[0001]單一化學成份是藥物研究領域的主要方 向，作用機理明確，絕大多數現代藥 物都是單一的化學成份藥物 ，而多物質及多化學成份的藥物（如複合成份 藥物及中藥）因 原料 、分子量、分子結構、沸點、旋光度、皂化值 、碘值、崩解度、溶解度與揮發度 等各項物理及生化指標不同 ，存在難以掌握的化學複雜性及多變性，在藥 物學研究 中 ，物質與化合及化學物數量越多，其相互間分 子物理及生物化學反應越複雜，產生 的結果也越難以預料及掌握 ，使複合藥物的研究困難度遠髙於單一化學成 份的藥物， 為尋求生物功能多樣性及有效性以帮助人類健 康治療 、抗衰老的功能性產品開發及研 究 ，在已知單一物質功能以外尋求更多的新藥物 及治療功能，多種天然物質複合是藥 物研究領域與功能性產品技術努力突破的方向 之一 ，多種天然物質及分子複合時因複 合物數量與分子成份交叉多及生物化學反應複 雜 ，在複合過程中會產生眾多的不確定 性 ，但是在產生不確定性的同時，產生藥用治療 功能作用的機率也隨之増加及提髙， 而一些新產生的功能效果往往是單一化學成份 及單一物質所完全不可能產生及存在 的 ，所以利用含多種化學成份的天然物質或以複 合方式尋找新的治療疾病功能，在醫 藥研究及功能產品開發方面具有潛力與發展空 間 。 摘 要：

[0002；]本發明中的一個實施例包括以天然提 取物為主製成的皮膚外用的產品來治療 及改善關節退化和骨質疏鬆症 、幫肋恢復活動能力及消除疼痛。同時，在另 一個實施 替换页 （细则第 26条） 例中 ，透過皮膚外用的天然提取物，可改善關節退 化和骨質疏鬆症、増加骨强度、幫 肋恢復活動能力及消除疼痛 。在一個實施例中 ，對於包括但不限於女性使用者，透過 皮膚外用的天然提取物在關節部位塗擦 ，不但能改善該關節之退化關節炎和骨質疏鬆 症等症狀 ，也能舒緩或調解女性更年期所產生的疼痛與 症狀，恢復活動能力。又在例 一個實施例中 ，本發明之天然提取物包括有效成分是禾本科 ( Gramineae )岩蘭草 vetiveria zizanioides及其同科屬植物，例如香根草 vetiver (chrysopogon zizanioides) 或 Andropogon zizanioides提取物 (以下統稱蘭草)。在另一個實施例中本發明之� ��然提取 物包括有效成分是傘形科 (Apiaceae)紅蘿蔔 ( Daucus carota )提取物，除此之外，在一 個實施例中 ，本發明之天然提取物包括蘭草與紅蘿蔔提取 物。

[0003]在本發明實施例中的皮膚外用能透皮吸 收避免消化液破壞及肝臟首過作用減 效 ，能治療激素異常，使雌二醇恢復正常，能將 骨質疏鬆症異常的雌二醇恢復致骨質 疏鬆症前水平 ，阻止骨鈣丟失及向血、尿轉移，提昇骨强度 ，預防骨折及治療骨質疏 鬆症 。 圖示簡單說明

[ ₀₀₀ 4]具有本領域技術人員可能領會到圖檔中� ��元素是用來說明簡單明瞭，所以並 非所有的連貫和選擇都表現出來 。例如，在商業上可行的實施例中有用或必要 的常見 但廣為人知的要素通常不能加以描述 ，以便對本披露的這些各種實施例的較少阻礙 。 可以進一步理解的是 ，而本領域技術人員可能理解，實際上不需要 序列方面的這種特 殊性 。也可以理解，本案使用的用語和用語可就其 相應的調查和研究領域作出定義， 替换页 (细则第 26条) 除非此處另有規定的具體含義 。

[0005；]圖 1為條形圖顯示動物實驗中藥物處理前大鼠體� �。

[0006；]圖 2 為條形圖顯示動物實驗中藥物處理後第 1天大鼠體重。

[0007；]圖 3 為條形圖顯示動物實驗中藥物處理後 20天大鼠體重。

[0008；]圖 4 為條形圖顯示動物實驗中 SDTL-E對去除卵巢模型大鼠血清鹼性磷酸酶 的影響 。

[oooq圖 5 為條形圖顯示動物實驗中 SDTL-E對去除卵巢模型大鼠雌二醇含量的影 塑 。 詳細說明

[0010]物質由不同的分子及分子結構所組成， 每一物質都有不同的分子式、空間結 構及功能作用 ，在所有的物質空間中 ，物質的內外所處空間或分子交叉空間與所產 生 的功能作用是一個變量及比量關係 ，而其比量因為其它比量的因素參予變量改變 ，而 會使之產生不同的功能變化及結果 ，在同一環境空間中複合化學成份的種類、數 量多 少及相互比例是一種比量的動態與靜態平衡關 係 ，而相互的比量平衡對於物質的功能 產生與消失以及功能的效果強弱具有重要的影 響 ，在同一所處空間中不同物質及分子 的數量越多其分子交叉點越多 ，集束及變化比量也越多、空間中的比量變化 過程也越 複雜 、變化比量也越難以掌握。而物質及分子在同 一空間的比量因素越少，其中的分 子交叉點及比量變化也越少 ，物理空間中的過程變量也越少，變化度及其 比量結果也 越少 。物質的品種選擇是否適當與相互比例是否適 合與何種使用方式（如口服、注射、 替换页 （细则第 26条） 皮膚外用等方式），都會影響其功能作用及效 用結果，天然植物能通過複雜成份與未知 生化反應或電子置換反應及不同的使用方式 ，可能產生一些新的藥物治療功能及效 果 ，而這些效果正是研究者所努力或期待的結果 ，可能會給人們帶來意外的驚喜。

[0011]在自然界中 ，骨骼是脊椎生物主要器官組織之一，功能之 一是支撐、保護身 體及通過關節與肌肉 、神經組織使生物體保持運動能力 ，骨骼有儲藏礦物質等功能， 主要由骨質 、骨髓和骨膜構成，骨關節（Articulation） 是骨與骨之間能活動與變換角度 的部位 ，其間有軟骨、關節嚢、韌帶及滑液，所有的 骨關節功能障礙疾病都會導至生 物體（包括人體）運動及活動能力下降或完全 喪失。骨質疏鬆症及退化性關節炎（又稱退 行性關節炎） 是骨科及運動能力障礙方面最主要疾病之一， 全世界患者人數衆多，在 發達先進國家及地區患者比未發達地區普遍 ，多存在於 40以上年齡人群 （絕經期後女 性尤多），並向年輕人群發展趨勢明顯，有資 料顯示數年前全球僅退化性關節炎患者就 已超過 8億人，退化性關節炎及骨質疏鬆症疾病嚴重� �響人們活動能力及生活自理能 力 。現代醫學治療骨關節退化及骨質疏鬆以手術 、注射及口服藥物方式為主，能有效 並迅速治療退化性關節及骨質疏鬆症並改善關 節活動能力的藥物極少 ，能有效並迅速 治療退化性關節及骨質疏鬆症的外用藥物更是 幾乎沒有 。

[0012]在疾病治療領域，外用藥物均是通過皮 膚給藥的方式，藥物起效時間及藥用 治療效果普遍明顯低於口服及注射方式的給藥 效果 ，本發明是利用選定天然植物提取 物的分子多樣性及分子集束複合 （混合）而產生功能作用，能以包括不限於皮 膚外用 形式應用於骨關節退化及骨質疏鬆疾病的臨床 治療及改善症狀 ，具有治療抽筋、 肌肉 替换页 （细则第 26条） 疼痛及青 、中、老年退化性 (退行性) 關節炎的關節異響、關節疲軟、肌肉無力、疼 痛 、下蹲困難、無法上下樓梯等症狀的功能作用 ，能改善骨質疏鬆症的激素異常與髖 關節疼痛 ，増加骨强度及提昇抗骨折的能力。本發明實 施例能快速減輕、消除及治療 骨關節退化及疏鬆產生的臨床症狀 ，適用者不分年齡及人種、性別，可應用於各 種生 物 ，包括但不限於貓、狗等動物，容易操作。

[0013；]本方法之提取物可以多種工藝方法取 得，包括蒸餾、壓榨及超臨界提取。本 發明可延伸應用於各領域 ，包括日用化工、化妝、護膚、保健及藥品， 能以各種形式 及劑型應用 ，包括皮膚外用及乳液劑型。

[0014]退化性關節炎及骨質疏鬆症全世界患者 衆多，並向年輕化發展，關節炎的關 節異響 、關節疲軟、肌肉無力、疼痛、下蹲困難、無 法上下樓梯等行動不便臨床症狀 及骨質疏鬆症如骨密度 、疼痛等臨床症狀普遍存在，給眾多患者、家 庭及社會造成嚴 重困擾及沉重負擔 ，現代治療方法除關節置換手術、關節玻尿酸 注射、口服葡萄胺、 口服補鈣及人工化學藥物治療方式外 ，對退化性關節炎及骨質疏鬆症尚無其它具明 顯 效果治療改善方法 。骨質疏鬆症是一種新陳代謝的疾病，患者因 骨質密度減少極易發 生疼痛 、骨折及併發症死亡現象，補鈣、補充維生素 D及運動雖是應對方法之一，但 效果有限 ，如非甾體抗炎藥雙氯芬酸 (Diclofenac)用於關節炎及骨質疏鬆症的體外治 療 ，但因孕婦禁用及副作用較多，美國食品藥物 管理局 (F D A )懷孕用藥制度將此藥品 分級為 C中度風險和 D髙度風險，產生的副作用有胃部不適、噁心� �吐、胃灼熱、腹 瀉 、便秘、脹氣、頭痛、嗜睡、頭暈等，而其它 藥物均存在治療周期長、副作用多、 替换页 (细则第 26条) 不能連續使用的缺陷 。

[0015]本發明有對人體及動物副作用小特點， 僅知的不良反應是如果出汗時使用， 因皮膚單向排汗機制使皮膚出現極少量局部性 小紅點現像 ，停止使用約两日紅點即自 行消失 。

[0016；]天然植物或提取物是天然藥物原料來 源之一，提取單一化合物（如青蒿素、 葉黃素 、欖香烯等）已廣泛應用於醫藥、美容及相關 產業或產品，並廣泛應用於抗衰 老及天然藥物的產生 ，單一化合物在提取過程中能通過現代工藝技 術將對人體有害的 重金屬 、農藥殘留等有害物質摒除，提供了更好及當 量濃度更髙的藥物原料，單一化 合物功能較簡單明確 ，效果較清晰，作用靶點及藥理較易清楚了解 。天然植物與生物 之間具有較佳的生物認受性及相容性 ，而天然提取物中化合物因分子集束現象，而 能 對不同細胞 、作用位點及功能異常的酶（ Enzyme）產生抑制、提昇等調節作用。

[0017]因全球植物衆多，借鑒一些傳統醫學、 醫藥如中醫藥理論及知識，結合各種 物理 、生物化學方法對眾多植物進行充分瞭解、分 析、評估及研究後，從眾多植物中 苢 0選了生薑 Zingiber officinale、辣椒 Capsicum annuum、洋蔥 Allium cepa、大宗宗 Allium sativum、胡椒 Piper nigrum、花椒（辛辣類）； 佛手相 Citrus medica var. sarcodactylis擰檬 Citrus limon、桂 Citrus reticulata、青撤欖 Canarium album（果類）； 玫瑰 Rosa rugosa、薰 衣草 Lavandula、岩蘭草 Andropogon zizanioides、當是帚 Angelica sinensis、香茅 Cymbopogon（芳香油類）； 菊花 Cymbopogon、茶花 Camellia japonica '桂花 Osmanthus fragrans（花葉類）； 黑木耳 Auricularia auricula、白木耳 Tremella fuciformis、紅藻 替换页 （细则第 26条） Rhodophyta（含膠質類）； 髙麗蔘 Panax ginseng、西洋蔘 Panax quinquefolius '黨蔘 Codonopsis pilosula、） ^' 少參 Adenophora stricta Codonopsis pilosula（暮材 I頁）； 黃瓜 Cucumis sativus、紅蘿蔔 Daucus carota、南瓜 Cucurbita cv、絲瓜 Luffa aegyptiaca（瓜果 類） 等多類天然植物及提取物作為最佳候選物，再 將每一種物質給予膝關節退化及骨 質疏鬆症患者的自願人群皮膚外用 1次，即時與數小時後詢問其状况及感覺。在� �個 實施例中 ，從試用者反映中發現禾本科岩蘭草 vetiveria zizanioides及其同科屬植物， 例如香根草 vetiver（chrysopogon zizanioides） 或 Andropogon zizanioides提取物對膝關節 疼痛現象有舒緩疼痛作用（約小於 2小時），亦對關節僵硬及活動能力有改善作� �。在 另一個實施例中 ，發現紅蘿蔔 Daucus carota提取物對關節僵硬及疼痛也有改善作用。 爾後 ，選定將岩蘭草 vetiveria zizanioides及其同科屬（如香根草 vetiver（chrysopogon zizanioides） 或 Andropogon zizanioides提取物）與紅蘿蔔 Daucus carota提取物複合，或 再與其它提取物進行複合 ，以尋求更佳、更快、更明顯的功能作用及治 療效果。

[0018]在一個實施例中 ，本發明是一種以天然植物岩蘭草 vetiveria zizanioides及其 同科屬（如香根草 vetiver（chrysopogon zizanioides） 或 Andropogon zizanioides的提取物 皮膚外用治療及改善關節退化和骨質疏鬆症的 方法 ，提取物可與其它介質或物質溶 合 ，包括油脂 （但不限於油脂、 提取物、 溶劑），在一個實施例中 ，提取物與溶劑在 1 ~9 : 9 ~1的重量比例範圍，在一個實施例中 ，重量比例範圍為 1~7 : 3~9，在一個實施 例中 ，重量比例範圍為 1~5 :5~9，皮膚外用有減緩關節疼痛、僵硬等作用� �

[0019]在一個實施例中 ，本發明是一種以天然植物岩蘭草 vetiveria zizanioides及其 替换页 （细则第 26条） 同科屬 (如香根草 vetiver (chrysopogon zizanioides) 或 Andropogon zizanioides的提取物 與紅蘿蔔 Daucus carota提取物複合的配方，能以皮膚外用方式治 療及改善關節退化和 骨質疏鬆症 ，配方由岩蘭草 vetiveria zizanioides及其同科屬（如香根草 vetiver （chrysopogon zizanioides） 或 Andropogon zizanioides的提取物為主要成份，在 ^_ 個實施 例中 ，再與紅蘿蔔 Daucus carota提取物複合而成， 在一個實施例中 ，两提取物相互 間重量比例範圍為 1~9 : 2~9 ;在一個實施例中 ，比例範圍為 1.5~7.5 : 2.5~8.5 ;在一個 實施例中 ，比例範圍為 1~5 : 4.5~8。

[0020；]在一個實施例中 ，本發明中皮膚外用能將去卵巢大鼠骨質疏鬆 症的異常雌激 素及血清鹼性磷酸酶含量恢復至骨質疏鬆症前 的正常水準 ，對雌激素缺少引起的骨質 疏鬆有生理性的改變 、治療與保護作用，能應用於與骨關節退化及 骨質疏鬆相關的疾 病治療 。

[0021]在一個實施例中 ，本發明皮膚外用能治療人體骨質疏鬆症的髖 關節疼痛及關 節退化的關節異響 、關節無法彎曲、關節疲軟、肌肉無力、下蹲 困難、上下樓梯困難 皮骨强度降低 ，是一種治療疾病的方法。

