La presente invención está dentro del campo técnico de la acuicultura, particularmente, el Invento se relaciona con una solución en particular para la prevención y tratamiento de enfermedades bacterianas a través de una bacteria ácido láctica Lactococcus lactis transformada para producir una cltoqulna inmunoestlmulante Interferón tipo II (IFN II), particularmente interferón gamma (IFNg o IFNy). Esta bacteria transformada ha sido depositada la Colección Chilena de Recursos Genéticos Microbianos de INIA número de acceso RGM 2416 de fecha 22 de Octubre de 2017. Así mismo, el Invento se relaciona con un alimento para especies acuícolas ¡nmunoestimulante que comprende la bacteria láctica transformada con IFN tipo II de salmónidos. También se refiere al método de preparación de dicho alimento probiótico, al método de preparación de dicha bacteria ácido láctica que expresa IFNg, es decir, producir una citoquina estimulante de la respuesta Inmune antibacterlana.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

En la industria salmonlcultora existen diversas causas naturales que producen la mortalidad de los peces, siendo las de origen Infeccioso las más agravantes. Algunos de los patógenos que han causado mayores pérdidas son las bacterias Flavobacterium psycrophilum y Pisciricketsia salmonis. La principal estrategia para estimular la respuesta Inmune de los peces en la industria acuícola, es por medio de la administración de vacunas inyectables. Sin embargo, este tipo de Inmunización conlleva a la manipulación y a un alto grado de estrés en los ejemplares. Además, debido a la corta memoria ¡nmunológica que poseen los peces se requiere de continuos refuerzos ( boosters ) que favorecen, por medio de la manipulación, la generación de más estrés, de mortalidad y daños en la calidad del filete. Por otra parte, las estrategias de vacunación oral y de Inmersión, poseen limitaciones en su efectividad y restricciones en su aplicación. Sumado al escenario de las vacunas, las enfermedades de origen bacteriano, principalmente producidas por P. salmonis no han podido controlarse con el uso de vacunas, lo que ha decantado en la aplicación excesiva de antibióticos de amplio espectro, los que pueden modificar el medioambiente donde se hacen los cultivos, pueden aumentar la resistencia de las bacterias patógenas y alterar la microbiota de los peces. Todos estos antecedentes hacen urgente la necesidad de crear nuevas formas de estimular el sistema Inmune de los peces de forma no Invasiva. Actualmente, los estudios se enfocan hacia el desarrollo de vacunas orales que puedan ser utilizadas como refuerzo ("boost") estimulando reiteradas veces el sistema ¡nmunológlco de los salmónidos sin la necesidad de manipularlos manteniéndolos en un estado más natural hasta la cosecha.

Los ¡nterferones son un grupo de cltoqulnas descubiertas originalmente por sus propiedades antlvlrales (Isaacs y Llndenmann, 1957). En los mamíferos, estas cltoqulnas pueden clasificarse en tres familias según su homología, receptores, estructura y función (Pestka et al., 2004). Los ¡nterferones de tipo I y II son familias de genes múltiples (17 tipos I y 4 de tipo II) fuertemente Inducidos por virus, desempeñando un papel preponderante en el control de las Infecciones virales (Lazear et al., 2015, McNab et al., 2015, Teljaro, 2016).

El ¡nterferón tipo II o Interferón gamma (IFNg) es una cltoqulna ¡nmunorreguladora codificada por un único gen, producida principalmente por células NK y T activadas, aunque también es secretada por células B y células presentadoras de antígeno (APC)

(Frucht et al. 2001, Kearney et al., 2013, Zlmonjlc et al., 1995).

El ¡nterferón tipo I de Salmo salar (Salmón del Atlántico) muestra propiedades antlvlrales que Inducen la expresión de varios genes antivíricos, entre los que se encuentran Mx (Ool y otros, 2008, Martin et al., 2007, C. Xu, Evensen y Munang'andu 2015). Experimentos in vitro e in vivo muestran que el ¡nterferón I es eficaz contra patógenos de Importancia económica tales como IPNV, IHNV, ISAV y SAV (Chang et al., 2014, 2016, Robertsen et al., 2003, Salnt-Jean y Pérez-Prleto, 2006, Sun y otros, 2011, Svlngerud et al., 2012, 2013, Xu et al., 2010). Además, en Salmo salar el ¡nterferón I también estimula la inmunidad adaptativa, aumentando la inmunoestimulación mediada por las vacunas de ADN (Chang et al., 2015).

No obstante, los ensayos de bioactivldad utilizando IFNg recombinante de Salmo salar o trucha arco iris muestran que esta citoquina es capaz de inducir la expresión de las proteínas MHCI, MHCII, relacionadas con el procesamiento de los antígenos y aumentar la explosión respiratoria de las células fagocíticas (Martin et al., 2007a, 2007b, 2007c, Zou et al., 2005). In vitro también el IFNg de Salmo salar tiene propiedades antivlrales contra SAV e IPNV (Sun et al., 2011).

Al Igual que en los seres humanos, IFN(s) tienen el potencial para ser utilizado como tratamiento terapéutico o profiláctico contra patógenos virales de salmonlcultura . Sin embargo, la aplicación de estas citoquinas ha sido poco estable en acuicultura, debido a la falta de un vehículo de entrega, compatible con la fisiología de los peces que haga efectivo su uso.

La presente invención desarrolla una bacteria inmunoestlmulante oral para estimular en forma no específica la respuesta inmune innata contra infecciones de origen bacteriano, tanto para patógenos Intra y extracelulares. La presente invención demuestra que IFN gamma (IFNg) de salmón es una citoquina que otorga protección contra infecciones bacterianas en salmónidos a partir de la activación de genes que favorecen la respuesta inmune celular y humoral de los peces. Así, la expresión a nivel mucoso de esta citoquina inmunoestlmulante, utilizando como vehículo de liberación una bacteria ácido láctica, otorga un efecto protector en los individuos contra las infecciones bacterianas.

En las últimas décadas, las bacterias de ácido láctico (LAB) han surgido como un vehículo factible para la liberación in situ de citoquinas y péptldos bloactlvos dentro del tracto gastrointestinal de mamíferos (Bahey-EI-DIn et al., 2010; Steldler et al., 2009). Los ¡nterferones alfa (Bayat et al., 2014, Ma et al., 2014, Zhang et al., 2010), beta (Zhuang et al., 2008), gamma (Bermúdez-Humarán et al., 2008; Rupa et al., 2008) e IL-10 (Steldler et al., 2000) se ha expresado con éxito en LAB bajo su forma biológicamente funcional, produciendo efectos locales y slstémicos después de la administración a animales (mamíferos). Si bien, cepas de Lactococcus Lactis para la entrega de proteínas recombinantes tales como proteínas antigénicas, citoquinas, incluyendo IFN u otras proteínas biológicamente activas en animales, han sido descritas anteriormente en los documentos Zhuang Z, Wu ZG, Chen M, Wang PG. (2008), Bahey-EI-Din MI, Gahan CG. (2011), W02011150127, W02010139195, CN 102329766, CN102796755, CL201503797, CN104120142,

CN 103074291, US4808523, CN 105331570 o W02014040987, el presente invento describe una solución concreta, de una bacteria LAB específica, para preparar un alimento inmunomodulador para un problema no resuelto satisfactoriamente como son las enfermedades bacterianas en acuicultura, particularmente, enfermedades de salmónidos, en la industria salmonera.

