TECHNISCHES GEBIET

Die vorliegende Erfindung betrifft das technische Gebiet der Zellkultur, insbesondere der dreidimensionalen Zellkultur tierischer und menschlicher Zellen.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Tierische und menschliche Zellen werden in der biomedizinischen und pharmazeutischen Forschung traditionell in der zweiten Dimension kultiviert. Hierbei transferiert man Zellen auf eine Plastik- oder Glasoberfläche, an der sie sich festsetzen und vermehren können. Diese Umgebung entspricht jedoch nicht den natürlichen, physiologischen Bedingungen der Zellen und führt deshalb sehr oft zum Funktionsverlust, zur Dedifferenzierung der Zellen und schlimmstenfalls zum Zelltod. (DE102007020302A1 ). Zellen im menschlichen Körper verhalten sich in ihrem Milieu grundlegend anders als jene in Kultur. Die Gründe sind sowohl komplexe interzelluläre als auch extrazelluläre Vorgänge, welche beispielsweise durch benachbarte Zellen, dem Gewebe oder auch durch lösliche Faktoren, wie zum Beispiel Wachstumsfaktoren oder Hormone beeinflusst werden. 2D-Zellkulturen ermöglichen zwar das Anheften und Wachsen der Zellen außerhalb eines Organismus, spiegeln aber nur unzureichend die natürlichen Wachstumsbedingungen von Zellen in ihrer natürlichen Umgebung wider.

Um diese Gräben zwischen zwei dimensionaler Zellkultur und dem in vivo Milieu zu reduzieren, wurden im letzten Jahrzehnt zahlreiche dreidimensionale Zellkultursysteme als Alternative entwickelt. 3D-Kulturen bringen zahlreiche Vorteile mit sich, da die kultivierten Zellen ein physiologisch authentischeres Modell des menschlichen Gewebes ermöglichen. Dazu zählen beispielsweise Systeme mit festen Trägern, wie beispielsweise porösen Stützstrukturen, die die extrazelluläre Matrix imitieren, und T räger-unabhängige Systeme, wie beispielsweise Sphäroid-Kulturen. Momentan existieren ca. 150 unterschiedliche 3D Kultursysteme weltweit, von denen 76% ein Gerüst zur Kultivierung (scaffold-basiert) nutzen (BCC Research: “3D Cell Cultures: Technologies and Global Markets”, (BIO140A), Publ. Date: Jan. 2015). Beispiele sind etwa Hanging-Drop Multiwell-Platten, die zur Herstellung von Sphäroiden eingesetzt werden (US 2013/236924 A1), Systeme zur Erzeugung dreidimensionaler Matrizen, die einen magnetischen Kern umfassen (US 2017/137766 A1) oder etwa ein Zellkultursystem, das eine dreidimensionale biokompatible Gerüststruktur und Nanopartikel umfasst. Diese Strukturen sollen die extrazelluläre Matrix als natürliche Umgebung der Zellen nachbilden (DE102007020302A1 ).

DE10003521A1 beschreibt eine Vorrichtung zur Herstellung von dreidimensionalen Matrixkörpern, die aus einer Trägersubstanz und darin eingelagerten Zellkulturen bestehen, und deren Einsatz zur Kultivierung von Zellen in Multiwell-Platten.

US 2019/276784 A1 offenbart verschiedene komplexe Zellkulturvorrichtungen, die das Gelenk eines Säugetiers imitieren sollen. Die Zellkulturvorrichtung umfasst mehrere hohle Gerüste mit vielen Öffnungen, zur Aufnahme einer Matrix in dem Hohlraum des Gerüsts.

US 2007/237683 A1 offenbart eine Vorrichtung, die der besseren optischen Bildgebung von zweidimensionalen Zellkulturen dient. Die Vorrichtung umfasst eine Multiwell-Platte mit zylindrischen Einlässen ohne Boden, die die Wellstreifen halten. Die Wellstreifen umfassen ebenfalls zylindrische Vertiefungen, die in die Einlässe der Multiwell-Platte passen, aber einen durchsichtigen Boden haben, auf dem die Zellen kultiviert werden.

CA 2579680 A1 offenbart einen Bioreaktor mit einer Perfusionseinheit und einer Multiwell-Platte, die eine Vielzahl von Bioreaktor-Einheiten umfasst, in denen jeweils unterschiedliche Experimente durchgeführt werden können.

WO 2004/027016 A1 offenbart einen Perfusions-Inkubator mit einer peristaltischen Pumpe, der insbesondere zur Aufzucht von Embryonen verwendet werden kann.

Die Handhabung von scaffold-basierten Systemen und bereits bestehenden dreidimensionalen Zellkultursystemen gestaltet sich allerdings oftmals schwierig und eine Automatisierung der Zellkultur ist nur sehr schwer bis gar nicht möglich. Es besteht daher ein Bedarf an dreidimensionalen Zellkultursystemen, die robust und leicht zu handhaben sind und bevorzugt auch in einem automatisierten System geführt werden können.

KURZBESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, verbesserte Vorrichtungen zur in vitro Kultivierung tierischer und menschlicher Zellen zur Verfügung zu stellen. Insbesondere ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Zellkulturvorrichtungen zur Verfügung zu stellen, die eine vereinfachte Handhabung ermöglichen und deren Handhabung optional auch automatisiert werden kann.

Diese Aufgabe wird durch den Gegenstand der Erfindung gelöst. Die Verwendung von Scaffold -basierten Matrizen in automatisierten Zellkulturprozessen gestaltet sich aufgrund der Komplexität im Hinblick auf unterschiedliche Materialien und Techniken als schwierig. Aus diesem Grund wurde ein neues Zellkultursystem entwickelt in dem sowohl Hydrogele als auch poröse Stützstrukturen verwendet werden können. Insbesondere wurde eine Zellkulturvorrichtung in vertikaler Ausrichtung entwickelt, mit der Zellen in dreidimensionaler (3D) Umgebung kultiviert werden können. Das Ziel hierbei ist, den manuellen Aufwand möglichst zu reduzieren und Möglichkeiten für 3D-Kulturen aus Hydrogelen oder porösen Stützstrukturen für Medium- bis High-Throughput Anwendungen zu eröffnen.

Die vorliegende Erfindung umfasst eine Zellkulturvorrichtung für eine dreidimensionale Zellkultur mit einer oder mehreren Zellkultureinheiten, dadurch gekennzeichnet, dass eine Zellkultureinheit folgendes umfasst: i. mindestens eine Matrixhalterung (12), mit einer zentralen Öffnung (13) zur Aufnahme einer Matrix; ii. einen Träger (10), der fix oder reversibel mit der mindestens einen Matrixhalterung (12) verbunden ist; und iii. einen Wellstreifen (11), bestehend aus einem Gefäß mit mindestens einer Vertiefung, die mindestens eine Matrixhalterung (12) bis zum oberen Ende der zentralen Öffnung (13) oder mehr, umfassen kann, wobei die Matrixhalterung (12) vertikal ausgerichtet ist.

Der kompakte Aufbau der Zellkultureinheit erlaubt eine einfache Handhabe nicht nur einer, sondern auch mehrerer Matrixhalterungen.

Die zentrale Öffnung (13) der Matrixhalterung (12) kann eine durchgehende Öffnung (13a und 13c) oder eine Vertiefung mit einer Wand (13b) aufweisen.

Die Innenwände der Öffnung (13) können einen Winkel von 1-30° aufweisen, sodass die beiden Enden der Öffnung (13) einen unterschiedlichen Durchmesser haben können. Insbesondere können sie einen Winkel von etwa 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 oder 29° aufweisen.

Die vorliegende Erfindung umfasst auch eine Besiedelungsvorrichtung (30, 33).

In einer Ausführungsform der Matrixhalterung (12) weist die Öffnung (13) der Matrixhalterung eine Vertiefung (13c) zur Abdichtung und reversiblen Befestigung an eine Besiedelungsvorrichtung (30, 33) auf. Gemäß einer besonderen Ausführungsform umfasst die Besiedelungsvorrichtung (30, 33) Dichtungselemente (31). Die Besiedelungsvorrichtung kann Erhöhungen (32) aufweisen.

In einer weiteren Ausführungsform weist die Öffnung (13a) eine obere Vertiefung (13d) auf, um den Einschluss von Luftblasen in der Matrix während der horizontalen Besiedelung zu vermeiden.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Zellkulturvorrichtung, umfasst die zentrale Öffnung (13) eine Matrix, die ein fester poröser Träger oder ein Hydrogel ist, oder eine Kombination davon. Beispielsweise kann die Matrix ein fester poröser Träger sein, auf den ein Hydrogel aufgebracht wird und/oder der mit einem Hydrogel gefüllt ist.

Eine Zellkultureinheit kann mehrere Matrixhalterungen (12) umfassen. Insbesondere kann die Zellkultureinheit 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 oder 20 Matrixhalterungen (12) umfassen. Die Matrixhalterungen (12), die von einer Zellkultureinheit umfasst sind, können gleiche oder unterschiedliche Matrizen umfassen.

Insbesondere enthalten die Matrixhalterungen (12) einer Zellkultureinheit jeweils eine Matrix aus Hydrogel oder jeweils eine Matrix, die ein fester poröser Träger ist. Dies erlaubt die simultane Kultur von Zellen in derselben drei dimensionalen Umgebung, wobei das Medium in den Wells des Wellstreifens (11) ident oder unterschiedlich sein kann. Einerseits kann die Zusammensetzung des Mediums unterschiedlich sein, um beispielsweise den Einfluss des Mediums auf Zellwachstums zu untersuchen. Andererseits können, falls das Medium einen Testwirkstoff enthält, verschiedene Wirkstoffe oder verschiedene Konzentrationen eines Wirkstoffs, getestet werden.

