Transgene Expressionskonstrukte und Verfahren zum Erhöhen des Vitamin E-Gehaltes in pflanzlichen Organismen Beschreibung Die Erfindung betrifft transgene Expressionskonstrukte und Ver- fahren zum Erhöhen des Vitamin E-Gehaltes in pflanzlichen Orga- nismen, bevorzugt in Algen, durch transgene Expression von ORF s110529 aus Synechocystis sp. PCC6803. Die Erfindung betrifft ferner transgene Expressionskonstrukte zur Expression von ORF s110529 in pflanzlichen Organismen, bevorzugt in Algen, transgene pflanzlichen Organismen exprimierend s110529, sowie die Verwen- dung von besagten transgenen pflanzlichen Organismen zur Herstel- lung von Nahrungs-, Futtermitteln, Saatgut, Pharmazeutika oder Feinchemikalien, insbesondere zur Herstellung von Vitamin E Die in der Natur vorkommenden acht Verbindungen mit Vitamin E- Aktivität sind Derivate des 6-Chromanols (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A 27 (1996), VCH Verlagsgesell- schaft, Chapter 4., 478-488, Vitamin E). Die Gruppe der Toco- pherole (la-d) weist eine gesättigte Seitenkette auf, die Gruppe der Tocotrienole (2a-d) eine ungesättigte Seitenkette : la, a-Tocopherol : R1 = R2 = R3 = CH3 lb, ß-Tocopherol [148-03-8] : R1 = R3 = CH3, R2 = H Ic, y-Tocopherol [54-28-4] : Roi = H, R2 = R3 = CH3 ld, 5-Tocopherol [119-13-1] : R1 = R2 = H, R3 = CH3

2a, a-Tocotrienol [1721-51-3] : R1 = R2 = R3 = CH3 2b, ß-Tocotrienol [490-23-3] : R1 = R3 = CH3, R2 = H 2c, y-Tocotrienol [14101-61-2] : R1 = H, R2 = R3 = CH3 2d, 6-Tocotrienol [25612-59-3] : R1 = R2 = H, R3 = CH3 In der vorliegenden Erfindung werden unter Vitamin E alle acht vorstehend erwähnten Tocopherole und Tocotrienole mit Vitamin-E- Aktivität verstanden.

Vitamin E-Verbindungen haben einen hohen wirtschaftlichen Wert als Zusatzstoffe im Food-und Feed-Bereich, in pharmazeutischen Formulierungen und in kosmetischen Anwendungen.

Es gibt Versuche zur Erhöhung des Stoffwechselflusses zur Steigerung des Tocopherol-bzw. Tocotrienolgehaltes in trans- genen Pflanzen durch Überexpression einzelner Tocopherol-Bio- synthesegene (WO 97/27285 ; WO 99/04622 ; WO 99/23231 ; WO 00/10380 ; Shintani und Dellapenna, Science 282 (5396) : 2098-2100,1998 ; Tsegaye et al. Jahrestreffen der American Society of Plant <BR> <BR> Physiologists (24. -28. 07.1999, Baltimore, USA) Abstract No. 413).

Synechocystis sp. PCC 6803 ist ein einzelliges, nicht Stickstoff fixierendes Cyanobakterium, das genetisch gut untersucht ist (Churin et al. (1995) J Bacteriol 177 : 3337-3343), leicht transformiert werden kann (Williams (1988) Methods Enzymol 167 : 766-778) und ein sehr aktives homologes Rekombinations- vermögen aufweist. Der Stamm PCC 6803 wurde 1968 von R. Kunisawa als Aphanocapsa N-1 in Kalifornien, USA, aus Süßwasser isoliert und ist heute über die"Pasteur Culture Collection of Axenic Cyanobacterial Strains" (PCC), Unite de Physiologie Microbienne, Paris, Frankreich, erhältlich. Die genomische Gesamtsequenz von Synechocystis sp. PCC 6803 wurde ab 1995 veröffentlicht (Kaneko et al. (1995) DNA Research 2 : 153-166 ; Kaneko et al. (1995) DNA Research 2 : 191-198 ; Kaneko et al. (1996) DNA Research 3 : 109-136 ; Kaneko et al. (1996) DNA Research 3 : 185-209 ; Kaneko und Tabata (1997) Plant Cell Physiol 38 : 1171-1176 ; Kotani und Tabata (1998) Annu Rev Plant Physiol 49 : 151-171) und ist über das Internet (http ://www. kazusa. or. jp/cyano/cyano. html) unter dem Namen "CyanoBase"veröffentlicht. Effektive Expressionssysteme für Synechocystis 6803 sind in der Literatur beschrieben (Mermet- Bouvier et al. (1993) Curr Microbiol 27 : 323-327 ; Mermet-Bouvier und Chauvat (1993) Curr Microbiol 28 : 145-148 ; Murphy und Stevens (1992) Appl Environ Microbiol 58 : 1650-1655 ; Takeshima et al.

(1994) Proc Natl Acad Sci USA 91 : 9685-9689 ; Xiaoqiang et al.

(1997) Appl Environ Microbiol 63 : 4971-4975 ; Ren et al. (1998) FEMS Microbiol Lett 158 : 127-132).

Trotz einiger Erfolge besteht weiterhin Bedarf an einer Opti- mierung der Vitamin E Biosynthese. Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, weitere Verfahren zur Verfügung zu stellen, die die Vitamin E-Biosynthese steigern und damit zu vorteilhaften trans- genen pflanzlichen Organismen führen.

Diese Aufgabe wird durch die vorliegende Erfindung gelöst. Im Rahmen der Erfindung wurde das Protein kodiert durch ORF s110529 aus Synechocystis sp. PCC 6803 (GenBank Acc. -No. : NP_442804 ; gi : 16332076 ; SEQ ID NO : 2) überraschenderweise als Schlüssel- faktor der Vitamin E-Biosynthese identifiziert (infolge Tocen-3 für"Tocopherol synthesis enhancing protein"-3). Das Protein wurde in der Cyanobase (http : //www. kazusa. or. jp/cyano/) als hypo- thetisches Protein annotiert. Überraschenderweise wurde festge- stellt, dass die transgene Expression dieses Proteins, den Vita- min E Gehalt in pflanzlichen Organismen erhöhen kann.

Ein erster Gegenstand der Erfindung umfasst Verfahren zum Erhöhen des Vitamin E-Gehaltes in pflanzlichen Organismen, durch a) transgene Expression des Tocen-3 Proteins kodiert durch SEQ ID NO : 2 oder eines funktionellen Äquivalentes desselben oder eines funktionell äquivalenten Teils der vorgenannten in dem besagten pflanzlichen Organismus oder einem Gewebe, Organ, Teil oder Zelle des besagten pflanzlichen Organismus, und. b) Auswahl von pflanzlichen Organismen, bei denen-im Unter- schied oder Vergleich zum Ausgangsorganismus-der Vitamin E-Gehalt in dem besagten pflanzlichen Organismus oder einem Gewebe, Organ, Teil oder Zelle des besagten pflanzlichen Organismus erhöht ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann im Prinzip auf alle pflanz- lichen Organismen angewendet werden, bevorzugt auf solche die natürlicherweise Vitamin E produzieren, ganz besonders bevor- zugt auf solche die für industrielle Produktion von natürlichem Vitamin E eingesetzt werden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft transgene Expressionskonstrukte zur Expression einer Nukleinsäuresequenz kodierend für das Tocen-3 Proteins kodiert durch SEQ ID NO : 2 oder eines funktionellen Äquivalentes desselben oder eines funktionell äquivalenten Teils der vorgenannten. Besonders bevorzugt ist die Sequenz gemäß SEQ ID NO : 1 und die aufgrund

der Degeneration des genetischen Codes davon abgeleiteten Sequenzen sowie funktionell äquivalente Teile der vorgenannten.

