발명의명칭 :네이세리아고노르호에아유래탄산무수화효� �를 이용한탄산무수화활성이증가된형질전환체 기술분야

[1] 본발명은네이세리아고노르호에아유래탄산무 수화효소를이용한

탄산무수화활성이증가된형질전환체및그제조 방법에관한것이다.

배경기술

[2] 이산화탄소방출을감소시키는것은전세계적인 기후재앙을방지하기위해 필수적인것이며，산업원료로부터방출되는이 산화탄소를고정화하는것은 인류의생존을위해본질적으로필요한요소이다 .무기탄산염화 (mineral carbonation)방법은다른이산화탄소고정화방법에 비해고정효율이좋기 때문에많은관심을받아왔다.그러나,무기물화 (mineralization)반응의경우 매우느린반웅속도를갖는경우가일반적이다.

[3] 생체에서이산화탄소를중탄산염 (bicarbonate)로변화시키는과정은풍부하게 존재한다.생체에서상기반응은탄산무수화효� � (carbonic anhydrase, CA)의 존재로인해통상의조건에서빠르게진행되며,� �산화탄소의무기탄산염화 과정에있어서의율속단계 (rate-Kmiting step)에해당한다.이산화탄소의 무기탄산염화과정에서상기탄산무수화효소의 고효율성에도불구하고，짧은 반감기로인해실제적인웅용에는제약이많은상 황이다.상기효소의안정성을 증가시키기위해다양한고정화방법이도입되었 으나,대용량의이산화탄소를 생산하는장비에사용하기에는고비용이소요되 는문제점이있다.탄산무수화 효소를여러유무기물질에고정화해안정화하는 방식이여러번제시되었다. 키토산,알긴산과같은고분자비드나레진，금� �의재료를하이브리드형태로 제작하여를을만들고，거기에탄산무수화효소 의아민기를이용해결합시킨다. 탄산무수화효소는소유래탄산무수화효소가많 이사용되었으나,경우에따라 미생물의탄산무수화효소나사람의탄산무수화 효소가사용되기도했다.

그러나이경우，재료인탄산무수화효소를정제 하는과정이매우복잡하고 값비싸,산업적으로정제탄산무수화효소를사� �하기란불가능하다.

[4] 따라서，탄산무수화효소를경제적으로활용하 기위해세포의표면상에다수를 발현시키는것이강력한방법이될수있다.이러� �방법은효소정제의 필요성을감소시키고，효소를보다쉽게다롤수 있도록해주는장점이있다. 미생물의전체세포시스템에서,탄산무수화효� �는미생물유전체에재조합된 플라스미드를삽입하여줌으로써세포내에위치 시키는것이가능하다.만일 탄산무수화효소가세포질 (cytoplasm)상에존재한다면，이산화탄소고정에� ��른 pH감소에의해세포내부의항상성에영향을미치� ��된다.또한,세포막은 확산의장벽으로작용하기때문에세포질에서발 현되는효소의활성은제한될 수밖에없다.이대신최근대장균또는효모의주� �세포질 (periplasm)또는 표면 (surface)에탄산무수화효소를위치시키는방법이 제안되었다.그러나，이와 같은방법은탄산무수화효소의열적안정성측면 에있어제약사항이존재한다. 탄산무수화효소는 40 °C근처에서는안정하지만， 50 ⁰ C로열처리하였을때 효소의활성이급격히감소하는단점이있다.

발명의상세한설명

기술적과제

[5] 상기와같은문제점을해결하기위해서본발명에 서는코리네박테리움

글루타미 g/Mtomi ^' i)세포의표면에다수의네이세리아 고노르호에아 (Ne^^rw gonorrhoeae)유래탄산무수화효소를발현하여 이산화탄소고정화효과및효소의열적안정성을 현저히상승시키고자하였다. 과제해결수단

[6] 본발명은막단백질-단백질링커-탄산무수화효� ��가순차적으로연결된

구조를갖는이산화탄소의탄산염전환을위한아 미노산서열을포함하는 단백질에관한것이다.

[7] 또한본발명은상기아미노산서열을코딩하는핵 산분자에관한것이다.