Insbesondere umfasst eine Zellkultureinheit Matrixhalterungen (12) deren Matrix ein Hydrogel ist und Matrixhalterungen deren Matrix ein fester poröser Träger ist. Umfasst eine Zellkultureinheit verschiedene Matrixhalterungen (12), ermöglicht dies beispielsweise ein rasches Screening unterschiedlicher dreidimensionaler Umgebungen.

Insbesondere besteht die Matrix aus natürlichem, halbsynthetischem oder synthetischem Material oder einer Kombination davon. Optional kann die Matrix mit Protein- oder Peptid Sequenzen modifiziert oder beschichtet sein. Beispielsweise kann die Matrix Antikörper oder Antikörperfragmente oder RGD Sequenzen aufweisen. Insbesondere kann jegliches Material, das mit der Kultur von tierischen oder menschlichen Zellen vereinbar ist, als Material für die hierin beschriebene Matrix verwendet werden. Insbesondere ist das natürliche Material ausgewählt aus Kollagen, Fibrin, Glykosaminglykanen und Hyaluronsäure, und das synthetische oder halbsynthetische Material ausgewählt ist aus polymeren Bestandteilen wie Polymethylmethacrylat, Polymilchsäure, Polyglykol, Polystyrol und keramischen Bestandteilen wie Hydroxylapatit oder Trikalziumphosphat.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform weist der Träger (10) ein Element (15) zur Aufnahme der Matrixhalterung (12) auf und die Matrixhalterung (12) weist an ihrem oberen Ende Einkerbungen (14a, 14b) auf, über die sie reversibel mit dem Element (15) des Trägers (10) verbunden werden kann.

Gemäß einer weiteren besonderen Ausführungsform des Trägers (10) der Zellkulturvorrichtung, umfasst der Träger an mindestens einem Ende, bevorzugt an beiden Enden, eine Öffnung zur Befestigung einer magnetisierbaren Mutter (45), beispielsweise mittels Schraube. Insbesondere weist der Träger zusätzliche mehrere Öffnungen für Matrixhalterungen (46) auf, die beispielsweise mittels Befestigungszapfen (47) mit dem Träger verbunden werden können.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform umfasst die Vorrichtung zusätzlich eine Transporteinheit (20), welche eine oder mehrere Zellkultureinheiten (21) transportieren kann.

Insbesondere erleichtert die Transporteinheit (20) die Verwendung der gegenständlichen Zellkulturvorrichtung in einer automatisierten Umgebung. Mittels der Transporteinheit können eine oder mehrere Zellkultureinheiten bewegt und bedient werden. Insbesondere wird dadurch die Automatisierung bestimmter Prozesse möglich, wie beispielsweise automatisierter Medienwechsel oder automatisierte Besiedelung der Einheiten. Insbesondere kann die Automatisierung mittels eines Roboters erfolgen.

Gemäß einer bestimmten Ausführungsform umfasst die Transporteinheit: i. eine Tragschiene (22) zur Befestigung einer oder mehrerer Zellkultureinheiten (21) an der Transporteinheit (20), ii. eine Aufnahmeeinheit (20a) für eine Tragschiene (22), iii. einen Deckel (23), und iv. zwei Spacer-Elemente (24), die optional direkt miteinander verbunden sind, zur geordneten Aufnahme von mindestens zwei oder mehr Trägern (10) einer Matrixhalterung, v. optional mindestens ein Kennzeichnungselement (26) wie beispielsweise einen RFID-Chip oder einen Barcode, und vi. optional eine Zentriereinheit (27).

Insbesondere umfasst der Wellstreifen (11 ) eine Position (25) zur Befestigung an die Tragschiene (20).

Die Spacer-Elemente dienen der Aufnahme und geordneten Reihung der Zellkultureinheiten, die im Spacer über dem Träger (10) der Matrixhalterungen angebracht sind. Insbesondere sind die Zellkultureinheiten im Spacer (24) parallel angeordnet. Die Spacer-Elemente können fix oder reversibel miteinander verbunden sein oder auch nicht direkt miteinander verbunden sein, sondern nur über die Träger der Matrixhalterungen.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform umfasst die Transporteinheit (20): i) eine Platte (48), welche die Unterseite der Transporteinheit bildet, ii) Öffnungen in der Platte (48) zur Zentrierung der Transporteinheit auf der Platte (49), iii) Öffnungen in der Platte (48) für Verschraubungen (50), iv) eine weitere Platte (51), welche ungefähr auf mittlerer Höhe der Transporteinheit angebracht ist, v) magnetisierbare Metallstäbe (52), vi) eine Zentrierhalterung (54), vii) Öffnungen in der Platte (51) für die Zentrierhalterung (54), viii) und ein Zentrierobjekt (55).

Insbesondere dienen die magnetisierbaren Metallstäbe (52) zur reversiblen Verbindung mit einem Zellkultur-Roboter. Gemäß einem speziellen Beispiel dienen die magnetisierbaren Metallstäbe (52) als Andockpunkt zur reversiblen Verbindung mit einer robotisierten Einheit zum Transport der Transporteinheit, beispielsweise zur reversiblen Verbindung mit Magneten des Oli-MAT (erhältlich von LifeTaq-Analytics GmbH, Tulln an der Donau). Die Z-Achse des Oli-MAT verfügt über zwei Permanentmagneten, mit deren Hilfe die Transfereinheit von Position zu Position getragen werden kann. Durch einen kurzen Impuls können die Magneten kurzzeitig entmagnetisiert werden, was zum Abstellen der Transfereinheit führt.

Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein Verfahren zur Zellkultivierung unter Verwendung der hierin offenbarten Zellkulturvorrichtung.

Insbesondere umfasst das Verfahren die folgenden Schritte: i. Suspendieren der zu kultivierenden Zellen in einer angemessenen Menge eines Zellkulturmediums zur Bildung einer Zellsuspension, ii. Besiedeln der Matrix in der Öffnung (13) der Matrixhalterung (12) mit der Zellsuspension, iii. Übertragen der Matrixhalterung in einen Wellstreifen (11), insbesondere unter Verwendung des Trägers der Matrixhalterung (10), und iv. Inkubieren der Zellkulturvorrichtung, die die Zellen enthält, unter Bedingungen, die ein Zellwachstum ermöglichen.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform des hierin offenbarten Verfahrens, erfolgt die Besiedelung der Matrix mit der Zellsuspension in horizontaler Anordnung der Matrixhalterung (12).

Insbesondere weist die Matrixhalterung (12) der Zellkulturvorrichtung zur Verwendung in diesem Verfahren, eine Öffnung (13) mit einer Vertiefung (13c) auf, wobei die Matrixhalterung über ein komplementäres Dichtungselement (31) an einer Besiedelungsvorrichtung (30) reversibel mit dieser verbunden ist, wobei die verwendete Matrix ein Hydrogel ist und das Zellkultivierungsverfahren insbesondere die folgenden Schritte umfasst: i. Suspendieren der zu kultivierenden Zellen in einer angemessenen Menge eines Zellkulturmediums zur Bildung einer Zellsuspension, ii. Vermischen der Zellsuspension mit einem oder mehreren Bestandteilen eines Hydrogels, um eine Zellsuspension-Hydrogel Mischung herzustellen, iii. Besiedeln der Öffnung (13) der Matrixhalterung (12), die horizontal in der Besiedelungsvorrichtung (30) ausgerichtet ist, mit der Zellsuspension-Hydrogel- Mischung, iv. Inkubieren des Zellansatzes in einer geeigneten Kultivierungsumgebung, vorzugsweise bei 37°C und 5% CÖ2, bis zur Auspolymerisation der Matrix, v. Trennen der Matrixhalterung (12) von der Besiedelungsvorrichtung (30), vi. Übertragen der Matrixhalterung (12) in einen mit Medium befüllten Wellstreifen (11), bevorzugt unter Verwendung des Trägers der Matrixhalterung (10), vii. Inkubieren der Zellkulturvorrichtung, die die Zellsuspension-Matrix Mischung enthält, unter Bedingungen, die ein Zellwachstum ermöglichen.

Die Auspolymerisierung des Hydrogels kann insbesondere ungefähr 5 Minuten und bis zu 24 Stunden dauern. Die Dauer der Auspolymerisation ist typischerweise von der Zusammensetzung des Hydrogels, insbesondere seiner Bestandteile und deren Konzentration abhängig, sowie von der Umgebung, beispielsweise der Luftfeuchtigkeit und der Lufttemperatur. Der Fachmann ist in der Lage, dementsprechend die benötigte Zeit bis zur Aushärtung des Gels zu bestimmen.

Nach der Auspolymerisation der Zellsuspension-Hydrogel Mischung, kann eine weitere Schicht einer Zellsuspension-Hydrogel Mischung in die Matrix eingebracht werden. Die weitere Zellsuspension-Hydrogel Mischung kann andere Zellen als die erste Mischung, wie beispielsweise modifizierte Varianten der Zellen der ersten Mischung, enthalten. Die weitere Zellsuspension-Hydrogel Mischung kann die gleichen Zellen wie die erste Mischung enthalten, aber beispielsweise eine andere Hydrogel- Zusammensetzung.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform weist die Besiedelungsvorrichtung (30) eine innere Erhöhung (32) auf, die dafür sorgt, dass bei der Auspolymerisation der Zellsuspension-Hydrogel Mischung eine Vertiefung in der Öffnung (13) entsteht, welche nach Entfernen der Besiedelungsvorrichtung (30) mit der weiteren Zellsuspension- Hydrogel Mischung befüllt werden kann. Dies ermöglicht beispielsweise die Ko-Kultur unterschiedlicher Zellarten, oder die Kultur einer Zellart in unterschiedlicher dreidimensionaler Umgebung in einer Matrixhalterung (12).