"Pflanzlicher Organismus oder von diesem abgeleitete Zellen" meint allgemein jede Zelle, Gewebe, Teile oder Vermehrungsgut (wie Samen oder Früchte) eines Organismus, der zur Photosynthese befähigt ist. Eingeschlossen sind im Rahmen der Erfindung alle Gattungen und Arten höherer und niederer Pflanzen des Pflanzen- reiches. Einjährige, mehrjährige, monocotyledone und dicotyledone Pflanzen sind bevorzugt.

"Pflanze"im Rahmen der Erfindung meint alle Gattungen und Arten höherer und niederer Pflanzen des Pflanzenreiches. Ein- geschlossen unter dem Begriff sind die reifen Pflanzen, Saat- gut, Sprossen und Keimlinge, sowie davon abgeleitete Teile, Ver- mehrungsgut (zum Beispiel Knollen, Samen oder Früchte), Pflanze- norgane, Gewebe, Protoplasten, Kallus und andere Kulturen, zum Beispiel Zell-oder Kalluskulturen, sowie alle anderen Arten von Gruppierungen von Pflanzenzellen zu funktionellen oder struktu- rellen Einheiten. Reife Pflanzen meint Pflanzen zu jedem beliebi- gen Entwicklungsstadium jenseits des Keimlings. Keimling meint eine junge, unreife Pflanze in einem frühen Entwicklungsstadium.

"Pflanze"umfasst alle einjährigen und mehrjährige, mono- kotyledonen und dikotyledonen Pflanzen und schließt beispiel- haft jedoch nicht einschränkend solche der Gattungen Cucurbita, Rosa, Vitis, Juglans, Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycopersicon, Nicotiana, Solanum, Petunia, Digitalis, Majorana, Cichorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Heterocallis, Nemesis, Pelar- gonium, Panieum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaalia, Glycine, Pisum, Phaseolus, Lolium, Oryza, Zea, Avena, Hordeum, Secale, Triticum, Sorghum, Picea und Populus ein.

Bevorzugt sind Pflanzen nachfolgender Pflanzenfamilien : Amaranth- aceae, Asteraceae, Brassicaceae, Caryophyllaceae, Chenopodiaceae, Compositae, Cruciferae, Cucurbitaceae, Labiatae, Leguminosae, Papilionoideae, Liliaceae, Linaceae, Malvaceae, Rosaceae, Rubi- aceae, Saxifragaceae, Scrophulariaceae, Solanacea, Sterculiaceae, Tetragoniacea, Theaceae, Umbelliferae.

Bevorzugte monokotyle Pflanzen sind insbesondere ausgewählt aus den monokotylen Kulturpflanzen, wie zum Beispiel der Familie der Gramineae wie Reis, Mais, Weizen oder andere Getreidearten wie

Gerste, Hirse, Roggen, Triticale oder Hafer sowie dem Zuckerrohr sowie alle Arten von Gräsern.

Die Erfindung wird ganz besonders bevorzugt aus dikotyledone pflanzliche Organismen angewendet. Bevorzugte dikotyle Pflanzen sind insbesondere ausgewählt aus den dikotylen Kulturpflanzen, wie zum Beispiel - Asteraceae wie Sonnenblume, Tagetes oder Calendula und andere mehr, - Compositae, besonders die Gattung Lactuca, ganz besonders die Art sativa (Salat) und andere mehr, - Cruciferae, besonders die Gattung Brassica, ganz besonders die Arten napus (Raps), campestris (Rübe), oleracea (z. B. Kohl, Blumenkohl oder Broccoli und weitere Kohlarten) ; und der Goat- tung Arabidopsis, ganz besonders die Art thaliana sowie Kresse oder Canola und andere mehr, - Cucurbitaceae wie Melone, Kürbis oder Zucchini und andere mehr, - Leguminosae besonders die Gattung Glycine, ganz besonders die Art max (Sojabohne) Soja sowie Alfalfa, Erbse, Bohnengewächsen oder Erdnuss und andere mehr - Rubiaceae, bevorzugt der Unterklasse Lamiidae wie beispiels- weise Coffea arabica oder Coffea liberica (Kaffeestrauch) und andere mehr, - Solanaceae besonders die Gattung Lycopersicon, ganz besonders die Art esculentum (Tomate) und die Gattung Solanum, ganz be- sonders die Art tuberosum (Kartoffel) und melongena (Aubergine) und die Gattung Capsicum, ganz besonders die Art annum (Pa- prika), sowie Tabak und andere mehr, - Sterculiaceae, bevorzugt der Unterklasse Dilleniidae wie bei- spielsweise Theobroma cacao (Kakaostrauch) und andere mehr, - Theaceae, bevorzugt der Unterklasse Dilleniidae wie beispiels- weise Camellia sinensis oder Thea sinensis (Teestrauch) und andere mehr, - Umbelliferae, besonders die Gattung Daucus (ganz besonders die Art carota (Karotte)) und Apium (ganz besonders die Art graveolens dulce (Sellerie)) und andere mehr ;

sowie Lein, Soja, Baumwolle, Hanf, Flachs, Gurke, Spinat, Möhre, Zuckerrübe und den verschiedenen Baum-, Nuss-und Weinarten, ins- besondere Banane und Kiwi.

Umfasst sind ferner Schmuckpflanzen, Nutz-oder Zierbäume, Blumen, Schnittblumen, Sträucher oder Rasen. Beispielhaft aber nicht einschränkend seien zu nennen Angiospermen, Bryophyten wie zum Beispiel Hepaticae (Leberblümchen) und Musci (Moose) ; Pteridophyten wie Farne, Schachtelhalm und Lycopoden ; Gymno- spermen wie Koniferen, Cycaden, Ginkgo und Gnetalen, die Familien der Rosaceae wie Rose, Ericaceae wie Rhododendrons und Azaleen, Euphorbiaceae wie Weihnachtssterne und Kroton, Caryophyllaceae wie Nelken, Solanaceae wie Petunien, Gesneriaceae wie das Usambaraveilchen, Balsaminaceae wie das Springkraut, Orchidaceae wie Orchideen, Iridaceae wie Gladiolen, Iris, Freesie und Krokus, Compositae wie Ringelblume, Geraniaceae wie Geranien, Liliaceae wie der Drachenbaum, Moraceae wie Ficus, Araceae wie Philodendron und andere mehr.