[8] 또한본발명은상기핵산분자를포함하는플라스 미드에관한것이다.

[9] 또한본발명은상기플라스미드로형질전환된인 간을제외한형질전환체에 관한것이다.

[10] 또한본발명은상기핵산분자를인간을제와한숙 주세포에도입하여

형질전환하는단계를포함하는탄산무수화효소 가세포표면에발현되는 형질전환체의생산방법에관한것이다.

[11] 또한본발명은막단백질-단백질링커-탄산무수� ��효소가순차적으로연결된 구조를갖는아미노산서열을포함하는단백질을 이용한이산화탄소의탄산염 전환방법에관한것이다.

발명의효과

[12] 본발명에의해세포표면에발현된탄산무수화효 소의경우자체의수화활성 또한우수하며，열에대한안정성이높아산업적 으로유용한전체세포효소 시스템으로서이산화탄소의효율적고정에활용 될수있을것으로기대된다. 도면의간단한설명

[13] 도 1은코리네박테리움글루타미쿰표면에서 «gCA의발현을위한플라스미드 제작에관한것이다.

[14] 도 2는 (a)링커의길이 n=2일때와 (b) n=3일때형광을이용한 ngCA의발현 위치분석에관한것이다.

[15] 도 3은 (a) porinB-(G ₄ S) ₂ -ngCA및 (b) porinB-(G ₄ S) ₃ -"gCA의 SDS-PAGE결과를 음성대조군및 porinB— ngCA의결과와비교한것이다.

[16] 도 4는 (a) porinB-(G ₄ S) ₂ -/igCA및 (b) porinB-(G ₄ S) ₃ -ngCA의웨스턴블롯결과를 음성대조군및 porinB-ngCA의결과와비교한것이다.

[17] 도 5는 porinB-(G ₄ S) ₂ -^CA및 porinB-(G ₄ S) ₃ -"gCA의 SDS-PAGE결과로부터 ng

CA의발현량을측정한것이다.

[18] 도 6은 porinB-(G ₄ S) ₂ -ngCA에대해공초점현미경스캔이미지에서 "gCA의 발현차이를측정한것이다.

[19] 도 7은 porinB-(G ₄ S) ₂ -«gCA및 porinB-(G ₄ S) ₃ -"gCA의수화실험을통한

탄산무수화효소활성을측정한결과이다.

[2이 도 8은링커의길이 n= l , 2, 3및 6일때 60 °C에서 6시간열처리수행시

열안정성을측정한결과이다.

[21 ] 도 9는상업적으로판매되는탄산무수화효소 (commercial CA)및대장균

분리생산탄산무수화효소 (free ngCA)에대한표면발현된탄산무수화효소의열 안정성을 (a)표면발현된 porinB-(G ₄ S) ₂ -^CA에대하여 50 °C에서 30일및 (b) 표면발현된 porinB-(G ₄ S) ₂ -rtgCA에대하여 60 °C에서 48시간동안측정한 결과이다.

발명의실시를위한최선의형태

[22] 본발명은막단백질-단백질링커-탄산무수화효� ��가순차적으로연결된

구조를갖는이산화탄소의탄산염전환을위한아 미노산서열을포함하는 단백질에관한것이다.

[23] 본발명에서상기막단백질은세포외막을통해연 결통로를이루는단백질인 경우특별히제한되지는않으나포린 (porin)계열단백질을사용할수있으며， 일예로포린 B，포린 C또는포린 H로이루어진군으로부터선택되는어느하나 이상을선택하여사용할수있고，일예로본발명 의실시예에서와같이포린 B 단백질을사용할수있다.

[24] 또한본발명에서상기단백질링커는특별히제한 되지는않으나하기화학식 I의구조를갖을수있다.

[25] [화학식 I]

[26] (G ₄ S)n

[27] G:글리신 (glycine), S:세린 (serine)이다;

[28] n은 1내지 10의정수이다.

[29] 본발명에서상기탄산무수화효소는특별히제한 되지는않으나네이세리아 속 (N^i n^ sp.)에서유래된것을사용할수있으며，일예로� �이세리아 고노르호에아 (Ne/Men ^' a go ^/zoeae)에서유래된것을사용할수있다.