[0022]在本發明中 ，提取物可以用各種生產工藝方法取得，包括 蒸餾、萃取、超臨 界等 ，配方能與其它物質再次複合或溶合，能以各 種不同形式及劑型，例如液體、乳 液 、噴霧、塗抹等。

[0023]在一個實施例中 ，本發明能改善人體退化性關節炎及骨質疏鬆 症臨床症狀， 改善關節活動能力 ，増加關節活動幅度及減輕關節疼痛，有改善 關節異響、改善關節

8 替换页 （细则第 26条） 無法彎曲 、改善關節疲軟、改善肌肉無力、改善下蹲困 難、改善上下樓梯困難等臨床 症狀的效果 ，並具有改善骨質疏鬆症髖關節疼痛的功能作 用。

[0024]在一個實施例中 ，本發明能調節激素水平，能應用於改善骨關 節退化與骨質 疏鬆症 ，及激素異常引致的身體不適現象。

[00 ²⁵ ]芳香酶 ( Aromatase )被稱為雌激素合成酶 ( estrogen synthetase ) ^• 能催化與 甾體激素合成過程中從雄激素到雌激素的芳香 化反應 ，催化雄烯二酮、睾酮向雌酮及 雌二醇转化 ，芳香酶在生殖腺、腦、脂肪組織、血管、皮 膚和骨骼中均有存在，芳香 酶反應速度可由辅酶 ( coenzyme )調節。 SDTL-E的骨質疏鬆症大鼠實驗結果提示， SDTL-E具有芳香化加速輔酶 ( Aromatization Acceleration Coenzyme )作用，其提取物複 合所產生的芳香化加速辅酶集束 [ Aromatization Acceleration Coenzyme Cluster (AACC) ] 對芳香酶 ( Aromatase )有調節作用，其機制可能是通過激活芳香酶 ( Aromatase )酶 促反應 ( Enzyme catalysis )使異常的激素水平，包括雌二醇恢復正常及� �異常多 ALP 活性 、血清鈣、尿鈣等恢復正常，促使了破骨細胞 與成骨細胞對身體的作用，而呈現 出將異常激素恢復致正常水平及促進骨强度恢 復的藥物治療效果 。

[0026]實施例：

[0027]在以岩蘭草 vetiveria zizanioides及其同科屬 (如香根草 vetiver (chrysopogon zizanioides) 或 Andropogon zizanioides提取物複合其它提取物的組合中發現� ��岩蘭草與 紅蘿蔔提取物複合後有更明顯止痛増效作用外 ，還増加了改善關節僵硬、關節異響、 關節彎曲及關節活動能力的功能效果 ，所以選擇將天然植物岩蘭草 vetiveria zizanioides 替换页 (细则第 26条) 及其同科屬 (如香根草 vetiver (chrysopogon zizanioides) 或 Andropogon zizanioides提取 物與紅蘿蔔 Daucus carota提取物共同組成複合配方（以下簡稱為 SDTL-E）。本發明將此 2天然提取物在比例範圍內混合 ，作為本發明中的複合配方，試用於人體及動 物，並 根據動物實驗及人體使用統計 ，証實了本發明配方及使用方法具有實用性強 、功效明 顯 、起效快速、作用廣泛及使用方便的獨特優點 ，並可與其它提取物及包括不限於化 合物 、化學物、油脂、溶劑、水、乳液等物質再次 複合或相溶合，能以包括不限於滴 液 、噴霧、塗抹、敷塗等方式使用於皮膚，能使 用於包括不限於人體，本發明在動物 及人體的實施例如下：

[0028]實施例 _ :

[0029]激素缺乏是造成絕經後骨質疏鬆及關節 退化的主要成因之一，而在小腸、成 骨細胞 、破骨細胞前體、骨細胞和生長骨板等軟骨細 胞中均有激素受體，絕經後雌激 素水準下降及血清鹼性磷酸酶含量増加是女性 發生關節退化及骨質疏鬆的最主要原因 之一 ，遂以本發明方法中一個實施例中之混合物配 方 （以下簡稱 SDTL-E） 使用在去卵 巢（ovariectomized, 0VX） 骨質疏鬆模型大鼠皮膚，觀察大鼠體內數據變 化。最終實驗顯 示皮膚外用治療大鼠後 ，去卵巢模型大鼠血清鹼性磷酸酶含量降低恢 復到接近正常水 準 （ P<0.01），去卵巢模型大鼠雌激素上昇恢復到 接近正常水準 （ P<0.01）。（見附件 1. 動物實驗 J

[0030；]在一個實施例中 ，顯示本 SDTL-E可以提髙生物大鼠體內雌激素及降低大鼠 血 清鹼性磷酸酶含量至正常水準 ，具有平衡去卵巢模型大鼠雌激素及血清鹼性 磷酸酶含

10 替换页 （细则第 26条） 量的作用 ，具治療關節退化及骨質疏鬆症的潛在研究與 實際應用價值。在一個實施例 中 ，選用的去卵巢大鼠實驗模型文献資料豐富， 技術成熟且穩定可靠，是世界衛生組 織 WHO 及美國國家衛生研究院 (NIH)均推薦使用的 OVX大鼠研究的最佳模型。

[0031]在一個實施例中 ， SDTL-E配方是以岩蘭草提取物為主要與紅羅蔔 Daucus camta提取物共同進行複合，在一個實施例中 ， 2提取物複合前單獨震盪並攪拌＞10 秒 ，在一個實施例中 ， 2提取物相互間重量比例範圍為 1〜 9 : 2〜 9 ;在一個實施例 中 ，比例範圍為 1.5〜 7.5 : 2.5〜 8.5 ;在一個實施例中 ，比例範圍為 2〜 5 : 4.5〜 8。在 一個實施例中 ，兩物混合約在＞4°C以上環境可以＞40轉 /秒混合攪拌＞5秒後 (視實際配 比總重量最終決定増加攪拌時間)靜置，可以� �其它溶劑如油脂溶合，在一個實施例 中 ，與油脂溶合在 1 ~9 : 9 ~1的重量比例範圍有效，在一個實施例中 ，重量比例範圍 為 1~7 : 3~9，在一個實施例中 ，重量比例範圍為 1~5 :5~9，外抹皮膚使用於實驗動 物 ，結果顯示對模型大鼠早期的鹼性磷酸酶 Alkaline phosphatase (ALP)代償性升髙具有 下調作用 ，對大鼠雌二醇激素有増加作用，能減輕骨質 疏鬆動物骨吸收亢進，有恢復 雌激素及血清鹼性磷酸酶的治療功能及平衡作 用 ，對雌激素缺少引起的骨質疏鬆的病 理性改變具有保護與治療作用 ，能迅速増加骨强度，増加抗骨折能力 ，可以研究發展 成為治療骨關節退化及骨質疏鬆症的藥物 。 (見附件 1. 動物實驗 J

[0032]實施例二：

[0033]在一個實施例中 ，先以天然植物岩蘭草 vetiveria zizanioides及其同科屬 (如香 根草 vetiver (chrysopogon zizanioides) 或 Andropogon zizanioides的提取物以溶劑稀釋

11 替换页 (细则第 26条) （酒精、油脂等） ，使用於人體退化性關節炎膝部位皮膚 ， 在一個實施例中 ，提取物與 溶劑在 1 ~9 : 9 ~1的重量比例範圍有效， 在一個實施例中 ，重量比例範圍為 1~7 :

3~9 在一個實施例中 ，重量比例範圍為 1~5 :5~9，做為溶劑有減緩及改善關節疼痛、 僵硬的作用 ， 在一個實施例中 ，使用於人體退化性關節炎膝部位皮膚時每日 2次，每 次 0. 4m I ， 8人試用 ，於使用 2小時後統計 ， 在一個實施例中 ，其中 4人關節疼痛僵 硬症狀有減緩趨勢（趨勢率為 50%）能保持約 2小時左右 ， 在一個實施例中 ，顯示出岩蘭 草單一提取物對關節退化疼痛 、僵硬症狀都有改善作用。在一個實施例中 ，經多方面 分析考慮後 ，將岩蘭草、紅蘿蔔 2物提取物組成 SDTL-E配方作為人體皮膚外用試劑 ， 使用於關節退化患者（自願使用者）膝關節皮 膚處 ，觀察效果並作統計。

[0034]在一個實施例中 ， SDTL-E配方由岩蘭草 vetiveria zizanioides及其同科屬（如香 根草 vetiver（chrysopogon zizanioides） 或 Andropogon zizanioides與紅蘿葡 Daucus carota 提取物複合而成 ， 在一個實施例中 ， 2提取物複合前單獨震盪並攪拌＞10秒 ， 在一個實 施例中 ， 2提取物相互間重量比例範圍為 1〜 9 : 2〜 9 ; 在一個實施例中 ， 比例範圍為 1.5〜 7.5 : 2.5〜 8.5 ; 在一個實施例中 ， 比例範圍為 2〜 5 : 4.5〜 8。在一個實施例中 ， 2 物混合在＞4°C以上環境以＞40轉 /秒混合攪拌＞5秒（視實際總重量最終决定増� ��攪拌時 間）後靜置， 在一個實施例中 ，再與油脂溶合 ， 在一個實施例中 ，與油脂溶合在 1 ~9 : 9 ~1的重量比例範圍 ， 在一個實施例中 ，重量比例範圍為 1~7 : 3~9 ， 在一個實施例中 ， 重量比例範圍為 1~5 :5~9， 在一個實施例中 ， 外抹皮膚使用於人體 ， SDTL-E以 23名 患有膝關節障礙年齡 50 -96歲人士試用 ， 在一個實施例中 ，每日使用 2次 ，每次 0. 4

12 替换页 （细则第 26条） m l 48小時統計 23人中 21人症狀得到明顯改善（2人無效） ， 在一個實施例中 ，有效 率為 92.93 %（見表 1）， 在一個實施例中 ， SDTL-E 配方及皮膚外用方法顯示出明顯的 減輕人體退化性關節炎臨床症狀 、増加關節活動幅度、改善關節活動能力及行 走運動 能力的功能治療作用（見表 1）。

[0035]再另以 17名患有骨質疏鬆症髖關節疼痛的 55-81歲人士試用 ，每日 1次 ，每 次 0.4 m I ， 20分鐘及 48小時調查， 17人中 16人症狀明顯改善（1人無效） ，統計有效 率為 94.118 %。（見表 2）

[0036]表 1 :

[0037]實施例二

[0038]退化性關節炎皮膚外用 SDTL-E每日 2次 ，每次 0. 4 m I。

[0039]效果統計表 ，統計人數 23人 （男性 11人、女性 12人、年齡 50 -96歲）

13 替换页 （细则第 26条）

[0040]退化性關節炎每日皮膚外用 SDTL-E每日 2次 ，每次 0. 4 m I。

[0041]約 20分鐘、 4 8小時調查表，調查人數 23人 （男性 11人、女性 12人、年齡 -96歲）

14 替换页 （细则第 26条）

15 替换页 （细则第 26条）

16 替换页 （细则第 26条） 注： 表中無效者可能是使用者不是退化性關節炎或 是其它炎症患者

[0042]表 2 :

[0043]骨質疏鬆髖關節疼痛每日 1次，每次 0. 4 m I SDTL-E皮膚外用

[0044] 48小時效果統計表，統計總數 17人（男性 4人、女性 13人、年齡 55-81歲）

[0045]骨質疏鬆髖關節疼痛每日 2次，每次 0.4 m I， SDTL-E皮膚外用。

[0046] 48小時效果調查表，統計人數 17人（男性 4人、女性 13人、 55-81歲 ）

17 替换页 （细则第 26条） 注： 表中無效者可能是使用者不是骨質疏鬆症或是 其它炎症患者。

[0047]在一個實施例中 ，人體試用顯示出單一岩蘭草 vetiveria zizanioides及其同科 屬（女口香根草 vetiver（chrysopogon zizanioides） 或 Andropogon zizanioides的提耳又物有改 善關節疼痛及僵硬的作用 ，在一個實施例中 ，而 SDTL-E複合配方比單一岩蘭草提取物 治療作用更快速 ，效果也更顯著，在一個實施例中 ，經動物實驗証實， SDTL-E配方對 去卵巢大鼠雌激素有提昇作用 ，對血清鹼性磷酸酶含量有降低作用，另觀察 數例皮膚

18 替换页 （细则第 26条） 外用於貓或狗 ，對關節活動障礙也有改善的效果，能應用於 其它動物的治療用途，且 配方可與包括不限於油液 、乳霜的其它物質製成不同的劑型使用。

[0048]除了以上的實驗數據外，附件二至四提 供其他支持本發明特性的實驗報告， 包括 SDTL-E對細胞活力的影響及比較； SDTL-E對細胞內活性氧的影響； SDTL-E不同比 例組合物對細胞鉀離子通道的活性影響 。

[0049]儘管是可變的並且取決於應用，但是使 用在此揭示的方法或成分的實例。熟 習此項技術者將會認識到 ，有些步驟可以以任何實際的順序進行，從而 以期望的用途 製成成分或化合物 。

[0050；]以上描述和圖式僅解釋和說明本發明 ，本發明不限於此。雖然說明書是關於 某些實行方案或實施例來描述的 ，但是出於說明的目的闡述了許多細節。因此 ，上述 內容只是說明了本發明的原則 。例如，本發明可以具有其他具體形式而不背 離其精神 或本質特徵 。所描述的佈置是說明性的而不是限制性的。 對於熟習此項技術者而言， 本發明容許附加的實行方案或實施例 ，並且本申請中所描述的這些細節中的某些細 節 可以在不脫離本發明的基本原理的情況下有相 當大的變化 。應意識到熟習此項技術者 能設計出各種方案 ，這些方案雖然並未明確描述或顯示於本文中 ，但是體現本發明的 原則 ，因此在其範圍和精神內。

[0051]上述說明具有說明性，沒有限制性。在 審查披露時，實施例的許多變化可能 會變得明顯 。因此，範圍實施例不應參照上述說明確定， 而應參照待決權利請求及其 全部範圍或等價物來確定 。

19 替换页 （细则第 26条） [0052]任何實施例中的一個或多個特徵可與任何 其他實施例的一個或多個特徵結合 使用 ，而無需偏離範圍實施例。對於 "一個〃 ， "單個〃 ，或 "某個〃 意在指”一個或 多個”，除非特別指出相反的陳述。背誦 "和 /或" 意在代表該術語中最具包容性的意 識 ，除非有相反的明確說明。

[0053]雖然本披露可以以許多不同的形式體現 ，但提交圖紙和討論時的理解是，本 披露是一項或多項發明原則的體現 ，無意將任何一個實施例限於所說明的實施例 。

[0054]本披露為上述長期需求提供了解決方案 。特別是，本發明的方面克服了依賴 現有使用非天然或化學配方為主的混和物來治 療及改善關節退化和骨質疏鬆症 、幫助 恢復活動能力及消除疼痛 。

[0055]上述成分和方法的進一步優勢和修改， 可能很容易發生在本領域技術人員。

[0056]因此，披露在更廣泛的方面並不限於具 體細節、代表性制度和方法，以及上 述說明性實例 。可對上述規範作出各種修改和修改，而無須 偏離本披露的範圍或精 神 ，本披露應涵蓋所有此類修改和變更，前提是 這些修改和變更屬於下列權利請求及 其等同件的範圍 。