En el salmón Atlántico y la trucha arco Iris, el uso de LAB en la entrega in situ de proteínas bloactlvas ha sido deficientemente estudiado, explorando su uso sólo para la entrega de péptldos antlgénicos (Li et al., 2012). Los inventores previamente han descrito la transformación de bacterias Lactococcus lactis con IFN tipo I, la cual es útil en la prevención de la enfermedad viral del virus de la necrosis pancreática infecciosa. Sin embargo, el presente invento describe una cepa de Lactococcus lactis transformado con IFN tipo II y que sorprendentemente pudo proteger de enfermedades bacterianas Importante en la Industria acuícola, particularmente de salmónidos. En este invento se utilizó Lactococcus lactis para la expresión de IFNg de Salmo salar. Las bacterias lácticas del presente Invento, que expresan IFNg de Salmo salar, administradas junto con una base de alimento fueron biológicamente funcionales en el ensayo in vivo, en la protección de enfermedades bacterianas. Además, la administración de estas LAB modificadas, muestran que los especímenes tratados permiten el control eficaz de infecciones bacterianas con patógenos ¡ntracelulares y extracelulares de peces, tales como Flavobacterium psycrophilum o Pisciricketsia salmonis, solución no prevista ni deduclble del estado de la técnica en forma directa.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con una bacteria Lactococcus lactis transformada, productora de ¡nterferón gamma (IFNg) de Salmo salar que comprende cepa de Lactococcus lactis NZ3900 que comprende el sistema génico que comprende la construcción de ADN pNZ8149-pl-USP45-IFNg-GGG-6xHIS. Esta bacteria de L. lactis transformada tiene un número de acceso RGM 2416 de fecha 22 de Octubre de 2017 en la Colección Chilena de Recursos Genéticos Microbianos de INIA, Chile. Así mismo, el invento se relaciona con un plásmido para transformar bacteria de L. lactis para producir ¡nterferón gamma (IFNg) que comprende el vector pNZ8149 y la secuencia de ADN Pl- Usp45-IFNy-GGG-6xHIS y con el método para preparar la bacteria L. lactis transformada e individualizada anteriormente. Es parte del invento, también el alimento probiótico para inmunoestimular peces el cual comprende la bacteria L. lactis transformada con el fin de prevenir o tratar infecciones bacterianas en peces y el método de preparación del alimento que comprende mezclar la bacteria transformada con alimento de peces. De igual forma, el invento abarca una composición inmunomoduladora de peces y kit que comprende la bacteria L. lactis transformada. Así mismo el invento describe uso de la bacteria L. lactis transformada para preparar un alimento útil para inmunoestimular peces, para reducir la carga bacteriana, preferentemente, de bacterias patógenas de peces tales como Flavobacterium psychrophilum y/o Piscirickettsia salmonis.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Mapa genético correspondiente la construcción pNZ8149-IFNg. PnisA: promotor inducible por nisina. Pl : promotor de expresión constitutiva de L. lactis. Usp45: señal de exportación. IFNg : secuencia madura del mRNA codificante para ¡nterferón gamma (IFNy) de Salmo salar. 3xGly: tres glicinas espaciadoras. 6xH¡s: cola de histid i na . RepA y RepC: genes que permiten la replicación del plásmido. LacF: gen que codifica para la lactasa. Se muestran los sitios de restricción Ncol y Xbal, utilizados para clonar el cassette en el vector pNZ8149. Tamaño del plásmido: 3289 pb.

Figura 2. Detección de gamma (IFNy o IFNg) desde el contenido citosólico de L. lactis recombinante inducido con distintas concentraciones de nisina. St: estándar de peso molecular. Lac: 20 ug de proteína total de L. lactis que contiene el plásmido pNZ8149 sin el marco de lectura del gen como control inducido con 10 ng/mL de nlsina. O, 1, 5 y 10: 20 ug de proteína total de L. lactis que expresa IFNy Inducida con 0, 1, 5 y 10 ng/mL de nlsina. A la izquierda el gel teñido con Azul de Coomassie y a la derecha western blot para la cola de hlstdina (6XHIs). Para el western blot se utilizó el anticuerpo primarlo contra la cola de histid i na 6X (1 :2000) que es incubado durante 1 hora a temperatura ambiente en agitación. El anticuerpo secundarlo conjugado a HRP que reconoce el IgG del anticuerpo primarlo (1 :2000) es incubado durante 1 hora a temperatura ambiente en agitación. Después de cada anticuerpo se lavó 3 veces la membrana durante 10 minutos con PBS-Tween20 0,15%. La membrana fue relevada mediante quimlolumlnlscencia con el kit UltraSIgnal® (nombre kit), y el equipo chemldock LI-COR.

Figura 3. Cinética de secreción de IFNy o IFNg, producido por L. lactis- IFNg.

Cuatro cultivos con 40 mL de M17 suplementados con lactosa fueron Inoculados al 2% con un precultivo de L. lactis- IFNg, e incubados a 30 °C sin agitación. Luego los sobrenadantes se analizaron 1, 2, 6 y 24 horas post Inducción con Nlsina. Para el western blot se utilizó el anticuerpo primarlo contra la cola de hlstidina 6X (1 :2000) que es incubado durante 1 hora a temperatura ambiente en agitación. El anticuerpo secundarlo conjugado a HRP que reconoce el IgG del anticuerpo primarlo (1 : 2000) es incubado durante 1 hora a temperatura ambiente en agitación. Después de cada anticuerpo se lavó 3 veces la membrana durante 10 minutos con PBS-Tween20 0,15%. La membrana fue revelada mediante quimlolumlnlscencia con el kit UltraSIgnal® (nombre kit), utilizando el equipo chemldock LI-COR. C+ : lOug de extracto citoplasmático de L. lactis- IFNg. A la izquierda se Indican los valores en kDa correspondientes al estándar de peso molecular. Las muestras fueron cargadas en duplicado.

Figura 4. Cuantificación del número de copias del mRNA de IFNg de L. lactis- IFNg mediante RT-qPCR. Cuantificación absoluta del número de copias del mRNA que codifica para IFNg desde cultivos de L. lactis-IFNg Inducidos con cantidades crecientes de nlsina. Mediante TRIZOL, se extrajo el RNA total a partir de 20 mL de cultivo bacteriano. Posteriormente, para la reacción de RT-qPCR se utilizaron 100 ng de RNA tratado con DNAsas de cada condición. Los controles de transcripción reversa no mostraron amplificación (dato no mostrado). El ensayo fue realizado con réplica biológica y técnica. Figura 5. Inducción de genes relacionados a la respuesta inmune activados por la mezcla de sonicados de L. lactis- IFNg en células SHK-1. Distintas concentraciones de sonicados obtenidos de mezclas de L. lactis fueron utilizados según la

Tabla 1. Los sonicados fueron incubados en células SHK-1 por 8 horas a 16 °C. Se midió la inducción de STAT1, gamma IP-10, IFNg, TGF-b, IL-lb e IL-6. Los valores obtenidos fueron normalizados y relativos a eFla. Control: células SHK-1 sin tratamiento. 0: células SHK-1 incubadas con 200 ng/mL de extracto de L. lactis con plásmido sin inserto. 20, 50, 100 y 200: células SHK-1 incubadas con 0 ng/mL, 20 ng/mL, 50 ng/mL, 100 ng/mL y

200 ng/mL de sonicado aportado por L. lactis- IFNg, respectivamente. Ensayo se realizó con réplica biológica y técnica.

Figura 6. Esquema de alimentación con L. lactis productor de IFNg in vivo en truchas arcoíris. La estrategia utilizada consistió en aclimatar a los peces durante 7 días, posteriormente se inició la alimentación especial con a) alimentados con alimento comercial , b) L. lactis con el vector sin inserto y c) L. lactis- IFNg durante 7 días. A los días 0 (antes del tratamiento), 2, 4 y 6 de alimentación se realizaron muéstreos de 3 peces por cada tiempo. Luego, se suspendió la alimentación especial y todos los peces fueron alimentados con el peí let comercial. Se analizaron grupos de 3 peces nuevamente a los 1, 3, 5 y 7 días post alimentación con el problótlco. (d.a) : durante la alimentación y (d.p.a): durante post alimentación.

Figura 7. Cuantificación mediante RT-qPCR de los transcritos asociados a la respuesta inmune de interferón gamma (IFNy o IFNg) durante la administración de Lactococcus lactis-IFNg a ejemplares de trucha arcoiris. Se realizó cuantificación relativa de distintos genes de respuesta a IFNg. Se muestra la respuesta a nivel de bazo (Spleen, BZ) y riñón (Kidney, RÑ) al día 0, 2, 4 y 6 de alimentación (d.a). Se midió IL-lb, IL-12, IL-6, IFNg, STAT1 y glPlO. Los valores fueron normalizados y estandarizados en base al factor de elongación 1 alpha (eFla). El análisis estadístico fue realizado con Mann Withney de una cola y la significancia de los datos fue determinada por t-student (p<0,05) comparando con los niveles de transcritos del primer día, es decir, antes de iniciar la dieta. NER: Expresión relativa normalizada. Número de peces analizados por día de muestreo: 3. Réplicas técnicas: 2.

Figura 8. Cuantificación de lisozima en suero de trucha arcoiris durante el tratamiento con L. lactis-IFNg. Truchas fueron alimentadas durante 7 días con alimento suplementado con L. lactis-IFNg o alimento normal (control). Se extrajeron muestras de sangre al inicio de la alimentación (0 d.a) y a 2, 4 y 6 días del tratamiento (d.a). A partir de las muestras de sangre, se preparó suero mediante centrifugación a 4500 r.p.m por 15 minutos a 4 °C. La cantidad de lisozima en suero se estimó mediante el ensayo de Micrococcus lutheus a través de una disminución en la densidad óptica y se midió la absorbancia en un Tecan Pro200 Nanoquant. Número de peces analizados por día de muestreo:3.