[30] 탄산무수화효소에는여러종류가있으며，인간 유래탄산무수화효소가가장 높은활성을지니고있는것으로알려져있다.그� �나，인간유래세포는그 크기와복잡성때문에클로닝 (cloning)에제약이따른다.따라서，차선책으로 인간유래탄산무수화효소 Π의활성에필적할수있는네이세리아

고노르호에아 (N ^en ^' a gonorrhoeae)유래의탄산무수화효소 ( CA)를사용하는 것이바람직하다.이는상기효소의크기가작고� �량체의형태를지니고있어 박테리아에서발현하기에장점이있기때문이다 .

[31] 또한본발명에서상기아미노산서열은제한되지 는않으나탄산무수화효소의 C-말단에화학식 II의아미노산서열을갖는표지단백질이추가로� ��결될수 있다.

[32] [화학식 II]

[33] DYKDDDDK

[34] D:아스파르트산 (aspartic acid), Y:티로신 (tyrosine), K:리신 (lysine).

[35]

[36] 또다른양태로,본발명은상기아미노산서열을� �딩하는핵산분자에관한 것이다ᅳ

[37] 또한본발명은상기핵산분자를포함하는플라스 미드에관한것이다.

[38] 또한본발명은상기플라스미드로형질전환된인 간을제외한형질전환체에 관한것이다.

[39] 본발명에서상기형질전환체는인간을제외한대 상이라면특별히제한되지는 않으나，바람직하게는미생물올대상으로할수 있으며，보다바람직하게는 코리네박테리움속 (Corynebacterium sp.)의미생물을대상으로할수있고,더욱 바람직하게는코리네박테리움 glutamicum)을 대상으로할수있다.

[40] 코리네박테리움글루타미쿰은단백질발현을위 한대표적인미생물세포인 대장균에비해열에대한안정성이현저히우수하 다.코리네박테리움

글루타미쿰은비병원성 (non-pathogenic)이며 ,포자를형성하지

않는 (non-sporulatag)그람 -양성 (Gram-positive)박테리아로，산업적인용도로 널리사용되어왔다.생물학적유전자조작에있� �코리네박테리움

글루타미큼은재조합복원시스템의결핍과높은 복제개수 (copy number) 플라스미드로인해유전적으로보다안정하다.� �욱이,코리네박테리움 글루타미쿰의세포외피 (cell envelope)는결정화된단백질층인 S-layer를 포함하고있어,매우강도가높다.상기와같은안� ��적특성에의해，

코리네박테리움글루타미쿰을포함하는산업공 정은고농도에서진행될수 있다.이에따라，코리네박테리움글루타미쿰� �안정적인전체세포

생촉매 (whole-cell biocatalyst)로의활용을위한플랫폼으로활용할수 있다.

[41]

[42] 또다른양태로，본발명은상기핵산분자를인간 을제외한숙주세포에

도입하여형질전환하는단계를포함하는탄산무 수화효소가세포표면에 발현되는형질전환체의생산방법에관한것이다 .

[43]

[44] 또한본발명은막단백질-단백질링커-탄산무수� ��효소가순차적으로연결된 구조를갖는아미노산서열을포함하는단백질을 이용한이산화탄소의탄산염 전환방법에관한것이다.

[45]

[46] 이하,실시예를통하여본발명을보다상세히설� �한다.그러나이들실시예는 본발명에대한이해를돕기위한것일뿐,어떤의� �로든본발명의범위가이들 예로만한정되는것은아니다.

[47]

[48] [실험재료]

[49] 규주및유저자

[5이 유전자클로닝 (gene cloning)및유지를위한숙주로대장균 (E. coli XLl-Blue;

Stratagene Co., Santa Clara,CA, USA)을사용하였으며，코리네박테리움 glutamicum; ATCC 13032)을탄산무수화효소의 발현을위한주숙주로사용하였다.