20 替换页 （细则第 26条） 附件一

SDTL-E對去勢雌性大鼠骨質疏鬆症的作用實驗 摘要 骨質疏鬆症影響全球，研究起效快、治療期短 、副作用小的治療骨質疏鬆藥物有其 必要性。本實驗中，以去卵巢 （OVX）大鼠作為骨質疏鬆症模型，以天然植物 提取物 SDTL- E作为治療藥物成份 。大鼠被隨機分配到假手術對照組（對照組） 、去卵巢大鼠骨質疏鬆 模型對照組（模型組 、去卵巢大鼠骨質疏鬆模型 SDTL-E治療組 8011 _^ £組＞ ，模型 組及 SDTL-E組接受卵巢切除手術，對照組接受手術但 沒有切除卵巢。手術後 3個月， 去卵巢大鼠骨質疏鬆模型組 、去卵巢大鼠骨質疏鬆模型（ SDTL-E治療組）與對照組相 比 ，骨密度差異顯著，數據顯示骨質疏鬆症造模 成功。將對照組和模型組皮膚外用塗抹 植物油液體 ， SDTL-E組皮膚外用塗抹油狀液體 SDTL-E，每日兩次，持續 20 日 。

20 日後實驗結果顯示，模型組血清雌二醇值仍明 顯偏低 ^· 血清鹼性磷酸酶 ALP） 活 性 、血清鈣、尿鈣仍明顯偏髙，骨力學指標仍明 顯偏低，骨小梁數目減少、變細、稀疏 及斷裂 。而 SDTL-E組雌二醇值顯著恢復至接近（假手術）對 照組水平， ALP活性、 血清鈣 、尿鈣顯著降低至接近（假手術）對照組水平 ，骨力學指標扭轉力、扭矩和剪切 模量有提髙 ，剪切應力顯著提升至接近（假手術）對照組 水平，骨小梁數目有輕度増多 趨勢 。

21 替换页 （细则第 26条） 本研究顯示，皮膚外用 SDTL-E在 20日內能迅速內源性調節、恢復去卵巢骨質疏� �� 症大鼠體內激素 、 ALP活性、血清鈣、尿鈣水平，能増加骨小梁數 量和骨小梁厚度，能 改善骨質疏鬆症 ，増加骨強度及抗骨折能力。研究提示 SDTL-E有預防骨質疏鬆症骨折 發生 、减少骨質疏鬆症骨折率的藥物治療作用。 研究背景 全球 79億人口骨質疏鬆症患病率為 183%約 13.55 億人。 50 歲以上女性患病率為 37% 是男性的 4倍。激素失衡及缺乏會減少破骨細胞再吸收� �性，及降低成骨細胞活 性導致骨質淨損失 ，所以藥物能降低骨折率及骨折後的死亡率才 具最佳的臨床效果。 藥物治療主要分為 口服及注射兩大類 ， 一類是降低骨吸收速度， 有雙磷膦酸鹽 (Bisphosphonates)、雌激素 (Estrogen)和地諾單抗 (Denosumab) 等。另 ^_ 類是増加骨形成， 藥物有甲狀旁腺激素類似物 (Parathyroid Hormone Analogs) 等。現有藥物存在治療期遠 長於骨折後死亡時間的嚴重缺陷 。 本研究使用專利植物提取物 SDTL - E為治療藥物，以去卵巢 OVX；)骨質疏鬆症模型 大鼠皮膚外用 20 日 ，然後通過用藥前後的對比分析雌激素、骨代 謝標誌、血清鹼性磷 酸酶 (ALP) 活性、血清鈣、尿鈣、骨密度、骨力學指標和 骨組織變化等指標，觀察 SDTL - E對 OVX 誘導骨質疏鬆症大鼠的骨代謝、骨強度等影響 ，以了解天然植物成份治療 骨質疏鬆症的功能藥效及作用機制 。 研究程序

22 替换页 (细则第 26条) 實驗大鼠

3 月齡 Sprague Dawley 雌性大鼠從廣東省醫學實驗動物中心（^Foshan, Guangdong, China^f買。大鼠飼料為 SPF級顆粒鼠料，並可自由攝取瓶裝自來水。飼 養條件為溫度 20°C 濕度 80%，光照明暗各 12小時。大鼠餵養 15天后，隨機分配到以下三個處理組 （每組 10-12隻大鼠）：（ 1）假手術對照組（對照組）； （2）去卵巢大鼠模型對照組（模 型組；）； C3） 去卵巢大鼠骨質疏鬆模型 SDTL-E治療組 CSDTL-E組）。 去卵巢大鼠模型和處理程序 模型組及 SDTL-E治療組給予乙酗（Sinopharm Chemical Reagents Co. Ltd, Shanghai, China）麻醉，無菌操作，在劍突下 4 cm處打開腹腔，約 1.5 cm，牽出脂肪墊找出兩側的 卵巢並摘除 ，送回脂肪墊縫合腹腔。對照組接受上述手術 但並沒有切除卵巢。然後肌肉 注射氨节青黴素（^Sinopharm Chemical Reagents） 10萬單位 /只，連續注射 3天。上述動物 飼養 3個月 ，然後經測量重量和雙能 X線檢測骨密度，數據證實骨質疏鬆模型造模� � 功 。 以上 3組大鼠給予 3%戊巴比妥鈉（ 36mg/kg）（Sinopharm Chemical Reagents） 腹腔 注射麻醉後 ，於背部塗抹脫毛劑（硫化鈉 3g， 肥皂粉 lg，澱粉 7g，加水至適量調至糊 狀 ）5分鐘左右，脫毛面積約 3cmx4cm。脫毛 48小時後開始給藥。將 100 _|i l/kg/d SDTL- E 及植物油 （ Shandong Luhua Group, Yantai, Shandong, China）外用塗抹於大鼠脫毛區 域 ，每天兩次，持續 20 天。 對照組和模型組皮膚外用塗抹植物油， SDTL-E組皮膚外

23 替换页 （细则第 26条） 用塗抹 SDTL-E。 給藥第 19天收集 24小時尿量， -80°C 保存待測；末次給藥 45分鐘後，用 3%戊巴 比妥鈉麻醉動物 ，腹腔動脈取血， 3000rpm離心，取上清液 -80°C保存待測。斷頸處死各 組大鼠 ，無菌條件下取大鼠右側股骨、脛骨和左側股 骨，用生理鹽水濕紗布包裏 -80°C保 存待測 。

ALP 活性測定

ALP測試盒 (Nanjing Jiancheung Bioengineering Institute, Nanjing, Jiangsu, China) 將被 用作測定血清 ALP活性。根據供應商的說明，樣品中的血清 ALP與試劑 盒提供的對 硝基苯磷酸鹽底 物 (p-Nitrophenylphosphate)發生反應生成黃色產物 ，然後使用 S22PC 分光光度言十 (Shanghai Lengguang Technology Co. Ltd, Shanghai, China).在 415 nm波長 測量吸光度以量化血清 ALP活性。 鈣離子測定 金丐離子測試盒 (Nanjing Jiancheung Bioengineering Institute)被用作測定血清和尿 #5離 子水平 。根據供應商的說 明 ， 樣品中的鈣離子與試劑盒提供的甲基百里酚藍 底物 (Methylthymolblue)發生反應生成藍色產物，然後使 用 S22PC 分光光度計 .在 610 nm波 長測量吸光度以量化血清和尿鈣離子水平 。 肌酐測定

24 替换页 (细则第 26条) 肌酐測試盒 (Nanjing Jiancheung Bioengineering Institute)被用作測定尿肌酐水平。根據 供應商的說明 ，樣品中的尿肌酐被試劑盒提供的氧化酶氧化 ，產生紫紅色產物，然後使 用 S22PC 分光光度計 .在 546 nm波長測量吸光度以量化尿肌酐水平。 雌二醇測定

AxSYM 雌二醇劑盒 (Abbott, Chicago, Illinois, U.S. A)被用作測定雌二醇水平。根據 供應商的說明 ，樣品中的血清雌二醇以抗體-雌二醇-鹼性磷� ��酶偶聯物的形式與基質孔 結合 ，然後與 4 -甲基饊形酮磷酸酯底物 (4-methylumbelliferyl phosphate)發生反應產生榮 光 ，然後使用 ARCHITECT i2000SR免疫檢測分析儀 (Abbott)測量榮光以量化血清雌二 醇水平 。 骨密度檢測 各組大鼠乙酗麻醉，當大鼠呈穩定的昏睡狀態 達到 5min以上時，置於 Lunar Prodigy雙 能 X線骨密度儀 (GE Healthcare, Chicago, Illinois, U S A) 的探頭下，掃描速度為 60.0 mmol/L/秒， 步距 1.0x1. Ommol/L,應用小動物軟體模組校準後進行全身掃� ��，測定骨密度 值 BMD(CV<1%) 。 骨力學檢測 右側脛骨 CTibia；) 用於扭轉實驗 (Torsional Testing) 。扭轉實驗： 將脛骨的近端和遠端 嵌入聚甲基丙烯酸甲酯中 ，置於 858 Mini Bionix II 型材料測試系統上進行扭轉實驗

25 替换页 (细则第 26条) ( MTS Systems, Eden Prairie, Minnesota, U.S.A )。標本的遠端以 6°/min 的速度橫向旋 轉，直到觀察到骨衰竭 (Bone Failure)。從負載位移曲線計算峰值扭轉力 ( N )、扭矩 ( Nmm )、 剪切應力 ( MPa )和剪切模量 ( MPa )數據。 組織學檢查 去除大鼠左側股骨近端 1/2 軟組織，用新鮮配製的 10%的中性福馬林 (Sinopharm Chemical Reagents) 固定 24h 後 ， 用 0.01M 磷酸鹽緩衝溶液 (PBS) (Sinopharm Chemical Reagents) 沖洗 3次，再用 20%的甲酸溶液 (Sinopharm Chemical Reagents)脫金丐 6 天，每日需更換工作液， PBS沖洗後， 75%、 80%、 95%、 100%各梯度乙醇 (Sinopharm Chemical Reagents)脫水，然後用二甲苯 (Sinopharm Chemical Reagents) 處理 2次，每次 15min，再以 60°C的石臘浸瀆 3 h，包埋過夜，第 2 日按股骨縱徑方向 5 pm連續切片， 貼片於經 4%的多聚賴氨酸處理過的載玻片，烘乾，行 HE (Sinopharm Chemical Reagents) 染色 ，光學顯微鏡 (Leica, Wetzlar, Germany)下觀察骨組織的結構變化。 統計分析 所有數據均通過統計軟件 GraphPad Prism 9 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, U S A.) 進行分析。實驗結果以平均值 ± 標準差表示。任何兩組之間的組間差異比較 採用 t檢驗。當 P < 0.05 時，差異被認為具有統計學意義。 結果

OVX 去卵巢骨質疏鬆大鼠模型

26 替换页 (细则第 26条) 去卵巢 3個月後，模型組、 SDTL組及對照組大鼠，在準備皮膚給藥前進行� �密度 檢查 。 模型組和 SDTL-E組骨密度明顯低於對照組 （P<0.05）（表 1），與對照組比較有 明顯差異 ，顯示 OVX誘導骨質疏鬆症大鼠模型建立成功。

⑹ 分組 骨密度 ( g/cm ² )

12 模型組 0. 20±0. 02*

12 對照組 0. 22±0. 02

10 SDTL組 0. 20±0. 01** 表 1 .去卵巢 3 個月後大鼠骨密度 *^<0.05, **P<0.01 vs對照組

OVX 大鼠體重變化 所有組別大鼠在去卵巢前體重相近。去卵巢 3個月後的皮膚給藥第 1天，模型組和 SDTL- E 組體重明顯髙於對照組（P<0.01）。 SDTL-E組皮膚外用 SDTL-E，模型組和對照組皮 膚外用植物油 ， 20 天後體重無明顯改變 ，模型組和 SDTL-E 組體重仍髙於對照組 （P<0.01）（表 2，附件一圖 1）。 分組 ( n ) 去卵巢前重量 給藥 1天後重量 給藥 20天後重量

(g) (g) (g)

12 模型組 266. 00± 10. 37 341. 92±34. 36** 343. 00±34. 93**

12 對照組 268. 58± 11. 02 289. 08±21. 04 291. 25±21. 78

10

SDTL組 264. 80±8. 16 346. 00±29. 62** 341. 10±28. 51**

27 替换页 （细则第 26条） 表 2 . 大鼠去卵巢前及給藥處理後體重 *^<0.01 vs對照組 大鼠體重變化 。去卵巢手術後 90天，模型組（ n = 12）和對照組（ n = 12）大鼠皮膚外 用植物油 。 SDTL-E組 = 10）大鼠皮膚外用 SDTL-E。皮膚外用每天兩次連續 20天。 大鼠體重分別在去卵巢手術前 、術後 90 天 （給藥 1天後）和術後 110 天 （給藥 20天 後）測量。結果以平均值 ± 標準差表示。 **^<0.01 vs對照組。

SDTL-E 有降低 OVX誘導骨質疏鬆症大鼠血清 ALP活性作用 ALP 測定被用作評估 SDTL-E 對骨代謝標誌物血清 ALP 活性的影響。與對照組血清 ALP 活性 19.41 ±5.76 金氏單位 /100 mL相比，模型組血清 ALP活性顯著升髙到 46.69±13.32 金氏單位 /100 mL（ ^O.Ol）° SDTL-E組皮膚外用 SDTL-E 20天後血 清 ALP活性與模型組相比 ，顯著降低了 58.79%至 19.24±6.06 金氏單位 /100 mL （ ^O.Ol）與對照組水平相近（附件一圖 2），顯示有顯著的調節及降低 ALP活性作 用 。

SDTL-E降低了 OVX誘導骨質疏鬆大鼠的血清 ALP活性。模型組（ n = ll）和對照組 （ n = 10）大鼠皮膚外用植物油。 SDTL-E組（n = 10）大鼠皮膚外用 SDTL-E °皮膚外用 每天兩次連續 20天。 ALP測定被用作評估血清 ALP 活性。結果以平均值 ± 標準差 表示 。 w/^cO.Ol vs模型組。

SDTL-E 有提升 OVX誘導骨質疏鬆大鼠血清雌二醇水平作用 雌二醇測 定被用作評估 SDTL-E 對血清雌二醇的影響 。與對照組血清雌二醇水平

28 替换页 （细则第 26条） 27.27±6.77 pg/mL 相比，模型組血清雌二醇顯著降低到 20.18±4.77 pg/mL ( P<0.05 ) ° SDTL-E組皮膚外用 SDTL-E ， 20天後血清雌二醇與模型組相比，顯著提升了 25.37% 至 25.30±4.52 pg/mL ( P<0.05 )與對照組水平相近 (附件一圖 3 )，顯示有顯著迅速的調 節及恢復激素雌二醇的生理功能性作用 。

SDTL-E提升了 OVX誘導骨質疏鬆大鼠的血清雌二醇水平 。模型組 ( n = ll )和對照組 ( n = ll )大鼠皮膚外用植物油。 SDTL-E組 (n=10)大鼠皮膚外用 SDTL-E °皮膚外用 每天兩次連續 20天。雌二醇測定被用作評估血清 雌二醇水平。結果以平均值 ± 標準 差表示 。 */ ³ <0.05 vs模型組。

SDTL-E 有降低 OVX誘導骨質疏鬆大鼠血清 、尿鈣離子水平作用 鈣離子測定被用作評估 SDTL-E 對骨代謝標誌物血清和尿鈣離子水平的影響。 與對照 組血清鈣離子水平 2.28±0.20 mM相比，模型組血清鈣離子水平顯著升髙到 2.70±0.32 mMCPO.Ol ；)。 SDTL-E組皮膚外用 SDTL-E， 20天後血清鈣離子與模型組相比，顯著降 低了 28.15%至 1.94±0.21 mM ( P<0.01 )，並低於對照組水平 ( P<0.01 )(附件一圖 4a )， 顯示阻止了骨鈣丟失及鈣離子向血中的轉移 。 與對照組 尿鈣離子水平 1.39±0.79 mmol/L 相比 ， 模型組尿鈣離子水平顯著升髙到 2.45±0.76 mM (P<0.01) ° SDTL-E組皮膚外用 SDTL-E， 20天後與模型組相比，尿鈣離 子水平顯著降低 28.16%至 1.76±0.80 mM ( P<0.01 ) (附件一圖 4b )，顯示有顯著阻止鈣 離子丟失及向尿中轉移的作用 。