Figura 9. Cuantificación mediante RT-qPCR de transcritos asociados a la respuesta inmune de IFNy (IFNg) durante el periodo post alimentación con L. lactis-IFNg. Se realizó cuantificación relativa de distintos genes de respuesta a IFNy

(IFNg). Se muestra la respuesta a nivel de bazo (BZ) y riñón (RÑ), al día 0, 1, 3 y 7 post alimentación (d.p.a). Se midió IFNg (A), STATl(B), glPlO (C), TGF-b (D) y IL-6 (E). Los valores fueron normalizados y estandarizados en base al factor de elongación 1 alpha (eFla) y al día de inicio de la alimentación (0 d.a). El análisis estadístico fue realizado con Mann Withney de una cola y la significancia de los datos fue determinada por t- student (p<0,05) comparando con los niveles de transcritos del primer día, es decir, antes de iniciar la dieta. NER: Expresión relativa normalizada. Número de peces analizados por día de muestreo: 3. Número de réplicas técnicas: 2.

Figura 10. Cuantificación de lisozima en suero post alimentación. A partir de las muestras de sangre de los peces analizados una vez finalizada la alimentación se extrajo sangre a 1, 3, 5 y 7 dias post alimentación (d.p.a) posteriormente se centrifugó a 4500 r.p.m por 15 minutos a 4°C para separar el suero. A continuación, se hizo ensayo de Micrococcus lutheus para determinar la cantidad de lisozima a través de una disminución en la densidad óptica, y se midió la absorbancia en un Tecan Pro200 Nanoquant. El ensayo fue realizado por triplicado. Número de peces analizados por día de muestreo: 3. Replicas técnicas: 2. Las condiciones ensayadas fueron peces alimentados con alimento normal (control), peces alimentados con L. lactis NZ3900 (L. lactis) y L. lactos que expresa IFNg (L. lactis-IFNg)

Figura 11. Mortalidad ocasionada por F. psychrophilum en ejemplares de Trucha arcoíris alimentados con L. lactis- IFNy(IFNg) e infectados. Se utilizaron seis acuarios (AQ1-AQ6) con 15 ejemplares cada uno, de aproximadamente 25 g. Se desafiaron mediante inyección intraperitoneal con 100 pL (1,25 x 10 ⁹ UFC) de inoculo y se observó la mortalidad acumulada durante 17 días a 12 °C. Control sin desafío: peces inyectados con medio de cultivo TYES. (A) Porcentaje de sobrevida promediados por condición. (B) Porcentaje de sobrevida obtenidos por cada acuario. Flavo: peces inyectados con Flavobacteria. Flavo + L. lactis: peces alimentados durante 7 días con L. lactis y posteriormente inyectados con Flavobacteria. Flavo + L. lactis IFNy: peces alimentados durante 7 días con L. lactis que expresa IFNy (IFNg) y posteriormente inyectados con Flavobacteria. 100% corresponde a 15 peces por cada condición.

Figura 12. Número de copias de RpoS/mL de F. psychrophilum desde bazo de truchas arcoíris infectados. Peces alimentados con alimento normal y con alimento suplementado con L. lactis-INFg (IFNg) o con L. lactis que no expresa interferon g (Lactis) fueron desafiados con F. psycrophillum (FLAVO, IFNg+fLAVO y Lactis+FLAVO, respectivamente). Como control negativo de infección los peces fueron tratados con alimento normal e inyectados con suero fisiológico (control). Mediante qPCR al gen RpoC, se realizó una cuantificación absoluta de la carga bacteriana en los peces moribudos y los sobrevivientes al desafío con F. psycrophillum. Los peces moribundos aparecieron a partir del día 7 post infección. Se definió como sobrevivientes a los peces no moribundos vivos al dia 17 post infección. Los valores de carga bacteriana que se encuentran debajo de la línea roja se consideran ruido de la técnica.

Figura 13. Mortalidad ocasionada por F. psychrophilum en ejemplares de Trucha arcoíris alimentados con L. lactis-IFNg e infectados. Se utilizaron doce acuarios (AQ1-AQ12) con 12 ejemplares cada uno, de aproximadamente 30 g. Se desafiaron mediante inyección intraperitoneal con 100 pL (1,25 x 10 ⁹ UFC) de inoculo por pez y se observó la mortalidad acumulada durante 17 días a 12°C. Control : peces Inyectados con medio de cultivo TYES. Flavo: peces inyectados con 1,25 x 10 ⁹ UFC en cultivo TYES. Flavo + Lactis : peces inyectados con 1,25 x 10 ⁹ UFC en cultivo TYES y alimentados durante 7 días con 1 x 10 ⁷ UFC de L. lactis por pez. Flavo + L. lactis IFNg (7da): peces inyectados con 1,25 x 10 ⁹ UFC en cultivo TYES y alimentados durante 7 días con lxlO ⁷ UFC de L. lactis que expresa IFNg por pez. Flavo + Lactis IFNg (x3): peces inyectados con 1,25 x 10 ⁹ UFC en cultivo TYES y alimentados durante 7 días con 3xl0 ⁷ UFC de L. lactis que expresa IFNg. Flavo + Lactis IFNg (14da): peces inyectados con 1,25 x 10 ⁹ UFC en cultivo TYES y alimentados durante 14 días con lxlO ⁷ UFC de L. lactis que expresa IFNg.

Figura 14. Peso y longitud de los ejemplares de Trucha arcoíris sobrevivientes de cada condición experimental al final del ensayo de la Figura 13. Control : peces inyectados con medio de cultivo TYES. Flavo: peces inyectados con 1,25 x 10 ⁹ UFC en cultivo TYES. Flavo + Lactis : peces inyectados con 1,25 x 10 ⁹ UFC en cultivo TYES y alimentados durante 7 días con 1 x 10 ⁷ UFC de L. lactis por pez. Flavo + L. lactis IFNg (7da): peces inyectados con 1,25 x 10 ⁹ UFC en cultivo TYES y alimentados durante 7 días con lxlO ⁷ UFC de L. lactis que expresa IFNg por pez. Flavo + Lactis IFNg x3: peces inyectados con 1,25 x 10 ⁹ UFC en cultivo TYES y alimentados durante 7 días con 3xl0 ⁷ UFC de L. lactis que expresa IFNg. Flavo + Lactis IFNg 14da : peces inyectados con 1,25 x 10 ⁹ UFC en cultivo TYES y alimentados durante 14 días con lxlO ⁷ UFC de L. lactis que expresa IFNg. Los duplicados se muestran como experimentos independientes.

Figura 15. Mortalidad ocasionada por Piscirickettsia salmonis en ejemplares de Salmo salar alimentados con L. lactis- IFNy (IFNg) e infectados. Se utilizaron 10 acuarios con 8 peces cada uno, de aproximadamente 45 g, evaluados en 5 condiciones en duplicado cada una. (A) Porcentaje de sobrevida obtenidos por cada acuario. (B) Porcentaje de sobrevida promediados por condición Control inyección: peces Inyectados con medio de cultivo L-15. Control desafío: peces Inyectados ¡ntraperitonealmente con 100 pL de P. salmonis (lxlO ⁷ bacterias vivas/mL). L. lactis + SRS: peces inyectados intraperitonealmente con 100 pL de P. salmonis (lx 10 ⁷ bacterias vivas/mL) y alimentados 7 días con L. lactis más un refuerzo de 3 días. L. lactis- IFNy (IFNg) (7da) + SRS: peces inyectados intraperitonealmente con 100 pL de P. salmonis (lx 10 ⁷ bacterias vivas/mL) y alimentados 7 días con L. lactis que expresa IFNy (IFNg) más un refuerzo de 3 días. L. lactis- IFNy (IFNg) (14da) + SRS: peces inyectados intraperitonealmente con 100 pL de P. salmonis (lx 10 ⁷ bacterias vivas/mL) y alimentados 14 días con L. lactis que expresa IFNy (IFNg). Los resultados se muestran en duplicado.

Figura 16. Mortalidad ocasionada por Piscirickettsia salmonis en ejemplares de Salmo salar alimentados con L. lactis sin inserto. Se utilizaron 6 acuarios con 7 peces cada uno, de aproximadamente 50 g, evaluados en 3 condiciones en duplicado cada una. Los peces fueron alimentados durante 7 días, al día siguiente desafiados intraperitonealmente. Control vehículo: Medio L-15. P. salmonis: P. salmonis (lxlO ⁷ Bacterias/pez). P. salmonis + pNZ8149 s/insert: Salmo salar alimentado con alimento suplementado con L. lactis con el vector pNZ8149 sin el gen de IFNg de Salmo salar y desafiado con P. salmonis (lxlO ⁷ Bacterias/pez). El gráfico muestra los promedios del porcentaje de sobrevida de cada condición.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un alimento probiótico que comprende una bacteria ácido láctica, especialmente, L. lactis, transformada para producir una citoquina inmunoestimulante, preferentemente, IFN de Tipo II, para inmunoestimular especies acuícolas ante infecciones bacterianas, logrando así la expresión heteróloga de una proteína inmunoestimulante de Salmo salar en una bacteria ácido láctica. La bacteria L. lactis transformada tiene número de acceso RGM 2416 de fecha 22 de Octubre de 2017 de la Colección Chilena de Recursos Genéticos Microbianos de INIA, Chile.