Pflanzliche Organismen im Sinne der Erfindung sind weiterhin weitere photosynthetisch aktive befähigte Organismen, wie zum Beispiel Algen, Cyanobakterien sowie Moose. Bevorzugte Algen sind Grünalgen, wie beispielsweise Algen der Gattung Haematococcus, Phaedactylum tricornatum, Volvox oder Dunaliella. Insbesondere bevorzugt ist Synechocystis.

Insbesondere bevorzugt sind pflanzliche Organismen ausgewählt aus der Gruppe der Ölpflanzen bestehend aus Borago officinalis, Bras- sica campestris, Brassica napus, Brassica rapa, Cannabis sativa, Carthamus tinctorius, Cocos nucifera, Crambe abyssinica, Cuphea Arten, Elaeis guineensis, Ekeis oleiferu, Glycine max, Gossypium hirsitum, Gossypium barbadense, Gossypium herbaceum, Helianthus annus, Linum usitatissimum, Oenothera biennis, Ozea europea, Oryza sativa, Ricinus communis, Sesamum indicum, Triticum Arten, Zea maize, Walnuss und Mandel.

Am meisten bevorzugt sind pflanzliche Organismen, die zur Vitamin E-Produktion geeignet sind, wie beispielsweise Raps, Sonnenblume, Sesam, Färberdistel, Ölbaum, Soja, Mais, Weizen oder verschiedene Nussarten wie beispielsweise Walnuss oder Mandel.

"Vitamin E-Gehalt"meint die Summe der Tocopherole und Tocotri- enole in einem pflanzlichen Organismus oder einem Gewebe, Organ, Teil oder Zelle desselben. Dabei umfassen Tocopherole und Toco- trienole bevorzugt die oben beschriebenen 8 Verbindungen a-Toco- pherol, ß-Tocopherol, y-Tocopherol, 6-Tocopherol, a-Tocotrienol, ß-Tocotrieno,'y-Tocotrienol und 8-Tocotrienol. Besonders bevorzugt

ist der Vitamin E-Gehalt im Samen eines pflanzlichen Organismus erhöht.

"Erhöhung"des Vitamin E-Gehaltes meint die Steigerung des Gehaltes an Vitamin E in einem pflanzlichen Organismus oder einem Teil, Gewebe oder Organ derselben, bevorzugt in den Samen- organen desselben. Dabei ist der Vitamin E-Gehalt im Vergleich zu einer nicht dem erfindungsgemäßen Verfahren unterworfenen, aber ansonsten unveränderten Ausgangspflanze unter ansonsten gleichen Rahmenbedingungen um mindestens 5 %, bevorzugt mindestens 10 %, besonders bevorzugt mindestens 15 %, ganz besonders bevorzugt mindestens 20 %, am meisten bevorzugt mindestens 25 % erhöht.

Rahmenbedingungen meint dabei alle für die Keimung, Kultivierung oder Wachstum der Pflanze relevanten Bedingungen wir Boden-, Klima-oder Lichtverhältnisse, Düngung, Bewässerung, Pflanzen- schutzmaßnahmen usw.

Funktionelle Äquivalente meint insbesondere natürliche oder künstliche Mutationen des Tocen-3 Proteins gemäß SEQ ID NO : 2 sowie homologe Polypeptide aus anderen Organismen, bevorzugt aus pflanzlichen Organismen, die die gleichen wesentlichen Eigen- schaften aufweisen.

"Wesentliche Eigenschaften"des Tocen-3 Proteins beschrieben durch SEQ ID NO : 2 meint insbesondere die Eigenschaft, bei trans- gener Expression in einem pflanzlichen Organismus den Vitamin E Gehalt im Vergleich zu einem identischen aber nicht transgenen pflanzlichen Organismus entsprechend oben gegebener Definition zu erhöhen. In einer bevorzugten Ausführungsform gelten als wesent- liche Eigenschaften ferner mindestens eine Eigenschaft ausgewählt aus nachfolgender Gruppe : a) ein rechnerisches Molekulargewicht entsprechend der Polypep- tidsequenz in einem Bereich von ungefähr 50 bis ungefähr 110 kDa, bevorzugt ungefähr 70 bis ungefähr 90 kDa, besonders bevorzugt ungefähr 78 kDa. b) einen theoretischen isoelektrischen Punkt in einem Bereich von ungefähr 4,5 bis ungefähr 6,5, bevorzugt ungefähr 5,0 bis ungefähr 6,0, besonders bevorzugt ungefähr pH 5,4, am meisten bevorzugt ungefähr pH 5,36. c) einen sauren Charakter bevorzugt mit einer Gesamtnettoladung bei neutralem pH in einem Bereich von ungefähr-24 bis unge-

fähr-14, bevorzugt ungefähr-21 bis ungefähr-17, besonders bevorzugt ungefähr-19, am meisten bevorzugt ungefähr-18,9. d) eine Peptidsequenz representativ für ein Protein mit Trans- ketolaseaktivität, wie beispielsweise eine putative Trans- ketolasedomäne der Sequenz GHPGGFASIAEAE oder Sequenzen mit einer Homologie von mindestens 50 %, bevorzugt mindestenz 80 %, besonders bevorzugt mindestens 90 % zu besagter Sequenz. Bevorzugt ist die Sequenz im N-ter- minalen Bereich des funktionellen Äquivalentes enthalten. Im Tocen-3 Protein liegt besagte putative Transketolasedomäne im Bereich von Aminosäure 73 bis Aminosäure 84.

Funktionelle Äquivalente aus anderen Organismen, beispiels- weise aus pflanzlichen Organismen deren genomische Sequenz ganz oder teilweise bekannt ist, wie beispielsweise aus Arabi- dopsis thaliana, Brassica napus, Nicotiana tabacum oder Solanum tuberosum-können z. B. durch Datenbanksuche in Sequenzdaten- banken wie GenBank oder Durchmustern von Gen-oder cDNA-Banken- z. B. unter Verwendung der Sequenz gemäß SEQ ID NO : 1 oder eines teils derselben als Suchsequenz bzw. Sonde-aufgefunden werden.

Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Inversion oder Insertionen eines oder mehrerer Aminosäurereste.

Bevorzugt haben besagte funktionelle Äquivalente eine Homologie von mindestens 40 %, besonders bevorzugt mindestens 60 %, besonders bevorzugt mindestens 80 %, am meisten bevorzugt min- destens 90 % zu dem Protein mit der SEQ ID NO : 2. Dabei erstreckt sich die Homologie über mindestens 30 Aminosäuren, bevorzugt min- destens 60 Aminosäuren besonders bevorzugt mindestens 90 Amino- säuren, am meisten bevorzugt über die gesamt Länge des Tocen-3 Polypeptides gemäß SEQ ID NO : 2.

Unter Homologie zwischen zwei Polypeptiden wird die Identität der Aminosäuresequenz über die jeweilige Sequenzlänge ver- standen, die durch Vergleich mit Hilfe des Programmalgorithmus GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird : Gap Weight : 8 Length Weight : 2 Average Match : 2,912 Average Mismatch : -2, 003

Beispielhaft wird unter einer Sequenz, die eine Homologie von mindestens 80 % auf Proteinbasis mit der Sequenz SEQ ID NO : 2 aufweist, eine Sequenz verstanden, die bei einem Vergleich mit der Sequenz SEQ ID NO : 2 nach obigem Programmalgorithmus mit obigem Parametersatz eine Homologie von mindestens 80 % aufweist.

