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Patent Searching and Data


Title:
TRACING METHOD AND DETECTION KIT FOR TEST SAMPLE IN NEXT-GENERATION SEQUENCING TECHNIQUE OF DNA
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2014/079002
Kind Code:
A1
Abstract:
The invention provides a tracing method and a detection kit for a test sample in next-generation sequencing technique of DNA. The method comprises the following steps: 1) incorporating a DNA molecular tag of known sequence into the test sample to get a sequencing sample; 2) DNA sequencing for the sequencing sample; 3) extracting the molecular tag sequence in sequencing results of step 2), and aligning the sequence with the known sequence of the molecular tag.

Inventors:
CHEN DI (CN)
SONG ZHUO (CN)
ZHANG JIANGUANG (CN)
ZHOU DAIXING (CN)
GAO YANG (CN)
Application Number:
PCT/CN2012/084988
Publication Date:
May 30, 2014
Filing Date:
November 21, 2012
Export Citation:
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Assignee:
BERRY GENOMICS CO LTD (CN)
CHEN DI (CN)
SONG ZHUO (CN)
ZHANG JIANGUANG (CN)
ZHOU DAIXING (CN)
GAO YANG (CN)
International Classes:
C12Q1/68
Foreign References:
CN102181533A2011-09-14
CN102409042A2012-04-11
Other References:
MATTHIAS MEYER ET AL.: "Targeted high-throughput sequencing of tagged nucleic acid samples", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 35, no. 15, 1 August 2007 (2007-08-01), pages 1 - 5, XP002482386, DOI: doi:10.1093/nar/gkm566
Attorney, Agent or Firm:
KANGXIN PARTNERS, P.C. (CN)
北京康信知识产权代理有限责任公司 (CN)
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Claims:
权 利 要 求 书

1. 一种 DNA二代测序技术中待测样品的追踪方法, 其特征在于, 包括以下步骤:

1 ) 将已知序列的 DNA分子标签掺入所述待测样品, 得到测序样品;

2) 对所述测序样品进行 DNA测序;

3 )提取步骤 2)测序结果中的分子标签序列与所述分子标签的已知序列进 行比对。

2. 根据权利要求 1所述的追踪方法, 其特征在于, 所述 DNA分子标签是在测序 长度内与待测 DNA相似性低于 20%的 DNA序列。

3. 根据权利要求 1 所述的追踪方法, 其特征在于, 所述待测样品为人的血液和 / 或血浆样品,所述 DNA分子标签是在测序范围内与人基因组 DNA相似性低于 20%的外源物种 DNA 或人工合成 DNA; 所述 DNA 分子标签的长度为 120~200bp。

4. 根据权利要求 3所述的追踪方法, 其特征在于, 在所述步骤 1 ) 之前进一步包 括:

对所述 DNA分子标签的 5'端进行磷酸化处理; 和 /或 对所述 DNA分子标签的扩增引物的 5'端进行预磷酸化处理。

5. 根据权利要求 3所述的追踪方法, 其特征在于, 所述 DNA分子标签掺入血液 的比例为 lpg~1000pg : lml 血液; 所述 DNA 分子标签掺入血浆的比例为 0.1pg~1000pg: lml血浆。

6. 一种 DNA二代测序技术中待测样品的检测试剂盒, 其特征在于, 包括: 已知 序列的 DNA分子标签、待测 DNA测序引物及所述 DNA分子标签的测序引物。

7. 根据权利要求 6所述的检测试剂盒, 其特征在于, 所述 DNA分子标签是在测 序长度内与待测 DNA相似性低于 20%的 DNA序列。

8. 根据权利要求 6所述的检测试剂盒, 其特征在于, 所述待测样品为人的血液和 / 或血浆样品,所述 DNA分子标签是在测序范围内与人基因组 DNA相似性低于 20%的外源物种 DNA或人工合成 DNA。