Las proteínas inmunoestimulantes ejercen un potente efecto modulador sobre la respuesta inmune. La administración de éstas en forma recombinante ha permitido su uso terapéutico para incrementar la respuesta inmune contra bacterias patógenas. En el mercado de la acuicultura no se dispone de sistemas de producción heteróloga in situ de proteínas ¡nmunoestimulantes funcionales que permitan su uso terapéutico. Las bacterias ácido lácticas, son organismos GRAS (Generally Regarded as Safe), que en virtud de esta clasificación han sido utilizadas como sistemas de vacunación y liberación de moléculas terapéuticas.

La bacteria ácido láctica de la presente invención puede ser usada para expresar y secretar proteínas ¡nmunoestimulantes funcionales en especies acuícolas, particularmente, en peces y preferentemente en Salmo salar y trucha arcoiris. La presente bacteria ácido láctica permite la protección inmunogénica no invasiva y aplicable a gran escala, capaz de incrementar los sistemas de inmunización actuales.

La administración de la presente bacteria láctica productora de una citoquina inmunoestimulante puede estimular in vivo la expresión de genes de respuesta a IFN gamma y reducir la mortalidad de especies acuícolas desafiadas con bacterias, particularmente con F. psychropillhum y P. salmonis.

Mediante técnicas de biología molecular, se generó una cepa de bacteria ácido láctica productora de una citoquina inmunoestimulante. Sus propiedades ¡nmunoestimulantes fueron estudiadas en especies de interés acuícola, administrando una dosis oral de lxlO ⁷ UFC en cada pez. La inmunoestimuladón se evaluó cuantificando los genes de respuesta a esta citoquina mediante real time qPCR normalizando su expresión con el gen housekepping eFla. Para lograr este objetivo el RNA total fue extraído a partir de órganos inmunológicos (Bazo y Riñón), los cuales fueron inspeccionados previamente para evaluar, a través de la morfología, signos de toxicidad.

La bacteria ácido láctica produce y secreta la proteína heteróloga. La proteína se ubicó principalmente en la fracción citoplasmática. Los bioensayos mostraron que esta proteína es funcional al estimular la expresión de genes inmunológicos.

La invención se relaciona, particularmente, con una bacteria Lactococcus lactis transformada, productora de interferón gamma (IFNg) de Salmo salar que incluye la construcción de ADN que comprende pNZ8149-Pl-USP45-IFNg-GGG-6xHIS, donde pNZ8149 es el vector transformado; Pl, el promotor de expresión constitutiva de L. lactis,- Usp45 es la señal de exportación; IFNg es la secuencia madura de mRNA codificante para IFN gamma de Salmo salar; GGG es una secuencia que codifica para tres glicinas (SEQ ID No.5) y 6xHIS (SEQ ID No. l) es una secuencia que codifica para 6 H istid inas terminales. La cepa transformada de Lactococcus lactis es aquella identificada como NZ3900, no obstante, no es limitativa y pueden ser otras cepas de L. lactis. La bacteria, preferente es Lactococcus lactis NZ3900 transformada con el sistema génico que comprende el plásmido pNZ8149/Pl-USP45-IFNg-GGG-6xHIS. En forma preferida, la cepa recombinante es aquella que tiene el número de acceso RGM 2416 de fecha 22 de Octubre de 2017 de la Colección Chilena de Recursos Genéticos Microbianos de INIA, Chile.

Es parte del invento, también, un plásmido útil para transformar una bacteria L. lactis para producir interferón gamma (IFNg) que comprende el vector pNZ8149 y la secuencia Pl-Usp45-IFNy-GGG-6xHIS, donde Pl, el promotor de expresión constitutiva de L. lactis,- Usp45 es la señal de exportación; IFNg es la secuencia madura de mRNA codificante para IFN gamma de Salmo salar, GGG es una secuencia que codifica para tres glicinas y 6xHIS es una secuencia que codifica para 6 Histidinas terminales.

Así mismo, el invento se relaciona con un método para preparar la bacteria L. lactis transformada que comprende los siguientes pasos:

a) Digerir un plásmido que contiene el marco de lectura de IFNg de Salmo salar y optimizado codogénicamente para Lactococcus lactis, con enzimas de restricción, b) Purificar el producto de digestión correspondiente al gen de IFNg con los sitios cohesivos para las enzimas de restricción,

c) En paralelo, digerir con las mismas enzimas el plásmido NZ8149,

d) Purificar el plásmido linea I izado desde gel de agarosa,

e) Ambos productos purificados, son ligados mediante una Ligasa,

f) Dializar el producto de ligación;

g) Transformar bacterias L. lactis electrocompetentes con el plásmido ligado;

Las enzimas de restricción, preferentes, para las etapas a) y c) corresponden a las enzimas de restricción Ncol y Xbal y la bacteria electrocompetente de la etapa g) es la cepa de L. lactis NZ3900. Es parte del presente invento un alimento problótlco para ¡nmunoestlmular especies acuícolas, en forma particularmente preferida, inmunoestimular peces. El alimento probiótico comprende la bacteria L. lactis transformada con una bacteria Lactococcus lactis transformada, productora de interferón gamma (IFNg) de Salmo salar que incluye la construcción de ADN que comprende pNZ8149-Pl-USP45-IFNg-GGG-6xHIS, donde pNZ8149 es el vector transformado; Pl, el promotor de expresión constitutiva de L. lactis,- Usp45 es la señal de exportación; IFNg es la secuencia madura de mRNA codificante para IFN gamma de Salmo salar, GGG es una secuencia que codifica para tres glicinas y 6xHIS es una secuencia que codifica para 6 Histidinas terminales. De igual manera, el invento abarca el método para preparar un alimento probiótico antes descrito. Adicionalmente, el invento protege cualquier composición inmunomoduladora para ser administrado a especies acuícolas, en el sentido más amplio del alcance de composición. La composición puede tener una forma líquida o sólida y excipientes para otorgar estabilidad para el almacenaje y aumentar la biodisponibilidad a la bacteria transformada del presente invento. Además, la composición incluye todas las combinaciones de moléculas orgánicas útiles para la administración en especies acuícolas, siendo ellas proteínas, lípidos o sacáridos, en combinación con la bacteria L. lactis transformada, descrita precedentemente o con la bacteria descrita en la realización preferida de los ejemplos. Esta composición puede comprender, la combinación de la bacteria del invento con vacunas de proteínas recombinantes o vacunas de ácidos nucleicos, bacterinas, probióticos, prebióticos, otros inmunomoduladores, vitaminas, etc.

El uso de la bacteria L. lactis transformada es para preparar un alimento o composición útil para inmunoestimular especies acuícolas, particularmente, inmunoestimular peces. El uso dado para esta bacteria es para preparar un alimento útil para reducir la carga bacteriana, preferentemente carga bacteriana de Flavobacterium psychrophilum y/o Piscirickettsia salmonis. El uso de la bacteria y del alimento que la comprende, es para preparar un alimento o composición útil para tratar o prevenir la infección de Flavobacterium psychrophilum y/o Piscirickettsia salmonis en peces. Es parte del invento, un kit que incluye un envase que comprende la bacteria L. lactis transformada con la construcción de ADN pNZ8149-Pl-USP45-IFNg-GGG-6xHIS. Además, este kit puede comprender instrucciones para el uso de alimentar, tratar o prevenir enfermedades bacterianas en especies acuícolas, preferentemente, peces relevantes en la industria acuícola. En una realización preferida las instrucciones tienen información para el uso de alimentar peces, tratar o prevenir enfermedades causadas por Flavobacterium psychrophilum y Piscirickettsia salmonis en peces.

El invento, además, abarca el método para reducir la carga bacteriana en especies acuícolas, que comprende administrar a estas especies, el alimento mezclado con la bacteria L. lactis transformada, seleccionada de cualquiera bacteria que comprende la construcción de ADN pNZ8149-Pl-USP45-IFNg-GGG-6xHIS detallada en los ejemplos de la presente invención. Las especies acuícolas, preferentemente son peces, y el método trata o previene infecciones por Flavobacterium psychrophilum o Piscirickettsia salmonis. El método de administración es capaz de tratar o prevenir una infección bacteriana al reducir la carga bacteriana en especies acuícolas, preferentemente, peces.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Mediante biología sintética se diseñó y sintetizó un gen codificante para una proteína inmunoestimulante de Salmo salar optimizada codogénicamente, con un péptido de secreción y una cola de 6 histidinas (6xHis) (SEQ ID NO: l). El gen fue clonado en un vector de expresión con calidad alimentaria. La producción de la proteína heteróloga se determinó a través de Western blot y su funcionalidad fue determinada mediante bioensayos.

