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CN102181533A | 2011-09-14 | |||
CN102409042A | 2012-04-11 |
北京康信知识产权代理有限责任公司 (CN)
权 利 要 求 书 1. 一种 DNA二代测序技术中待测样品的追踪方法, 其特征在于, 包括以下步骤: 1 ) 将已知序列的 DNA分子标签掺入所述待测样品, 得到测序样品; 2) 对所述测序样品进行 DNA测序; 3 )提取步骤 2)测序结果中的分子标签序列与所述分子标签的已知序列进 行比对。 2. 根据权利要求 1所述的追踪方法, 其特征在于, 所述 DNA分子标签是在测序 长度内与待测 DNA相似性低于 20%的 DNA序列。 3. 根据权利要求 1 所述的追踪方法, 其特征在于, 所述待测样品为人的血液和 / 或血浆样品,所述 DNA分子标签是在测序范围内与人基因组 DNA相似性低于 20%的外源物种 DNA 或人工合成 DNA; 所述 DNA 分子标签的长度为 120~200bp。 4. 根据权利要求 3所述的追踪方法, 其特征在于, 在所述步骤 1 ) 之前进一步包 括: 对所述 DNA分子标签的 5'端进行磷酸化处理; 和 /或 对所述 DNA分子标签的扩增引物的 5'端进行预磷酸化处理。 5. 根据权利要求 3所述的追踪方法, 其特征在于, 所述 DNA分子标签掺入血液 的比例为 lpg~1000pg : lml 血液; 所述 DNA 分子标签掺入血浆的比例为 0.1pg~1000pg: lml血浆。 6. 一种 DNA二代测序技术中待测样品的检测试剂盒, 其特征在于, 包括: 已知 序列的 DNA分子标签、待测 DNA测序引物及所述 DNA分子标签的测序引物。 7. 根据权利要求 6所述的检测试剂盒, 其特征在于, 所述 DNA分子标签是在测 序长度内与待测 DNA相似性低于 20%的 DNA序列。 8. 根据权利要求 6所述的检测试剂盒, 其特征在于, 所述待测样品为人的血液和 / 或血浆样品,所述 DNA分子标签是在测序范围内与人基因组 DNA相似性低于 20%的外源物种 DNA或人工合成 DNA。 9. 根据权利要求 8所述的检测试剂盒, 其特征在于, 所述 DNA分子标签的长度 为 120~200bp。 10. 根据权利要求 8所述的检测试剂盒, 其特征在于, 进一步包括: 对所述 DNA 分子标签的 5'端进行磷酸化处理的磷酸化试剂; 和 /或对所述 DNA分子标签的 扩增引物的 5 '端进行预磷酸化处理的预磷酸化试剂。 |
1. TA 克隆载体为 TAKARA pMD19-T Vector, 质粒扩增引物为 Barcode-F 和 Barcode-R, 引物 5'端需做磷酸化处理:
Barcode-F: 5' pCCGGGGATCCTCTAGAGAT3 '
Barcode-R: 5' p ATGCCTGC AGGTCGACGAT3 ' DNA标签序列结构:
5' ATGCCTGCAGGTCGACGATT NN... NNNAATCTCTAGAGGATCCCCGG3 '
3' TACGGACGTCCAGCTGCTAANNN... NNTTAGAGATCTCCTAGGGGCC5
DNA标签 1序列:
2. 样品 血浆样品: 取 ImL正常人血浆加入相应量标签 DNA, 抽提血浆游离 DNA。 全血样品: 取 ImL正常人外周血加入 5ng标签 DNA,进行血浆分离,抽提血浆游 离 DNA。 样品与标签渗入量的关系见表 1 : 表 1
3. 末端补平 制备如下的反应混合液 待测样品 DNA溶液 38.5 μΐ
T4 DNA磷酸化缓冲液 (10X) 5 μ1 lO mM dNTP混合液 2 μΐ
T4 DNA聚合酶 2 μΐ
T4 DNA磷酸化酶 2 μΐ
Klenow酶 0.5μ1 无菌 H20 0 μΐ 总体积 50μ1 a. 在 20。C温浴 30分钟; b. 在纯化柱上纯化 DNA样品, 并在 42μ1的无菌 dH 2 0或洗脱缓冲液中洗脱, 得 到平末端 DNA。
4. 在 DNA片段的 3'末端加多聚腺嘌吟尾 制备如下的反应混合液 平末端 DNA 32μ1
Klenow反应缓冲液 (10X) 5μ1 dATP溶液 ΙΟμΙ klenow ex- (3'-5'外切活性缺失) 3μ1 无菌 H20 Ομΐ 总体积 50μ1 a. 在 37°C温浴 30分钟; b. 在柱上纯化 DNA样品, 并在 25μ1的无菌 dH 2 0或洗脱缓冲液中洗脱, 得到末 端补平的、 dA-尾 DNA。
5. 为 DNA片段连接接头 制备如下的反应混合液 末端补平的、 dA-尾 DNA 33μ1 快速连接反应缓冲液 (5X) ΙΟμΙ μΜ DNA接头 2μ1 快速 T4 DNA连接酶 ( EB) 5μ1 总体积 50μ1 a. 在 20°C温浴 15分钟; b. 在 Qiagen柱上纯化回收 DNA样品,并在 25μ1的无菌 dH 2 0或洗脱缓冲液中洗
6. 通过 PCR预扩增富集接头修饰的 DNA片段 制备如下的 PCR反应混合液
DNA (步骤 5中得到的) 12.5 μΐ
Phusion DNA聚合酶(Phusion DNA聚合 25 μΐ 酶混合物)
PCR引物混合物 2 μΐ 超纯水 10.5μ1 总体积 50 μΐ
用如下的 PCR实验方案进行扩增: a. 98 °C 30 秒; b. 18个如下的循环: 98 °C 10 秒, 65 °C 30秒, 72°C 30 秒; c 72 °C 5 分钟; d. 保持在 4°C。
7. 将步骤 6中的 PCR产物置于 2%的琼脂糖凝胶上进行电泳, 结果见图 3b所示, 然后采用 Qiagnen kit切胶回收 300bp目标条带 (DNA文库), 洗脱于 30 μΐ的洗脱缓 冲液中。 图 3a为本发明实施例采用的 DNA分子标签凝胶电泳图。
8. 将制作好的文库质控后, Illumina Hiseq 2000进行 36bp单端测序。 测序分析结果见表 2。 表 2
对待测样品的文库进行测序, 尽管一个样品掺入的是一种 DNA标签, 但在检测 时可以同时检测加入其他样品所掺入的 DNA标签, 如果只检测出本样品掺入的 DNA 标签, 而其他 DNA便签的掺入量为 0, 则可以更好的说明样品的准确性。 由上表 2可以看出标签掺入量与标签存在线性关系, 从实际应用推算分子标签渗 入全血的比例在 lpg~100pg: 1ml全血; 分子标签渗入全血的比例在 0.1pg~10pg: lml 血浆检测效率最高。 从表 2的数据也可以看出, 在本实施例的样品检测过程中没有样 品混淆的情况出现。 以上所述仅为本发明的优选实施例而已, 并不用于限制本发明, 对于本领域的技 术人员来说, 本发明可以有各种更改和变化。 凡在本发明的精神和原则之内, 所作的 任何修改、 等同替换、 改进等, 均应包含在本发明的保护范围之内。