Gemäß einerweiteren Ausführungsform des hierin offenbarten Verfahrens, wobei die Besiedelung der Matrix mit der Zellsuspension in horizontaler Anordnung der Matrixhalterung (12) erfolgt, weist die Öffnung (13) der Matrixhalterung (12) eine Vertiefung mit einer Wand (13b) auf, und die Matrix ist ein fester poröser Träger. Insbesondere umfasst das Verfahren die folgenden Schritte: i. Transfer eines festen porösen Trägers in die Vertiefung (13b), ii. Suspendieren der zu kultivierenden Zellen in einer angemessenen Menge eines Zellkulturmediums zur Bildung einer Zellsuspension, iii. Transferieren der Zellsuspension in die Öffnung (13b) der Matrixhalterung

(12), iv. Inkubieren der Besiedelungsvorrichtung für mindestens 30min bis 24h unter Bedingungen, die das Anwachsen der Zellen an dem festen porösen Träger ermöglichen, v. Übertragung der Matrixhalterung in einen zuvor mit Medium befüllten Wellstreifen (11), insbesondere unter Verwendung des Trägers der Matrixhalterung (10), und vi. Inkubieren der Zellkulturvorrichtung, die die angehefteten Zellen an den porösen Träger enthält, unter Bedingungen, die ein Zellwachstum ermöglichen.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform des hierein offenbarten Verfahrens erfolgt die Besiedelung der Matrix mit der Zellsuspension in vertikaler Anordnung der Matrixhalterung (12).

Insbesondere weist die Matrixhalterung (12) der Zellkulturvorrichtung zur Verwendung in diesem Verfahren, eine obere Öffnung (13d) auf, die Matrixhalterung (12) ist reversibel mit einer Besiedelungsvorrichtung (33) verbunden und die Matrix ist ein Hydrogel. Insbesondere weist das Verfahren die folgenden Schritte auf: i. Suspendieren der zu kultivierenden Zellen in einer angemessenen Menge eines Zellkulturmediums zur Bildung einer Zellsuspension, ii. Vermischen der Zellsuspension mit einem Hydrogel, um eine Zellsuspension-Hydrogel Mischung herzustellen, iii. Befüllen der Vertiefungen (Wells) der Besiedelungsvorrichtung (33) mit der Zellsuspension-Hydrogel-Mischung, iv. Besiedeln der Öffnung (13) der Matrixhalterung durch Eintauchen der Matrixhalterung (12) in die Besiedelungsvorrichtung (33), v. Inkubieren des Zellansatzes in einer geeigneten Kultivierungsumgebung, vorzugsweise bei 37°C und 5% CÖ2, bis zur Auspolymerisation der Matrix, vi. Übertragen der Matrixhalterung (12) von der Besiedelungsvorrichtung (33) in einen mit Nährmedium befüllten Wellstreifen (11), und vii. Inkubieren der Zellkulturvorrichtung, die die Zellsuspension-Matrix Mischung enthält, unter Bedingungen, die das Zellwachstum ermöglichen.

Um das Volumen möglichst gering zu halten, kann das Volumen der Wells der Besiedelungsvorrichtung (33) im Gegensatz zum Wellstreifen (11) reduziert sein. Die Besiedelungsvorrichtung (33) kann zusätzlich Befüllungselemente (40) aufweisen. Über die Befüllungselemente (40) können die Wells der Besiedelungsvorrichtung (33) mit Medium befüllt werden.

Insbesondere weist das Verfahren die folgenden Schritte auf, wenn eine Befüllungsvorrichtung (33) verwendet wird, die Befüllungselemente (40) aufweist: i. Suspendieren der zu kultivierenden Zellen in einer angemessenen Menge eines Zellkulturmediums zur Bildung einer Zellsuspension, ii. Vermischen der Zellsuspension mit einem Hydrogel, um eine Zellsuspension-Hydrogel Mischung herzustellen, iii. Einführen der Matrixhalterung in die Besiedelungsvorrichtung (33), iv. Befüllen der Wells der Besiedelungsvorrichtung (33) mit der Zellsuspension-Hydrogel-Mischung über die Befüllungselemente (40), wodurch die Öffnung (13) der Matrixhalterung mit der Zellsuspension-Hydrogel-Mischung besiedelt wird, v. Inkubieren des Zellansatzes in einer geeigneten Kultivierungsumgebung, vorzugsweise bei 37°C und 5% 5% CO2, bis zur Auspolymerisation der Matrix vi. Übertragen der Matrixhalterung (12) von der Besiedelungsvorrichtung (33) in einen mit Nährmedium befüllten Wellstreifen (11), und vii. Inkubieren der Zellkulturvorrichtung, die die Zellsuspension-Matrix Mischung enthält, unter Bedingungen, die Zellwachstum ermöglichen.

Gemäß einer weiteren besonderen Ausführungsform ist die Matrixhalterung zur Besiedelung horizontal ausgerichtet. In dieser Ausführungsform weist die Öffnung (13) der Matrixhalterung (12) eine Vertiefung mit einer Wand (13b) auf und die Matrix ist ein fester poröser Träger. Das Verfahren zur Besiedelung der Matrixhalterung in dieser Ausführungsform umfasst die Schritte: i. Transfer eines festen porösen Trägers in die Vertiefung (13b), ii. Suspendieren der zu kultivierenden Zellen in einer angemessenen Menge eines Zellkulturmediums zur Bildung einer Zellsuspension, iii. Transfer der Zellsuspension in die Öffnung (13b) der Matrixhalterung (12), iv. Inkubieren der Besiedelungsvorrichtung, insbesondere für mindestens 30min bis 24h, unter Bedingungen, die das Anwachsen der Zellen an dem festen porösen Träger ermöglichen.

Anschließend kann die Matrixhalterung in einen mit Zellkulturmedium befüllten Wellstreifen (11), insbesondere unter Verwendung des Trägers der Matrixhalterung (10), transferiert werden und die Zellen können in der Zellkulturvorrichtung, welche die an den porösen Träger angehefteten Zellen enthält, unter Bedingungen inkubiert werden, die ein Zellwachstum ermöglichen.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren kann der T ransfer der Matrixhalterungen in einen Wellstreifen, der T ransfer einer ganzen Zellkulturvorrichtung und/oder der Transfer eines Wellstreifens durch einen robotergestützten Greifarm automatisiert erfolgen.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Zellkulturvorrichtung ist der Wellstreifen eine Perfusionsvorrichtung (34), die Schlauchanschlüsse (41) zum An Schluss an eine Pumpe aufweist. Über diese Schlauchanschlüsse kann mittels einer Pumpe ein kontinuierlicher Fluss einer zellverträglichen Flüssigkeit, wie beispielsweise Zellkulturmedium, durch die Perfusionsvorrichtung geleitet werden.

Gemäß einerweiteren Ausführungsform umfasst die Zellkulturvorrichtung weiters eine Box (44) und einen Einsatz (42) zur Aufnahme einer oder mehrerer

Zellkultureinheiten (21) in der Box (44).

Gemäß einerweiteren Ausführungsform umfasst die Zellkulturvorrichtung weiters eine Box (44) und einen Einsatz (43) zur Aufnahme einer oder mehrerer

Besiedelungsvorrichtungen (33) in der Box (44).

FIGUREN

Figur 1 zeigt Bestandteile einer Ausführungsform der Zellkultureinheit (21), insbesondere Matrixhalterungen (12) mit verschiedenen Öffnungen (13a, 13b, 13c, 13d), einen Wellstreifen (11) und einen Träger (10).

Figur 2 zeigt Bestandteile einer Ausführungsform der Transporteinheit (20), insbesondere eine Aufnahmeeinheit (20a), mehrere Zellkultureinheiten (21), eine Tragschiene (22), einen Deckel (23), Spacer-Elemente (24), ein Kennzeichnungselement (26) und eine Zentriereinheit (27).

Figur 3 zeigt Besiedelungsvorrichtungen. Figur 3a) zeigt eine Besiedelungsvorrichtung (30) mit Dichtungselementen (31), die reversibel mit der Matrixhalterung (12) über die Vertiefung der Öffnung (13c) verbunden werden können. Figur 3b) zeigt eine Besiedelungsvorrichtung (30) die Erhöhungen (32) aufweist.

Figur 4 zeigt Bestandteile einer Zellkultureinheit und die Besiedelungsvorrichtung

(33) mit Befüllungselementen (40).

Figur 5 zeigt Bestandteile einer Zellkultureinheit und eine Perfusionsvorrichtung

(34) mit Schlauchanschlüssen (41).

Figur 6 zeigt Bestandteile einer Zellkultureinheit (10, 11, 12) und eine Box (44) und einen Einsatz (42) zur Aufnahme einer oder mehrerer Zellkultureinheiten in der Box.

Figur 7 zeigt Bestandteile einer Zellkultureinheit (10, 12) mit einer Besiedelungsvorrichtung (30), sowie eine Box (44) zur Aufnahme einer oder mehrerer Besiedelungsvorrichtungen.

Figur 8 zeigt eine weitere Ausführungsform eines Trägers (10) der Zellkulturvorrichtung mit einer Öffnung zur Befestigung einer magnetisierbaren Mutter mittels Schraube (45), mehreren Öffnungen im Träger für Matrixhalterungen (46), Befestigungszapfen einer Matrixhalterung (47) und der Matrixhalterung (12).

Figur 9 zeigt eine weitere Ausführungsform der Transporteinheit (20) umfassend mehrere Zellkulturvorrichtungen (21). Die Figur zeigt eine Platte (48) welche die Unterseite der Transporteinheit bildet, Öffnungen in der Platte (48) zur Zentrierung der Transporteinheit auf der Platte (49), Öffnungen in der Platte (48) für Verschraubungen (50), eine weitere Platte (51) welche ungefähr auf mittlerer Höhe der Transporteinheit angebracht ist, magnetisierbare Metallstäbe (52), eine Zentrierhalterung (54) und Öffnungen in der Platte (51) für die Zentrierhalterung (54) und ein Zentrierobjekt (55).