SDTL-E降低了 OVX誘導骨質疏鬆大鼠的血清和尿鈣離子水平 。模型組 ( n = ll-12 )

29 替换页 (细则第 26条) 和對照組 （ n = 10-11）大鼠皮膚外用植物油。 SDTL-E組（n = 10）大鼠皮膚外用 SDTL- E。皮膚外用每天兩次連續 20天。鈣離子測定被用作評估（a）血清 及（b） 尿鈣離子水平。 結果以平均值 ± 標準差表示。 **P<0.01 vs模型組 ; ^## P<0.01 vs 對照組。

SDTL-E 對 OVX誘導骨質疏鬆大鼠的尿鈣 /肌酐比率無顯著影響 鈣離子測定及肌酐測定被用作測量鈣離子及肌 酐量以計算尿鈣 /肌酐比率。與對照組尿 鈣 /肌酐比率 0.36±0.33相比，模型組尿鈣 /肌酐比率雖升髙到 0.49±0.29，但沒有統計學 意義 。 SDTL-E組皮膚外用 SDTL-E， 20天後尿鈣 /肌酐比率降低至 0.36±0.14，與對照 組相近 ，與模型組相比較沒有統計學意義（附件一圖 5）。

SDTL-E對 OVX誘導骨質疏鬆大鼠的尿錦 /肌酐比率無顯著影響。模型組（ n = 12）和對 照組（ n = ll）大鼠皮膚外用植物油。 SDTL-E組（n = 10）大鼠皮膚外用 SDTL-E °皮膚外 用每天兩次連續 20天。鈣離子測定及肌酐測定被用作測量鈣離� ��及肌酐量以計算尿鈣 /肌酐比率。結果以平均值 ± 標準差表示。

SDTL-E 對 OVX誘導骨質疏鬆大鼠的骨密度無顯著影響 對右股骨進行骨密度 檢測以評估 SDTL-E 對骨密的影響。與對照組骨密度 0.22±0.02 g/cm ² 相比，模型組骨密度顯著降低到 0.20±0.01 g/cm ² CP<0.01；）。 SDTL-E 組皮膚外用 SDTL-E ， 20天後骨密度為 0.20±0.01 g/cm ² ，與模型組動物相比較無顯著差異（附件 一 圖 6：），顯示使用 SDTL-E 組 20日 ，對骨質疏鬆模型大鼠骨密度無顯著影響。

SDTL-E 對 OVX誘導骨質疏鬆大鼠的骨密度無顯著影響 。模型組（ n = 12）和對照組

30 替换页 （细则第 26条） （ n = ll）大鼠皮膚外用植物油。 SDTL-E組（n=10）大鼠皮膚外用 SDTL-E °皮膚外用 每天兩次連續 20天。對右股骨進行骨密度檢測以評估骨密度� ��結果以平均值 ± 標準 差表示 。 ^M /^CO.OI vs模型組。

SDTL-E 提高 OVX誘導骨質疏鬆大鼠的骨強度和硬度 模型組及對照組皮膚外用植物油 ， SDTL-E組皮膚外用 SDTL-E， 20日後骨扭轉實驗結 果顯示 ，模型組的扭轉力、扭矩和剪切應力均顯著低 於對照組（户<0.05）（附件一圖 7a- c）-剪切模量雖然也低於對照組，但沒有統計� ��意義（附件一圖 7d）。 SDTL-E組剪切 應力與模型組剪切應力 178.281±45.672 Mpa相比，顯著提升了 39.93%至 249.502±63.445 Mpa （ P<0.05） 接近於對照組的剪切應力 235.540±58.097 Mpa（附件一圖 7c）。 SDTL- E 組的扭轉力、扭矩和剪切模量與模型組相比， 雖然也有提髙，但無統計學意義。實驗 數據顯示 ， SDTL-E皮膚外用 SDTL-E， 20日後扭轉力、扭矩和剪切模量均接近於對照 組 （附件一圖 7a,b,d），顯示 SDTL-E提髙了骨質疏鬆大鼠的骨強度和硬度。 SDTL-E提 髙了 OVX誘導骨質疏鬆大鼠的骨力度和硬度。模型組 （ n=9）和對照組（ n = ll）大鼠 皮膚外用植物油 。 SDTL-E組 =9）大鼠皮膚外用 SDTL-E。皮膚外用每天兩次連續 20 天。骨扭轉實驗被用作評估（a） 扭轉力 、 （b） 扭矩 、 （c） 剪切應力 及（d） 剪切模量。 結果以平均值 ± 標準差表示。 *^<0.05 vs模型組。

SDTL-E 有改善 OVX誘導骨質疏鬆大鼠骨組織結構作用 由附件一圖 8a可見，對照組大鼠的骨組織結構清晰、骨小� ��較粗、著色加深、排列較 密 、骨髓造血功能活躍、骨小梁間隙也較小。附 件一圖 8b可見，模型組大鼠骨小梁數

31 替换页 （细则第 26条） 目減少 、變細、稀疏、斷裂、骨組織著色較淺、骨小 梁間隙相對増寬、血紅骨髓減少， 造血功能低下、脂肪組織増多、呈骨質疏鬆圖 像。附件一圖 8c可見， SDTL-E組大鼠與 對照組正常大鼠相比 ，骨小梁變細、排列稀疏、斷裂和著色較淺、 骨小梁間隙増寬、血 紅骨髓減少 ，造血功能低下、脂肪組織増多，但也呈現與 模型大鼠相比較骨小梁數目有 輕度増多 、増厚的趨勢，所以下一步實驗有必要延長 SDTL-E使用天數。

SDTL-E改善了 OVX誘導骨質疏鬆大鼠的骨組織結構 。模型組和對照組大鼠皮膚外用 植物油 。 SDTL-E組大鼠皮膚外用 SDTL-E。皮膚外用每天兩次連續 20天。左股骨骨 組織用 HE染色，然後在 200X放大的光學顯微鏡下觀察。以上是（ a）對照組（ b）模 型組和 （ c） SDTL-E組大鼠的代表性染色圖像。

5 5冊 更年期骨質疏鬆症或激素缺乏均會導致骨轉換 増加，雌激素水平降低會導致腎臟的鈣離 子排泄増加和腸道的鈣離子吸收減少 ，從而刺激骨鈣釋放到血液中，從而令骨代謝 標誌 物血清 ALP活性升髙，儘管骨代謝總體増加，但骨吸收 速率超過了骨形成。一項研究 表明 ，更年期骨形成標誌物只増加了 37-52% 但骨吸收標誌物増加了 79-97%。淨骨 吸收是導致髙血清鈣離子水平的主要決定因素 。以上因素導致骨代謝標誌物血清鈣離子、 尿鈣離子和尿鈣 /肌酐比率在絕經後骨質疏鬆症患者中升髙。� �實驗研究結果顯示，與 模型組大鼠相比， SDTL-E大鼠皮膚外用 20 天，內源性的顯著提髙恢復了雌二醇水平， 調節性降低了血清 ALP活性及血清鈣離子、尿鈣離子水平。實驗結 果表明， SDTL-E 具有內源性調節恢復骨質疏鬆症大鼠雌二醇作 用 ，能減少骨代謝、淨骨吸收、骨鈣丟失

32 替换页 （细则第 26条） 和腎臟的尿鈣離子排泄 。 有研究顯示除卵巢外 ，各種性腺外器官也會產生雌二醇，如胰腺、 大腦、腎上腺、皮膚 和脂肪組織等。但值得注意的是有研究顯示髙 水平的雌激素藥物治療不僅會増加患乳腺 癌和子宮內膜癌的風險，還會導致血栓形成等 諸多副作用。本研究中，植物成份的 SDTL- E 能迅速恢復已切除卵巢的骨質疏鬆症大鼠激素 水平，可能是通過激活上述器官或相 應未知受體而產生顯著的調節雌二醇作用 。能內源性的令 OVX誘導骨質疏鬆大鼠雌二 醇水平恢復到與對照組大鼠相近的水平 ，能最大限度降低激素治療藥物的副作用風險 。 骨強度與骨骼的抗骨折能力呈正相關 。本研究使用常用的骨強度標誌物骨密度，以 研究 SDTL-E 對 OVX大鼠骨強度的影響 ，模型組 OVX大鼠的骨密度明顯低於對照組，骨 質疏鬆症模型成功 。而 SDTL-E組 OVX-大鼠皮膚外用 SDTL-E20天後，骨扭轉實驗數 據表明 SDTL-E 組與模型組相比，大鼠的剪切應力顯著提髙， 扭轉力、扭矩和剪切模 量也有提髙及恢復至接近對照組水平 ，表明外用 SDTL-E僅 20 天可快速使 OVX-大鼠 的骨強度恢復到正常水平 ，但骨密度卻沒有明顯改變，這可能是由於研 究時間比礦化新 形成骨骼需要長達 30 個月左右的時間短得多所致。 骨密度和骨骼結構都對骨強度有影響 。骨重塑過程的早期階段從骨小梁開始。骨質 疏鬆 症骨小梁數量 、骨小梁厚度和連接程度降低都會影響骨強度 。 OVX 大鼠外用 SDTL-E 20 天雖令骨強度恢復，但骨密度沒有顯著變化， 表明外用 SDTL-E20天時，骨強度迅 速増加並不是因為骨密度的増加 ，而可能是因為其它迅速改變骨强度的作用機 制。本研 究的顯微鏡觀察結果表明 ，與對照組大鼠相比，模型組和 SDTL-E 組 OVX-大鼠的骨小

33 替换页 （细则第 26条） 梁結構減少 、變細、斷裂和稀疏，但 SDTL-E 組大鼠的骨小梁數量大於模型組大鼠， 表明外用 SDTL-E 20 天 已可迅速増加骨小梁數量和厚度 ，骨小梁數目有輕度増多的 趨勢 ，通過此機制也改善了 OVX大鼠的骨強度，其它作用機制有待進一步研 究了解。 芳香酶 ( Aromatase )被称为雌激素合成酶 ( estrogen synthetase )，能催化與甾體激素合 成過程中從雄激素到雌激素的芳香化反應 ，催化雄烯二酮、睾酮向雌酮及雌二醇转化， 芳香酶在生殖腺、腦、脂肪組織、血管、皮膚 和骨骼中均有存在，芳香酶反應速度可由 辅酶 ( coenzyme )調節。 SDTL-E的骨質疏鬆症大鼠實驗結果提示， SDTL-E具有芳香 化加速輔酶 ( Aromatization Acceleration Coenzyme )作用，其提取物複合所產生的芳香 化加速辅酶集束 [ Aromatization Acceleration Coenzyme Cluster, we named it as (AACC) ] 對芳香酶 ( Aromatase )有調節作用，其機制是通過激活芳香酶 ( Aromatase )酶促反應 ( Enzyme catalysis )調節異常激素水平，包括雌二醇，以調節異� � ALP活性、血清鈣、 尿鈣等 ，促使了破骨細胞與成骨細胞恢復正常功能， 而呈現出將異常激素恢復致正常水 平及促進骨强度恢復的藥物治療效果 。 骨質疏鬆症會使骨折及骨折後死亡率増加，絕 經後雌激素缺乏會導致肥胖和骨髓脂肪増 加 ，而骨折後死亡相關的主要並發症有心臟、呼 吸、腦血管和惡性腫瘤疾病。本研究實 驗顯示 SDTL-E能迅速並顯著増加恢復骨強度，可以預防 骨折及顯著提髙抗骨折能力。 與對照組大鼠相比 ，模型組 OVX大鼠體重顯著増加 ，骨小梁減少，骨小梁間隙脂肪組 織増加 ，血紅骨髓減少，造成造血功能低下。表明雌 激素缺乏引起肥胖和骨小梁間隙脂 肪増加從而導致貧血 ，可能是引致 OVX 大鼠骨質疏鬆的機制。 SDTL-E 組大鼠外用

34 替换页 (细则第 26条) SDTL-E - 20 天改善了雌二醇水平、骨強度和骨小梁，但沒 有降低體重。而之前有研 究表明雌激素可以調節體重 ，並増加紅細胞的產生，本實驗沒有進行血紅 骨髓等數值對 比是一缺陷 ，無法看到恢復的雌二醇水平對造血紅骨髓變 化的影響， 所以後續研究將 増加實驗天數及相關生化指標 。 有研究烦顯示 ，其他骨質疏鬆藥物以口服灌藥或注射方式治 療 OVX 骨質疏鬆大鼠，骨 強度恢復的時間遠比外用 SDTL-E恢復骨強度時間長，療效並不顯著。如雙 磷膦酸鹽相 關藥（ 阿斋膦酸鈉， Alendronate Sodium） 口服灌藥 6個月（~180天） ，骨強度才能顯著 増加並恢復到正常水平， 注射甲狀旁腺激素類似物相關藥需 0^rt _eO ®> 12 週 卜 84天） ， 骨強度 才顯著増加並 恢復到正常水平 ， 雌激素受體調節劑相關藥 雷洛 昔芬 ， Raloxifene；）口服灌藥 4 週 （:〜 28天> 骨強度仍未有顯著的増加。本研究顯示，植物 成份 的 SDTL-E外用通過內源性調節作用迅速恢復雌二醇 水平、 ALP活性、血清鈣水平，増 加骨小梁數量和骨小梁厚度 ，減少了骨代謝、淨骨吸收和腎臟的尿鈣離子 排泄，迅速増 加了骨強度 ，使其治療有效時間，能遠比文献報導骨折後 出現死亡率大増的 6 個月時 間為短 ，有明顯的治療骨質疏鬆症及増加抗骨折能力 ，對預防、治療骨質疏鬆症、大 幅降低骨折及骨折後死亡率 、提髙臨床治療效率有積極作用。 SDTL-E治療骨質疏鬆作 用機制除通過迅速調節 、恢復激素水平、迅速減少骨代謝及阻止骨钙 丟失、迅速恢復骨 强度外 ，其它機制尚有待進一步研究了解。 芳香酶（ Aromatase）在人體內由基因 CYP19A1 編碼，存在於细胞色素 P450酶系中，

35 替换页 （细则第 26条） 也被稱為雌激素合成酶 ( estrogen synthetase ) 能催化與甾體激素合成過程中從雄激素 到雌激素的芳香化反應 ，催化雄烯二酮、睾酮向雌酮及雌二醇转化， 芳香酶在生殖腺、 腦 、脂肪組織、血管、皮膚和骨諮中均有存在， 芳香酶反應速度可由辅酶 ( coenzyme ) 調節 。從實驗結果分析， SDTL-E具有辅酶 ( coenzyme )般的作用，其 SDTL-E具有芳 香化加速辅酶集束 ［ Aromatization Acceleration Coenzyme Cluster (A ACC)］功能，可能 是通過激活芳香酶 ( Aromatase )酶促反應 ( Enzyme catalysis )調節激素水平，如雌二醇 及 ALP活性 、血清鈣、尿鈣等，促進了成骨細胞的活性並 抑制了破骨細胞活性。 本研究顯示 ， SDTL-E呈現出的皮膚外用快速、顯效治療優點， 能避免肝臟首過作用， 具有發展成為見效快、副作用少的治療骨質疏 鬆藥物潛力，皮膚外用方式所呈現的效果 可能打破外用藥物起效時間慢於口服、注射藥 物的認知，對藥物研究有積極引導作用。