[51] 앵커링단백질유전자 (anchoring protein gene)인포린 B(porin B),포린 C(porin C)및포린 H(porin H)는각각코리네박테리움글루타미쿰게놈으로� ��터 증합효소연쇄반응 (PCR; C1000 Thermal Cycler, BioRad, Hercules)을통해 확보하였다.각각의 PCR산물은 BamHl및 Xbal제한효소로절제한후 pCES208 플라스미드 (Jong-Uk et al., 2008)에클로닝 (cloning)되었다.

[52]

[53] 합성타산무수화효소

[54] 코리네박테리움글루타미큼내에서네이세리아 고노르호에아 (Ne^en ^' a

gonorrhoeae)유래의탄산무수화효소 (ngCA)의고발현을위해원래의 ngCA 유전자 (GenScript Co., Piscataway, NJ, US A)의코돈빈도 (codon frequency)를 조사하여,코돈최적화된탄산무수화효소유전� �를합성하고,

중합효소연쇄반웅을통해증폭하였다.

[55] 증폭된유전자를상기와동일한제한효소를사용 하여절제한후각각의산물올 준비된플라스미드에클로닝하였다.

[56] 유전자발현여부검출이보다잘이루어지도록하 기위해 «gCA효소 C-말단에 표지단백질 (flag-tag;서열 DYKDDDDK)를융합시켰다.

[57] 폴라스미드를제작하는동안，대장균은 37 °C, LB(Luria-Bertani)배지 (트립톤 10 g/L,효모추출물 5 g/L,염화나트륨 5 g/L; BD, Franklin Lakes, NJ, USA)에서 배양시켰다. DNA의조작방법은통상적으로널리알려져있는일 반적인 방법으로수행하였다.

[58]

[59] [시험예 1]코리네박테리움글루타미쿰표면에서 MgCA의발현

[60] 하기표 1과같이유전자를포함하도록플라스미드를제� �하여사용하였다 (도 1). [Table 1]

막단백질ᅳ단백질링커 -탄산무수화효소

[63] 각플라스미드는전기영동 (Gene Pulser, Bio-Rad)을통해숙주세포인

코리네박테리움글루타미쿰에형질전환하였다 .음성대조군으로는 pCES208 플라스미드를가지고있는세포를사용하였다.

[64] 모든형질전환된세포는 250 mL플라스크의 BHI(brain heart infusion; BD,

Franklin Lakes, NJ, USA)배지에접종한후 30 °C에서 20 rpm으로흔들어주면서 48시간동안배양하였다.배지에는항생제로 25 g/mL농도의

카나마이신 (kanamycin)을첨가하였다.

[65]

[66] [시험예 2] wgCA의발현분석

[67] SDS-PAGE및웨스터봄^ (western blot)

[68] 세포질，막，분비소포 (secretosome)에서 "gCA의발현레벨은 SDS-PAGE와

웨스턴블로팅 (western blotting)을순차적으로시행하여측정하였다.상� �배양한 세포는 4 °C에서 6,000 rpm으로 10분간원심분리 (Sonic, Vibra cell, Newtown, CT, USA)하여수득하였다.수득한세포는 PBS(phosphate-buffered saline; 135 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na2HP04, 1.4 mM KH2P04, pH 7.2)버퍼에서 재침전시키고，전체,수용성,불용성，막단백� ��분획으로분리하였다. 12% 폴리아크릴아미드겔에서전기영동한후，상기 겔은쿠마시브릴리안트 블루 (Coomassie brilliant blue; 50%메탄올， 10%아세트산， 1 g/L Coomassie brilliant blue R-250)에담가 1시간동안염색 (staining)한후，탈색용액 (destaining solution; 10%메탄올및 10%아세트산)에서탈색하였다.

[69] 단백질밴드는트랜스블롯 (transblot)장치 (Bio-Rad)를이용하여 100 mA로 60 분간폴리비닐디플루오라이드막 (polyvinyl difluoride membrane; Roche, Basel, Switzerland)위로이동시켰다.상기막은실온에서 1.5시간동안블로킹 용액 (Tris-buffered saline, 24.7 mM Tris, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl,및 0.5% Tween-20®)과 5 wt%탈지유 (skim milk)와함께배양하였다.상기막은

HRP(horseradish peroxidase)가결합된단일클론항 -FLAG M2

항체 (Sigma-Aldrich)와함께배양하여표지단백질로표지 된단백질의면역 검출 (immune-detection)을수행하였다.배양후，각각의� �은 TBS-T로 5분간 4회 세척한후 ECL Kit(Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Agent, GE Healthcare Bio-science AB)를이용하여단백질을검출하였다.