Figur 10 zeigt eine weitere Ausführungsform einer Besiedelungsvorrichtung (30) umfassend Dichtungselemente (31). Die Figur zeigt einen Träger (10) mit einer Matrixhalterung (12), die in die Besiedelungsvorrichtung eingebracht ist.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Verwendung von unterschiedlichen Matrizen in automatisierten Zellkulturprozessen gestaltet sich aufgrund der Komplexität im Hinblick auf unterschiedliche Materialien und Techniken als schwierig. Aus diesem Grund wurde ein System entwickelt in dem sowohl Hydrogele als auch feste poröse Träger verwendet werden können. Das Ziel bei der Verwendung automatisierter Prozesse ist, den manuellen Auswand möglichst gering zu halten.

Erfindungsgemäß eröffnet die gegenständliche Zellkulturvorrichtung die Möglichkeit dreidimensionale Zellkulturen mit einer Matrix aus Hydrogel und/oder porösen Stützstrukturen in automatisierten Medium- bis High-Throughput Anwendungen zu verwenden. Beispielsweise können somit Toxikologiestudien in einem automatisierten Umfeld in einer dreidimensionalen Zellkultur durchgeführt werden.

Die Erfindung betrifft Zellkulturvorrichtungen zur in vitro Kultivierung biologischer Zellen und von Gewebe sowie Kultivierungsverfahren unter Verwendung dieser Zellkulturvorrichtungen. Insbesondere sind die gegenständlichen Zellkulturvorrichtungen robust und leicht zu handhaben und ermöglichen die in vitro Kultivierung von Zellen in dreidimensionaler Umgebung. Ein weiterer besonderer Vorteil der gegenständlichen Zellkulturvorrichtungen ist, dass sie zur Verwendung in einer automationsgestützten Umgebung, beispielsweise in Kombination mit einem Roboter, geeignet sind. Durch den kompakten Aufbau der erfindungsgemäßen Zellkulturvorrichtung, insbesondere der Zellkultureinheiten, kann die Kultivierung verschiedener Zellarten in verschiedenen Umgebungen simultan ablaufen, wobei Variationen in der Kultivierung der Zellen, insbesondere durch menschliche Interaktion mit der Zellkulturvorrichtung, reduziert werden. Insbesondere können mehrere Replikate eines Zellkultursystems zeitgleich kultiviert werden.

Die gegenständliche Zellkulturvorrichtung umfasst mindestens eine Matrixhalterung, einen Träger zur Fixierung der Matrixhalterung und ein Gefäß mit mindestens einer in der Regel wannenförmigen Vertiefung (Well), das Wellstreifen genannt wird. Die erfindungsgemäße Zellkulturvorrichtung ist besonders dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine Matrixhalterung vertikal ausgerichtet ist.

Die Matrixhalterung ist insbesondere dadurch gekennzeichnet, dass sie aus einer äußeren Basisgrundform besteht und eine innere zentrale Öffnung umfasst. Diese Öffnung kann verschiedene Modifikationen und Formen aufweisen, beispielsweise kann sie eine durchgehende Öffnung sein oder eine Vertiefung mit einer rückseitigen Wand, die daher nur zu einer Seite hin offen ist. Dadurch wird ermöglicht, dass sowohl Hydrogele als auch feste poröse Träger verwendet werden können. Die Öffnung der Matrixhalterung kann durchgehend oder nicht-durchgehend sein, die Matrixhalterung kann beispielsweise eine rechteckige oder runde Öffnung aufweisen und beispielsweise als Zylinder, Quader, Pyramide, oder Würfel geformt sein.

Die Innenwände der Öffnung der Matrixhalterung können gerade sein oder einen Winkel von etwa 1 bis 25 Grad. Insbesondere können die inneren Wände der Öffnung der Matrixhalterung einen Winkel von etwa 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 oder 25 Grad aufweisen. Optional kann auch die Außenwand der Öffnung einen solchen Winkel aufweisen.

Dadurch können die beiden Enden der Öffnung einen unterschiedlichen Durchmesser aufweisen. Beispielsweise kann somit, wenn die Öffnung eine Vertiefung mit einer Wand ist, die rückseitige Wand einen kleineren Durchmesser aufweisen, als die vorderseitige Öffnung. Das hat den Effekt, dass Hydrogele geringer an der rückseitigen Wand haften und aus der Öffnung der Matrixhalterung leichter entfernt werden können. Dadurch können Schäden am Hydrogel und an den Zellen beim Entfernen aus der Matrixhalterung vermieden werden.

In einer besonderen Ausführungsform weist die Matrixhalterung auch rund um die innere zentrale Öffnung Modifikationen auf. Diese Modifikationen können beispielsweise weitere Vertiefungen rund um die Öffnung sein, wodurch eine Wand rund um die Öffnung entsteht. Diese Wand stellt insbesondere eine erhabene Rundung dar mit einer inneren wannenförmigen Öffnung, welche optional eine Wand aufweist, beispielsweise eine rückseitige Wand, oder durchgehend ist. Modifikationen dieser Art sind insbesondere dafür geeignet um die Matrixhalterung mit einer entsprechend kompatiblen Besiedelungsvorrichtung reversibel, beispielsweise über ein Stecksystem, zu verbinden.

In einer weiteren besonderen Ausführungsform weist die Matrixhalterung am oberen Rand der Öffnung eine Vertiefung oder auch eine Einbuchtung auf, wodurch Luftblasen aus dem Well entweichen können. Dadurch kann beispielsweise der Einschluss von Luftblasen in der Matrix, insbesondere während der Besiedelung, vermieden werden.

Es ist bekannt, dass mechanische Stimulation die Bildung von extrazellulären Matrixproteinen anregt. Gemäß einer besonderen Ausführungsform ist die Matrixhalterung aus weichem, elastischem Silikon unterschiedlicher Shorehärte geformt, wodurch mechanische Kräfte, wie etwa ziehen, dehnen oder drücken, auf die Matrixhalterung und somit auf die Zellen in der Matrix ohne negativen Effekt wirken können.

Die gegenständliche Zellkulturvorrichtung weist mindestens einen Träger auf, der fix oder reversibel mit mindestens einer Matrixhalterung verbunden ist. Bevorzugt ist der Träger dazu geeignet mehr als eine Matrixhalterung, insbesondere mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 oder mehr Matrixhalterungen fix oder reversibel aufzunehmen. Bevorzugt sind die Matrixhalterungen dabei in Längsrichtung angeordnet, insbesondere in einer Linie oder in parallelen Linien.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform, in der Matrixhalterungen reversibel mit dem Träger verbunden sind, umfasst der Träger Konstruktionen oder Elemente zur Aufnahme jeweils einer Matrixhalterung. Bevorzugt sind diese Konstruktionen oder Elemente in Längsrichtung angeordnet, insbesondere in einer Linie oder in parallelen Linien. Insbesondere weisen die Matrixhalterungen Elemente auf, wie beispielsweise Einkerbungen, die mit den Konstruktionen oder Elementen des Trägers kompatibel sind und dadurch reversibel mit dem Träger verbunden werden können. Beispielsweise können die Elemente des Trägers und die Einkerbungen einer Matrixhalterung ein Stecksystem darstellen, indem die Einkerbungen der Matrixhalterung in die Elemente des Trägers gesteckt oder geschoben werden.

Gemäß einer weiteren besonderen Ausführungsform weist der Träger Elemente zur fixen oder reversiblen Verbindung und Befestigung an eine Transporteinheit auf. Insbesondere weisen der Träger und die Transporteinheit kompatible Elemente auf über die Träger und Transporteinheit fix oder reversibel miteinander verbunden werden können. Beispielsweise können sie verbunden werden, indem eines der Elemente in das dazu passende Element geschoben oder gesteckt wird.

Gemäß einer weiteren besonderen Ausführungsform des Trägers der Zellkulturvorrichtung, umfasst der Träger an mindestens einem Ende, bevorzugt beiden Enden, eine Öffnung zur Befestigung einer magnetisierbaren Mutter, beispielsweise mittels Schraube. Insbesondere weist der Träger zusätzlich mehrere Öffnungen für Matrixhalterungen auf, die beispielsweise mittels Befestigungszapfen mit dem Träger verbunden werden können.

Bevorzugt ist die Mutter aus Eisen oder einem anderen magnetisierbaren Metall. Die Mutter kann durch Permanentmagneten, beispielsweise in einer separaten Konstruktion wie etwa einem Roboter, magnetisiert werden. Die separate Konstruktion kann beispielsweise ein Zellkulturroboter sein, beispielsweise Oli-Mat (erhältlich von LifeTaq-Analytics GmbH, Tulln an der Donau). Über die magnetisierbare Mutter kann der Träger reversibel mit der separaten Konstruktion verbunden werden und somit die Bewegung der Zellkultureinheit (beispielsweise in frisches Nährmedium) über den Träger ermöglichen. Zum Abstellen am Zielort, können die Träger durch physische Krafteinwirkung oder durch einen kurzen Impuls vom Magneten getrennt werden.