Funktionelle Äquivalente umfasst auch solche Proteine, die durch Nukleinsäuresequenzen kodiert werden, die eine Homologie von mindestens 40 %, besonders bevorzugt mindestens 60%, besonders bevorzugt mindestens 80 %, am meisten bevorzugt mindestens 90 % zu der Nukleinsäuresequenz mit der SEQ ID NO : 1 haben. Dabei erstreckt sich die Homologie über mindestens 100 Basen, bevorzugt mindestens 200 Basen besonders bevorzugt mindestens 300 Basen, am meisten bevorzugt über die gesamt Länge der Sequenz gemäß SEQ ID NO : 1.

Unter Homologie zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen wird die Identität der beiden Nukleinsäuresequezen über die jeweilige Sequenzlänge verstanden, die durch Vergleich mit Hilfe des Programmalgorithmus GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA ; Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25 : 3389ff) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird : Gap Weight : 50 Length Weight : 3 Average Match : 10 Average Mismatch : 0 Beispielhaft wird unter einer Sequenz, die eine Homologie von mindestens 80 % auf Nukleinsäurebasis mit der Sequenz SEQ ID NO : 1 aufweist, eine Sequenz verstanden, die bei einem Vergleich mit der Sequenz SEQ ID NO : 1 nach obigem Programmalgorithmus mit obigem Parametersatz eine Homologie von mindestens 80 % aufweist.

Funktionelle Äquivalente umfasst auch solche Proteine, die durch Nukleinsäuresequenzen kodiert werden, die unter Standard- bedingungen mit einer der durch SEQ ID NO : 1 beschriebenen Nukleinsäuresequenz, der zu dieser komplementären Nukleinsäure- sequenz oder Teilen der vorgenannten hybridisieren und die wesentlichen Eigenschaften des Proteins beschrieben durch SEQ ID NO : 2 aufweisen.

"Standardhybridisierungsbedingungen"ist breit zu verstehen und meint stringente als auch weniger stringente Hybridisierungs- bedingungen. Solche Hybridisierungsbedingungen sind unter anderem bei Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T et al., in Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2. Auflage, Cold Spring Harbor

Laboratory Press, 1989, Seiten 9.31-9. 57) oder in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3. 1-6.3. 6. beschrieben.

Beispielhaft können die Bedingungen während des Waschschrittes ausgewählt sein aus dem Bereich von Bedingungen begrenzt von solchen mit geringer Stringenz (mit ungefähr 2X SSC bei 50°C) und solchen mit hoher Stringenz (mit ungefähr 0,2X SSC bei 50°C bevor- zugt bei 65°C) (20X SSC : 0,3 M Natriumcitrat, 3 M NaCl, pH 7,0).

Darüberhinaus kann die Temperatur während des Waschschrittes von niedrig stringenten Bedingungen bei Raumtemperatur, ungefähr 22°C, bis zu stärker stringenten Bedingungen bei ungefähr 65°C angehoben werden. Beide Parameter, Salzkonzentration und Temperatur, können gleichzeitig variiert werden, auch kann einer der beiden Para- meter konstant gehalten und nur der andere variiert werden.

Während der Hybridisierung können auch denaturierende Agenzien wie zum Beispiel Formamid oder SDS eingesetzt werden. In Gegen- wart von 50 % Formamid wird die Hybridisierung bevorzugt bei 42°C ausgeführt. Einige beispielhafte Bedingungen für Hybridisierung und Waschschritt sind infolge gegeben : (1) Hybridisierungbedingungen zum Beispiel aus nachfolgenden Bedingungen ausgewählt sein : a) 4X SSC bei 65°C, b) 6X SSC bei 45°C, c) 6X SSC, 100 Ag/ml denaturierter, fragmentierte Fisch- sperma-DNA bei 68°C, f) 50 % Formamid, 4X SSC bei 42°C, h) 2X oder 4X SSC bei 50°C (schwach stringente Bedingung), i) 30 bis 40 % Formamid, 2X oder 4X SSC bei 42°C (schwach stringente Bedingung).

(2) Waschschritte können zum Beispiel aus nachfolgenden Bedingungen ausgewählt sein : a) 0,015 M NaCl/0, 0015 M Natriumcitrat/0,1 % SDS bei 50°C. b) 0,1X SSC bei 65°C. c) 0, 1X SSC, 0,5 % SDS bei 68°C. d) 0, 1X SSC, 0,5 % SDS, 50 % Formamid bei 42°C. e) 0,2X SSC, 0,1 % SDS bei 42°C. f) 2X SSC bei 65°C (schwach stringente Bedingung).

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft transgene Expressionskonstrukte, die eine transgene Expression des Proteins kodiert durch SEQ ID NO : 2 oder eines funktionellen Äquivalentes desselben oder eines funktionell äquivalenten Teils der vor-

genannten in einem pflanzlichen Organismus oder einem Gewebe, Organ, Teil oder Zelle des besagten pflanzlichen Organismus gewährleisten können.

In besagten transgenen Expressionskonstrukten steht ein Nukleinsäuremolekül kodierend für ein Protein beschrieben durch SEQ ID NO : 2 oder eines funktionellen Äquivalentes desselben oder eines funktionell äquivalenten Teils der vorgenannten bevorzugt in funktioneller Verknüpfung mit mindestens einem genetischen Kontrollelement (beispielsweise einem Promotor), das eine transgene Expression in einem pflanzlichen Organismus oder einem Gewebe, Organ, Teil oder Zelle desselben gewährleistet.

Unter einer funktionellen Verknüpfung versteht man zum Bei- spiel die sequentielle Anordnung eines Promotors mit der zu ex- primierenden Nukleinsäuresequenz (zum Beispiel der Sequenz gemäß SEQ ID NO : 1) und ggf. weiterer regulativer Elemente wie zum Bei- spiel einem Terminator derart, dass jedes der regulativen Ele- mente seine Funktion bei der transgenen Expression der Nuklein- säuresequenz erfüllen kann. Dazu ist nicht unbedingt eine direkte Verknüpfung im chemischen Sinne erforderlich. Genetische Kon- trollsequenzen, wie zum Beispiel Enhancer-Sequenzen, können ihre Funktion auch von weiter entfernten Positionen oder gar von ande- ren DNA-Molekülen aus auf die Zielsequenz ausüben. Bevorzugt sind Anordnungen, in denen die transgen zu exprimierende Nukleinsäure- sequenz hinter der als Promoter fungierenden Sequenz positioniert wird, so dass beide Sequenzen kovalent miteinander verbunden sind. Bevorzugt ist dabei der Abstand zwischen der Promotorse- quenz und der transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz ge- ringer als 200 Basenpaare, besonders bevorzugt kleiner als 100 Basenpaare, ganz besonders bevorzugt kleiner als 50 Basenpaare.