9. 根据权利要求 8所述的检测试剂盒, 其特征在于, 所述 DNA分子标签的长度 为 120~200bp。

10. 根据权利要求 8所述的检测试剂盒, 其特征在于, 进一步包括: 对所述 DNA 分子标签的 5'端进行磷酸化处理的磷酸化试剂; 和 /或对所述 DNA分子标签的 扩增引物的 5 '端进行预磷酸化处理的预磷酸化试剂。

Description:
DNA二代测序技术中待测样品的追踪方法及检测 试剂盒 技术领域 本发明涉及临床检测领域, 具体而言, 涉及一种 DNA二代测序技术中待测样品 的追踪方法及检测试剂盒。 背景技术 随着测序技术的进步, 传统的 Sanger测序已经不能完全满足研究的需要, 费用更 低、 通量更高、 速度更快、 可完成全基因组测序的第二代测序技术应运而 生。 第二代 测序技术的核心思想是高通量的边合成边测序 , 即通过捕捉新合成的末端的标记来确 定 DNA 的序列, 现有的技术平台主要包括 Roche/454 FLX、 Illumina/Genome Analyzer/Hiseq/Miseq Applied Biosystems SOLID禾口 life Technologies/Ion Torrent等。 以 Illumina产品为例, HiSeq 2000目前运行一次可以达到 6个人基因组 30X覆盖的测 序通量, 运行一次约 600 G数据, 上机操作时间也减少到了 30分钟。 而且随着第二代 测序技术的成熟, 将其应用于临床的研究迅猛发展。研究表明通 过测序孕妇血浆 DNA 可以判断胎儿遗传健康状况, 而测序检测者血浆 DNA可以进行癌症早期筛查, 并具 有很强的应用前景。 但是, 随着血浆 DNA检测的普及, 大样品量集中检测时, 样品检测步骤较多, 涉及不少人工操作, 样本混淆的概率会逐渐增加, 样本的追踪和及时发现样品混淆变 得越来越重要。 目前尚没有一种有效方法能够发现血浆 /血液检测过程中的样品混淆问 题。 发明内容 本发明旨在提供一种 DNA二代测序技术中待测样品的追踪方法及检测 试剂盒, 以解决现有技术中待测样品在人工操作时易产 生混淆且不能被及时发现的技术问题。 为了实现上述目的, 根据本发明的一个方面, 提供了一种 DNA二代测序技术中 待测样品的追踪方法。 该方法包括以下步骤: 1 ) 将已知序列的 DNA分子标签掺入待 测样品, 得到测序样品; 2)对测序样品进行 DNA测序; 3 )提取步骤 2)测序结果中 的分子标签序列与分子标签的已知序列进行比 对。 进一步地, DNA分子标签是在测序长度内与待测 DNA相似性低于 20%的 DNA 序列。 进一步地, 待测样品为人的血液和 /或血浆样品, DNA分子标签是在测序范围内 与人基因组 DNA相似性低于 20%的外源物种 DNA或人工合成 DNA; DNA分子标签 的长度为 120~200bp。 进一步地,在步骤 1 )之前进一步包括:对 DNA分子标签的 5'端进行磷酸化处理; 和 /或对 DNA分子标签的扩增引物的 5'端进行预磷酸化处理。 进一步地, DNA分子标签掺入血液的比例为 lpg~1000pg: 1ml血液; DNA分子 标签掺入血浆的比例为 0.1pg~1000pg: lml血浆。 根据本发明的另一个方面, 提供一种 DNA二代测序技术中待测样品的检测试剂 盒。 该试剂盒包括: 已知序列的 DNA分子标签、 待测 DNA测序引物及 DNA分子标 签的测序引物。 进一步地, DNA分子标签是在测序长度内与待测 DNA相似性低于 20%的 DNA 序列。 