La presente invención consiste en una cepa recombinante de Lactococcus lactis NZ3900, que comprende el plásmido pNZ8149 en el cual se clonó un segmento de ADN sintético que comprende el promotor Pl, el péptido señal de la proteína USP45, un gen que codifica para la secuencia madura del interferón I de Salmo salar, y una cola de tres glicinas y seis histidinas, denominándose pNZ8149-IFNgSS (Figura 1). La secuencia del gen de IFNg se obtuvo a partir del genoma de Salmo salar y está optimizada codogénicamente para ser expresada en el hospedero L. lactis (Figura 1). Esta cepa expresa constitutivamente el gen de IFN gamma a partir de la presencia del Promotor Pl, de L. lactis secuencia SEQ IDNo:2, y es inducible a partir de la presencia del Promotor nisina presente en el vector comercial (Figura 2). IFNg es secretada hacia el medio de cultivo gracias a la presencia del péptldo señal Usp45, secuencia SEQ ID No:3, que está fusionado en marco con la secuencia de IFN gamma (INFg), SEQ ID No:4 (Figura 3). La expresión de IFNg fue detectada en extractos de L. lactis productor de IFNg comparada con el extracto de la cepa con que contiene el plásmido pNZ8149 sin el marco de lectura del gen (Figura 4).

Metodología

Diseño de vector pNZ8149-IFNg. Para el diseño del vector lactococcal, se utilizó como backbone (esqueleto) el plásmido pNZ8149 (Mobltec®) y un plásmido pJetl .2-IFNg (Genescript®) que contiene el marco de lectura de IFNg de Salmo salar (GenBank: FJ263446.1). In silico el gen IFNg fue optimizado codogénicamente para Lactococcus lactis nz3900 a través de la aplicación online http://www.kazusa.or.jp/codon/, y modificado de tal manera de Incorporar en sus extremo amino terminal la secuencia que codifica para el péptldo USP45, y en su extremo carboxllo la secuencia que codifica para una cola de tres glicinas y seis h istid i na (GGGHHHHHH) SEQ ID No: 5. Estas secuencias fueron colocadas en marco de lectura junto con el gen de INFg optimizado codogénicamente para L. lactis. También in silico se agregó la secuencia del promotor Pl en el extremo 5' de la secuencia que codifica para USP45-IFNg-GGGHHHHHH. Esta nueva secuencia Pl- USP45-IFNg-GGGHHHHHH fue sintetizada in vitro y clonada en pJetl.2 (Genescript co) (Figura 1). La Identidad de la secuencia génica del constructo fue corroborada mediante secuenclaclón sanger y la secuencia aminoacídlca del gen que sintetiza a través de la página http://vvww.biOinform3tics.orQ/sms2/rev trans.html.

Ya que los plásmidos pNZ8149 y pJetl.2-IFNg poseen origen de repllcaclón para ser propagado en E. col i y el marcador de selección de ampiclllna, se utilizó la cepa MC1061 para obtener altas concentraciones de ambos plásmidos. Posteriormente, ambos plásmidos fueron digeridos durante 1 hora a 37°C con las enzimas Ncol y Xbal, presentes en el sitio de múltiple clonamiento de pNZ8149 y en los extremos de IFNg presente en pJetl.2. Ambas digestiones fueron resueltas en un gel de agarosa al 1% p/v donde se obtuvo el vector lineal y el inserto para su purificación por Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega®). El vector y el inserto fueron ligados toda la noche a

4°C y al día siguiente dializados durante 30 minutos para la electroporaclón de Lactococcus lactis NZ3900 para obtener la bacteria con el vector pNZ8149-IFNg.

Detección de IFNg en cultivos de L. lactis. Para detectar la expresión de la proteína recombinante se realizaron ensayos de western blot a partir del extracto citoplasmático de L. lactis sonlcado. Para esto se creció un pre-cultivo de L. lactis pNZ8149-IFNg en M17 0,5% de lactosa toda la noche a 30 °C. Al día siguiente se inoculó al 2% un cultivo de 40 mL, luego de cultivar a 30 °C hasta que la OD _S00 alcanzara un valor entre 0,4 y 0,6, el cultivo se dividió en volúmenes iguales. A unos cultivos se agregó concentraciones de nlsina entre 0 y 10 ng/mL. Los cultivos se Incubaron durante 2 horas a 30 °C. Posteriormente, las bacterias fueron colectadas por centrifugación a 7.000 rpm durante

20 mln a 4 °C.

El pellet bacteriano se resuspendió en 500 uL de PBS1X suplementado con Inhibidor de proteasas 1 mM. Luego, es sonlcado 5 veces durante 15 segundos en un equipo Ultrasonlc processor Sonic Vlbracell VCX130 (amplitud del 90%) incubando en hielo entre cada ciclo. La muestra se centrifugó a 6000 rpm durante 10 mln a 4°C y el sobrenadante se separó del debris celular en un nuevo tubo que fue congelado a -20 °C hasta su uso. Para determinar la concentración de proteínas totales en el extracto se utilizó el método de Bradford. Una vez conocida la concentración, esta se normalizó para resolver y comparar la cantidad de proteína mediante electroforesis SDS-PAGE. Se cargaron 10 pg del extracto citoplasmático de L. lactis productor de IFNg Inducido y no inducido con nlsina, además de un extracto de L. lactis que contiene el plásmldo pNZ8149 sin el marco de lectura del gen para IFNg como control. Las muestras fueron sometidas a electroforesis durante 40 mln a 60 V y luego 1,5 horas a 120 V. Las proteínas contenidas en el gel de poliacrllamlda fueron electrotransferldas a una membrana de nltrocelulosa a 300 mA durante 7 min. Posteriormente, la membrana se bloqueó en una solución de PBS-BSA al 2% con agitación a 4°C durante toda la noche. A continuación, la membrana se lavó a temperatura ambiente tres veces durante 10 minutos con PBS lX-Tween 20 al 0,1% y se Incubó durante 1 hora con una dilución 1 :2.000 del anticuerpo primario antl- His (Abcam) en PBS-BSA al 2%. Luego, la membrana se lavó con el mismo procedimiento y se Incubó durante 1 hora con una dilución 1 : 5.000 del anticuerpo secundario antl IgG de conejo conjugado a peroxldasa de rábano. Se volvió a lavar la membrana y se reveló mediante qulmioluminiscencla con el kit superslgnal® West Pico Chemiluminescent Substrate, Incubando las soluciones durante 5 minutos y exponiendo la membrana en un equipo de revelado digital C-DIGIt model 3600 (LI-COR) durante 7 minutos para la adquisición de Imágenes.

Detección de IFNg en sobrenadantes de cultivos de L. lactis Para detectar la proteína del sobrenadante del cultivo de L. lactis, el sobrenadante obtenido luego de la centrifugación del cultivo bacteriano, se precipitó con seis volúmenes de acetona y se almacenó a -20 °C toda la noche. Luego, se centrifugó a 6.000 rpm durante 10 min a 4°C, se descartó el sobrenadante y el precipitado fue lavado dos veces con 1 mL de agua bidesti lada, finalmente el pellet se resuspendió en 50 uL de buffer de carga para proteínas. Para la detección de la proteína se utilizó el protocolo de westernblot descrito previamente.

Cuantificación de mRNA para INFg en cultivos de L. lactis. Para correlacionar el nivel de inducción de la proteína con el nivel de RNAs mensajeros de IFNg generados por L. lactis (Figura 4) se replicaron las condiciones de crecimiento e inducción de la bacteria. Luego de haber inducido con nislna durante 2 horas, el cultivo bacteriano se centrifugó a 6000 r.p. m a 4 °C durante 10 minutos, el sobrenadante fue eliminado y la bacteria se liso en 1 mL de Trizol para extraer el RNA total según recomendación del fabricante. Posteriormente, el RNA se trató con DNasal (Promega®) para eliminar trazas de DNA plasmidlal contaminante, y se utilizó como plantilla para cuantlflcar el número de coplas del mRNA que codifica IFNg mediante qRT-PCR. La mezcla de reacción utilizada fue la siguiente: 2 uL de RNA total (100 ng), 5 uL de 2X SensIMix SYBR No-ROX One-Step Kit, 0,5 uL de primer Fw IFNy L. lactis, 0,5 uL de primer Rv IFNy L. lactis (lOmM) (Tabla 2) y 2 uL de agua libre de nucleasas.