Die Herstellung einer funktionellen Verknüpfung als auch die Herstellung eines transgenen Expressionskonstruktes kann mittels gängiger Rekombinations-und Klonierungstechniken realisiert werden, wie sie beispielsweise in Maniatis T, Fritsch EF und Sambrook J (1989) Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY), in Silhavy TJ, Berman ML und Enquist LW (1984) Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY), in Aus- ubel FM et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience und bei Gelvin et al. (1990) In : Plant Molecular Biology Manual beschrieben sind. Zwischen beide Sequenzen können aber auch weitere Sequenzen positioniert werden, die zum Beispiel die Funktion eines Linkers mit bestimmten Restriktionsenzymschnittstellen oder eines Signal- peptides haben. Auch kann die Insertion von Sequenzen zur Expres-

sion von Fusionsproteinen führen. Bevorzugt kann das transgene Expressionskonstrukt, bestehend aus einer Verknüpfung von Promo- ter und zu exprimierender Nukleinsäuresequenz, integriert in einem Vektor vorliegen und durch zum Beispiel Transformation in ein pflanzliches Genom insertiert werden.

Unter einem transgenen Expressionskonstrukt sind aber auch solche Konstruktionen zu verstehen, bei denen die Nukleinsäuresequenz kodierend für das Proteins kodiert durch SEQ ID NO : 2 oder ein funktionelles Äquivalent desselben oder ein funktionell äqui- valentes Teil der vorgenannten-zum Beispiel durch eine homologe Rekombination-so hinter einen endogenen pflanzlichen Promotor platziert wird, dass dieser die transgene Expression der besagten Nukleinsäuresequenz gewährleistet.

Pflanzenspezifische Promotoren meint grundsätzlich jeden Pro- motor, der die Expression von Genen, insbesondere Fremdgenen, in Pflanzen oder Pflanzenteilen,-zellen,-geweben,-kulturen steu- ern kann. Dabei kann die Expression beispielsweise konstitutiv, induzierbar oder entwicklungsabhängig sein.

Bevorzugt sind : a) Konstitutive Promotoren "Konstitutive"Promotoren meint solche Promotoren, die eine Expression in zahlreichen, bevorzugt allen, Geweben über einen größeren Zeitraum der Pflanzenentwicklung, bevorzugt zu allen Zeitpunkten der Pflanzenentwicklung, gewährleisten (Benfey et al. (1989) EMBO J 8 : 2195-2202). Vorzugsweise ver- wendet man insbesondere einen pflanzlichen Promotor oder einen Promotor, der einem Pflanzenvirus entstammt. Insbeson- dere bevorzugt ist der Promotor des 35S-Transkriptes des CaMV Blumenkohlmosaikvirus (Franck et al. (1980) Cell 21 : 285-294 ; Odell et al. (1985) Nature 313 : 810-812 ; Shewmaker et al.

(1985) Virology 140 : 281-288 ; Gardner et al. (1986) Plant Mol Biol 6 : 221- 228) oder der 19S CaMV Promotor (US 5,352, 605 ; WO 84/02913 ; Benfey et al. (1989) EMBO J 8 : 2195-2202). Ein weiterer geeigneter konstitutiver Promotor ist der"Rubisco small subunit (SSU) "-Promotor (US 4,962, 028), der LeguminB- Promotor (GenBank Acc.-Nr. X03677), der Promotor der Nopalin- synthase aus Agrobacterium, der TR-Doppelpromotor, der OCS (Octopin Synthase) Promotor aus Agrobacterium, der Ubiquitin Promotor (Holtorf S et al. (1995) Plant Mol Biol 29 : 637-649), der Ubiquitin 1 Promotor (Christensen et al. (1992) Plant Mol Biol 18 : 675-689 ; Bruce et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86 : 9692-9696), der Smas Promotor, der Cinnamylalkoholdehydro-

genase-Promotor (US 5,683, 439), die Promotoren-der vakuolärer ATPase Untereinheiten oder der Promotor eines prolinreichen Proteins aus Weizen (WO 91/13991), sowie weitere Promotoren von Genen, deren konstitutive Expression in Pflanzen dem Fachmann bekannt ist. b) Gewebespezifische Promotoren Bevorzugt sind ferner Promotoren mit Spezifitäten für die Antheren, Ovarien, Blüten, Blätter, Stengel, Wurzeln und Samen.

Samenspezifische Promotoren wie zum Beispiel der Promotor des Phaseolins (US 5,504, 200 ; Bustos MM et al. (1989) Plant Cell 1 (9) : 839-53), des 2S Albumingens (Joseffson LG et al.

(1987) J Biol Chem 262 : 12196-12201), des Legumins (Shirsat A et al. (1989) Mol Gen Genet 215 (2) : 326-331), des USP (unknown seed protein ; Baumlein H et al. (1991) Mol Gen Genet 225 (3) : 459-67), des Napins (US 5,608, 152 ; Stalberg K et al.

(1996) L Planta 199 : 515-519), des Saccharosebindeproteins (WO 00/26388) oder der Legumin B4-Promotor (LeB4 ; Baumlein H et al. (1991) Mol Gen Genet 225 : 121-128 ; Baumlein H et al.

(1992) Plant J 2 (2) : 233-9 ; Fiedler U et al. (1995) Biotechno- logy (NY) 13 (10) : 1090f), der Oleosin-Promoter aus Arabidopsis (WO 98/45461), der Bce4-Promoter aus Brassica (WO 91/13980).

Weitere geeignete samenspezifische Promotoren sind die der Gene kodierend für das"High Molecular Weight Glutenin" (HMWG), Gliadin, Verzweigungsenzym, ADP Glucose Pyrophos- phatase (AGPase) oder die Stärkesynthase. Bevorzugt sind ferner Promotoren, die eine samenspezifische Expression in Monokotyledonen wie Mais, Gerste, Weizen, Roggen, Reis etc. erlauben. Vorteilhaft eingesetzt werden können der Promoter des lpt2 oder lptl-Gen (WO 95/15389, WO 95/23230) oder die Promotoren beschrieben in WO 99/16890 (Promotoren des Hor- dein-Gens, des Glutelin-Gens, des Oryzin-Gens, des Prolamin- Gens, des Gliadin-Gens, des Glutelin-Gens, des Zein-Gens, des Kasirin-Gens oder des Secalin-Gens). Weitere samenspezifische Promotoren sind beschrieben in WO 89/03887.

Knollen-, Speicherwurzel-oder Wurzel-spezifische Promotoren umfassen beispielsweise den Patatin Promotor Klasse I (B33) oder den Promotor des Cathepsin D Inhibitors aus Kartoffel.

Blattspezifische Promotoren umfassen beispielsweise den Pro- motor der cytosolischen FBPase aus Kartoffel (WO 97/05900), den SSU Promotor (small subunit) der Rubisco (Ribulose-1,5-

bisphosphatcarboxylase) oder den ST-LSI Promotor aus Kartof- fel (Stockhaus et al. (1989) EMBO J 8 : 2445-2451).

Blütenspezifische Promotoren umfassen beispielsweise den Phy- toen Synthase Promotor (WO 92/16635) oder den Promotor des P-rr Gens (WO 98/22593).