进一步地, 待测样品为人的血液和 /或血浆样品, DNA分子标签是在测序范围内 与人基因组 DNA相似性低于 20%的外源物种 DNA或人工合成 DNA。 进一步地, DNA分子标签的长度为 120~200bp。 由于血浆 DNA片断长约 166bp, 所以 DNA分子标签的长度需与之相适配。 进一步包括:对 DNA分子标签的 5'端进行磷酸化处理的磷酸化试剂;和 /或对 DNA 分子标签的扩增引物的 5'端进行预磷酸化处理的预磷酸化试剂。 应用本发明的技术方案,将已知序列的 DNA分子标签掺入 DNA二代测序技术中 待测样品, 然后通过测序结果中的分子标签序列与分子标 签的已知序列进行比对, 判 断待测样品是否混淆。 因为此标签的测序过程是在待测 DNA分子的测序过程中同时 进行的, 所以此方法操作方便, 且能即时发现可能因人工操作造成的将样品混 淆的技 术问题, 这不但对科学研究有重要意义, 如果应用于临床检测, 将极大的提高临床检 测的严谨性。 附图说明 说明书附图用来提供对本发明的进一步理解, 构成本发明的一部分, 本发明的示 意性实施例及其说明用于解释本发明, 并不构成对本发明的不当限定。 在附图中: 图 1示出了根据本发明实施例的血浆 /血液样品的追踪流程图; 图 2示出了根据本发明实施例的 DNA分子标签制备的流程图; 图 3 A示出了根据本发明实施例中的 DNA分子标签凝胶电泳图; 以及 图 3B示出了根据本发明实施例中的 PCR扩增产物的凝胶电泳图。 具体实施方式 需要说明的是, 在不冲突的情况下, 本发明中的实施例及实施例中的特征可以相 互组合。 下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发 明。 根据本发明一种典型的实施方式, 提供一种 DNA二代测序技术中待测样品的追 踪方法。 该追踪方法包括以下步骤: 1 ) 将已知序列的 DNA分子标签掺入待测样品, 得到测序样品; 2)对测序样品进行 DNA测序; 3 )提取步骤 2)测序结果中的分子标 签序列与分子标签的已知序列进行比对。 如果测序结果中的分子标签序列的信息与待 测样品掺入的相应分子标签的信息相吻合, 说明该样品不存在标签样品标记错误和样 品间交叉污染。 因为此标签的测序过程是在待测 DNA分子的测序过程中同时进行的, 所以此方法操作方便, 且能即时发现可能因人工操作造成的将样品混 淆的技术问题, 这不但对科学研究有重要意义, 如果应用于临床检测, 将极大的提高临床检测的严谨 性。 DNA分子标签在测序长度内与待测 DNA序列的相似性越差越便于检测分析准确 率及速度, 优选地, DNA分子标签是在测序长度内与待测 DNA相似性低于 20%的 DNA序列, 这样便于从测序结果中迅速地将 DNA分子标签检测序列与待测 DNA分 子的序列区分开来, 提高检测分析速度, 方便批量化样品的分析。 根据本发明一种典型的实施方式, 待测样品为人的血液和 /或血浆样品, DNA分 子标签是在测序范围内与人基因组 DNA相似性低于 20%的外源物种 DNA或人工合成 DNA。若将将本发明的技术方案应用于临床检测 ,其所得到的有效果更为突出。因为, 鉴于临床检测的严谨性, 需要从根本上发现并消除样本混淆带来的假阴 性和假阳性, 采用本发明的技术方案向血浆和 /或血液中加入一定比例外源 DNA (DNA分子标签), 通过第二代测序技术, 在不影响检测的情况下, 将外源 DNA序列与掺入记录比较, 当样品记录与实际渗入不一致时确定为混样。 