Actividad biológica de IFNg producido en L. lactis. Para determinar si la proteína generada es activa biológicamente, se incubaron extractos citoplasmáticos de la bacteria en la línea celular SHK-1 derivada de Salmo salar (Tabla 1) y posteriormente se cuantificaron algunos transcritos Involucrados en la respuesta de IFNg. Brevemente, distintas proporciones entre extractos citoplasmáticos de L. lactis y L. lactis- IFNg fueron mezclados con medio de cultivo L-15 e incubados durante 8 horas a 16°C en células SHK-1 con el fin de determinar la contribución de la proteína recomblnante entre el contenido total de proteínas aportadas por la bacteria. Posteriormente, el RNA total de las células de salmón fue extraído mediante el kit E.Z.N .A Total RNA (OMEGA blo-tek) y tratadas con DNAsa I (Promega®). El RNA tratado se utilizó como plantilla para la síntesis de cDNA con Ollgos (dT) con la siguiente mezcla de reacción : 11 uL de RNA tratado, 0,5 uL de OllgodT (lOmM), 1 uL de dNTPs (lOmM cada uno), 0,5 uL de M-MLV (Promega®), 7 uL de agua libre de nucleasas. El cDNA obtenido fue diluido 1 :2 y utilizado como plantilla para la cuantlflcaclón relativa de los transcritos asociados a la respuesta inmune mediante qPCR con la siguiente mezcla de reacción: 2 uL cDNA, 5 uL de 2X SensIMix SYBR No-ROX Kit, 0,25 uL de Fw (lOmM), 0,25 uL de Rv (lOmM) y 2 uL de agua libre de nucleasas (Tabla 2).

Tabla 1. (Figura 5) Cantidad de proteína total utilizada en cada ensayo para determinar la contribución de IFNg en la respuesta inmune de SHK-1. Se normalizó la cantidad de proteína final a 20ug mezclando los volúmenes de sonicado de L. lactis que expresa IFNg (L.L IFNg) y de L. lactis que no la expresa (L.L vacío). A partir de esta cantidad final se hicieron las concentraciones posteriores de trabajo.

Tabla 2. Secuencia nucleotídica de los primers utilizados para la cuantlflcaclón de genes de respuesta inmune y patógenos evaluados.

Descripción de los Resultados

La pNZ8149-IFNg tiene un marcador de selección tipo grado alimentario ("food grade" ) que permite el metabolismo de lactosa (LacF), contiene un promotor constitutivo pl y un promotor inducible por nisina (PnisA), la señal de secreción natural de L. lactis Usp45, el gen que codifica para IFNg de Salmo salar y un "tag" de histid inas . RepA y RepC son genes que permiten la repllcaclón del plásmido (Figura 1). Al transformar bacterias NZ3900 que presenta una deleclón cromosomal en el ORF de lactosa, la bacteria puede utilizar esta fuente de carbono y mantener el plásmido. El promotor constitutivo Pl permite la expresión de IFNg, esta inducción puede aumentar proporclonalmente con la cantidad de nisina adicionada al medio de cultivo gracias al promotor pNisA (Figura 2). La proteína es fácilmente detectable desde la fracción cltoplasmátlca mediante western blot, sin embargo la cantidad de proteína secretada esta en mucha menor proporción (Figura 3). Este mismo aumento en la cantidad de proteína detectada mediante western blot puede observarse al cuantificar el número de transcritos del mRNA de IFNg mediante qRT-PCR. (Figura 4).

Al utilizar el extracto cltoplasmátlco de la bacteria sonlcada en la línea celular de salmón SHK-1, normalizando la cantidad de proteína total (Tabla 1) es posible detectar la Inducción de transcritos como STAT1, glPlO e IL-lb, sugiriendo que la proteína es funcional in vitro ya que estas dos primeras están Involucrados en la cascada de señalización Iniciada por IFNg y la tercera Involucrada en la respuesta prolnflamatorla natural posterior a IFNg. (Figura 5). Por otro lado, al cuantificar IL-6, una cltoqulna plelotróplca asociada a una Inducción en la respuesta Inmune Innata, aumenta proporclonalmente con la cantidad de proteína recomblnante presente en el cultivo, sugiriendo que IFNg estaría sorpresivamente Induciendo su expresión.

Ejemplo 2: Efectos de la administración de la bacteria L. lactis que produce IFNg Para evaluar el efecto ¡nmunoestlmulador de L. lactis productor de IFNg en un modelo in vivo, se montó un ensayo con ejemplares de trucha arcoírls (gramaje <x> : 20-25 g) donde se evaluó, a través del tiempo, el efecto que tiene el problótlco durante la alimentación y posterior a este como se representa en el esquema de la Figura 6.

La estrategia fue aclimatar a los peces durante 7 días, posteriormente Inicia la alimentación especial con a) L. lactis- IFNg, b) L. lactis con el vector sin Inserto y c) alimentados con alimento comercial durante 7 días. A los días 0 (antes del tratamiento), 2, 4 y 6 de alimentación se realizaron muéstreos de 3 peces por cada tiempo. Luego, se suspende la alimentación especial y todos los peces son alimentados con el pellet comercial. Se analizaron grupos de 3 peces nuevamente a los 1, 3, 5 y 7 días post alimentación con el problótlco. Para día de los muéstreos, durante la alimentación (d .a) y post alimentación (d.p.a) se extrajeron 300 uL de sangre a tres ejemplares, los cuales fueron posteriormente sacrificados para la extracción de bazo y riñón. La sangre se utilizó para cuantificar la actividad enzlmátlca de llsozlma en suero mediante suspensiones de Micrococcus iuteus. El ensayo constó de medir la disminución en la absorbancla a 450 nm desde 180 uL del stock de M. Iuteus Incubado con 20 uL de suero directo, utilizando como control positivo 200-400 unidades de llsozima/mL. Los cálculos de la cantidad de llsozlma en suero se llevaron a cabo con la siguiente fórmula :

(AA min Muestra - AA min Blanco)

un¡dades/ml enzima =

(0.001) (0.02)

Para determinar si existe estimulación de la respuesta Inmune a nivel de transcrito se extrajo el RNA total desde bazo y riñón con TRIZOL siguiendo las recomendaciones del fabricante. A continuación, se cuantificaron las citoquinas: IL-Ib, IL-6, IL-12, TGF-b, IFNy, gamma IP10 y STAT1 mediante cuantificación relativa. El RNA tratado con DNAsa I se utilizó como plantilla para la síntesis de cDNA con Ollgos (dT) con la siguiente mezcla de reacción: 11 uL de RNA tratado, 0,5 uL de OllgodT (lOmM), 1 uL de dNTPs (lOmM cada uno), 0,5 uL de M-MLV (Promega®), 7 uL de agua libre de nucleasas. El cDNA obtenido fue diluido en una proporción 1 :2 y utilizado como plantilla para la cuantificación relativa de los transcritos asociados a la respuesta Inmune mediante qPCR con la siguiente mezcla de reacción : 2 uL cDNA, 5 uL de 2X SensIMIx SYBR No-ROX Kit, 0,25 uL de Fw (lOmM), 0,25 uL de Rv (lOmM) y 2 uL de agua libre de nucleasas (Tabla 2).

Para evaluar si la ¡nmunoestlmulaclón observada es capaz de generar protección contra patógenos de Importancia en la salmonlcultura, se montó un desafío en ejemplares de trucha arcolrls (gramaje <x> : 15-20 g) utilizando F. psychrophilum (lxlO ⁸ bacterlas/pez) como modelo. Los peces fueron aclimatados durante 7 días, posteriormente se Inicia la alimentación especial durante 7 días y 5 días post alimentación se realiza el desafío. Luego se registró la mortalidad durante los siguientes 18 días post Infección para evaluar la respuesta ¡nmunltarla y la carga bacteriana.

En este ensayo se evaluaron los tratamientos: a) Peces alimentados durante 7 días con L. lactis- IFNg (lxlO ⁷ bacterlas/pez) y posteriormente Infectados, b) Peces alimentados durante 7 días con L. lactis que contiene el plásmldo sin Inserto (lxlO ⁷ bacterlas/pez) y posteriormente Infectados y c) Peces alimentados durante 7 días con alimento comercial y posteriormente Infectados. Se registró la mortalidad durante 17 días post Infección donde se extrajo el bazo de peces que se observaron moribundos durante el ensayo y de peces que sobrevivieron hasta el término del ensayo para la cuantlflcaclón de la carga bacteriana

Para definir si mayores dosis o una administración de la dieta más prolongada puede mejorar la sobrevivencia se realizó otro desafío en ejemplares de trucha arcoiris (gramaje <x> : 30-40 g) con F. psychrophilum (lxl O ⁸ bacterias/pez). En este ensayo los peces fueron aclimatados durante 7 días, posteriormente se inicia la alimentación especial durante 7 días y 5 días post alimentación se realiza el desafío. Para esto se evaluaron los tratamientos: a) Peces alimentados durante 7 días con una dosis tres veces más alta de L. lactis- IFNg que la original (3xl0 ⁷ bacterias/pez) y posteriormente infectados, b) Peces alimentados durante 13 días con L. lactis- IFNg (lxlO ⁷ bacterias/pez) y posteriormente infectados, c) Peces alimentados durante 7 días con L. lactis- IFNg (lxlO ⁷ bacterias/pez) y posteriormente infectados y d) Peces alimentados durante 7 días con L. lactis que contiene el plásmido sin inserto (lxlO ⁷ bacterias/pez) y posteriormente infectados y e) Peces alimentados durante 7 días con alimento comercial y posteriormente infectados. Para determinar si la administración del probiótico altera el estado físico de los peces se registró la talla y el peso de los peces sobrevivientes al final del ensayo.