[70]

[71] 막분획에서발현된 ngCA의정량을위해 SDS-PAGE겔에서단백질의함량을 실버스테이닝키트 (silver staining kit; GE Healthcare)로분석하였다.막단백질 분획에서발현된 ngCA의비율 (%)확정을위해 Quantity One Software(Bio-Rad)를 사용하였다.

[72]

[73] 상기결과,포린 B는코리네박테리움글루타미쿰에서 / CA에대한고정화

능력이있음을나타냈다.또한，앵커링단백질� �효소사이의펩티드링커는 입체장해 (steric hindrance)를방지하고, ngCA의고정화가잘일어나도록한다. 플라스미드에추가적인코돈을삽입함으로써, «gCA와앵커링단백질은각각 형질전환된세포에서 Gly ₄ Ser (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)의더블렛 (doublet)및 트리플렛 (triplet)에의해결합되어 porinB-(G ₄ S) ₂ -ngCA및 porinB-(G ₄ S) ₃ -"gCA를 형성하였디-.

[74]

[75] 발혀세포의유세포분석 (ᅳ flow-cvtometric analysis)

[76] 세포를두번세척하고 PBS에재침전시켰다.그리고 1:250비율로희석된상기 세포를 4 ⁰ C에서 1시간동안 FITC(fluorescein isothiocyanate)가결합된단일클론 항 -FLAG M2항체 (Sigma-Aldrich)로면역염색 (immunostaining)하였다.상기 세포를 PBS용액으로 1회세척하여결합되지않은탐침들 (probes)을제거하였다. 염색된세포를약 10 ⁶ cells/mL의농도로희석한후 FACS(fluorescent activated cell sorter; MoFlo XDP, Beckman Coulter, Inc., Brea, CA, USA)로분석하여형광 강도를측정하였다.

[77]

[78] 공초점휘미경스캐 /confocal microscopy scanning)

[79] 배양된세포를세척한후 PBS에재침전시켰다. FITC(fluorescein

isothiocyanate)가결합된단일클론항 -FLAG M2항체 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로면역염색 (immunostaining)한후，세포를 4 %(v/v)

포름알데히드 (Sigma-Aldrich)로고정하고형광측정을위한봉입제 (mounting medium; Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA)에재침전시켰다.세포 샘플을공초점현미경 (Leica TCS SP8 Hyvolution (resolution = 140 nm, Leica Microsystems, Ernst-Leitz-Strasse, Wetzlar, Germany))으로관찰하였다.이때여기 파장 (excitation wavelength)은 488 nm아르곤레이저를사용하였고,영상은 552 nm필터로특정한빛만통과시켰다.

[80]

[81] 상기결과, FITC가세포들의세포질에존재하지않았기때문� �,형광세포는 세포질이아닌세포의표면에 CA를나타내게됨을알수있었다 (도 2).대조군 중에서 porinB-ngCA가발현된세포또한다른포린패밀리 (porin family)를 발현하는다른세포에비해형광신호강도가강하 였으나， G ₄ S링커가삽입된 porinB-(G ₄ S) ₂ - CA또는 porinB-(G ₄ S) ₃ -"gCA단백질이발현된세포의경우 상대적인형광신호의세기가링커가결합되지않 은상기대조군들에비해 현저히상승하는것을확인하였으며，음성대조 군으로 ngCA단빡질이발현되지 않은세포의경우형광이나타나지않음을확인하 였다.