Die gegenständliche Zellkulturvorrichtung weist mindestens einen Wellstreifen auf, welcher aus einem Gefäß mit mindestens einer Vertiefung besteht. Diese Vertiefung kann mindestens eine Matrixhalterung, mindestens bis zum oberen Ende der zentralen Öffnung der Matrixhalterung, vollständig umfassen. Bevorzugt weist der Wellstreifen Vertiefungen auf, deren Anzahl mit der Anzahl an Matrixhalterungen auf einem Träger korrespondiert. Alternativ kann der Wellstreifen auch mehr Vertiefungen aufweisen als Matrixhalterungen auf einem Träger enthalten sind, und/oder mindestens eine der Vertiefungen des Wellstreifens kann mehr als eine Matrixhalterung aufnehmen. Optional weist der Wellstreifen nur eine Vertiefung auf, welche groß genug ist um alle Matrixhalterungen eines Trägers oder mehrerer Träger aufzunehmen. Umfasst eine Vertiefung des Wellstreifens mehrere Matrixhalterungen, so sind die Matrixhalterungen in Kontakt mit demselben Medium, wodurch beispielsweise Variationen in der Zusammensetzung des Mediums zwischen verschiedenen Vertiefungen vermieden werden können.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform weist der Wellstreifen ein Element zur fixen oder reversiblen Befestigung an die Transporteinheit auf. Optional weist der Wellstreifen auch eine Abschleif- oder Abstreifkonstruktion auf. Eine Abschleifkonstruktion ist insbesondere bei Verwendung der Zellkulturvorrichtung in einer automatisierten Umgebung, beispielsweise mit einem Roboter, hilfreich, da so das T ropfen von Zellkulturmedium beim Transport einzelner Einheiten vermieden werden kann.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform weist mindestens eine der Vertiefungen ein Insert auf, wodurch das Volumen der Vertiefung verringert wird. Beispielsweise kann hierdurch das benötigte Volumen an Zellkulturmedium oder Hydrogel verringert werden, wodurch die Kosten der Zellkultur erheblich gesenkt werden können. Durch Reduktion des Volumens kann auch die Menge an Reagenzien, die in dem Zellkultursystem an den Zellen getestet oder verwendet werden, reduziert werden.

Die Bestandteile der gegenständlichen Zellkulturvorrichtung können aus jeglichem Material bestehen, das in einem Zellkultursystem verwendet werden kann. Insbesondere bestehen die Komponenten der Zellkulturvorrichtung aus biokompatiblem und sterilisierbarem Material. Dazu zählen beispielsweise Materialien wie Silikon, Polycarbonat, Polystyrol, Polyethylen, Polysulfon (PSU), Polyphenylsulfon (PPSU) und andere üblicherweise in Zellkultursystemen verwendete Materialien.

Die hierin beschriebene Matrix kann ein fester poröser Träger oder ein Hydrogel, oder eine Kombination davon, sein. Beispielsweise kann die Matrix ein fester poröser Träger sein, auf den ein Hydrogel aufgebracht wird und/oder der mit einem Hydrogel gefüllt ist. Beispielsweise kann die poröse Matrix auch dehydriert sein. Im Speziellen kann die poröse Matrix ein Poly(L-Lactid) (PLLA) sein, das zu Mikrofasern verarbeitet ist, die hinsichtlich des Faserdurchmessers und der Porengröße sehr konsistent ist. Alternativ kann es sich um Polystyrene Scaffolds handeln die für die 3D Zellkultur geeignet sind. Insbesondere besteht die Matrix aus natürlichem, halbsynthetischem oder synthetischem Material, oder einer Kombination davon. Optional kann die Matrix mit Proteinen oder Peptiden modifiziert oder beschichtet sein. Beispielsweise kann die Matrix Antikörper, Antikörperfragmente oder RGD Sequenzen aufweisen. RGD- Sequenzen sind Aminosäure-Sequenzen enthaltend Arginin/Glycin/Asparagin. Diese Sequenzen kommen in Proteinen der EC-Matrix vor, beispielsweise

Fibronektin/Vitronektin. Zellen können über Integrine an diese binden.

Die poröse Matrix kann in die Matrixhalterung transferiert werden, sie kann alternativ aber auch mittels Lyophilisierung in der Matrixhalterung integriert sein.

Insbesondere kann jegliches Material, das mit der Kultur von tierischen Zellen vereinbar ist, als Material für die hierin beschriebene Matrix verwendet werden. Insbesondere ist das natürliche Material ausgewählt aus Kollagen, Fibrin, Glykosaminglykanen und Hyaluronsäure, und das synthetische oder halbsynthetische Material ausgewählt aus polymeren Bestandteilen wie Polymethylmethacrylat, Polymilchsäure, Polyglykol, Polystyrol und keramischen Bestandteilen wie Hydroxylapatit oder Trikalziumphosphat.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform wird die Matrix in der Matrixhalterung mit Proteinen oder Proteinbestandteilen aufbereitet. Hierbei wird das Hydrogel oder der feste poröse Träger in der Matrixhalterung gebildet. Nachfolgend kann die Matrix durch traditionelle Quervernetzungstechniken wie NHS-EDC oder Click-Chemie oder anderen Varianten mit funktionellen Proteinen wie Antikörpern, Wachstumsfaktoren oder extrazellulären Protein sowie mit funktionellen Peptiden funktionalisiert werden, wobei die unterschiedlichen Flüssigkeiten in unterschiedlichen Wellstreifen gelagert sind und die chemischen Reaktionen über den manuellen Wechsel von einem Wellstreifen zum nächsten erfolgt. Danach kann eine Besiedelung mit Zellen oder ein operativer Eingriff in einen tierischen Organismus erfolgen.

In dem gegenständlichen Zellkultursystem können sowohl adhärente Zellen als auch Suspensionszellen kultiviert werden.

Die zu kultivierenden Zellen sind bevorzugt eukaryotische Zellen, insbesondere tierische Zellen. Vorzugsweise sind die Zellen Säugerzellen, insbesondere bevorzugt menschliche aber auch nicht-menschliche, wie beispielsweise Nagetierzellen etwa von Maus, Hamster, Opossum, Potorous, oder Ratte, Insekten, bovine Zelllinien, Hund wie MDCK Zelllinien, Schwein etc.

Die Zellen können Stammzellen sein, z.B. omnipotent, pluripotent, multipotent oder unipotent, oder differenzierte Gewebezellen oder Blutzellen bzw. Lymphozyten sein. Die Zellen können von immortalisierten Zelllinien sein, z.B. Tumorzelllinien. Es ist möglich, dass die Zellen so kultiviert werden, dass eine Differenzierung stattfindet. Somit können Zellen den Differenzierungsgrad auch ändern. Dies sollte vorzugsweise durch die Kulturbedingungen festgelegt werden (z.B. Wachstums- oder Differenzierungsfaktoren).

Adhärente Zellen umfassen jegliche tierische, insbesondere menschliche, Zellen, die typischerweise in der biomedizinischen oder pharmazeutischen Forschung verwendet werden. Dazu zählen beispielsweise Stammzellen aus diversen Quellen wie dem Mesenchym, Fett, Leber, Gehirn oder anderen Quellen bzw. differenzierte Zellen wie Fibroblasten, Chondrozyten, Osteoblasten, Epithelzellen unterschiedlichen Ursprungs, Endothelzellen, neuronale Zellen, Hepatozyten sowie induzierte pluripotente Stammzellen embryonalen Ursprungs, und Zelllinien.

Suspensionszellen können beispielsweise Vorläuferzellen des Blutes oder differenzierte Blutzellen umfassen. Dabei können Suspensionszellen entweder in einer Hydrogelmatrix eingebettet werden oder als Suspension im Rahmen von Ko- Kulturstudien im Wellstreifen kultiviert werden, wobei im zweiten Fall eine adhärente Zellkultur in einer Matrix in der Matrixhalterung eingebettet ist. Beispielsweise können Interaktionsstudien zwischen Blutzellen als Suspension und mesenchymalen Stammzellen in einem Hydrogel in der Matrixhalterung durchgeführt werden.

Ein dreidimensionales Zellkultursystem bezeichnet die Kultivierung von Zellen in einer mikrostrukturierten dreidimensionalen Zellkultur unter in vitro Bedingungen. Die Kultur bzw. ihre Zellen sollen eine räumliche Orientierung einnehmen. Dies geschieht hauptsächlich in Form von Hydrogelen aus Gerüstproteinen wie etwa Fibrin, Kollagen, Gelatine-(Poly)Methacrylat oder Matrigel sowie aus festen Scaffolds wie beispielsweise aus Polystyrol Polylactatsäure oder anderen chemischen Substanzen. In einer dreidimensionalen Umgebung bilden viele Zelllinien Sphäroide aus, deren Durchmesser im Laufe der Zeit nach der Einbettung der Zellen anwächst. Auch nicht Sphäroid bildende Zellen zeigen oft eine Morphologie, die sich von 2D Kulturen stark unterscheidet.

Vorzugsweise wird in der erfindungsgemäßen Zellkulturvorrichtung und im erfindungsgemäßen Verfahren eine zellverträgliche Flüssigkeit eingesetzt, insbesondere Zellkulturmedium. In dieser Flüssigkeit werden vorzugsweise die oben beschriebenen Schritte ii) bis v) durchgeführt. Diese Flüssigkeit wird als Teil der komplexen zellulären Umgebung eingesetzt. Sie kann ein zum Wachstum der Zellen oder zur Zellversorgung geeignetes Medium sein. Definierte Zellkulturmedien basieren auf den Komponenten-Gruppen Aminosäuren, Kohlenhydrate, anorganische Salze und Vitamine. Häufig enthaltene Salze sind beispielsweise Calciumchlorid, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid und Mononatriumphosphat. Häufig enthaltene Vitamine sind beispielsweise Folsäure, Nicotinamid, Riboflavin und B12. Zusätzlich kann das Zellkulturmedium FCS (Fetal Calf Serum) oder FBS (Fetal Bovine Serum) enthalten. Bevorzugte Zellkulturmedien sind MEM, a-MEM, DMEM, RPMI und Variationen oder Abwandlungen davon.

Umfasst die erfindungsgemäße Zellkulturvorrichtung auch eine zellverträgliche Flüssigkeit, wie etwa Zellkulturmedium, und lebende Zellen so wird es auch als Zellkultursystem bezeichnet.