36 替换页 (细则第 26条) 附件二

SDTL-E對細胞活力的影響及比較研究報告 摘 要 本研究以永生化人臍靜脈內皮細胞系 HUVEC> 作為模型細胞，並透過細胞活力測定， 評估用専利 SDTL-E提取物不同劑量及不同組合配製的 A、B、C、D、E、F、G、H試 劑 ，研究其對正常及被過氧化氫 (H2O2) 損傷的 HUVEC細胞活力的影響及各組間的效 用比較 。結果顯示，相對於正常細胞對照組，各試劑 組對正常細胞活力影響微小，數據 沒有統計學意義 。 細胞活力測定結果顯示 ，油溶性試劑 A、 B、 C、 D比水溶性試劑 E、 F、 G、 H改善及 提升損傷細胞活力的能力強。 A、 B、 D 油溶性試劑濃度越髙，對損傷細胞増加活力效 果越明顯 ，濃度達到 0.1%-0.9%時為最有效峰值量。眾多試劑中， A試劑改善及提升損 傷細胞活力的能力最髙及最為明顯 ，且 0.1%-0.9%濃度 A顯著増加損傷細胞活力值最 髙 ，達 259% (p<0.05)。 實驗結果顯示 ，各試劑組對正常細胞活力影響微小，數據沒 有統計學意義。各試劑組的 油溶性試劑比水溶性試劑提升損傷細胞活力的 表現強，且 0.1%-0.9%濃度 A試劑改善和 提升損傷細胞活力的作用最髙及最顯著 。 以上結果對將來發展全天然植物抗氧化提取物 成份產品和藥物時及成份組合、溶劑選擇 和使用量具參考價值 。

37 替换页 (细则第 26条) 研究背景 我們之前對専利 SDTL-E提取物的研究顯示，使用専利 SDTL-E提取物成份以皮膚外用方 式改善及治療骨質疏鬆和關節退化的動物實驗 及（非正式人體臨床）人體試用效果顯著。 為進一步了解専利 SDTL-E提取物成份及不同組合對細胞的效果，我 們用専利 SDTL-E提 取物成份不同劑量及組合共配製了 8隻不同份量的試劑： A、 B、 C、 D、 E、 F、 G、 H， 其中實驗進行前僅知 A、 B、 C、 D為油溶性試劑，及 E、 F、 G、 H為水溶性試劑，其它 信息在實驗完結 、統計及分析完成後披露揭嘵。本實驗 _在透過細胞實驗以研究専利 SDTL-E提取物不同劑量及組合各試劑組對細胞活 力的影響程度，以選出及佐証最佳使用 量及最佳效用范圍 ，為後續研發抗氧化最佳物及組合與使用量提 供參考，也為相關動物 實驗提供研究參考依據 。 研究目的 通過先前 用於研究骨質疏鬆 相關藥物對細胞活 力影響的人臍靜脈 內皮細胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cell, HUVEC）模型實驗［1］，研究了解専利 SDTL-E提取物及組合 A 、 B、 C、 D、 E、 F、 G、 H各組試劑對細胞活力的不同程度影響，探討� �下問題：

1. 専利 SDTL-E提取物不同劑量對正常細胞及損傷細胞活 力的影響研究。

2. 専利 SDTL-E提取物不同稀釋濃度對正常細胞及損傷細 胞活力的影響。

3. 専利 SDTL-E提取物及組合成份對正常細胞及損傷細胞 活力的影響。

4. 専利 SDTL-E提取物成分以水及油作為試劑溶液時，對 正常細胞及損傷細胞細胞活力

38 替换页 （细则第 26条） 的影響。 研究程序 ： 細胞系 (Cell Line) 永生化人臍靜脈內皮細胞系 (Immortalized HUVEC ) (ATCC, Manassas, Virginia, U.S.A)被用 作這次研究的模型細胞 。細胞培養方法是根據細胞供應商 ATCC的說明，將加入了內皮 細胞生長液 (Endothelial Cell Growth Kit-VEGF) (ATCC)的血管細胞基礎培養基 (Vascular Cell Basal Medium) (ATCC) 用於培養人臍靜脈內皮細胞，培養環境為 37°C 及 5%的二氧 化碳 。 計算細胞數量 血細 胞計數板 (Hemocytometer) (Paul Marienfeld GmbH & Co. KG, Lauda-Konigshofen, Germany)被用作計算細胞數量。 10 細胞被注入血細胞計數板中 ，然後將血細胞計數 板放在細胞培養顯微鏡 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, U.S.A)下計算 細胞數量 。 細胞活力測定 (Cell viability assay)

PrestoBlue™ HS細胞活力試劑 (Thermo Fisher Scientific)被用作測定細胞活力 ， 其原理 為試劑中刃天 青素 (Resazurin) 進入活細胞後會被還原成為紅色且髙度熒光的 試鹵靈 (Resorufin) °

39 替换页 (细则第 26条) 細胞活力測定是根據 PrestoBlueä HS細胞活力試劑供應商的說明，在 96孔板 (96-well plate) 中 ，先在每個孔 (well)預備 10000 個細胞浸在 90 培養基裡。然後將 10 PrestoBlueä HS細胞活力試劑加到孔中 ，並放在黑暗 37°C 恆溫箱 10分鐘。 最後 ，使用酶標儀 (Microplate Reader) (Molecular Devices, San Jose, California, U_S_A) 測 量榮光 (Fluorescence) ^· 榮光激發波長 (Excitation Wavelength)為 560 nm， 然後量度榮 光發射波長 (Emission Wavelength) 590 nm ^· 以量化測定細胞活力。 評估程序 ： 將 0.5mM過氧化氫 (Kam Sing Medicine Co. Hong Kong, China) 加至 HUVEC細胞中 30 分鐘 (受損細胞對照組)。血管細胞基礎培養基加至 HUVEC細胞中 30分鐘 (正常細胞 對照組) 。然後將血管細胞基礎培養基及被血管細胞基 礎培養基稀釋至實驗所需濃度的 A 、B、C、D、E、F、G、H試劑 ，分別加到受損細胞對照組、正常細胞對照組 中 15分 鐘 。再透過細胞活力測定、取值，統計，分析各 試劑對細胞活力影響及差異。 統計分析 本研究分三階段進行 。每階段實驗均重複進行 3次，然後不同組別細胞和對照組及損傷 細胞對照組的細胞活力平均值差異被用作統 計學分析。如果數據是正態分佈 (Normally Distributed)的，參數化 (Parametric) t檢驗 (t-test) 將被用作分析數據，如果數據是非正態 分佈的 ，非參數化 (Non-parametric)曼惠特尼檢驗 (Mann-Whitney test) 將被用作分析數據。 當 P值＜0.05時，統計學上認為差異是顯著的。所� ��數據由統計學軟件 GraphPad Prism

40 替换页 (细则第 26条) 9 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, United States) 分析。第一階段實驗是在使用各組 試劑後 15分鐘測定細胞活力狀況以篩選出對細胞活力� ��果最好的試劑；第二階段實驗 是以第一階段篩選出的試劑稀釋至不同濃度處 理細胞 15分鐘後測定細胞活力以選出各 組試劑的最佳劑量；第三階段以第一及第二階 段選出的最佳試劑在最佳劑量下處理細胞 15分鐘後測定細胞活力 ， 對各組試劑影響細胞活力能力作進一步比較。 數據及結果 第 1階段實驗： 各試劑處理 15分鐘對正常及損傷細胞活力的影響 建立損傷細胞對照組模型 ，相對於正常細胞對照組，損傷細胞對照組模 型的細胞活力明 顯降低了 75%（p<0.05） 顯示損傷細胞模型造模成功。（表 1） 實驗結果顯示 ，相對於正常細胞對照組，各試劑組對正常細 胞活力影響輕微，數據沒有 統計學意義（表 1, 附件二圖 1）。 實驗結果顯示 ，相對於損傷細胞對照組 ， 0.1%- 0.9%濃度 A 顯著増加了損傷細胞活力 262%（p<0.05） ， 0.1%- 0.9%濃度 D顯著増加了損傷細胞活力 213%（p<0.05） ， 0.1%- 0.9% 濃度 B増加了損傷細胞活力 204%， 0.1%- 0.9%濃度 C増加了損傷細胞活力 148%。（表 1）與油溶試劑相比較，水溶性試劑 E、 F、 G、 H 増加損傷細胞活力的程度較低，（表 1 , 附件二圖 2） 所以之後階段的實驗將主要集中於 A、 B、 C、 D試劑。

41 替换页 （细则第 26条） 表 1. 經各試劑組處理 15分鐘細胞相對於正常及損傷細胞活力的變化 註 1: 所有試劑以細胞培養基稀釋。經預實驗參考 ， 決定水劑的稀釋濃度為 1%-5%, 油劑的稀釋濃度為 0.1%-0.9%， A.B.C.D稀釋濃度為 0.1%-0.9%。 E.F.G.H稀釋濃 度均為 0.6%-1.5%。 註 2: a.以上各試劑處理正常細胞組 15 分鐘取值。 b.以上各試劑處理損傷細胞組 15 分鐘取值 。 註 3: 損傷細胞組是以 0.5 mM H ₂ 0 ₂ 處理 30 分鐘 ，取值 。 註 4: *表示與正常細胞對照組相比有顯著統計學差� �（p<0.05）; #表示與損傷細胞對 照組相比有顯著統計學差異（p<0.05） 。 附件二圖 1. 經各試劑組處理 15 分鐘 ^· 相對於正常細胞（以紅色虛線代表｝對照 組細胞 活力的％變化。 註 1: 紅線為正常細胞對照組活力水平。 註 2: 所有試劑以細胞培養基稀釋 ， A、 B、 C、 D的濃度為 0.1%-0.9%; E、 F、 G、 H的

42 替换页 （细则第 26条） 濃度為 0.6%-1.5%。 註 3: *表示與正常細胞對照組相比有顯著統計學差� � (p<0.05)。 附件二圖 2. 經各試劑組處理 15 分鐘 ^· 相對於損傷細胞對照組 (以紅色虛線代表｝細 胞活力的％變化。 註 1: 紅線為損傷細胞對照組活力水平。 註 2: 所有試劑以細胞培養基稀釋， A、 B、 C、 D的濃度為 0.1%-0.9%; E、 F、 G、 H的 濃度為 0.6%-1.5%。 註 3: *表示與損傷細胞對照組相比有顯著統計學差� � (p<0.05)。 第 2階段實驗： 不同濃度 A、 B、 D試劑處理 15分鐘對正常及損傷細胞活力的影響 為了找出 A、 B、 D試劑最佳效用範圍，本研究測試了不同濃度 A、 B、 D對正常及損傷 細胞活力的劑量效應 。 結果顯示 ，相對於正常細胞對照組，所有濃度的試劑都 無顯著増加正常細胞活力，數據 無統計學意義 。 (表 2, 附件二圖 3) 相對於損傷細胞對照組， 0.001%-0.009%濃度 A顯著増加了損傷細胞活力 121% (p<0.05)， 0.01%-0.09%濃度 A顯著増加了損傷細胞活力 185% (p<0.05)， 0.1%-0.9%濃度 A顯著増加 了損傷細胞活力 190%， 1%-5%濃度 A顯著増加了損傷細胞活力 126% (p<0.05)。 相對於損傷細胞對照組 ， 0.1%-0.9%濃度 B顯著増加了損傷細胞活力 158%， 1%-5%濃度 B顯著増加了損傷細胞活力 99%。 相對於損傷細胞對照組 ， 0.1%-0.9%濃度 D増加了損傷細胞活力 79%， 1%-5%濃度 D増

43 替换页 (细则第 26条) 加了損傷細胞活力 65%。 結果顯示 ，相對於損傷細胞對照組 ，所有濃度的 A、 B、 D 試劑都升髙了損傷細胞的活 力 ，而且當 A、 B、 D試劑的濃度由 0.001%-0.009%増加到 0.1%-0.9%時， 它們増加損傷 細胞活力的程度有上升趨勢 ，而 0.1%-0.9%濃度為最佳峰值。（表 2, 圖 4）之後的油溶性 試劑 A、 B、 C、 D將都以 0.1%-0.9%濃度進行實驗。

44 替换页 （细则第 26条） SUBSTITUTED SHEET 表 2. 經不同濃度 A、 B、 D試劑組處理 15分鐘細胞相對於正常及損傷細胞的活力變化 註 1: 所有試劑以細胞培養基稀釋 註 2: a.以上各試劑處理正常細胞組 15 分鐘取值。 b.以上各試劑處理損傷細胞組 15 分鐘取值。 註 3: 損傷細胞組是以 0.5 mM H ₂ 0 ₂ 處理 30 分鐘，取值 。 註 4: *表示與正常細胞對照組相比有顯著統計學差� �（p<0.05>; #表示與損傷細胞對照組相比有顯著統計學差� �（p<0.05>

附件二圖 3. 經不同濃度 A、 B、 D試劑組處理 15 分鐘 .細胞相對於正常對照組 (以紅色 虛線代表)細胞活力的％變化 註 1: 紅線為正常細胞對照組活力水平。 註 2: 所有試劑以細胞培養基稀釋。 註 3: *表示與正常細胞對照組相比有顯著統計學差� � (p<0.05)。 附件二圖 4. 經不同濃度 A、 B、 D試劑組處理 15 分鐘 .細胞相對於損傷細胞對照組 (以紅色虛線代表｝細胞活力的％變化。 註 1: 紅線為損傷細胞對照組活力水平。 註 2: 所有試劑以細胞培養基稀釋。 註 3: *表示與損傷細胞對照組相比有顯著統計學差� � (p<0.05)。 第 3階段實驗： 再次確認 A、 B、 C、 D試劑對正常及損傷細胞活力的影響 第 3階段實驗，再次確認 A、 B、 C、 D試劑在最佳細胞實驗濃度 0.1%-0.9%的情況下，對 正常及損傷細胞活力的影響 。 損傷細胞對照組模型相對於正常對照組的細胞 活力 ，明顯降低了 77% (p<0.05) 顯示造模 成功 。 實驗顯示 ， 0.1%-0.9%濃度 A試劑顯著増加了正常細胞活力 367% (p<0.05) ， 0.1%-0.9%濃度 B試劑顯著増加了正常細胞活力 104% (p<0.05) 0.1%-0.9%濃度 D試劑顯著増加了正常細 胞活力 255% (p<0.05) ， 0.1%-0.9%濃度 C試劑僅増加了正常細胞活力 61%。 (表 3, 附件二 圖 5) 相對於損傷細胞對照組 ， 0.1%-0.9%濃度 A 試劑顯著増加了損傷細胞活力 259%

46 替换页 (细则第 26条) (p<0.05)。 0.1%-0.9%濃度 B試劑顯著増加了損傷細胞活力達 198% (p<0.05) 。 0.1%-0.9%% 濃度 D試劑顯著増加了損傷細胞活力 198% (p<0.05)。 0.1%-0.9%濃度 C試劑顯著増加了損 傷細胞活力 176% (p<0.05)。 (表 3, 附件二圖 6) 。 以上實驗結果表明 ， 0.1%-0.9%濃度 A試劑無論是在増加正常或損傷細胞活力的表� �都是 最佳 ，而 C試劑對雖増加正常細胞活力的作用不明顯，� �能顯著増加損傷細胞活力。 表 3. 經 A、 B、 C、 D試劑組處理 15 分鐘細胞相對於正常及損傷細胞活力的變化 註 1: 所有試劑以細胞培養基試劑以細胞培養基稀釋 到 0.1%-0.9%，水的濃度 1%-5%。 註 2: a.以上各試劑處理正常細胞組 15 分鐘取值。 b.以上各試劑處理損傷細胞組 15 分 鐘取值 。 註 3: 損傷細胞組是以 0.5 mM H ₂ 0 ₂ 處理 30 分鐘，取值 。 註 4: *表示與正常細胞對照組相比有顯著統計學差� � (p<0.05); #表示與損傷細胞對照組 相比有顯著統計學差異 (p<0.05)