[82]

[83] 또한, porinB-(G ₄ S) ₃ -^CA의 SDS-PAGE와웨스턴블롯결과를음성대조군및 porinB-«gCA의결과와비교한것을도 3내지도 5에도시하였다.대조군인 porinB-ngCA의경우 ngCA의농도는 0.230 mg/mL로측정되었고,이는 porinC-«g CA의경우에비해매우높은값을나타내었다.반면 링커를통해연결된실시예 porinB-(G ₄ S) ₃ -ngCA에서는 ngCA의농도가상기대조군보다높은 0.27 mg/mL 정도로증가하였다.또한대조군인 porinB-ngCA의경우세포표면상의 ngCA의 양이 0.15 X 10-' pg/cell로측정되었고,이는 porinC-/ CA의 0.23 x 10 ¹ pg/cell에 비해매우낮은값을나타내었다.반면링커를통� �연결된실시예 porinB-(G ₄ S) ₂ - ngCA에서는 ngCA의농도가상기대조군보다높은 0.26 x 10 ^" ' pg/cell을 나타내는것을확인하였다 (도 5).

[84]

[85] wgCA의발현차이는공초점현미경스캔이미지에� �도확인할수있었다 (도 6).상기결과로부터 porinB-(G ₄ S) ₂ -rtgCA에서 "gCA가세포표면에성공적으로 발현되었음을확인하였다.

[86]

[87] [시험예 3]수화 (hydration)실험을통한탄산무수화효소 (CA)활성측정

[88] 탄산무수화효소는이산화탄소를수화시키며， 탄산수소이온 (HCO _r )은반응 용액의 pH를낮추는역할을한다.따라서,수화반웅이일� �나는동안 pH의 변화를감지할수있다. 40 mL유리병을구멍이 있는격막튜브 (rubber speta sleeve)로덮고， 20 mM Tris-HCl (pH 8.44-8.48; Sigma-Aldrich) 12 mL을

주입하였다. pH측정기 (Thermo scientific)의탐침을유리병을덮고있는튜브의 구멍을통해주입하였다.유리병에 400 의탄산무수화효소샘플을

주입하였다.얼음플라스크에이산화탄소 (Special gas，대전,대한민국)를 주입하였다. 8 mL의이산화탄소-포화된물을주입한직후용액의 pH를 기록하였다.상기용액은전체반웅에걸쳐 750 rpm의속도로마그네틱 교반하였다.

[89] 탄산무수화효소의활성은 pH가 8.0에서그 0으로변화하는데필요한시간으로 결정하였다.이시간데이터는아래수학식 I에의해 WA(Wilbur-Anderson)단위의 탄산무수화효소활성도로변환될수있다. [91] [수학식 I]

[92] Activity(Uml- ¹ 0.D.- ' )=(t ₀ -t)/t x df/(Sample solution(ml O.D ¹ )

[93] 상기식에서， to와 t는각각비촉매화된버퍼및탄산무수화효소로� �성화된 용액에서 pH가 8.0에서 7.0으로변화하는데필요한시간을나타낸다.또� � df는 실험회차에따른실험적차이를보정하기위한희 석인자 (dilution factor)이다.

[94] 양성대조군으로，상업적으로판매되는소유래 탄산무수화효소 (88%단백질 2613 U/mg, Sigma, BCA)가사용되었다.

[95]

[96] 상기방법에따라수화실험을통한탄산무수화효 소 (CA)활성을측정한

결과를도 7에도시하였다.이로부터 porinB-(G ₄ S) ₂ -"gCA또는 porinB-(G ₄ S) ₃ - CA를발현시킨경우 pH가빠르게낮아지는것을알수있으며，탄산무� ��화 효소의활성이가장높음을확인하였다.

[97]

[98] [시험예 4]링커의길이에따른탄산무수화효소의열안정� ��

[99] [Table 2]

[100]

[101] 링커의길이에따른 ¾산무수화효소의열안정성을비교하기위하여 ,상기표 2의실시예 1내지실시예 4의실험군을구성하고，각실시예의단백질링� �는 상기시험예에서와동일한과정을통해제조하고 ， 60 °C에서각각 6시간동안 열처리한후,잔여효소활성을측정하였다.

[102] 또한링커의길이 n=3인경우와 , n=0인대조군에대하여， 60 °C에서각각 2시간 동안열처리한후,잔여효소활성을측정하였다.

[103]

[104] 이를통해열안정성을측정한결과를도 8에도시하였다.