Insbesondere umfasst das Zellkultursystem das Behältnis und das Kulturmedium, nicht jedoch die spezielle atmosphärische Zusammensetzung. Somit können die Zellen in Schritt ii) des gegenständlichen Verfahrens aus dem Inkubator, in dem atmosphärische Bedingungen herrschen, die ein möglichst gutes Wachstum begünstigen sollen, herausgenommen werden. Die bevorzugten atmosphärischen Bedingungen für ein möglichst gutes Zellwachstum für tierische Zellen sind 35-38°C, besonders bevorzugt ungefähr 37°C, und 0-10% CO2, besonders bevorzugt 3-6% CO2.

Eine hier beschriebene Transporteinheit zum Transport der Zellkultureinheiten umfasst bevorzugt eine Tragschiene (22) zur Befestigung einer oder mehrerer Zellkultureinheiten, eine Aufnahmeeinheit (20a) für eine Tragschiene (22), einen Deckel (23), und zwei Spacer-Elemente (24), die optional direkt miteinander verbunden sind, zur geordneten Aufnahme von mindestens zwei oder mehr Trägern (10) einer Matrixhalterung. Optional kann die Transporteinheit ein oder mehrere Kennzeichnungselemente (26) wie beispielsweise einen RFID, Barcode oder QR Code umfassen, und/oder eine Zentriereinheit (27), speziell für automatisierte Prozesse. Die Transporteinheit besteht bevorzugt aus einem festen Material, beispielsweise einem Kunststoff, der bevorzugt temperaturbeständig und/oder säureresistent ist. Die einzelnen Elemente der Transporteinheit können aus dem gleichen Material oder aus verschiedenen Materialien bestehen.

Optional kann die hierin beschriebene Transporteinheit weiters eine Platte (48) welche die Unterseite der Transporteinheit bildet, Öffnungen in der Platte (48) zur Zentrierung der Transporteinheit auf der Platte (49), Öffnungen in der Platte (48) für Verschraubungen (50), eine weitere Platte (51) welche ungefähr auf mittlerer Höhe der Transporteinheit angebracht ist, magnetisierbare Metallstäbe (52), eine Zentrierhalterung (54), Öffnungen in der Platte (51) für die Zentrierhalterung (54), und/oder ein Zentrierobjekt (55) umfassen. Die magnetisierbaren Metallstäbe (52) ermöglichen eine reversible Verbindung mit einer externen Konstruktion, beispielsweise einem Roboter, der für die automatisierte Manipulation der Zellkulturen verwendet wird. Beispielsweise dienen die magnetisierbaren Metallstäbe (52) als Andockpunkt zur reversiblen Verbindung mit einer robotisierten Einheit zum Transport der Transporteinheit, beispielsweise zur reversiblen Verbindung mit Magneten des Oli-MAT (erhältlich von LifeTaq-Analytics GmbH, Tulln an der Donau). Die Z-Achse des Oli-MAT verfügt über zwei Permanentmagneten, mit deren Hilfe die Transfereinheit von Position zu Position getragen werden kann. Durch einen kurzen Impuls können die Magneten kurzzeitig entmagnetisiert werden, was zum Abstellen der Transporteinheit führt.

Zusätzlich beinhaltet das System noch je eine Vorrichtung zur Besiedelung in horizontaler und in vertikaler Orientierung.

Bei Besiedelung in vertikaler Anordnung werden die Zellen beispielsweise mit einem Hydrogel vermischt und in die Vorrichtung zur vertikalen Besiedelung, einem Wellstreifen, mittels Pipette transferiert. Nachfolgend wird die Matrixhalterung mit der Vorrichtung für die Matrixhalterung in das Hydrogel getaucht, bis dieses auspolymerisiert. Danach wird die Matrixhalterung vorsichtig in einen mit Medium befüllten Wellstreifen transferiert, wobei nur eine definierte Menge in der inneren Öffnung des auspolymerisierten Hydrogels mit entsprechenden Zellen mittransferiert wird. Je nach Konzentration der Hydrogelkomponenten kann die Polymerisierung wenige Minuten bis Stunden dauern. Dementsprechend muss die Kultur gegebenenfalls in einen Inkubator überführt werden. Um Luftblasen in der Öffnung während der Polymerisation zu vermeiden, kann die Matrixhalterung in diesem Fall eine kleine Öffnung in der vertikalen Oberfläche, oberhalb der Öffnung aufweisen.

In einer anderen Variante der vertikalen Besiedelung wird zuerst die Matrixhalterung in die Vorrichtung zur vertikalen Besiedelung transferiert und nachfolgend das Hydrogel mit Zellen hinzugefügt. Nach der Auspolymerisierung erfolgt wiederum der Transfer in einen mit Medium befüllten Wellstreifen.

Alternativ kann die Besiedelung im Falle von Hydrogelen in horizontaler Anordnung mit einer horizontalen Besiedelungsvorrichtung erfolgen. Hierbei wird die Matrixhalterung mit der Vorrichtung zur Befestigung der Matrixhalterung an der Besiedelungsvorrichtung zuvor befestigt. Danach erfolgt die Vermischung der Zellen mit dem Hydrogel und der Transfer dieser Mischung in die Öffnung der Matrixhalterung. Nach Auspolymerisation wird die Vorrichtung von der Matrixhalterung manuell gelöst und in einen mit Medium befüllten Wellstreifen transferiert. Durch diese Anordnung kann das Volumen im Vergleich zur vertikalen Anordnung um mindestens den Faktor 5 reduziert werden.

Bei der horizontalen Besiedelung kann die Besiedelungsvorrichtung mit einem Plateau versehen sein. Nach Besiedelung wie oben beschrieben wird die Matrixhalterung von der horizontalen Besiedelungsvorrichtung gelöst, wobei eine Vertiefung auf der Rückseite des Hydrogels entsteht. In einer besonderen ausführungsform ist auf dieser Vertiefung dann eine Besiedelung mit einem weiteren Zelltyp, beispielsweise epithelialen Ursprungs wie Endothelzellen eines Blutgefäßes oder Epithelzellen des Darms möglich und kann eine Barriere-artige Struktur bilden.

Im Falle von porösen festen Trägern erfolgt die Besiedelung bevorzugt in horizontaler Anordnung. In diesem Fall weist die zentrale Öffnung eine Vertiefung mit einer Wand auf. Auf dieser Wand liegt der poröse Träger auf, auf dem Zellen direkt besiedelt werden können, wobei in dieser Anordnung das Konstrukt für mehrere Stunden bis zu einem Tag in einen Inkubator transferiert werden kann. Nach erfolgter Besiedelung kann die Matrixhalterung in einen mit Medium befüllten Wellstrip überführt werden. Je nach Träger kann vor der Besiedelung der Träger in mehreren Schritten dehydriert werden. Dies kann im Vorfeld erfolgen, indem die Vorrichtung mit den Matrixhalterung von einem mit Flüssigkeit gefüllten Wellstreifen in einen anderen mit Flüssigkeit gefüllten Wellstreifen transferiert wird. Nach Besiedelung kann ein nachfolgender Medienwechsel durchgeführt werden, indem die Vorrichtung mit den Matrixhalterung und der dreidimensionalen Zellkultur von dem alten Wellstreifen mit altem Medium in einen neuen, zuvor mit frischem Medium befüllten, Wellstreifen transferiert wird. In einer besonderen Ausführungsform kann der Transfer der Wellstreifen mit den Matrixhalterungen auch mit Hilfe der Transporteinheit oder eines robotergestützten Greifarms automatisiert erfolgen.

Für eine langfristige Kultivierung von Zellen in der Matrix als Hydrogel oder porösem abbaubaren Träger kann die Kultur gemäß einer besonderen Ausführungsform dezellularisiert werden, um eine extrazelluläre Matrix zellfrei zu erhalten. Beispielsweise können hierbei mesenchymale Stammzellen in Osteoplasten, Chondrozyten oder Adipozyten über mehrere Wochen differenziert werden und schlussendlich die erhaltene Matrix mit einem Standard-Dezellularisierungsprotokoll zellfrei gemacht werden.

In einer anderen möglichen Variante wird auf eine Vorkultur in 2D komplett verzichtet und das Passagieren der Zellen in 2D vermieden. In diesem Fall werden Zellen in niedriger Konzentration (<5000-10000/Well) auf der Matrixhalterung, entweder als Hydrogel oder als fester poröser Träger besiedelt und bis zu einer hohen Konzentration kultiviert. Nachfolgend wird die Matrix aufgelöst oder die Zellen mittels enzymatischer Reaktion vom Träger gelöst und für eine nächste Besiedelung wiedergewonnen.

In einer anderen Ausführung kann die Matrixhalterung mit Zellen und einer Hydrogel-Matrix gefüllt sein und in eine Vorrichtung zur Perfusion transferiert werden, wobei eine kontinuierliche oder periodische Strömung initiiert werden kann.

Die erfindungsgemäße Zellkulturvorrichtung kann in einer Box, optional mit einem speziellen Einsatz zur Aufnahme der Vorrichtungen aufbewahrt oder transportiert werden. Im Speziellen, kann die Box weitere Elemente zur Temperierung oder Kühlung bzw. Elemente zur Temperaturkontrolle und/oder Temperaturaufzeichnung oder Sensoren zur CO2 bzw. 02-Messung aufweisen. Des Weiteren kann die Box eine Isotherm-Box sein.

Die Matrixhalterung, beispielsweise aus Silikon, kann alternativ in ein Bioreaktorsystem mit Perfusion transferiert werden. Beispielsweise können Zellen in niedriger Konzentration angezüchtet werden, wenn die Zellzahl zu groß für eine rein statische Kultur wird, kann die Matrixhalterung in ein größeres Gefäß oder Bioreaktorsystem mit Perfusion transferiert werden. Dies erlaubt Initiierung einer kontinuierlichen oder periodischen Strömung.