47 替换页 (细则第 26条) 附件二圖 5. 經 A、 B、 C、 D試劑組處理 15 分鐘 .細胞相對於正常細胞對照組 （以紅色 虛線代表） 細胞活力的 ％ 變化。 註 1: 紅線為正常細胞對照組活力水平。 註 2: 所有試劑以細胞培養基稀釋到 0.1%-0.9%，水的濃度為 1%-5%。 註 3: *表示與正常細胞對照組相比有顯著統計學差� �（p<0.05）。 圖 6. 經 A、 B、 C、 D試劑組處理 15 分鐘 *細胞相對於損傷細胞對照組 （以紅色虛線代 表） 細胞活力的 ％ 變化。 註 1: 紅線為損傷細胞對照組活力水平。 註 2: 所有試劑以細胞培養基稀釋到 0.1%-0.9%，水的濃度為 1%-5%。 註 3: *表示與損傷細胞對照組相比有顯著統計學差� �（p<0.05）。 討論 ：

H ₂ 0 ₂ 過氧化氫是一種活性氧，能對細胞產生氧 化損傷及破壞細胞活力，並在過往研究中被 廣泛應用於建立 HUVEC 損傷細胞模型 ［2］。在本研究實驗中 ，過氧化氫顯著平均降低了 HUVEC細胞活性超過 70%，成功的建立了損傷細胞模型。 第 1階段實驗結果顯示：各試劑組都整體改善及� �升了受損傷細胞的活力，但沒有整體改 善或提升正常細胞的活力 ，顯示各試劑組僅作用於受損傷細胞。 實驗結果顯示 ，相對於正常細胞，各試劑組對正常細胞改善 及提升活力效應不明顯，僅對 受損傷細胞有提髙活力作用 ，而且細胞受到的損傷越大，各試劑組對損傷 細胞的修復與改 善活力作用就越强 。在對損傷細胞的活力改善和提升方面，油溶 性試劑比水溶性試劑強， 其中 A 試劑改善和提升損傷細胞活力的能力最髙也最 為顯著。

48 替换页 （细则第 26条） 第 2階段實驗結果顯示：當油溶性試劑濃度越髙� �對損傷細胞増加活力的效果越明顯，濃 度達到 0.1%-0.9%時為最有效的峰值量（圖 4），提示後續涉及細胞實驗油溶性試劑將都� � 0.1%-0.9%濃度處理細胞。 第 3階段實驗結果顯示：各油溶性試劑均能顯著� �善及提升損傷細胞的活力，並再次顯示 A試劑 改善及提升損傷細胞活力的表現都是最佳及最 為顯著。

A 、 B、 D試劑在第 1階段實驗中，對正常細胞活力沒有顯著影響� �但在第 3階段實驗中卻 顯著提升了正常細胞活力 ，經翻查原始資料及數據發現，第 3階段實驗中正常細胞對照組 活力平均取值 （附錄表 3）遠低於第 1階段實驗正常細胞對照組活力平均值 （附錄表 1），其 原因可能是因為在第 3階段細胞培養過程中因未明原因而受損，例� �環境化學污染物產生 自由基對細胞產生氧化損傷 ，破壞細胞活力等 ［3］ 。 以上實驗數據表明 ，實驗中，細胞本身受到的損傷越大， A、 B、 D各試劑組對細胞的修復 與改善活力作用就越顯著 ，顯示出對受損細胞强烈的修復與改善活力作 用特性。而對於正 常細胞 ，各試劑組作用輕微，數據並沒有統計學意義 ，提示了各試劑組對受損細胞的顯著 修復及調控作用 。 結論 ： 實驗明確了専利 SDTL-E 提取物各組及各不同劑量對細胞活力的生物效 應、明確了水與油 作為溶液時對細胞活力的差異性 、明確了在一定範圍內劑量與細胞活性效果存 在量效關係。 實驗結果顯示 ，各組試劑對於正常細胞的生物效應作用有限 ，數據也沒有統計學意義。 而實驗結果也顯示，各組試劑對於受損傷細胞 作用明顯，而且當細胞本身受到的損傷越大，

A 、 B、 D各試劑組對細胞的修復與改善活力作用就越� �著，結果顯示専利 SDTL-E提取物及

49 替换页 （细则第 26条） 相關組合試劑 ，對受損細胞活力具有強烈的修復與改善、調 節作用。 實驗結果顯示 ，油溶性試劑比水溶性試劑提升損傷細胞活力 的表現強。 實驗結果顯示 ， 0.1%-0.9%濃度 A試劑改善和提升損傷細胞活力的作用最髙及� �為顯著，相 對於受損傷細胞達到 259%。

0.1%-0.9%濃度 D試劑改善和提升損傷細胞活力的作用次之，� �對於受損傷細胞達 198%。 0.1%-0.9%濃度 B試劑改善和提升損傷細胞活力的作用再次之� �相對於受損傷細胞達 198%。 0.1%-0.9%濃度 C試劑改善和提升損傷細胞活力的作用最次之� �相對於受損傷細胞為 176%。 以上結果對發展全天然植物抗氧化 提取物成份產品和藥物時所用的成份、 組合、 使用量 與溶劑選擇都具參考價值及啟發意義 。

50 替换页 （细则第 26条） 附件三

SDTL-E對細胞內活性氧影響研究報告 摘 要 活性氧 (Reactive Oxygen Species, ROS) 在化學反應中是比分子氧更活潑的化合物。本 研究 以永生化人臍靜脈內皮細胞系 HUVEQ 作為模型細胞，並透過細胞內活性氧測定，評 估 以專利 SDTL-E提取物 A、 B及組合 D試劑使用於細胞後 15分鐘及 3分鐘時，對正常及 對被過氧化氫 (H2O2) 損傷的 HUVEC細胞內活性氧的影響，以瞭解其抗氧化功� ��及抗氧 化起效時間 、量效關係及部份作用機制。 細胞內活性氧測定結果顯示 ， A、 B、 D試劑都能降低損傷細胞內的活性氧水平， A、 B、 D 試劑處理損傷細胞 3分鐘，即能迅速降低細胞內活性氧水平。 各試劑組處理受損細胞 3分鐘，相對於受損傷細胞對照組， 0.1%-0.9%濃度 A試劑顯著的 降低了損傷細胞內活性氧 67% (p<0.05)，作用最為迅速，顯著降低及改善損� ��細胞內活性 氧最迅速與最顯著 。 各試劑組處理受損細胞 15分鐘，相對於受損傷細胞對照組， 0.1%-0.9%濃度 B試劑顯著降 低損傷細胞內活性氧 75% (p<0.05) 作用最為顯著，改善和降低損傷細胞內活性氧 作用最 顯著與最持續 。 實驗結果顯示各試劑組具有顯著的降低活性氧 作用 ，實驗對研究發展全天然植物抗氧化成 份和藥物所用的成份 、組合、使用量抗氧化功效、抗氧化起效速度 及後續其它細胞研究具 有方向啟發意義與後續的動物實驗參考價值 。 研究背景

51 替换页 (细则第 26条) 活性氧 (Reactive Oxygen Species, ROS) 在化學反應中是比分子氧更活潑的化合物。活 性氧 包括自由基 (Free Radical)和非自由基 (Nonfree Radical)含氧分子，可導致活性氧形成増加和 氧化應激 (Oxidative Stress)並損害氧化還原平衡。過氧化氫是一種� �自由基活性氧，當它多 接受一個電子時 ，它會分裂成羥基自由基 (Hydroxyl Radical) (HO )和羥基陰離子 ( OH- )［1, 2］。 當細胞內氧氣接受細胞內正常氧化代謝產生自 由電子，細胞內便會產生活性氧，如 02—、 羥基自由基以及過氧化氫 ，過量活性氧形成會導致氧化應激，直接損傷 細胞蛋白質、脂質 和核酸等 ，引致氧化損傷 (Oxidative Damage)導致細胞功能障礙甚至細胞死亡，而不� �身體 部位的氧化損傷會引起不同的疾病 ， 如癌症、哮喘、肺動脈髙壓和視網膜病變等『 3P 相關文獻指出 ，氧化應激可損傷成骨細胞並與骨質疏鬆症有 關 ，而抗氧化劑可以保護成骨 細胞免受氧化損傷 ，並有助於控制骨質疏鬆症［4, 5］。 我們之前以專利 SDTL-E提取物及組合皮膚外用 ，改善及治療骨質疏鬆和關節退化，經動 物實驗及 非正式人體臨床；)人體試用 ，治療及改善臨床症狀效果明顯。在之前 「不同植物 提取物對細胞活力影響研究」實驗中，專利 SDTL-E提取物及組合不同份量的 A、 B、 D因 應實驗環境及實際操作需要 ，以血管細胞基礎培養基稀釋至不同百分比濃 度。實驗結果顯 示 ， 在稀釋至 0.1%-0.9%濃度時， 能最顯著提髙被過氧化氫 (Hydrogen Peroxide, H ₂ 02)損傷 的人臍靜脈內皮細胞 (Human Umbilical Vein Endothelial Cell, HUVEC) 的細胞活力。 本研究旨在為進一步瞭解專利 SDTL-E提取物及組合 A、 B、 D試劑是否擁有細胞內的抗 氧化功能及抗氧化程度 ，以瞭解 A、 B、 D試劑提髙細胞活力及改善治療骨質疏鬆和關� � 退化的一些機制與量效關係 。 A、 B、 D試劑相關資訊在實驗完結、統計及分析完成� �才會

52 替换页 (细则第 26条) 被披露 。 研究目的 通過先前 研究骨質疏鬆相 關藥物问及細胞抗 氧化實驗［7］的人臍靜脈內皮細胞 ( H u m a n Umbilical Vein Endothelial Cell, HUVEC)模型與參考相關文獻，實驗研究瞭解專利 SDTL®A、

B 、 D試劑組植物提取成份對細胞內活性氧的不同� �度影響，以瞭解 A、 B、 D試劑對細胞 的抗氧化功效及抗氧化功能起效的速度與初步 作用機制 。 研究程序 細胞系 (Cell Line) 永生化人臍靜脈內皮細胞系 (Immortalized HUVEC ) (ATCC, Manassas, Virginia, U.S.A)被用作 這次研究的模型細胞 。細胞培養方法是根據細胞供應商 ATCC的說明，將加入了內皮細胞 生長液 (Endothelial Cell Growth Kit-VEGF) (ATCC)的血管細胞基礎培養基 (Vascular Cell Basal Medium) (ATCC) 用於培養人臍靜脈內皮細胞，培養環境為 37°C 及 5%的二氧化碳。 計算細胞數量 血細胞計數板 (Hemocytometer) (Paul Marienfeld GmbH & Co. KG, Lauda-Konigshofen, Germany) 被用作計算細胞數量 。 10 piL細胞被注入血細胞計數板中 ，然後將血細胞計數板放在細胞 培養顯微鏡 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, U.S.A)下計算細胞數量。 細胞內活性氧測定 (Intracellular ROS Assay) 榮光細胞內活性氧測定 (Fluorometric Intracellular ROS Assay) (Sigma Aldrich)被用作測定細 胞內活性氧的含量 ，以評估 A、 B、 D試劑作用於細胞的抗氧化能力。其原理為細� �內活

53 替换页 (细则第 26条) 性氧與可滲透細胞的傳感器化學物質 (Cell-permeable Sensor Chemical)發生反應產生榮光， A 、 B、 D試劑細胞內抗氧化能力越強，熒光亮度值會� �低。 熒光細胞內活性氧測定是根據供應商的說明 ，在 96孔板 (96 Well Plate)中 ，先在每個孔預 備 10000 個細胞浸在 100 培養基裡，然後加入 100 傳感器反應混合物 (Reaction Master Mix)，並放在 B7°C 30分鐘。然後使用酶標儀 (Molecular Devices) 激發波長 540 nm ^· 並測量發射波長 570 nm，以量化細胞內活性氧。 評估程序 將 0.5mM過氧化氫 (Kam Sing Medicine Co. Hong Kong, China) 加至 HUVEC細胞中 30分鐘 (受損細胞對照組 )。血管細胞基礎培養基加至 HUVEC細胞中 30分鐘 (正常細胞對照組)。 然後將血管細胞基礎培養基及被血管細胞基礎 培養基稀釋至 0.1%-0.9%濃度的 A、 B、 D試 劑 ，分別加到受損細胞對照組、正常細胞對照組 中。再透過細胞內活性氧測定、取值，統 計 ，分析各試劑對細胞內活性氧影響及差異。實 驗分組為：正常細胞對照組、正常細胞加 水 、正常細胞加油、正常細胞加 A試劑、正常細胞加 B試劑、正常細胞加 D試劑、受損細 胞對照組 、受損細胞加水、受損細胞加油、受損細胞加 A試劑、受損細胞加 B試劑及受損 細胞加 D試劑共 12組。 統計分析 本研究分兩階段進行 。每階段實驗均重複進行 3次，然後不同組別細胞和對照組及損傷細 胞對照組的細胞內活性氧 平均值差異被用作統計學分析 。如果數據是正態分佈 (Normally

Distributed)的，參數化 (Parametric) t檢驗 (t-test) 將被用作分析數據，如果數據是非正態分 佈的 ，非參數化 (Non-parametric)曼惠特尼檢驗 (Mann-Whitneytest) 將被用作分析數據。當

54 替换页 (细则第 26条) P 值 <0.05 時，統計學上認為差異是顯著的。所有數據由 統計學軟件 GraphPad Prism 9 （Graph Pad Software Inc., La Jolla, CA, United States） 分析。第一階段實驗是在使用各組試劑 後 15分鐘測定細胞內活性氧狀況；第二階段實驗� ��在使用各組試劑後 3分鐘測定細胞內 活性氧狀況 。 數據及結果 第 1階段實驗： 各試劑處理 15分鐘 對正常及損傷細胞組活性氧的影響 實驗結果顯示 相對於正常細胞對照組 ，各試劑組對正常絀胞組細胞內活性氧雖有影 響 ^· 但沒有統計學意義 。（表 1, 圖 1） 實驗造模中顯示 ，損傷細胞對照組模型的細胞內活性氧相對於 正常細胞對照組，顯著増加 了 94%（p<0.05） 顯示損傷細胞模型造模成功。（表 1） 實驗結果顯示，相對於損傷細胞對照組 ^· 0.1-0.9%濃度 A顯著降低了損傷絀胞內活性氧 68% （p<0.05） ^• 0.1-0.9%濃度 B顯著降低了損傷細胞內活性氧 75%（p<0.05） ^• 0.1-0.9%濃度 D降 低了損傷細胞內活性氧 36%。（表 1, 圖 2） 表 1. 經各試劑處理 15分鐘細胞相對於正常及損傷細胞組細胞內活� ��氧的變化

55 替换页 （细则第 26条） 註 1: 所有試劑以細胞培養基稀釋到 0.1-0.9%，水的濃度為 1%-5%。 註 2: 1.以上各試劑處理正常細胞組 15 分鐘取值。 2.以上各試劑處理損傷細胞組 15 分 鐘取值 。 註 3: 損傷細胞組是以 0.5 mM H ₂ O ₂ 處理 30 分鐘，取值 。 註 4: *表示與正常細胞對照組相比有顯著統計學差� � (p<0.05); #表示與損傷細胞對照組 相比有顯著統計學差異 (p<0.05)