由于血浆 DNA片断长约 166bp, 为了构 建文库后测序的方便, 在进行血浆和 /或血液样品检测时掺入的外源 DNA 长度为 120~200bp, 优选地, 166±10bp。 其中, 外源 DNA可以来自于与人基因组同源性差的 其他物种, 也可以人工合成。 为了方便测序的高效进行, 优选地, 在步骤 1 )之前进一步包括: 对 DNA分子标 签的 5'端进行磷酸化处理; 和 /或对 DNA分子标签的扩增引物的 5'端进行预磷酸化处 理, 有利于提高 TA克隆连接效率。 优选地, DNA分子标签掺入血液的比例为 lpg~1000pg: 1ml血液; DNA分子标 签掺入血浆的比例为 0.1pg~1000pg : 1ml血浆, 这种比例的添加量既能有效准确的检 测到分子标签, 又不会影响待测 DNA分子快速有效的序列检测。 步骤 2) 中的测序采 用的是二代测序技术, 因为二代测序技术不仅测序通量高, 而且结果准确, 非常适合 在本发明的技术方案中应用。 根据本发明一种典型的实施方式, 提供一种 DNA二代测序技术中待测样品的检 测试剂盒。 该检测试剂盒包括: 已知序列的 DNA分子标签、 待测 DNA测序引物及 DNA分子标签的测序引物。 采用此时试剂盒, 应用本发明的技术方案对 DNA二代测 序技术中待测样品进行检测, 可以极大的提高检测的严谨性。 优选地, DNA分子标签是在测序长度内与待测 DNA相似性低于 20%的 DNA序 列,这样便于从测序结果中迅速地将 DNA分子标签检测序列与待测 DNA分子的序列 区分开来, 提高检测分析速度, 方便批量化样品的分析。 优选地, DNA二代测序技术中待测样品为人的血液和 /或血浆样品, DNA分子标 签是在测序范围内与人基因组 DNA相似性低于 20%的外源物种 DNA或人工合成 DNA。 因为, 鉴于临床检测的严谨性, 需要从根本上发现并消除样本混淆带来的假阴 性和假阳性,采用本发明的技术方案向血浆和 /或血液中加入一定比例外源 DNA(DNA 分子标签), 通过第二代测序技术, 在不影响检测的情况下, 将外源 DNA序列与掺入 记录比较, 当样品记录与实际渗入不一致时确定为混样。 由于血浆 DNA 片断长约 166bp,在进行血浆和 /或血液样品检测时掺入的外源 DNA长度为 120~200bp,优选地, 166±10bp。 其中, 外源 DNA可以来自于与人基因组同源性差的其他物种 , 也可以人 工合成。 优选地, 进一步包括: 对 DNA分子标签的 5'端进行磷酸化处理的磷酸化试剂; 和 /或对 DNA分子标签的扩增引物的 5'端进行预磷酸化处理的预磷酸化试剂。 下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效 果。 实施例 本实施例的血浆 /血液样品的追踪流程参见图 1。 本实施例采用的是将与人同源性差的外源基因 组 phix片断破碎,选取特定长度的 片断, 通过 TA克隆得到单一的 phix片断序列, Sanger测序确定序列组成, PCR质粒 扩增出相应长约 167bp 的 phix片断作为一个分子标签。 DNA分子标签制备的流程参 见图 2。 当然, 本实施例中采用的外源基因组 DNA为 phix基因组, 但不局限于 Phix, 任何与人的基因组同源性差的基因组均可以作 为分子标签, 例如, 可以将人工设计合 成的序列做为分子标签。 本实施例中所采用的试剂及操作步骤如下:

1. TA 克隆载体为 TAKARA pMD19-T Vector, 质粒扩增引物为 Barcode-F 和 Barcode-R, 引物 5'端需做磷酸化处理:

Barcode-F: 5' pCCGGGGATCCTCTAGAGAT3 '

Barcode-R: 5' p ATGCCTGC AGGTCGACGAT3 ' DNA标签序列结构:

5' ATGCCTGCAGGTCGACGATT NN... NNNAATCTCTAGAGGATCCCCGG3 '

3' TACGGACGTCCAGCTGCTAANNN... NNTTAGAGATCTCCTAGGGGCC5

DNA标签 1序列:

2. 样品 血浆样品: 取 ImL正常人血浆加入相应量标签 DNA, 抽提血浆游离 DNA。 全血样品: 取 ImL正常人外周血加入 5ng标签 DNA,进行血浆分离,抽提血浆游 离 DNA。 样品与标签渗入量的关系见表 1 : 表 1

3. 末端补平 制备如下的反应混合液 待测样品 DNA溶液 38.5 μΐ

T4 DNA磷酸化缓冲液 (10X) 5 μ1 lO mM dNTP混合液 2 μΐ

T4 DNA聚合酶 2 μΐ

T4 DNA磷酸化酶 2 μΐ

Klenow酶 0.5μ1 无菌 H20 0 μΐ 总体积 50μ1 a. 在 20。C温浴 30分钟; b. 在纯化柱上纯化 DNA样品, 并在 42μ1的无菌 dH 2 0或洗脱缓冲液中洗脱, 得 到平末端 DNA。

4. 在 DNA片段的 3'末端加多聚腺嘌吟尾 制备如下的反应混合液 平末端 DNA 32μ1

Klenow反应缓冲液 (10X) 5μ1 dATP溶液 ΙΟμΙ klenow ex- (3'-5'外切活性缺失) 3μ1 无菌 H20 Ομΐ 总体积 50μ1 a. 在 37°C温浴 30分钟; b. 在柱上纯化 DNA样品, 并在 25μ1的无菌 dH 2 0或洗脱缓冲液中洗脱, 得到末 端补平的、 dA-尾 DNA。

5. 为 DNA片段连接接头 制备如下的反应混合液 末端补平的、 dA-尾 DNA 33μ1 快速连接反应缓冲液 (5X) ΙΟμΙ μΜ DNA接头 2μ1 快速 T4 DNA连接酶 ( EB) 5μ1 总体积 50μ1 a. 在 20°C温浴 15分钟; b. 在 Qiagen柱上纯化回收 DNA样品,并在 25μ1的无菌 dH 2 0或洗脱缓冲液中洗

6. 通过 PCR预扩增富集接头修饰的 DNA片段 制备如下的 PCR反应混合液

DNA (步骤 5中得到的) 12.5 μΐ

Phusion DNA聚合酶(Phusion DNA聚合 25 μΐ 酶混合物)

PCR引物混合物 2 μΐ 超纯水 10.5μ1 总体积 50 μΐ

用如下的 PCR实验方案进行扩增: a. 98 °C 30 秒; b. 18个如下的循环: 98 °C 10 秒, 65 °C 30秒, 72°C 30 秒; c 72 °C 5 分钟; d. 保持在 4°C。

7. 将步骤 6中的 PCR产物置于 2%的琼脂糖凝胶上进行电泳, 结果见图 3b所示, 然后采用 Qiagnen kit切胶回收 300bp目标条带 (DNA文库), 洗脱于 30 μΐ的洗脱缓 冲液中。 图 3a为本发明实施例采用的 DNA分子标签凝胶电泳图。

8. 将制作好的文库质控后, Illumina Hiseq 2000进行 36bp单端测序。 测序分析结果见表 2。 表 2

对待测样品的文库进行测序, 尽管一个样品掺入的是一种 DNA标签, 但在检测 时可以同时检测加入其他样品所掺入的 DNA标签, 如果只检测出本样品掺入的 DNA 标签, 而其他 DNA便签的掺入量为 0, 则可以更好的说明样品的准确性。 由上表 2可以看出标签掺入量与标签存在线性关系, 从实际应用推算分子标签渗 入全血的比例在 lpg~100pg: 1ml全血; 分子标签渗入全血的比例在 0.1pg~10pg: lml 血浆检测效率最高。 从表 2的数据也可以看出, 在本实施例的样品检测过程中没有样 品混淆的情况出现。 以上所述仅为本发明的优选实施例而已, 并不用于限制本发明, 对于本领域的技 术人员来说, 本发明可以有各种更改和变化。 凡在本发明的精神和原则之内, 所作的 任何修改、 等同替换、 改进等, 均应包含在本发明的保护范围之内。