Verschiedene Verfahren zur Verwendung der erfindungsgemäßen Zellkulturvorrichtung sind hier beschrieben. Dafür kann die Matrixhaltung horizontal oder vertikal ausgerichtet sein. Im Speziellen werden die für die Kultivierung verwendeten Elemente sterilisiert, insbesondere autoklaviert. Die verwendeten Zellen können für die Kultivierung vorbereitet werden, insbesondere durch Waschen und Kontakt mit Proteasen die jene Proteine abbauen, die den Zellverband aufrechterhalten, beispielsweise Trypsin. Dadurch können die Zellen von einem Träger abgelöst, vereinzelt und im weiteren Verfahren suspendiert werden. Zur Erhöhung der Zelldichte können die Zellen auch zentrifugiert werden. Die Zellzahl für das Einbetten oder Besiedeln der Matrix kann von der Fachperson bestimmt werden, die Zellzahl kann beispielsweise bei etwa 1000-100000 Zellen pro Matrix liegen. Die Matrixhalterung kann in einen Wellstreifen (11) übertragen werden, insbesondere unter Verwendung des Trägers der Matrixhalterung (10). Die Bedingungen für das Besiedeln der Matrix in der Öffnung (13) der Matrixhalterung (12) mit der Zellsuspension können für die jeweiligen Zelltypen individuell angepasst werden, beispielsweise kann die Temperatur bei etwa 30°C bis 38°C liegen, beispielsweise bei etwa 37°C für Säugetierzellekulturen.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann die Zellkulturvorrichtung eine oder mehrere Elektroden umfassen. Insbesondere, sind die Elektroden derart angeordnet, dass die zu kultivierenden Zellen elektrisch stimuliert werden können. Bevorzugt befinden sich die Elektroden im Wellstreifen, insbesondere in einer oder mehrerer der Vertiefungen des Wellstreifens.

Die Erfindung umfasst weiters folgende Ausführungsformen:

1 . Zellkulturvorrichtung für eine dreidimensionale Zellkultur mit einer oder mehreren Zellkultureinheiten, dadurch gekennzeichnet, dass eine Zellkultureinheit (21) umfasst: i. mindestens eine Matrixhalterung (12), mit einer zentralen Öffnung (13) zur Aufnahme einer Matrix; ii. einen Träger (10), der fix oder reversibel mit der mindestens einen Matrixhalterung (12) verbunden ist; und iii. einen Wellstreifen (11), bestehend aus einem Gefäß mit mindestens einer Vertiefung, die mindestens eine Matrixhalterung (12) bis zum oberen Ende der zentralen Öffnung (13) oder mehr, umfassen kann, wobei die Matrixhalterung (12) vertikal ausgerichtet ist.

2. Die Zellkulturvorrichtung nach Punkt 1 , wobei die zentrale Öffnung (13) der Matrixhalterung (12) eine durchgehende Öffnung (13a und 13c) oder eine Vertiefung mit einer Wand (13b) ist.

3. Die Zellkulturvorrichtung nach Punkt 1 oder 2, wobei die zentrale Öffnung (13) eine Matrix umfasst, die ein fester poröser Träger oder ein Hydrogel ist, oder eine Kombination davon.

4. Die Zellkulturvorrichtung nach einem der Punkte 1 bis 3, wobei die Matrix aus natürlichem, halbsynthetischem oder synthetischem Material besteht, oder einer Kombination davon.

5. Die Zellkulturvorrichtung nach Punkt 4, wobei das natürliche Material ausgewählt ist aus Kollagen, Fibrin, Glykosaminglykanen und Hyaluronsäure, und das synthetische oder halbsynthetische Material ausgewählt ist aus polymeren Bestandteilen wie Polymethylmethacrylat, Polymilchsäure, Polyglykol, Polystyrol und keramischen Bestandteilen wie Hydroxylapatit oder Trikalziumphosphat. 6. Die Zellkulturvorrichtung nach einem der Punkte 1 bis 5, wobei der Träger (10) ein Element (15) zur Aufnahme der Matrixhalterung (12) aufweist und die Matrixhalterung an ihrem oberen Ende Einkerbungen (14a, 14b) aufweist, über die sie reversibel mit dem Element (15) des Trägers (10) verbunden werden kann.

7. Die Zellkulturvorrichtung nach einem der Punkte 1 bis 6, wobei die Vorrichtung mindestens 5, insbesondere mindestens 10 Matrixhalterungen (12) umfasst.

8. Die Zellkulturvorrichtung nach einem der Punkte 1 bis 7, wobei die Vorrichtung zusätzlich eine Transporteinheit (20) umfasst, welche eine oder mehrere Zellkultureinheiten (21) transportieren kann.

9. Die Zellkulturvorrichtung nach Punkt 8, wobei die Transporteinheit (20) umfasst i. eine Tragschiene (22) zur Befestigung einer oder mehrerer Zellkultureinheiten (21) an der Transporteinheit (20), ii. eine Aufnahmeeinheit (20a) für eine Tragschiene (22), iii. einen Deckel (23), und iv. zwei Spacer-Elemente (24), die optional direkt miteinander verbunden sind, zur geordneten Aufnahme von mindestens zwei oder mehr Trägern (10) einer Matrixhalterung, v. optional mindestens ein Kennzeichnungselement (26) wie beispielsweise einen RFID-Chip oder einen Barcode, und vi. optional eine Zentriereinheit (27).

10. Die Zellkulturvorrichtung nach Punkt 8 oder 9, wobei der Wellstreifen (11 ) eine Position (25) zur Befestigung an die Tragschiene (20) umfasst.

11. Die Zellkulturvorrichtung nach Punkt 8 oder 9, wobei die Zellkultureinheiten im Spacer (24) parallel angeordnet sind.

12. Verfahren zur Zellkultivierung unter Verwendung der Zellkulturvorrichtung nach einem der Punkte 1 bis 11.

13. Verfahren nach Punkt 12, umfassend die Schritte i. Suspendieren der zu kultivierenden Zellen in einer angemessenen Menge eines Zellkulturmediums zur Bildung einer Zellsuspension, ii. Besiedeln der Matrix in der Öffnung (13) der Matrixhalterung (12) mit der Zellsuspension, iii. Übertragen der Matrixhalterung in einen Wellstreifen (11), insbesondere unter Verwendung des Trägers der Matrixhalterung (10), und iv. Inkubieren der Zellkulturvorrichtung, die die Zellen enthält, unter Bedingungen, die ein Zellwachstum ermöglichen.

14. Verfahren nach Punkt 13, wobei die Besiedelung der Matrix mit der Zellsuspension in horizontaler Anordnung der Matrixhalterung (12) erfolgt.

15. Verfahren nach Punkt 14, wobei die Öffnung (13) der Matrixhalterung (12) eine Vertiefung (13c) zur Befestigung aufweist und über ein komplementäres Dichtungselement (31) an einer Besiedelungsvorrichtung (30) reversibel mit dieser verbunden ist, und die Matrix ein Hydrogel ist, umfassend die Schritte i. Suspendieren der zu kultivierenden Zellen in einer angemessenen Menge eines Zellkulturmediums zur Bildung einer Zellsuspension, ii. Vermischen der Zellsuspension mit einem oder mehreren Bestandteilen eines Hydrogels, um eine Zellsuspension-Hydrogel Mischung herzustellen, iii. Besiedeln der Öffnung (13) der Matrixhalterung (12), die horizontal in der Besiedelungsvorrichtung (30) ausgerichtet ist, mit der Zellsuspension-Hydrogel- Mischung, iv. Inkubieren des Zellansatzes in einer geeigneten Kultivierungsumgebung, vorzugsweise bei 37°C und 5%CÖ2, bis zur Auspolymerisation der Matrix, v. Trennen der Matrixhalterung (12) von der Besiedelungsvorrichtung (30) vi. Übertragen der Matrixhalterung (12) in einen mit Medium befüllten

Wellstreifen (11), bevorzugt unter Verwendung des Trägers der Matrixhalterung (10), vii. Inkubieren der Zellkulturvorrichtung, die die Zellsuspension-Matrix

Mischung enthält, unter Bedingungen, die Zellwachstum ermöglichen.

16. Verfahren nach Punkt 13, wobei die Besiedelung der Matrix mit der Zellsuspension in vertikaler Anordnung der Matrixhalterung (12) erfolgt.

17. Verfahren nach Punkt 16, wobei die Öffnung (13) der Matrixhalterung (12) eine obere Öffnung (13d) aufweist und die Matrixhalterung (12) reversibel mit einer Besiedelungsvorrichtung (33) verbunden ist, und die Matrix ein Hydrogel ist, umfassend die Schritte i. Suspendieren der zu kultivierenden Zellen in einer angemessenen Menge eines Zellkulturmediums zur Bildung einer Zellsuspension, ii. Vermischen der Zellsuspension mit einem Hydrogel, um eine

Zellsuspension-Hydrogel Mischung herzustellen, iii. Befüllen der Wells der Besiedelungsvorrichtung (33) mit der Zellsuspension-Hydrogel-Mischung, iv. Besiedeln der Öffnung (13) der Matrixhalterung durch Eintauchen der Matrixhalterung (12) in die Besiedelungsvorrichtung (33), v. Inkubieren des Zellansatzes in einer geeigneten Kultivierungsumgebung, vorzugsweise bei 37°C und 5% 5% CÖ2, bis zur Auspolymerisation der Matrix, vi. Übertragen der Matrixhalterung (12) von der Besiedelungsvorrichtung (33) in einen mit Nährmedium befüllten Wellstreifen (11), und vii. Inkubieren der Zellkulturvorrichtung, die die Zellsuspension-Matrix

Mischung enthält, unter Bedingungen, die Zellwachstum ermöglichen.