56 替换页 (细则第 26条) 附件三圖 1. 經各試劑組處理 15 分鐘 ^· 相對於正常細胞 (以紅色虛線代表｝對照組 細胞內活性氧的％變化。 註 1: 紅線為正常細胞對照組細胞內活性氧水平。 註 2: 所有試劑以細胞培養基稀釋到 0.1-0.9%，水的濃度為 1%-5%。 附件三圖 2. 經各試劑組處理 15 分鐘 ^· 相對於損傷細胞對照組 (以紅色虛線代表｝ 細胞 內活性氧的％變化。 註 1: 紅線為損傷細胞對照組細胞內活性氧水平。 註 2: 所有試劑以細胞培養基稀釋到 0.1%-0.9%，水的濃度為 1%-5%。 註 3: *表示與損傷細胞對照組相比有顯著統計學差� � (p<0.05) 。 第 2階段實驗： 各試劑處理 3分鐘 對正常及損傷細胞組活性氧的影響 為了進一步瞭解 A、 B、 D試劑抗氧化功能的初始起效時間 本研究再測試了以各試劑處 理 3分鐘時，對正常及損傷細胞組活性氧的影響� � 實驗中 ，損傷細胞對照組模型的細胞活性氧，相對於 正常細胞對照組明顯増加了 148% (p<0.05) ，顯示損傷細胞模型造模成功。 實驗結果顯示，0.1%-0.9%濃度 A顯著降低了正常細胞內的活性氧 65% (p<0.05) 0.1%-0.9% 濃度 B顯著降低了正常細胞內的活性氧 56% (p<0.05) (表 2,圖 3)。相對於損傷絀胞對照組， 0.1%-0.9%濃度 A顯著降低了損傷絀胞內的活性氧 67% (p<0.05)。 0.1%-0.9%濃度 B顯著降 低了損傷細胞內的活性氧 60% (p<0.05)。 0.1%-0.9%濃度 D 也降低了損傷絀胞內的活性氧 19% 。 (表 2, 圖 4 )以上實驗結果表明， 0.1%-0.9%濃度 A及 B試劑處理正常及損傷細胞 3 分鐘時 ，能迅速顯著降低受損傷細胞及細胞內活性氧 水平。

57 替换页 (细则第 26条) 表 2. 經各試劑處理 3分鐘 ^· 相對於正常及損傷細胞組細胞內活性氧的 變化 註 1: 所有試劑以細胞培養基稀釋到 0.1-0.9%，水的濃度為 1%-5%。 註 2: 1.以上各試劑處理正常細胞組 3 分鐘取值。 2.以上各試劑處理損傷細胞組 3 分鐘 取值 。 註 3: 損傷細胞組是以 0.5 mM H ₂ 0 ₂ 處理 30 分鐘，取值 。 註 4: *表示與正常細胞對照組相比有顯著統計學差� �（p<0.05）; #表示與損傷細胞對照組 相比有顯著統計學差異（p<0.05） 。 附件三圖 3. 經各試劑處理 3 分鐘 相對於正常細胞（以紅色虛線代表｝對照組 細胞內活性氧的％變化。 註 1: 紅線為正常細胞對照組細胞內活性氧水平。 註 2: 所有試劑以細胞培養基稀釋到 0.1%-0.9%，水的濃度為 1%-5%。 註 3: *表示與正常細胞對照組相比有顯著統計學差� �（p<0.05）。 附件三圖 4 經各試劑處理 3 分鐘 ^· 相對於損傷細胞對照組（以紅色虛線代表 ｝ 細胞內

58 替换页 （细则第 26条） 活性氧的％變化。 註 1: 紅線為損傷細胞對照組細胞內活性氧水平。 註 2: 所有試劑以細胞培養基稀釋到 0.1%-0.9%，水的濃度為 1%-5%。 註 3: *表示與損傷細胞對照組相比有顯著統計學差� �（p<0.05） 冊

H202 過氧化氫是一種活性氧，能導致細胞內活性氧 如超氧陰離子 CSuperoxide anions；）増加 [8] -產生及對細胞產生氧化損傷作用令細胞凋亡� �常，並在過往研究中被廣泛應用於建立 HUVEC 損傷細胞模型 [9]。 在本研究建立損傷細胞模型實驗中 ，過氧化氫顯著的平均増加了 HUVEC細胞內活性氧超 過 90%，實驗結果確定損傷細胞模型建立成功。 第 1階段實驗：各試劑組處理細胞 15分鐘顯示， A、 B、 D試劑均降低了受損傷細胞內活 性氧 ，具統計學意義。而對正常細胞內活性氧沒明 顯作用，無統計學意義，其中 B、 D試 劑更提升了細胞內活性氧水平 。 實驗結果顯示 ，當細胞受損細胞內活性氧水平越髙，各試劑 組對損傷細胞的抗氧化功效越 大 、越顯著。在對損傷細胞的抗氧化功效上， B試劑處理損傷細胞 15分鐘時抗氧化功效 最髙及最為顯著 。 第 2階段實驗：各試劑組處理細胞 3分鐘，顯示 A、 B、 D試劑均能迅速整體降低受正常 細胞及損傷細胞內的活性氧 ，能迅速對受損傷細胞及正常細胞產生抗氧化 功效，其中 A試 劑處理損傷細胞 3分鐘時抗氧化功效最髙及最為顯著。 綜合兩階段的實驗結果顯示 ， A、 B試劑處理損傷細胞 3分鐘， A比 B降低損傷細胞內活

59 替换页 （细则第 26条） 性氧水平能力強 。但 A、 B試劑處理損傷細胞 15分鐘時， B比 A降低損傷細胞內活性氧 水平能力強 。 通過兩階段實驗結果分析及比較 ，顯示 A對損傷細胞的抗氧化作用起效比 B更迅速，而 B 對損傷細胞的抗氧化作用持久性比 A强，但起效較慢。 兩階段的實驗結果亦顯示 ， : B、 D試劑處理正常細胞 3分鐘，能降低正常細胞內活性氧水 平 ，但當 B、 D試劑處理正常細胞 15分鐘時，卻提升了細胞內活性氧水平，經翻� ��原始資 料數據及參考相關文獻發現有兩個原因可能導 致以上結果 。第一個原因是實驗原始資料數 據顯示 ，處理正常細胞 3分鐘的第 2階段實驗中，正常細胞對照組細胞內活性氧� �均取值 (附錄表 2；)遠髙於處理正常細胞 15分鐘的第 1階段實驗正常細胞對照組細胞內活性氧平均 值 附錄表 ，這有可能是因為在第 2階段實驗細胞培養過程中因環境化學污染物� �生自 由基對細胞產生氧化損傷所致『10；| ，由於第 2階段實驗正常細胞對照組細胞內活性氧水平 本身較髙 ， : B、 D試劑降低細胞內活性氧的效果亦較大。 第二個原因是 B、 D試劑處理細胞時間較長，反而有機會令細胞� �活性氧累積而使活性氧 水平升髙 。因曾有一些研究文獻顯示，一些天然抗氧化 植物分子，如 10 _)i M濃度以上白藜 薦酉學 (Resveratrol)處理 HUVEC 細胞 6小時後，竟升局了細胞內活性氧水平。這現� �可能 是因為外源性抗氧化劑 如白藜蘆醇在清除正常細胞中細胞信號傳導所 必需的低水平活性 氧過程中 ，正常細胞通過抗異生物代謝 (Anti-xenobiotic Metabolic Pathway) 為消除白藜蘆 醇而產生了髙活性氧累積『IIP 另外 ，抗氧化物對活性氧會引起哪些影響，很大程 度上取決於細胞的類型、活性氧產生的 來源 、數量、持續時間和位置［1］。以上條件在� �胞實驗中與在活體動物實驗中會有一定差

60 替换页 (细则第 26条) 異 ，例如細胞實驗因素可能引致活性氧代謝物無 法如在活體中產生生理代謝而排出體外， 從而使細胞內產生活性氧累積效應 ，並導致細胞內活性氧累積性的升髙。 所以 ，細胞實驗結果僅能作為動物實驗的參考，並 不能完全反映動物或人體中會實際發生 的狀況 。通過本研究，實驗結果及數據分析顯示，在 本實驗中，細胞內本身活性氧水平越 髙時 ， A、 B、 D各試劑組對降低細胞內活性氧水平功效就越� �著，越顯示出對受損細胞強 烈的抗氧化修復作用 ，而對於正常細胞，各試劑組效用有限，數據 也較沒有統計學意義， 提示了各試劑組對正 常細胞與受損細胞的顯著抗氧化效果是來自於 對細胞內活性氧的清 除及調控機制作用 。 結 論 實驗結果明確顯示了專利 SDTL-E提取物及組合 A、 B、 D試劑對受損細胞內活性氧具有顯 著的抗氧化效應及量效 、時間關係，實驗結果也顯示各試劑組，對於 正常細胞內活性氧的 抗氧化功效有限 ，數據較沒有統計學意義，但也提示了各試劑 組對受損及正常細胞的差異 性及調控或平衡作用 。 實驗結果顯示，各試劑組對受損傷細胞抗氧化 作用明顯，而且當細胞本身受到的損傷越大， A 、 B、 D各試劑組對細胞的抗氧化功效就越顯著，顯� �相關各試劑組對受損細胞內的活性 氧具有強烈的抗氧化作用 。各試劑組處理受損細胞 15分鐘， 0.1%-0.9%濃度 B試劑降低受 損傷細胞內活性氧的作用最髙及最為顯著 ，相對於受損傷細胞顯著降低了 75%。 0.1%-0.9% 濃度 A試劑降低損傷細胞內活性氧的作用次之，相� �於受損傷細胞顯著降低了 68%活性 氧 。 0.1%-0.9%濃度 D試劑降低損傷細胞內活性氧的作用再次之，� �對於受損傷細胞，降 低了 36%活性氧。

61 替换页 （细则第 26条） 各試劑組處理受損細胞 3分鐘， 0.1%-0.9%濃度 A試劑降低損傷細胞內活性氧的作用最迅 速及最顯著 ，相對於受損傷細胞，顯著降低了 67%活性氧。 0.1%-0.9%濃度 B試劑降低損 傷細胞內活性氧的作用次之 ，相對於受損傷細胞顯著降低了 60%活性氧。 0.1%-0.9%濃度 D 試劑降低損傷細胞內活性氧的作用再次之 ，相對於受損傷細胞降低了 19%活性氧。 以上對正常及受損細胞的實驗結果及試劑對正 常及受損細胞的作用 ，對進一步發展及開發 全天然植物抗氧化提取物成份產品 ，和研究藥物成份、組合、使用量、抗氧化功 效、抗氧 化起效速度 、量效關係及瞭解作用機制有啟發及參考價值 。

62 替换页 （细则第 26条） 附件四

SDTL-E對細胞鉀離子通道活性影響研究報告 摘 要 鉀離子通道 Potassium lon Chaime^是跨越細胞膜的孔 ， 可選擇性地只讓鉀離子通過細胞膜。 文獻指出鉀離子通道的調節在骨質疏鬆和關節 退化中發揮潛在作用。以往研究亦表明鉀離 子通道可影響細胞増殖週期 、細胞活力和細胞凋亡等。 本研究以永生化人臍靜脈內皮細胞系 HUVEC) 作為模型細胞 ，並透過鉀離子通道測定， 評估專利 SDTL-E提取物 A、 B及組合物 D三種試劑 ，使用於細胞後 15分鐘對正常及對 被過氧化氫 (H2O2) 損傷的 HUVEC細胞內鉀離子通道活性影響 ，以瞭解其調節細胞功能 的鉀離子通道形式 。 實驗結果顯示 ， A、 B、 D試劑處理正常細胞及損傷細胞 15分鐘 ，對正常及受損傷細胞都 有調降非電壓門控鉀離子通道活性的作用 。相對於受損傷細胞對照組， 0.1%-0.9%濃度 B 試劑顯著調降受損傷細胞非電壓門控鉀離子通 道活性 65% (p<0.05) 對非電壓門控鉀離子 通道作用最明顯 。 實驗結果顯示 ， A、 B、 D試劑處理正常及受損細胞 15分鐘 ，相對於受損傷細胞對照組 ， 對正常及損傷細胞的電壓門控鉀離子通道作用 極微 ，無統計學意義。 實驗結果顯示 ， A、 B、 D試劑均具有顯著調降正常及損傷細胞非電壓� �控鉀離子通道活性 作用 ，而對電壓門控鉀離子通道無明顯作用，顯示 其作用機制是通過非電壓門控鉀離子通 道途徑而呈現 。 實驗結果顯示 ，單一提取物與提取組合物間對電壓門控鉀離 子通道活性存在明顯差異，提

63 替换页 (细则第 26条) 示在提取組合物之間所產生的複合作用值得重 視。 實驗對於進一步發展及 開發全天然植物抗氧化提取物和研究作用鉀離 子通道作用機制與 瞭解其它途徑 ，具有啟發與參考價值。 研究背景 鉀離子通道是跨越細胞膜的孔 ，可選擇性的只讓鉀離子通過細胞膜。鉀離子 通道存在於大 多數細胞類型中 ，並控制多種生物學功能，例如調節激素分泌 、上皮功能和抑制興奮性信 號等［1］。文獻指出鉀離子通道的調節在骨� �疏鬆［2］和關節退化［3］中發揮潛在作用。 以往 研究亦表明鉀離子通道可影響細胞増殖週期 、細胞活力和細胞凋亡等『4, 5；|。 我們之前以專利 SDTL-E提取物皮膚外用改善及治療骨質疏鬆和關 節退化，經動物實驗及 人體治療試用 非正式人體臨床；)改善臨床症狀效果明顯。� �之前「不同植物提取物對細胞 活力影響研究」實驗中 ，不同劑量的專利 SDTL-E提取物因應實驗環境及實際操作需要， 以血管細胞基礎培養基稀釋至不同百分比濃度 實驗 ，實驗結果顯示，在稀釋至 0.1%-0.9% 濃度時 ，發現 A、 B、 D能最顯著提髙被過氧化氫 (Hydrogen Peroxide, H ₂ 02)損傷的人臍靜 脈內皮細胞 (Human Umbilical Vein Endothelial Cell, HUVEC) 細胞活力。 本研究旨在進一步瞭解專利 SDTL-E提取物 A、 B、 D試劑顯著提髙細胞活力的作用機制 及對細胞鉀離子通道活性的影響與作用途徑 ，瞭解 A、 B、 D試劑提髙細胞活力及改善治 療骨質疏鬆和關節退化的相關離子通道機制。 A、 B、 D試劑相關資訊在「不同植物提取物 對細胞活力影響研究」實驗完結 、統計及分析完成後已經披露。 研究目的

64 替换页 (细则第 26条) 通過先前 研究骨質疏鬆相關藥 物问及鉀離子通 道實驗［5］的人臍靜脈內皮細胞 (Human Umbilical Vein Endothelial Cell, HUVEC)模型及參考文獻，研究瞭解專利 SDTL-E提取物試劑 組植物成份對細胞鉀離子通道活性的影響 ，以瞭解 A、 B、 D試劑調節細胞功能的離子通 道機制及途徑 。 研究程序 細胞系 (Cell Line) 永生化人臍靜脈內皮細胞系 (Immortalized HUVEC ) (ATCC, Manassas, Virginia, U.S.A)被用作 這次研究的模型細胞 。細胞培養方法是根據細胞供應商 ATCC的說明，將加入了內皮細胞 生長液 (Endothelial Cell Growth Kit-VEGF) (ATCC)的血管細胞基礎培養基 (Vascular Cell Basal Medium) (ATCC) 用於培養人臍靜脈內皮細胞，培養環境為 37°C 及 5%的二氧化碳。 計算細胞數量 血細胞計數板 (Hemocytometer) (Paul Marienfeld GmbH & Co. KG, Lauda-Konigshofen, Germany) 被用作計算細胞數量 。 10 piL細胞被注入血細胞計數板中 ，然後將血細胞計數板放在細胞 培養顯微鏡 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, U.S.A)下計算細胞數量。 鉀離子通道測定 (Potassium Ion Channel Assay)