Antheren-spezifische Promotoren umfassen beispielsweise den 5126-Promotor (US 5,689, 049, US 5,689, 051), den glob-1 Promo- tor und deny-Zein Promotor. c) Chemisch induzierbare Promotoren Die transgenen Expressionskonstrukte können auch einen chemisch induzierbaren Promotor enthalten (Übersichtsartikel : Gatz et al. (1997) Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48 : 89-108), durch den die Expression des exogenen Gens in der Pflanze zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert werden kann. Derartige Promotoren, wie z. B. der PRP1 Promotor (Ward et al. (1993) Plant Mol Biol 22 : 361-366), ein durch Salicyl- säure induzierbarer Promotor (WO 95/19443), ein durch Benzol- sulfonamid-induzierbarer Promotor (EP 0 388 186), ein durch Tetrazyklin-induzierbarer Promotor (Gatz et al. (1992) Plant J 2 : 397-404), ein durch Abscisinsäure induzierbarer Promotor (EP 0 335 528) bzw. ein durch Ethanol-oder Cyclohexanon- induzierbarer Promotor (WO 93/21334) können ebenfalls ver- wendet werden. d) Stress-oder Pathogen-induzierbare Promotoren Ferner sind Promotoren bevorzugt, die durch biotischen oder abiotischen Stress induziert werden wie beispielsweise der pathogen-induzierbare Promotor des PRP1-Gens (Ward et al.

(1993) Plant Mol Biol 22 : 361-366), der hitzeinduzierbare hsp70-oder hsp80-Promoter aus Tomate (US 5,187, 267), der kälteinduzierare alpha-Amylase Promoter aus der Kartoffel (WO 96/12814), der licht-induzierbare PPDK Promotor oder der verwundungsinduzierte pinII-Promoter (EP-A 375 091).

Pathogen-induzierbare Promotoren umfassen die Promotoren von Genen, die infolge eines Pathogenbefalls induziert werden, wie beispielsweise Gene von PR-Proteinen, SAR-Proteinen, ß-1, 3-Glucanase, Chitinase usw. (beispielsweise Redolfi et al. (1983) Neth J Plant Pathol 89 : 245-254 ; Uknes, et al.

(1992) Plant Cell 4 : 645-656 ; Van Loon (1985) Plant Mol Viral 4 : 111-116 ; Marineau et al. (1987) Plant Mol Biol 9 : 335-342 ; Matton et al. (1987) Molecular Plant-Microbe Interactions

2 : 325-342 ; Somssich et al. (1986) Proc Natl Acad Sci USA 83 : 2427-2430 ; Somssich et al. (1988) Mol Gen Genetics 2 : 93-98 ; Chen et al. (1996) Plant J 10 : 955-966 ; Zhang and Sing (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91 : 2507-2511 ; Warner, et al. (1993) Plant J 3 : 191-201 ; Siebertz et al. (1989) Plant Cell 1 : 961-968).

Umfasst sind auch verwundungs-induzierbare Promotoren wie der des pinII Gens (Ryan (1990) Ann Rev Phytopath 28 : 425-449 ; Duan et al. (1996) Nat Biotech 14 : 494-498), des wunl-und wun2-Gens (US 5,428, 148), des winl-und win2-Gens (Stanford et al. (1989) Mol Gen Genet 215 : 200-208), des Systemin Gens (McGurl et al. (1992) Science 225 : 1570-1573), des WIP1-Gens (Rohmeier et al. (1993) Plant Mol Biol 22 : 783-792 ; Eckelkamp et al. (1993) FEBS Letters 323 : 73-76), des MPI-Gens (Corderok et al. (1994) Plant J 6 (2) : 141-150) und dergleichen. e) Entwicklungsabhängige Promotoren Weitere geeignete Promotoren sind beispielsweise frucht- reifung-spezifische Promotoren, wie beispielsweise der fruchtreifung-spezifische Promotor aus Tomate (WO 94/21794, EP-A 409 625). Entwicklungsabhängige Promotoren schließen zum Teil die gewebespezifische Promotoren mit ein, da die Ausbil- dung einzelner Gewebe naturgemäß entwicklungsabhängig er- folgt.

Besonders bevorzugt sind konstitutive, samenspezifische sowie blattspezifische Promotoren.

Es können ferner weitere Promotoren funktionell mit der zu ex- primierenden Nukleinsäuresequenz verknüpft sein, die eine trans- gene Expression in weiteren Pflanzengeweben oder in anderen Orga- nismen, wie zum Beispiel E. coli Bakterien ermöglichen. Als Pflan- zen Promotoren kommen im Prinzip alle oben beschriebenen Promoto- ren in Frage.

Die in den erfindungsgemäßen transgenen Expressionskonstrukten oder transgenen Expressionsvektoren enthaltenen Nukleinsäure- sequenzen können mit weiteren genetischen Kontrollsequenzen neben einem Promoter funktionell verknüpft sein. Der Begriff der genetischen Kontrollsequenzen ist breit zu verstehen und meint all solche Sequenzen, die einen Einfluss auf das Zustandekommen oder die Funktion eines erfindungsgemäßen transgenen Expressions- konstruktes haben. Genetische Kontrollsequenzen modifizieren zum Beispiel die Transkription und Translation in prokaryotischen oder eukaryotischen Organismen. Vorzugsweise umfassen die erfin- dungsgemäßen transgenen Expressionskonstrukte 5'-stromaufwärts

von der jeweiligen transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz einen pflanzenspezifischen Promoter und 3'-stromabwärts eine Ter- minatorsequenz als zusätzliche genetische Kontrollsequenz, sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente, und zwar je- weils funktionell verknüpft mit der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz.

Genetische Kontrollsequenzen umfassen auch weitere Promotoren, Promotorelemente oder Minimalpromotoren, die die expressions- steuernden Eigenschaften modifizieren können. So kann durch genetische Kontrollsequenzen zum Beispiel die gewebespezifische Expression zusätzlich abhängig von bestimmten Stressfaktoren erfolgen. Entsprechende Elemente sind zum Beispiel für Wasser- stress, Abscisinsäure (Lam E und Chua NH, J Biol Chem 1991 ; 266 (26) : 17131-17135) und Hitzestress (Schoffl F et al. (1989) Mol Gen Genetics 217 (2-3) : 246-53) beschrieben.

Weitere vorteilhafte Kontrollsequenzen sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren amy und SP02, in den Hefe-oder Pilz- promotoren ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH.

Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regu- lationssequenzen wie die oben genannten für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden. Darüberhinaus können auch syntheti- sche Promotoren vorteilhaft verwendet werden.

Genetische Kontrollsequenzen umfassen ferner auch die 5'-untrans- latierte Regionen, Introns oder nichtkodierende 3'-Region von Genen wie beipielsweise das Actin-1 Intron, oder die Adhl-S Introns 1, 2 und 6 (allgemein : The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling and Walbot, Eds., Springer, New York (1994)). Es ist gezeigt worden, dass diese eine signifikante Funktionen bei der Regulation der Genexpression spielen können. So wurde gezeigt, dass 5'-untranslatierte Sequenzen die transiente Expression heterologer Gene verstärken können. Beispielhaft für Translationsverstärker sei die 5'-Leadersequenz aus dem Tabak- Mosaik-Virus zu nennen (Gallie et al. (1987) Nucl Acids Res 15 : 8693-8711) und dergleichen. Sie können ferner die Gewebs- spezifität fördern (Rouster J et al. (1998) Plant J 15 : 435-440).