Para evaluar el efecto protector de L. lactis- IFNg en la especie Salmo salar, se utilizó como patógeno modelo la bacteria intracelular Pisiricketssia salmonis (1 x 10 ⁷ bacterias/pez). Los peces se aclimataron durante 7 días y posteriormente se iniciaron los siguientes tratamientos: Peces alimentados durante 7 días con L. lactis- IFNg (1 x 10 ⁷ bacterias/pez) y posteriormente infectados, b) Peces alimentados durante 14 días con L. lactis- IFNg (1 x 10 ⁷ bacterias/pez), c) Peces alimentados durante 7 días con L. lactis que contiene el plásmido sin inserto (1 x 10 ⁷ bacterias/pez) y posteriormente infectados y d) Peces alimentados durante 7 días con alimento comercial y posteriormente infectados. La mortalidad fue registrada durante los siguientes 23 días post infección.

Carga Bacteriana. La carga bacteriana de peces infectados con P. salmonis o F. psycrophillum se realizó mediante qPCR absoluto usando DNA total extraído a partir de los Orga nos inmunológicos del salmónidos Bazo y Riñón. A partir de estos Organos DNA total fue extraído con el Kit Wlzzart Genomlc DNA, promega . El DNA purificado fue cuantlflcado por absorbancla a 260 nm. 50 ng de DNA tota l fueron utilizados para la reacción de qPCR. Para la detección de F. psycrophillum se utilizaron los partidores rpoS- F (5’ GAA GAT GGA GAA GGT AAT TIA GTT GAT 3'), SEQ ID No: 23, y rpoS-R (5' CAA ATA ACA TCT GGT TTT TGT ACA ACT 3'), SEQ ID No: 24, que permiten la ampllflcanclon de un fragmento de 200 pb. Para la detección de P. salmonis si utilizaron los partidores 16SPS- F (5' AGG GAG ACT GGC GGT GAT A 3'), SEQ ID No: 26, y 16SPS-R (5' AGT ACG AGG CGC TTT CTC A3'), SEQ ID No :27. Cada producto de amplificación dio un solo peak de desnaturación Indicando la amplificación de un producto específico. Para cada uno de los ampllcones se construyó una curva de calibración basada en concentraciones creciente del producto PCR previamente clonado en pGEM-T. De esta manera se Infirió el número de bacterias, asumiendo que el número de coplas de cada gen es único dentro del cromosoma de cada una de las bacterias.

Descripción de los Resultados

Para evaluar el efecto in vivo la bacteria transformada se administró junto a la alimentación de ejemplares sanos de trucha arcolrls y se analizaron dura nte y post alimentación. Se ana lizaron dos parámetros desde bazo y riñón : a) los transcritos asociados a la respuesta Inmune de IFNg desde bazo y riñón dura nte la alimentación (Figura 7) y post alimentación con el problótlco (Figura 9 de la A a la E) y b) la actividad enzlmátlca de llsozlma desde suero d ura nte (Figura 8) y post alimentación (Figura 10) con el problótlco. Al observar la Inducción de los transcritos durante la alimentación, se obtiene un aumento de IL-12, STAT1 y gamma IP10, el primero Involucrado en la respuesta celular que genera el aumento de IFNg, y los otros dos asociados a la respuesta rio abajo de IFNg . Al evaluar el efecto del problótlco post alimentación ya no se ve un a umento significativo en los transcritos asociados a IFN tipo II, pero si existe una estimulación de la cltoqulna a ntünflamatorla (TGF-b) y un aumento considerable de IL-6 desde el quinto día post allmentanclón, efecto correlacionado a lo observado en cultivo celular. Cua ndo se cua ntlflca la actividad enzlmátlca de llsozlma no se ve un aumento de este durante la alimentación, sin embargo, existe un fuerte aumento importante desde el quinto dia post alimentación, mismo comportamiento observado para IL-6 mediante qPCR, lo que podría estar proponiendo que esta citoquina estaría involucrada en los niveles de lisozima séricos.

Ya que se obtuvo estimulación de genes involucrados en la respuesta IFN tipo II, se evaluó el efecto protector del probiótico, para esto se montó otro ensayo en ejemplares de trucha arcoíris frente a un desafío con Flavobacterium psychrophillum ("Figura 11). Los peces alimentados con L. lactis- IFNg (Tratamiento a) presentaron una sobrevivencia mayor al 70%, no así los peces alimentados con L. lactis que posee el plásmido sin inserto que sólo alcanzaron un 35% de sobrevivencia (Tratamiento b). Los peces que no recibieron tratamiento con el probiótico fueron los que presentaron menor porcentaje de sobrevivencia (25%), (Tratamiento c). Al comparar la carga bacteriana de los peces que murieron durante el ensayo con los de los peces sobrevivientes se observa que hay una disminución de al menos dos órdenes de magnitud en el número de copias del gen RpoS de la bacteria (Figura 12). Por lo tanto, la proteína heteróloga generada por L. lactis estaría protegiendo a los peces frente a la infección con F. psychrophilum.

Al administrar L. lactis- IFNg durante mayor tiempo (13 días en lugar de 7) se observó un mayor porcentaje de sobrevivencia (54%) que los peces alimentados solo durante 7 días (42%), mismo efecto se observó en los peces alimentados con una dosis tres veces mayor a la original (42%), indicando un mejor efecto al prolongar la alimentación (Figura 13). Los peces alimentados solo con L. lactis (Tratamiento d) presentaron un bajo porcentaje de sobrevivencia (29%) muy cercano el 25% obtenido en los peces alimentados solo con peí let comercial (Tratamiento e), comportamiento ya observado en el ensayo anterior. Este menor porcentaje de protección en el total de los diversos tratamientos podría deberse al mayor gramaje de los peces (<X> : 30-40 g en relación con <x> : 15-20 g), sugiriendo que el probiótico presenta mejores propiedades en estadios más tempranos de trucha arcoiris. Al evaluar el peso o la longitud de los ejemplares sobrevivientes al final del ensayo no se encontraron diferencias significativas (Figura 14), sugiriendo que el probiótico no altera el estado físico del pez. Con el fin de evaluar el potencial del problótlco en ejemplares de Salmo salar desafiados con Pisciricketssia salmonis se observa que los peces alimentados con L. lactis- IFNg durante 7 días (tratamiento a : Sobrevivencia de 28%) presentan un leve aumento en la protección en relación a los peces tratados con el problótlco durante 14 días (tratamiento b: sobrevivencia de 25%) sugiriendo que el efecto protector contra P. salmonis se da al alimentar a los peces durante 7 días y posteriormente se mantiene constante. Por otro lado, los peces alimentados con L. lactis que posee el plásmldo sin Inserto (tratamiento c: sobrevivencia : 0%) mostraron mortalidad total, sin embargo, los peces alimentados con L. lactis que posee el plásmldo sin el Inserto mostraron una disparidad significativa en su mortalidad (tratamiento d : 12% y 50% cada réplica). Por lo tanto, L. lactis- IFNg puede contribuir a la sobrevivencia de los peces frente a Infecciones con P. salmonis. (Figura 15).