18. Verfahren nach Punkt 16, wobei die Öffnung (13) der Matrixhalterung (12) eine obere Öffnung (13d) aufweist und die Matrixhalterung (12) reversibel mit einer Besiedelungsvorrichtung (33) verbunden ist, die Befüllungselemente (40) umfasst, und die Matrix ein Hydrogel ist, umfassend die Schritte i. Suspendieren der zu kultivierenden Zellen in einer angemessenen Menge eines Zellkulturmediums zur Bildung einer Zellsuspension, ii. Vermischen der Zellsuspension mit einem Hydrogel, um eine

Zellsuspension-Hydrogel Mischung herzustellen, iii. Einführen der Matrixhalterung in die Besiedelungsvorrichtung (33), iv. Befüllen der Wells der Besiedelungsvorrichtung (33) mit der Zellsuspension-Hydrogel-Mischung über die Befüllungselemente (40), wodurch die Öffnung (13) der Matrixhalterung mit der Zellsuspension-Hydrogel-Mischung besiedelt wird, v. Inkubieren des Zellansatzes in einer geeigneten Kultivierungsumgebung, vorzugsweise bei 37°C und 5% 5% CO2, bis zur Auspolymerisation der Matrix, vi. Übertragen der Matrixhalterung (12) von der Besiedelungsvorrichtung (33) in einen mit Nährmedium befüllten Wellstreifen (11), und vii. Inkubieren der Zellkulturvorrichtung, die die Zellsuspension-Matrix

Mischung enthält, unter Bedingungen, die Zellwachstum ermöglichen.

19. Zellkulturvorrichtung nach einem der Punkte 1 bis 7, wobei der Wellstreifen eine Perfusionsvorrichtung (34) ist, und die Perfusionsvorrichtung Schlauchanschlüsse (41), optional zur Verbindung an eine Pumpe, aufweist. 20. Zellkulturvorrichtung nach einem der Punkte 1 bis 7, zusätzlich umfassend eine Box (44) und einen Einsatz (42) zur Aufnahme einer oder mehrerer

Zellkultureinheiten (21) in der Box (44).

21. Zellkulturvorrichtung nach einem der Punkte 1 bis 7, zusätzlich umfassend eine Box (44) und einen Einsatz (43) zur Aufnahme einer oder mehrerer

Besiedelungsvorrichtungen (30).

BEISPIELE

Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter beschrieben, ohne auf diese konkreten Ausführungsformen der Erfindung notwendigerweise limitiert zu sein.

Beispiel 1:

Besiedeln einer Hydrogel Matrix mit Zellen unter Verwendung der horizontalen Besiedelunqsvorrichtunq (30) und anschließende Kultivierung der Zellen in einer Zellkultureinheit

Der Träger mit den Matrixhalterungen (13c) wurde mit der Besiedelungsvorrichtung (30) verbunden und gemeinsam autoklaviert. Anschließend wurde eine 2D-Kultur aus mesenchymalen Stammzellen 2x mit DPBS ohne Ca/Mg gewaschen und trypsiniert. Die gelösten Zellen wurden danach in Medium mit Serum aufgenommen und in 50ml Falcon überführt. Als nächstes wurden diese mittels Ultrazentrifuge bei 0.3RPM 5min zentrifugiert und der Überstand verworfen. Im nächsten Schritt erfolgte die Zugabe von neuem Medium ohne Serum und darüber hinaus wurde eine Zellzählung durchgeführt. Darauffolgend wurden die Zellen erneut bei 0.3RPM für 5min zentrifugiert und der Überstand verworfen. Für 50 Matrixhalterungen wurde eine 5ml Zell-Fibrinogen-Thrombin-Lösung vorbereitet. Je nach Ausgangskonzentration von Fibrinogen und Thrombin werden unterschiedliche Volumina verwendet. In dem vorliegenden Beispiel wurde das Zellpellet in 1 ,75ml Medium ohne Serum aufgenommen, sodass eine Zellzahl zwischen 1000-100000 Zellen pro Matrix eingearbeitet wurde. Danach erfolgte die Zugabe von 750mI rekonstituiertes Fibrinogen, sodass eine Konzentration von 5mg/ml an Fibrinogen erreicht wurde. Als Nächstes wurde 2mI einer Thrombin Stammlösung (8000U/ml) in 250mI 40mM CaCh (~64U/ml) überführt. Von dieser Lösung wurden 40mI in 2,5ml 40mM CaCh transferiert (~1 U/ml). 45mI der Zell-Fibrinogen-Lösung wurden mittels Pipette in eine Matrixhalterung (12) pipettiert. Anschließend wurden vorsichtig je 45mI Thrombin-Lösung (Zielkonzentration Fibrinogen ~2,5mg/ml Thrombin 0.5U/ml) ohne Luftblasen zu jedem Zell-Fibrinogen- T ropfen hinzugefügt und zur Auspolymerisation in einen Inkubator bei 37°C mit 5% CO2 transferiert. Nach der Polymerisation wurde die Besiedelungsvorrichtung (30) manuell von der Matrixhalterung (12) gelöst und der Träger mit der auspolymerisierten Matrix- Zell-Lösung in einen neuen Wellstreifen (11) mit je ~1 -1 ,5ml frischem Medium transferiert und in einen Inkubator (37°C/5%C02) überführt.

Beispiel 2:

Besiedeln einer Hydrogel Matrix mit Zellen unter Verwendung der vertikalen Besiedelunqsvorrichtunq (33) und anschließende Kultivierung der Zellen in einer Zellkultureinheit

Die Besiedelungsvorrichtung (33) und ein Träger mit den Matrixhalterungen (13a) wurden gemeinsam autoklaviert. Eine 2D-Kultur aus mesenchymalen Stammzellen wurde 2x mit DPBS ohne Ca/Mg gewaschen und trypsiniert. Die gelösten Zellen wurden anschließend in Medium mit Serum aufgenommen und in 50ml Falcon überführt. Danach erfolgte eine Zentrifugation mittels Ultrazentrifuge bei 0.3RPM für 5min und der Überstand danach verworfen. Im nächsten Schritt erfolgte die Zugabe von neuem Medium ohne Serum und eine Zellzählung wurde durchgeführt. Darauffolgend wurden die Zellen nochmals bei 0.3RPM für 5min zentrifugiert und der Überstand erneut verworfen. Für 5 Matrizen wurden 5ml Zell-Fibrinogen-Thrombin-Lösung vorbereitet. Je nach Ausgangskonzentration von Fibrinogen und Thrombin werden unterschiedliche Volumina verwendet. In diesem Fall wurde das Zellpellet in 1 ,75ml Medium ohne Serum aufgenommen, sodass eine Zellzahl zwischen 50000-250000 Zellen pro Matrix eingearbeitet werden konnte. Danach erfolgte die Zugabe von 750mI rekonstituiertes Fibrinogen, sodass eine Konzentration von 5mg/ml an Fibrinogen erreicht wurde. Anschließend wurden 2mI einer Thrombin Stammlösung (8000U/ml) in 250mI 40mM CaCh (~64U/ml) überführt. Von dieser Lösung wurden 40mI in 2,5ml 40mM CaCh transferiert (~1 U/ml). Als nächstes wurde die Fibrinogen-Zell-Lösung mit der Thrombin- Lösung vermischt und 0.5ml-1ml in die Besiedelungsvorrichtung (33) transferiert. Sobald die Lösung in der Besiedelungsvorrichtung war, wurde der Träger schnell in die Matrixhalterung eingetaucht und die Besiedelungsvorrichtung bis zur Auspolymerisation in einem Inkubator bei 37°C und 5%C02 gelagert. Nach erfolgter Polymerisation wurde der T räger vorsichtig aus der Besiedelungsvorrichtung nach oben gezogen und in einen neuen Wellstreifen mit frischem Medium transferiert und in einen Inkubator (37°C/5%C0 ₂ ) überführt. Beispiel 3:

Besiedeln einer festen porösen Matrix und anschließende Kultivierung der Zellen in einer Zellkultureinheit

Ein Träger mit den Matrixhalterungen ohne Öffnung (13b) und mehrere Wellstreifen (11) wurden gemeinsam autoklaviert. In diesem Fall wurde eine poröse dehydrierte Matrix (beispielsweise „Alvetex“ Reprocell oder „Mimetix“ TheElectroSpinningCompany) mittels Pinzette in die Matrixhalterung transferiert. Alternativ könnte die Matrix mittels Lyphilisierungsschritten bereits in der Matrixhalterung integriert sein. Im nächsten Schritt wurde die Matrix nach Angaben der Hersteller mittels Ethanols rehydriert und gewaschen. Für eine effiziente Handhabung wurden hierbei die eingesetzten Flüssigkeiten in mehrere parallele Wellstreifen transferiert, sodass der Träger von einem Wellstreifen schnell in den anderen getaucht werden konnte.

Eine 2D-Kultur aus mesenchymalen Stammzellen wurde 2x mit DPBS ohne Ca/Mg gewaschen und trypsiniert. Die gelösten Zellen wurden anschließend in Medium mit Serum aufgenommen und in 50ml Falcon überführt. Danach erfolgte wiederum eine Zentrifugation mittels Ultrafuge bei 0.3RPM 5min zentrifugiert und anschließender Entfernung des Überstands. Im nächsten Schritt wurde neues Medium mit Serum hinzugefügt und eine Zellzählung durchgeführt. Danach wurden die Zellen wieder bei 0.3RPM für 5min zentrifugiert und der Überstand verworfen. Für 50 Matrixhalterungen wurde eine 5ml Zell-Lösung vorbereitet, wobei die Anzahl der Zellen zwischen 1000- 20000 Zellen pro Matrix betrug. Der Träger mit den Matrixhalterungen wurde horizontal aufgelegt und 90mI Zellsuspension in die Öffnung auf die Matrix transferiert. Nachfolgend wurde das Konstrukt in einen Inkubator für 12-24h bei 37°C und 5%CÖ2 bis zu Anheftung der Zellen an die Matrix kultiviert. Nach der Anheftung erfolgte der Transfer des Trägers in einen neuen Wellstreifen mit frischem Medium und dessen nachfolgender Kultivierung in einen Inkubator (37°C/5%CÖ2).