Das transgene Expressionskonstrukt kann vorteilhafterweise eine oder mehrere sogenannte"enhancer Sequenzen"funktionell ver- knüpft mit dem Promoter enthalten, die eine erhöhte transgene Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3'-Ende der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden, wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die trans-

gen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen können einer oder mehreren Kopien im Genkonstrukt enthalten sein.

Als Kontrollsequenzen geeignete Polyadenylierungssignale sind pflanzliche Polyadenylierungssignale, vorzugsweise solche, die im wesentlichen T-DNA Polyadenylierungssignale aus Agrobacterium tumefaciens. Beispiele für besonders geeignete Terminatorsequen- <BR> <BR> zen sind der OCS (Octopin-Synthase) -Terminator und der NOS (Nopa-<BR> lin-Synthase)-Terminator.

Als Kontrollsequenzen sind weiterhin solche zu verstehen, die eine homologe Rekombination bzw. Insertion in das Genom eines Wirtsorganismus ermöglichen oder die Entfernung aus dem Genom erlauben. Bei der homologen Rekombination kann zum Beispiel die kodierende Sequenz eines bestimmten endogenen Gens gegen die für eine dsRNA kodierende Sequenz gezielt ausgetauscht werden.

Methoden wie die cre/lox-Technologie erlauben eine gewebe- spezifische, unter Umständen induzierbare Entfernung des trans- genen Expressionskonstruktes aus dem Genom des Wirtsorganismus (Sauer B (1998) Methods 14 (4) : 381-92). Hier werden bestimmte flankierende Sequenzen dem Zielgen angefügt (lox-Sequenzen), die später eine Entfernung mittels der cre-Rekombinase ermöglichen.

Ein transgenes Expressionskonstrukt und/oder die von ihm abgelei- teten transgenen Expressionsvektoren können weitere Funktionsele- mente enthalten. Der Begriff Funktionselement ist breit zu ver- stehen und meint all solche Elemente, die einen Einfluss auf Her- stellung, Vermehrung oder Funktion der erfindungsgemäßen transge- nen Expressionskonstrukte, der transgenen Expressionsvektoren oder der transgenen Organismen haben. Beispielhaft aber nicht einschränkend seien zu nennen : a) Selektionsmarker, die eine Resistenz gegen Biozide wie Meta- bolismusinhibitoren (z. B. 2-Desoxyglucose-6-phosphat ; WO 98/45456), Antibiotika (z. B. Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin) oder-bevorzugt-Herbizide (z. B. Phosphinotri- cin) verleihen. Als Selektionsmarker seien beispielhaft ge- nannt : Phosphinothricinacetyltransferasen (bar und pat Gen), welche Glutaminsynthaseinhibitoren inaktivieren, 5-Enolpyru- vylshikimat-3-phosphatsynthasen (EPSP Synthasegene), die eine Resistenz gegen Glyphosat (N- (phosphonomethyl) glycin) ver- leihen, Glyphosats degradierende Enzyme (gox-Genprodukt ; Gly- phosatoxidoreduktase), Dehalogenasen, welche z. B. Dalapon in- aktivieren (deh Genprodukt), Sulfonylurea-und Imidazolinon inaktivierende Acetolactatsynthasen sowie Nitrilasen, welche z. B. Bromoxynil degradieren (bxn Genprodukt), das aasa-Gen- produkt, das eine Resistenz gegen das Antibiotikum Apectino-

mycin verleih, Streptomycinphosphotransferasen-(SPT), die eine Resistenz gegen Streptomycin gewähren, Neomycinphospho- transferasen (NPTII), die eine Resistenz gegen Kanamycin oder Geneticidin verleihen, das Hygromycinphosphotransferasen (HPT), die eine Resistenz gegen Hygromycin vermitteln, das Acetolactatsynthasen (ALS), die eine Resistenz gegen Sulfo- nylharnstoff-Herbizide verleihen (z. B. mutierte ALS-Varianten mit z. B. der S4 und/oder Hra Mutation). b) Reportergene, die für leicht quantifizierbare Proteine kodieren und über Eigenfarbe oder Enzymaktivität eine Bewertung der Transformationseffizienz oder des Expressions- ortes oder-zeitpunktes gewährleisten. Ganz besonders bevor- zugt sind dabei Reporter-Proteine (Schenborn E, Groskreutz D.

Mol Biotechnol. 1999 ; 13 (1) : 29-44) wie das"green fluore- scence protein" (GFP) (Sheen et al. (1995) Plant Journal 8 (5) : 777-784), die Chloramphenicoltransferase, eine Luzi- ferase (Ow et al. (1986) Science 234 : 856-859), das Aequorin- Gen (Prasher et al. (1985) Biochem Biophys Res Commun 126 (3) : 1259-1268), die ß-Galactosidase, ganz besonders bevor- zugt ist die ß-Glucuronidase (Jefferson et al. (1987) EMBO J 6 : 3901-3907). c) Replikationsursprünge, die eine Vermehrung der erfindungs- gemäßen transgenen Expressionskonstrukte oder transgenen Expressionsvektoren in zum Beispiel E. coli gewährleisten.

Beispielhaft seien genannt ORI (origin of DNA replication), der pBR322 ori oder der P15A ori (Sambrook et al. : Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). d) Elemente, die für eine Agrobakterium vermittelte Pflanzen- transformation erforderlich sind, wie zum Beispiel die rechte oder linke Begrenzung der T-DNA oder die vir-Region.

Zusätzlich können besagte transgene Expressionskonstrukte oder transgenen Expressionsvektoren Nukleinsäuresequenzen enthalten, die nicht für das Proteins kodiert durch SEQ ID NO : 2, ein funk- tionelles Äquivalent desselben oder ein funktionell äquivalentes Teil der vorgenannten kodieren, und deren transgene Expression zu einer zusätzlichen Steigerung der Vitamin E-Biosynthese führt (infolge pro-VitE). Diese zusätzlich transgen exprimierte pro- VitE Nukleinsäuresequenz kann-beispielhaft aber nicht ein- schränkend-ausgewählt sein aus Nukleinsäuren kodierend für Homogentisatphytyltransferase, 2-Methyl-6-plastochinonmethyl- transferase, Tocopherolcyclase, y-Tocopherolmethyltransferase, Hydroxyphenylpyruvatdioxygenase, Tyrosinaminotransferase, tyrA,

Geranylgeranylpyrophosphatreduktase. Bei den vorgenannten wird der erwünschte Effekt durch eine Überexpression gewährleistet.

Jedoch kann ein entsprechender Effekt auch durch Expression einer einer pro-VitE Nukleinsäuresequenz erreicht werden, die z. B. als antisense. RNA oder doppelsträngige RNA die Suppression der Ex- pression bestimmter Gene bewirkt. Geeignete Zielgene wären hier - beispielhaft jedoch nicht einschränkend-die Homogentisatdi- oxygenase. Entsprechende Sequenzen sind dem Fachmann bekannt und aus Datenbanken oder entsprechenden cDNA-Banken der jeweiligen Pflanzen leicht zugänglich. Dem Fachmann ist bewusst, dass auch mehrere unterschiedliche der oben genannten zusätzlichen Expressionen von pro-VitE Nukleinsäuresequenzen im Rahmen der Erfindung kombiniert werden können.