Para determinar si L. lactis pNZ8149 sin Inserto genera un efecto en la sobrevivencia de los peces frente a desafíos con P. salmonis se repitió el ensayo con ejemplares de Salmo salar (Gramaje <x> : 50g) Infectados y alimentados con el problótlcos (Figura 16), observando que el comportamiento registrado en los niveles de mortalidad ocasionado fue el mismo que en los peces Infectados sin alimentación especial Indicando que la bacteria per se no genera protección.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> CONSORCIO TECNOLOGICO DE SANIDAD ACUICOLA S.A. (90%) UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE (10%)

<120> BACTERIA LACTOCOCCUS LACTIS TRANSFORMADA, PRODUCTORA DE

INTERFERON GAMMA (IFNG) DE SALMO SALAR, ALIMENTO Y COMPOSICION QUE LA COMPRENDE, PARA INMUNOESTIMULAR ESPECIES ACUICOLAS <130>

<140>

< 141 > <150> CL 201702897

<151> 2017-11-14

<160> 27 < 170 > ASCII Text

<210> 1

<211> 778

<212> ADN

<213> Secuencia Artifical

<220> gen

<223> gen que codifica para proteína inmunoestimulante de Salmo Salar <400> 1

CCATGGTATA GATCTAATTA ATCTATAAAC CATATCCCTC TTTGGAATCA AAATTTATTA 60 TCTACTCCTT TGTAGATATG TTATAATACA AGTATCAATG ATCTGGGAGA CCACAACGGT 120 TTCCCACTAG AAATAATPT GTTTAACTTT AGAAAGGAGA TATACGCATG AAAAAAAAGA 180 TTATCTCAGC TATTTTAATG TCTACAGTGA TACTTTCTGC TGCAGCCCCG TTGTCAGGTG 240 TTTACGCTGC TCAATATACA TCAATTAATA TGAAATCAAA TATTGATAAA CTTAAAGTAC 300 ATTATAAAAT TAGTAAAGAT CAATTGTTTA ATGGAAAACC AGTTTTTCCT AAAGATACAT 360 TTGAAGATTC AGAACGTAGA GTTTGGATGT CTGTTGTATT AGATGTATAT CGTTCAATTT 420 TTAATCAAAT GCTTAATCAA ACAGGTGATC AAGAAGTACG TGAAAGATTA GATCAAGTTA 480 AAGGAAAAGT ACAAGAAACT CAAAAACATT ATTTTCTTAA ACGAATTCCA GAATTGAGAA 540 CACATTTGCA AAATCTTTGG GCTATTGAAA CTAGTAATAC AACTGTTCAA GGAAAAGCAT 600 TGTCAGAATT TATTACTATT TATGAAAAAG CTTCTAAATT AGCACTTAAA ATTCATTTAA 660 AGAAAGATAA TCGACGTAAA AGACGACAAG CACAACGATT GAAAAGTAGT ATTATGGGAG

720

GTGGACATCA TCATCATCAT CATTAAAAAA AAGTCTTAAA ATAATAAAAA TAGTCTAGA 778

<210> 2

<211 > 161

<212> ADN

<213> Partidor

<220> Partidor Pl, L. lactis

<223> Partidor que expresa IFNg

<400> 2

TATAGATCTA ATTAATCTAT AAACCATATC CCTCTTTGGA ATCAAAATTT ATTATCTACT 60

CCTTTGTAGA TATGTTATAA TACAAGTATC AATGATCTGG GAGACCACAA CGGTTTCCCA 120 CTAGAAATAA TTTTGTTTAA CTTTAGAAAG GAGATATACG C

<210> 3

<211 > 81

<212> ADN

<213> precursor proteína secretada

<220> Usp45

<223> ácido nucleico que permite que se secrete IFNg

<400> 3

ATGAAAAAAA AGATTATCTC AGCTATTTTA ATGTCTACAG TGATACTTTC TGCTGCAGCC 60 CCGTTGTCAG GTGTTTACGC T.

<210> 4

<211 > 558

<212> ADN

<213> precursor de proteína

<220> precursor

<223> precursor de IFNg

<400> 4

GCTCAATATA CATCAATTAA TATGAAATCA AATATTGATA AACTTAAAGT 60

ACATTATAAA ATTAGTAAAG ATCAATTGTT TAATGGAAAA CCAGTTTTTC 120 CTAAAGATAC ATTTGAAGAT TCAGAACGTA GAGTTTGGAT GTCTGTTGTA 180

TTAGATGTAT ATCGTTCAAT TTTTAATCAA ATGCTTAATC AAACAGGTGA 240 TCAAGAAGTA CGTGAAAGAT TAGATCAAGT TAAAGGAAAA GTACAAGAAA 300 CTCAAAAACA TTATTTTCTT AAACGAATTC CAGAATTGAG AACACATTTG 360 CAAAATCTTT GGGCTATTGA AACTAGTAAT ACAACTGTTC AAGGAAAAGC 420 ATTGTCAGAA TTTATTACTA TTTATGAAAA AGCTTCTAAA TTAGCACTTA 480 AAATTCATTT AAAGAAAGAT AATCGACGTA AAAGACGACA AGCACAACGA 540

TTGAAAAGTA GTATTATG

<210> 5

<211 >

<212> ADN

<213> ácido nucleico que codifica secuencia de amino ácido

<220> secuencia nucleotida

<223> ácido nucleico que codifica secuencia amino ácido terminal <400> 5

GGAGGTGGAC ATCATCATCA TCAT

<210> 6

<211 > 20

<212> ADN

<213> partidor

<220> FW partidor <223> FW pa rtidor IFNg salmón

<400> 6

CCGTACACCG ATTGAGGACT

<210> 7

<211 > 20

<212> ADN

<213> partidor

<220> RV partidor

<223> RV partidor IFNg salmón

<400> 7

GCGGCATTAC TCCATCCTAA

<210> 8

<211 > 20

<212> ADN

<213> partidor

<220> FW pa rtidor

<223> FW pa rtidor ILl b salmón

<400> 8

CCCCATTGAG ACTAAAGCCA <210> 9

<211> 20

<212> ADN

<213> partidor

<220> RV partidor

<223> RV partidor ILlb salmón

<400> 9

GCAACCTCCT CTAGGTGCAG

<210> 10

<211> 20

<212> ADN

<213> partidor

<220> FW partidor

<223> FW partidor TGF-B salmón

<400> 10

AGCTCTCGGA AGAAACGACA

<210> 11

<211> 20

<212> ADN

<213> partidor <220> RV partidor

<223> RV partidor TGF-B salmón

<400> 11

AGTAGCCAGT GGGTTCATGG

<210> 12

<211 > 22

<212> ADN

<213> partidor

<220> FW pa rtidor

<223> FW pa rtidor gamma IP10 salmón

<400> 12

GTGTCTGAAT CCAGAGGCTC CA

<210> 13

<211 > 22

<212> ADN

<213> partidor

<220> RV partidor

<223> RV partidor ga mma IP10 salmón

<400> 13 TCTCATGGTG CTCTCTGTTC CA

<210> 14

<211 > 23

<212> ADN

<213> partidor

<220> FW pa rtidor

<223> FW pa rtidor IFNg Lactis-IFNg

<400> 14

CACATTTGCA AAATCTTTGG GCT

<210> 15

<211 > 21

<212> ADN

<213> partidor

<220> RV partidor

<223> RV partidor IFNg Lactis-IFNg

<400> 15

CAATCGTTGT GCTTGTCGTC T

<210> 16

<211 > 21 <212> ADN

<213> partidor

<220> FW pa rtidor

<223> FW pa rtidor IL-6 salmón

<400> 16

CCTTGCGGAA CCAACAGTTT G

<210> 17

<211 > 22

<212> ADN

<213> partidor

<220> RV partidor

<223> RV partidor IL-6 salmón

<400> 17

CCTCAGCAAC CTTCATCTGG TC

<210> 18

<211 > 23

<212> ADN

<213> partidor

<220> FW pa rtidor

<223> FW pa rtidor IL-12 salmón <400> 18

TGACGCTTTT TCTCACCGGT TGT

<210> 19

<211 > 22

<212> ADN

<213> partidor

<220> RV partidor

<223> RV partidor IL-12 salmón

<400> 19

ACGCTTTGCA GCATGAGCTT GA

<210> 20

<211> 20

<212> ADN

<213> partidor

<220> FW partidor

<223> FW partidor eFla salmón

<400> 20

GGGTGAGTTT GAGGCTGGTA <210> 21

<211 > 20

<212> ADN

<213> partidor

<220> RV partidor

<223> RV partidor eFla salmón

<400> 21

TTCTGGATCT CCTCAAACCG

<210> 22

<211 > 30

<212> ADN

<213> partidor

<220> FW pa rtidor

<223> FW pa rtidor RpoS F. pyschrophilum

<400> 22

GAAGATGGAG AAGGTAATTT AGTTGATATT

<210> 23

<211 > 30

<212> ADN

<213> partidor <220> RV partidor

<223> RV partidor RpoS F. pyschrophilum

<400> 23

CAAATAACAT CTCCTTTTTC TACAACTTGA

<210> 24

<211 > 24

<212> ADN

<213> partidor

<220> FW partidor

<223> FW partidor STAT1

<400> 24

GACCAGCGAA CCCAAGAACC TGAA

<210> 25

<211 > 23

<212> ADN

<213> partidor

<220> RV partidor

<223> RV partidor STAT1

<400> 25 CACAAAGCCC AGGATGCAAC CAT

<210> 26

<211 > 19

<212> ADN

<213> partidor

<220> FW pa rtidor

<223> FW pa rtidor rDNA 16S P. salmonis

<400> 26

AGGGAGACTG CCGGTGATA

<210> 27

<211 > 19

<212> ADN

<213> partidor

<220> RV partidor

<223> RV partidor rDNA 16S P. sa lmonis

<400> 27

ACTACGAGGC GCTTTCTCA