FluxORäll綠色紳離子通道測定 (Thermo Fisher Scientific)被用作測定細胞紳離子通道活性， 以評估 A、 B、 D試劑對細胞鉀離子通道活性的影響。其原理� �利用能通過鉀離子通道進 入細胞的鉈離子 (Thallium Ion)，當鉈離子進入細胞與事先放進細胞的 FluxORäll綠色指示 劑染料 (FluxOR™ll Green Indicator Dye) 發生反應就會放出綠色榮光，以量度紳離子通 道活

65 替换页 (细则第 26条) 性 。細胞鉀離子通道活性越髙 ，熒光亮度值會越髙。 鉀離子通道測定是根據 FluxORäll綠色鉀離子通道測定供應商的說明 ， 在 96孔板 (96 Well Plate)中 ，先在每個孔預備 20000個細胞浸在 80 培養基裡 ，然後加入 80 FluxORäll 綠色指示劑染料 ，並放在 24°C環境 60分鐘。之後，如要測量非電壓門控鉀離子通� �� (Non- Voltage Gated Potassium Ion Channel)活性 ， 就加入 40 piL 含鉈離子的基礎紳刺激緩衝液 (Basal Potassium Stimulus Buffer); 如要測量電壓門控紳離子通道活性 (Voltage-Gated Potassium Ion Channel) ^· 就加入 40 piL含鉈離子的髙紳刺激緩衝液 (High Potassium Stimulus Buffer)。 最後使用酶標儀 (Molecular Devices) 測量榮光 ，榮光激發波長為 490 nm ， 然 後量度熒光發射波長 525 nm ，以量化細胞鉀離子通道活性。 評估程序 將 0.5mM過氧化氫 (Kam Sing Medicine Co. Hong Kong, China) 加至 HUVEC細胞中 30分鐘 (受損細胞對照組 )。 血管細胞基礎培養基加至 HUVEC細胞中 30分氧正常細胞對照組 )。 然後將血管細胞基礎培養基及被血管細胞基礎 培養基稀釋至 0.1%-0.9%濃度的 A、 B、 D試 劑分別加到受損細胞對照組 、正常細胞對照組中 15分鐘。再透過鉀離子通道測定、取值， 統計 ，分析各試劑對細胞鉀離子通道活性影響及差 異。實驗分組為：正常細胞對照組、正 常細胞加水 、正常細胞加油脂、正常細胞加 A試劑、正常細胞加 B試劑、正常細胞加 D試 劑 、受損細胞對照組、受損細胞加水、受損細胞 加油脂、受損細胞加 A試劑、受損細胞加 B試劑及受損細胞加 D試劑 ，共 12組。 統計分析 本研究分兩階段進行 。每階段實驗均重複進行 3次，然後不同組別細胞和對照組及損傷細

66 替换页 (细则第 26条) 胞對照組的細胞鉀 離子通道活性平均值差異被用作統計學分析 。 如果數據是正態分佈

(Normally Distributed)的，參數化 (Parametric) t檢驗 (t-test) 將被用作分析數據，如果數據是 非正態分佈的 ，非參數化 (Non-parametric)曼惠特尼檢驗 (Mann-Whitneytest) 將被用作分析 數據 。當 P 值 <0.05 時，統計學上認為差異是顯著的。所有數據由 統計學軟件 GraphPad Prism 9 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, United States) 分析。第一階段實驗是在使用各 組試劑後 15分鐘測定正常及損傷細胞非電壓門控鉀離子� ��道活性；第二階段實驗是在使 用各組試劑後 15分鐘測定正常及損傷細胞的電壓門控鉀離子� ��道活性。 數據及結果 第 1階段實驗： 各試劑處理 15分鐘 ^· 對正常細胞和損傷細胞組非電壓門控鉀離 子通道活 性的影響 實驗造模顯示 ，損傷細胞對照組模型的細胞非電壓門控鉀離 子通道活性相對於正常細胞對 照組 ，顯著升髙了 71% (p<0.05) 顯示損傷細胞模型造模成功。 (表 1) 實驗結果顯示 ，相對於正常細胞對照組， 0.1%-0.9%濃度 A降低了正常細胞非電壓門控鉀 離子通道活性 68% ， 0.1%-0.9%濃度 B 降低了正常細胞非電壓門控鉀離子通道活性 55% (p<0.05) 0.1%-0.9%濃度 D降低了正常細胞非電壓門控鉀離子通道活性 67% (p<0.05)。顯 示 A、 B、 D試劑均有調降正常細胞非電壓門控鉀離子通� �活性的作用。 (表 1, 附件四圖 1) 。 實驗結果顯示 ，相對於損傷細胞對照組， 0.1%-0.9%濃度 A顯著降低了損傷細胞非電壓門 控鉀離子通道活性 54% (p<0.05) 0.1%-0.9%濃度 B顯著降低了損傷細胞非電壓門控鉀離 子通道活性 65% (p<0.05)， 0.1%-0.9%濃度 D顯著降低了損傷細胞非電壓門控鉀離子通道� �

67 替换页 (细则第 26条) 性 56%（p<0.05）。顯示 A、 B、 D試劑均有調降受損傷細胞非電壓門控鉀離子� �道活性的作 用 。（表 1, 附件四圖 2）。 表 1. 經各試劑處理 15分鐘細胞相對於正常及損傷細胞組非電壓門� ��鉀離子通道活性的 變化 註 1: 所有試劑以細胞培養基稀釋到 0.1%-0.9% 水的濃度為 1%-5%。 註 2: a.以上各試劑處理正常細胞組 15 分鐘取值。 b.以上各試劑處理損傷細胞組 15 分 鐘取值 。 註 3: 損傷細胞組是以 0.5 mM H ₂ 0 ₂ 處理 30 分鐘，取值 。 註 4: *表示與正常細胞對照組相比有顯著統計學差� �（p<0.05）; #表示與損傷細胞對照組 相比有顯著統計學差異（p<0.05）. 第 2階段實驗： 各試劑處理 15分鐘 對正常及損傷細胞組電壓門控鉀離子通道活性 的影響 實驗造模顯示 ，損傷細胞模型組的電壓門控鉀離子通道活性 相對於正常細胞對照組，僅降 低了 11%，沒有統計學意義。（表 1）

68 替换页 （细则第 26条） 實驗結果顯示 ，相對於正常細胞對照組， 0.1%-0.9%濃度 A及 B雖有降低正常細胞電壓門 控鉀離子通道活性 ，但沒有統計學意義。其中 0.1%-0.9%濃度組合物 D降低正常細胞電壓 門控鉀離子通道活性值最大 44%（p<0.05）。（表 2, 附件四圖 1） 實驗結果顯示 ，相對於損傷細胞對照組， 0.1%-0.9%濃度 A提髙了損傷細胞電壓門控鉀離 子通道活性 32% ， 0.1%-0.9%濃度 B提髙了損傷細胞電壓門控鉀離子通道活性 12%， 0.1%-0.9%濃度 D則降低了損傷細胞電壓門控鉀離子通道活性 28%，雖顯示出組合物 D與 提取物 A、 B對損傷細胞電壓門控鉀離子通道活性作用相� �，但數值並沒有統計學意義。 （表 2,圖 2） 也顯示 A B D試劑，無論是對正常細胞還是損傷細胞的電� �門控鉀離子通 道作用極微 。 表 2. 經各試劑處理 15分鐘 ^· 相對於正常及損傷細胞組電壓門控鉀離子 通道活性的變化 註 1: 所有試劑以細胞培養基稀釋到 0.1%-0.9%，水的濃度為 1%-5%。

69 替换页 （细则第 26条） 註 2: a.以上各試劑處理正常細胞組 15 分鐘取值。 b.以上各試劑處理損傷細胞組 15 分 鐘取值 。 註 3: 損傷細胞組是以 0.5 mM H ₂ 0 ₂ 處理 30 分鐘，取值 。 註 4: *表示與正常細胞對照組相比有顯著統計學差� � (p<0.05); #表示與損傷細胞對照組 相比有顯著統計學差異 (p<0.05) 。 附件四圖 1. 經各試劑處理 15 分鐘 相對於正常細胞 (以紅色虛線代表｝對照組細胞鉀離 子通道活性的％變化。 註 1: 紅線為正常細胞對照組細胞鉀離子通道活性水 平。 註 2: 所有試劑以細胞培養基稀釋到 0.1%-0.9%，水的濃度為 1%-5%。 註 3: *表示與正常細胞對照組相比有顯著統計學差� � (p<0.05)。 附件四圖 2 經各試劑處理 15 分鐘 ^· 相對於損傷細胞對照組 (以紅色虛線代表｝ 細胞內 鉀離子通道活性的％變化。 註 1: 紅線為損傷細胞對照組細胞鉀離子通道活性水 平。 註 2: 所有試劑以細胞培養基稀釋到 0.1%-0.9%，水的濃度為 1%-5%。 註 3: *表示與損傷細胞對照組相比有顯著統計學差� � (p<0.05).

5可 珊 鉀離子 通道根據其 結構和功能可 分為不同的亞 族 (Subfamily) ， 如內向整流器 (Inward

Rectifiers)、四個跨膜段 -2孔 (FourTransmembrane Segments-2 Pores, K2P)、電壓門控 (Voltage-

Gated)和鈣激活 (Calcium Activated)類型⑴。文獻指出 ，所有這些鉀離子通道根據激活方式 也可分為兩大類 ，即電壓門控鉀離子通道和配體門控鉀離子通 道 (Ligand-Gated Potassium

70 替换页 (细则第 26条) Ion Channel) 也稱為非電壓門控鉀離子通道。 亦有研究表明 ，有些鉀離子通道的激活過程不僅取決於電壓 ，還取決於配體結合，如在非 洲爪蟾卵母細胞 (Xenopus Oocytes)中 ，香菜葉提取物 (Cilantro Leaf Extract) 能降低、激活電 壓門控離子通道 KCNQ2/B的電壓依賴性［刀。綜合之前 A、 B、 D試劑活力實驗研究結果， 本實驗證實了 A、 B、 D試劑均是通過非電壓門控鉀離子通道途徑而� �現生物效應作用。 H ₂ 0 ₂ 過氧化氫是一種活性氧，在過往研究中被 廣泛應用於建立 HUVEC損傷細胞模型［8］， 並能増加鉀離子通道活性［9］。在本研究建� �損傷細胞模型實驗中，過氧化氫顯著的提髙� � HUVEC細胞非電壓門控鉀離子通道活性 71%，實驗結果確定損傷細胞模型建立成功。 第 1階段實驗：各試劑組處理細胞 15分鐘顯示 ^· A、 B、 D試劑均顯著降低了受損傷細胞 非電壓門控鉀離子通道活性 ，具統計學意義。而 B、 D試劑也顯著降低了正常細胞的非電 壓門控鉀離子通道活性 。 A試劑雖然也降低了正常絀胞非電壓門控鉀離� �通道活性，但無 統計學意義 。 實驗結果顯示 ， B試劑處理損傷細胞 15分鐘時降低非電壓門控鉀離子通道活性功效� ��強 及最為顯著 。 第 2階段實驗：各試劑組處理細胞 15分鐘顯示， A、 B試劑 (提取物對損傷細胞電壓門 控鉀離子通道的活性雖有影響 ，但無統計學意義，只有 D試劑 (提取組合物 )與正常絀胞 電壓門控鉀離子通道活性值相比較具有統計學 意義 ，顯示提取組合物 D與單一提取物 A、 B ，對正常細胞電壓門控鉀離子通道調控存在差 異。單一提取物 A、 B試劑對於損傷細胞 電壓門控鉀離子通道活性均呈現升高狀態，而 提取組合物 D試劑對於損傷細胞電壓門控鉀 離子通道活性卻呈現降低狀態 ，也顯示單一提取物與提取組合物對於損傷細 胞電壓門控鉀

71 替换页 (细则第 26条) 離子通道活性調控存在差異 。其差異性應來自於組合物之間相互作用所產 生的複合效應。 實驗造模過程中 ，過氧化氫顯著升高了非電壓門控鉀離子通道 活性 ^· 但對電壓門控鉀離子 通道活性影響卻不顯著。兩階段的實驗結果顯 示， A、 B、 D試劑無論是處理正常或損傷細 胞 ，對非電壓門控鉀離子通道活性的影響遠比對 電壓門控鉀離子通道活性的影響顯著，說 明 A、 B、 D試劑主要是透過影響非電壓門控鉀離子通道� �對正常及損傷細胞呈現生物效 應 。 過去的研究文獻表明 ，過氧化氫能提髙 HUVEC細胞鈣激活鉀電流的幅度［9］，反映過氧 化 氫是提高細胞鈣而激活鉀離子通道活性。另一 項研究文獻表明植物酚類化合物可以抑制鈣 而激活鉀離子通道［10］。雖然鈣激活鉀離子� ��道被傳統視為電壓門控鉀離子通道，但有文 獻指出一些電壓門控鉀離子通 道也可以通過直接與植物提取物結合以配體門 控鉀離子通 道方式進行調節作用［7］。以往研究文獻指� �，鉀離子通道中，電壓門控鉀離子通道是細� � 活力 、細胞増殖和細胞死亡的主要調節機制［4, 5］。参考上述文獻與我們之前「不同植物提 取物對細胞活力影響研究報告」中 A、 B、 D試劑能提升 HUVEC細胞活力的結果及分析本 實驗結果表明 ，在本實驗中， A、 B、 D試劑無論是處理正常或是損傷細胞，對非電� �門控 鉀離子通道活性的影響顯著 ，而對電壓門控鉀離子通道活性的影響有限， 數據也較沒有統 計學意義 ，提示了各試劑組是通過調控非電壓門控鉀離 子通道而對正常細胞與受損細胞呈 現功能作用 ，是透過非電壓門控鉀離子通道而調節細胞活 力。 結 論 實驗結果明確顯示專利 SDTL-E提取物 A、 B及組合 D試劑對正常及受損細胞非電壓門控 鉀離子通道活性均有顯著調節作用 ，而對於正常及受損細胞的電壓門控鉀離子通 道活性影

72 替换页 （细则第 26条） 響不明顯 ，數據也沒有統計學意義，顯示 A、 B、 D試劑主要是通過調控非電壓門控鉀離 子通道影響細胞 。 各試劑組處理受損細胞 15分鐘， 0.1%-0.9%濃度 B試劑降低受損傷細胞非電壓門控鉀離子 通道活性的作用最強及最為顯著 ，相對於受損傷細胞，顯著降低了 65%。 0.1%-0.9%濃度 D 試劑降低損傷細胞非電壓門控鉀離子通道活性 的作用次之，相對於受損傷細胞，顯著降 低 56%。 0.1%-0.9%濃度 A試劑降低損傷細胞非電壓門控鉀離子通道活� �的作用再次之， 相對於受損傷細胞降低了 54%。 各試劑組處理受損細胞 15分鐘，試劑對損傷細胞電壓門控鉀離子通道� ��活性無統計學意 義。相對於受損傷細胞， 0.1%-0.9%濃度 A提髙了損傷細胞電壓門控鉀離子通道 32%活性。 0.1%-0.9%濃度 B提髙了損傷細胞電壓門控鉀離子通道 12%活性。 0.1%-0.9%濃度 D則降低 了損傷細胞電壓門控鉀離子通道活性 28%。顯示組合物 D與提取物 A、 B之間因複合作用 而所產生的差異性 。 綜合文獻資料及本實驗結果表明 ， SDTL-E専利提取物 A、 B及組合物 D，都是以影響非電 壓門控鉀離子通道形式調節細胞 。 以上對正常細胞及受損細胞的實驗結果 ，對進一步發展及開發全天然植物抗氧化提取 物產 品和成份 、組合、使用量及瞭解對鉀離子通道活性的作 用機制有啟發及參考價值。

73 替换页 （细则第 26条）