[105] 링커의길이 n이각각 1, 2， 3및 6인경우에대하여잔여효소활성도를측정한 결과,각각 71.4%, 81.7%, 53.6%및 48.5%의평균활성을나타내어모두높은 활성을유지하고있으며,특히 n=2일때 81.7<¾로가장높은활성을나타내어 열에대한안정성이 porinB-(G ₄ S) ₂ -MgCA가실험군중가장우수함을확인할수 있었으며,이후장기적열적안정성은 p ₀ rinB-(G ₄ S) ₂ -«gCA를통해확인하였다. [107] [시험예 5]상업적으로판매되는탄산무수화효소 (commercial CA)및대장균 분리생산탄산무수화효소 (free ngCA)에대한표면발현된탄산무수화효소의열 안정성

[108] 형질전환된세포와배양된세포를이용하여표면 발현된 «gCA의열안정성을 평가하였다.양성대조군으로，상업적으로판� �되는소유래탄산무수화효소 (88%단백질, 2613 U/mg, Sigma, BCA)가사용되었다.세포펠릿 (pellets)은 4 °C에서 13,000 rpm으로 10분간원심분리 (Eppendorf 5451R)를통해분리한후약 10 OD(optical density)의농도로 PBS에재침전시켰다.샘플들은 50 °C와 60 °C의 전자식건조기 (Corning)에서최대 30일까지배양하였다.각샘플의세포는 6 시간경과할때마다 4 °C의냉장고로이동시킨후각샘플의수화에의한 활성을 상기시험예 3과같은방법으로측정하였다.매회 ^정시측정당일아침에 배양액에서수득한세포를실험에사용하였다.

[109] 대장균분리생산탄산무수화효소 (free wgCA)는합성단백질의일반적생산 도구인대장균의세포질에발현된것올정제하여 사용하였다.상기 free ngCA는 표면발현된탄산무수화효소대비하여열안정성 을비교하기위한대조군 그룹으로사용하였다.정제된효소는 0.01 mg/tnL의농도로희석하였다.

샘풀들은 50 °C와 60 °C와전자식건조기 (Corning, Corning, NY, USA)에서 배양하였다.각샘플의세포는 6시간경과할때마다 4 °C의냉장고로이동시킨 후각샘플의수화에의한활성을상기시험예 3과같은방법으로측정하였다.

[110]

[111] 상기실험결과를도 9에도시하였다.열처리를수행하지않은효소들� ��

대하여，6시간간격으로열처리를수행하여잔� �활성을측정한값을측정한 결과，상기도면에서확인할수있는바와같이 porinB-(G4S) ₂ -« _(? CA의경우 50 °C에서 7일경과후에도평균 58.4%의잔여활성을나타내고있음을알수 있으나,대조군인 BCA는 1.7%， free ngCA는 33.1%로활성이급격히

감소하였으며 , porinB-(G4S)2-ngCA의경우 60 ⁰ C에서 24시간경과후에도 43.4%의잔여활성을나타내고있는반면， BCA는 4.4%, free ngCA는 7.1%로 잔여활성이급격히감소한것을알수있었다.도� �에는나타내지않았지만， 37 oC에서는 30일동안약 121.3 %의활성이유지되었고，그에비해 BCA와 ngCA는 각각 39.3 %, 29.7 %로감소하는것으로나타났다.

[112] 또한, porinB-(G ₄ S) _r «gCA의경우 24시간경과후에도 60°C에서약 60%,

80°C에서약 35%의잔여활성을나타내고있음을알수있으나， 대조군인 BCA 및 free ngCA의경우열처리수행직후부터잔여활성이급� �히감소하였으며， BCA의경우각각약 15%와약 5%， free ngCA의경우각각약 5%와약 1%의 잔여활성만이남아，열에대한활성의감소가실 시예에비해현저히큼을알수 있었다.

[Π3]

[114] 상기결과로부터,본발명에의해세포표면에발� �된탄산무수화효소의경우 자체의수화활성또한우수하며，열에대한안정 성이높아산업적으로유용한 전체세포효소시스템으로서이산화탄소의효율 적고정에활용될수있는것을 확인하여본발명을완성하였다.