实施例 2噻吩磺隆水解難因在 BL21(pET-29a(+))中的髙效表达（图 2)

2.1噻吩磺隆水解 H¾因的 PCR扩增 以正向弓 I物： 5，-TGCAGACATATGGAAACCGATAAAAAAAC-3 ( SEQ ID N0.3 ) 禾口反向 引物： 5，-TGCAGAGAATTCCCTTCCATAAGAGCGCCGAT-3， ( SEQ ID N0.4 )为引物，用 PCR 从 S113 (CGMCC 1479) 基因组 DNA中扩增出噻吩磺隆水解酶基因片段。

扩增体系：

Primer star^$ ( 5ϋ7μ1) 0.5 μΐ

5 PCR Buffer II (Mg ²⁺ Plus) 10 μΐ

dNTP Mixture (各 2.5mM) 5 μΐ

模板 DNA 10 ng

正向引物 (20μΜ) Ι μΐ

反向引物 (20μΜ) Ι μΐ

灭菌蒸馏水 至 50 μΐ

PCR扩增程序：

a.95°C 变性 3min;

b.95°C 变性 1.5min， 53°C退火 0.5 min， 72°C延伸 1.5 min， 进行 25个循环；

c.72°C延伸 10 min， 冷却到室温。

2.2 PCR产物用 M和 H«<mi双酶切。

酶切体系：

Nde I 1 μΐ

Hindlll 1 μΐ

DNA <1

灭菌的蒸馏水 加至 20 μΐ

在 37°C水浴中， 反应 3h以上。 酶切产物进行 2%的琼脂糖凝胶电泳切胶回收。

2.3 pET-29a(+)用 和 H«<mi双酶切（参考 2.2)。

2.4转化

2.2中的回收片段和 2.3中酶切好的 pET-29a(+)进行酶连 （参考 1.5 )。 酶连好的含噻吩磺隆水 解酶基因的 pET-29a(+)重组质粒转化到表达宿主菌 BL21(DE3)获得重组微生物 BL21(TsmE)。

2.5 TsmE的表达、 纯化和功能验证

BL21(TsmE)在 LB培养基中培养至 OD600nm为 0.6至 IJO.8之间， 力口 IPTG至浓度 lmM， 30° C 培养 4个小时。 100ml菌液离心， 用 10ml (50 mM, pH 7.0) PBS缓冲液重悬菌体， 超声破碎 (Auto Science, UH-650B ultrasonic processor, 30% intensity) 5分钟， 离心， 收集上清， 用镍离子亲和层 析柱对 TsmE进行了纯化， 纯化后的酶进行蛋白质电泳， 见图 3。

2.6 TsmE活力测定

酶活反应体系： 采料 磷酸缓冲液 （軽 « )， 继纏料 噻吩磺隆或继 » 高效盖草能、 反 应酶量 （攔 »纯化所得） 采 ， ¾ 反应提斗 。 每个反应以加入酶开始计时， 用職斗 二 氯甲烷终止反应， 分层后有机相经无水硫酸钠脱水， 噻吩磺隆或高效盖草能含量用反向 HPLC 测定 （具体方法见 »。 一个酶活力单位 （ ） 定义为： 在 ， 温度«条件下， 每分钟 催化减少^ 噻吩磺隆或高效盖草能所需的酶量。 降解试验表明纯化后的 能在总 内降 解总建瞎 的噻吩磺隆或高效盖草能，酶学试验表明 对噻吩磺隆和高效盖草能的比酶活分 别为 ¾^¾¾斗 。 料

2.7代谢产物的确定

2.7.1 噻吩磺隆降解代谢产物的确定

2.6中的噻吩磺隆的酶反应液过滤， 取 20μί滤液进行 LC-MS, 液相色谱条件： 色谱柱： Agilent Zorbax XDB-C18柱（2.1 χ50ηιηι,3.5μηι)， 流动相： 甲醇： 水 =80: 20， 流速 0.25ml/min; 紫外检测波长 255nm。 一级质谱条件： 离子检测方式为多反应离子检测； 离子极性为负离子； 离子化方式为电喷雾离子化； 毛细管电压为 4000 伏； 干燥气温度： 33CTC ; 干燥气流速： 10.0 L/min, 雾化气压力： 35psi， 碰撞电压： 135 伏； 质量扫描范围 （m/z): 300-500。 二级子离子 质谱条件： 碰撞电压： 90 伏； 质量扫描范围 （m/z): 30-400

LC-MS的液谱图（见图 4A)表明， 其产物的保留时间为 1.95min， 一级质谱图（见图 4B ) 显示其有 m/z为 372.30分子负离子峰， m/z为 372.30的分子负离子其二级质谱图 （见图 4C) 中有 m/z为 162.10， 188.10, 206.20的片段， 这与噻磺酸相符。 因此， TsmE水解噻吩磺隆的 生化反应是就噻吩磺隆转化成噻磺酸 （见图 5)。

2.7.2 高效盖草能降解代谢产物的确定

利用串联质谱测定高效盖草能降解代谢产物， 2ml 2.6中的高效盖草能酶反应液二氯甲烷 提取物经氮气吹干后溶于 ΙΟΟμί甲醇， 进行串联质谱测定， 串联质谱条件： MS/MS (Finnigan TSQ Quantum Ultra AM, Thermal, U.S.A.) ， 采用电喷雾形式离子化， 正负离子同时检测， 质 量扫描范围 ( m/z): 30-1200。

MS/MS的一级质谱图 （见图 6A) 中有 m/z为 359.87的分子负离子峰， m/z为 359.87的 分子负离子其二级质谱 （见图 6B ) 中有 m/z为 287.60的片段， 这与 TsmE水解高效盖草能的 代谢产物 2-[4-(3-氯 -5-三氟甲基 -2-吡啶氧基)苯氧基]丙酸相符。 因此， TsmE水解高效盖草能的 生化反应是就将高效盖草能转化成 2-[4-(3-氯 -5-三氟甲基 -2-吡啶氧基)苯氧基]丙酸 （见图 7)。 以上实施例中使用的微生物来源如

pUC118 (β腿 HI) 购自宝生物工程 （大连） 有限公司， 大肠杆菌 DH10B 购自上海英骏生物技术有限公司， 大肠杆菌高表达载体 pET-29a(+) 购自 Novegen公司，

表达宿主菌大肠杆菌 BL21(DE3) 购自上海英骏生物技术有限公司。