Die Einführung eines erfindungsgemäßen transgenen Expressions- konstruktes in einen Organismus oder Zellen, Geweben, Organe, Teile bzw. Samen desselben (bevorzugt in Pflanzen bzw. pflanz- liche Zellen, Gewebe, Organe, Teile oder Samen), kann vorteilhaft unter Verwendung von Vektoren realisiert werden, in denen die transgenen Expressionskonstrukte enthalten sind. Vektoren können beispielhaft Plasmide, Cosmide, Phagen, Viren oder auch Agro- bacterien sein. Das transgene Expressionskonstrukt kann in den Vektor (bevorzugt ein Plasmidvektor) über eine geeignete Restrik- tionsschnittstelle eingeführt werden. Der entstandene transgene Expressionsvektor wird zunächst in E. coli eingeführt. Korrekt transformierte E. coli werden selektioniert, gezüchtet und der kombinante Vektor mit dem Fachmann geläufigen Methoden gewonnen.

Restriktionsanalyse und Sequenzierung können dazu dienen, den Klonierungsschritt zu prüfen. Bevorzugt sind solche Vektoren, die eine stabile Integration des transgenen Expressionskonstruktes in das Wirtsgenom ermöglichen.

Die Herstellung eines transformierten Organismus (bzw. einer transformierten Zelle oder Gewebes) erfordert, dass die ent- sprechende DNA (z. B. der Expressionsvektor), RNA oder Protein in die entsprechende Wirtszelle eingebracht wird. Für diesen Vorgang, der als Transformation (oder Transduktion bzw. Trans- fektion) bezeichnet wird, steht eine Vielzahl von Methoden zur Verfügung (Keown et al. (1990) Methods in Enzymology 185 : 527-537). So kann die DNA oder RNA beispielhaft direkt durch Mikroinjektion oder durch Bombardierung mit DNA-beschichteten Mikropartikeln eingeführt werden. Auch kann die Zelle chemisch, zum Beispiel mit Polyethylenglycol, permeabilisiert werden, so dass die DNA durch Diffusion in die Zelle gelangen kann. Die DNA kann auch durch Protoplastenfusion mit anderen DNA-enthaltenden Einheiten wie Minicells, Zellen, Lysosomen oder Liposomen erfol- gen. Elektroporation ist eine weitere geeignete Methode zur Ein-

führung von DNA, bei der die Zellen reversibel durch einen elek- trischen Impuls permeabilisert werden. Entsprechende Verfahren sind beschrieben (beispielsweise bei Bilang et al. (1991) Gene 100 : 247-250 ; Scheid et al. (1991) Mol Gen Genet 228 : 104-112 ; Guerche et al. (1987) Plant Science 52 : 111-116 ; Neuhause et al.

(1987) Theor Appl Genet 75 : 30-36 ; Klein et al. (1987) Nature 327 : 70-73 ; Howell et al. (1980) Science 208 : 1265 ; Horsch et al.

(1985) Science 227 : 1229-1231 ; DeBlock et al. (1989) Plant Physio- logy 91 : 694-701 ; Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach <BR> <BR> and Weissbach, eds. ) Academic Press Inc. (1988) ; and Methods in Plant Molecular Biology (Schuler and Zielinski, eds.) Academic Press Inc. (1989)).

Bei Pflanzen werden dabei die beschriebenen Methoden zur Trans- formation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder- Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation ge- nutzt. Geeignete Methoden sind vor allem die Protoplastentrans- formation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnahme, das- biolistische Verfahren mit der Genkanone, die sogenannte"parti- cle bombardment"Methode, die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung und die Mikroinjek- tion.

Neben diesen"direkten"Transformationstechniken kann eine Trans- formation auch durch bakterielle Infektion mittels Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes durchgeführt werden.

Die Agrobacterium-vermittelte Transformation ist am besten für dicotyledone Pflanzenzellen geeignet. Die Verfahren sind bei- spielsweise beschrieben bei Horsch RB et al. (1985) Science 225 : 1229f).

Werden Agrobacterien verwendet, so ist das transgene Expressions- konstrukt in spezielle Plasmide zu integrieren, entweder in einen Zwischenvektor (englisch : shuttle or intermediate vector) oder einen binären Vektor. Wird ein Ti oder Ri Plasmid zur Trans- formation verwendet werden soll, ist zumindest die rechte Begren- zung, meistens jedoch die rechte und die linke Begrenzung der Ti oder Ri Plasmid T-DNA als flankierende Region mit dem einzufüh- renden transgenen Expressionskonstrukt verbunden.

Bevorzugt werden binäre Vektoren verwendet. Binäre Vektoren können sowohl in E. coli als auch in Agrobacterium replizieren.

Sie enthalten in der Regel ein Selektionsmarkergen (z. B. nptII) und einen Linker oder Polylinker flankiert von der rechten und linken T-DNA Begrenzungssequenz. Sie können direkt in Agrobacte- rium transformiert werden (Holsters et al. (1978) Mol Gen Genet 163 : 181-187). Außerhalb der T-DNA enthält der Vektor in der Regel

noch ein weiteres Selektionsmarkergen, das eine Selektion trans- formierter Agrobakteria (und/oder E. coli) ermöglicht (z. B. nptIII). Das in diesem Fall als Wirtsorganismus fungierende Agro- bacterium sollte bereits ein Plasmid mit der vir-Region enthal- ten. Diese ist für die Übertragung der T-DNA auf die pflanzliche Zelle erforderlich. Ein so transformiertes Agrobacterium kann zur Transformation pflanzlicher Zellen verwendet werden. Die Verwen- dung von T-DNA zur Transformation pflanzlicher Zellen ist inten- siv untersucht und beschrieben (EP 120 516 ; Hoekema, In : The Bi- nary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B. V., Alblas- serdam, Chapter V ; An et al. (1985) EMBO J 4 : 277-287). Verschie- dene binäre Vektoren sind bekannt und teilweise kommerziell er- hältlich wie zum Beispiel pBI101. 2 oder pBIN19 (Clontech Labora- tories, Inc. USA).

Direkte Transformationstechniken eignen sich für jeden Organis- mus und Zelltyp. Im Falle von Injektion oder Elektroporation von DNA bzw. RNA in pflanzliche Zellen sind keine besonderen Anforde- rungen an das verwendete Plasmid gestellt. Einfache Plasmide wie die der pUC-Reihe können verwendet werden. Sollen vollständige Pflanzen aus den transformierten Zellen regeneriert werden, so ist er erforderlich, das sich auf dem Plasmid ein zusätzliches selektionierbares Markergen befindet.

Stabil transformierte Zellen d. h. solche, die die eingeführte DNA integriert in die DNA der Wirtszelle enthalten, können von untransformierten selektioniert werden, wenn ein selektionier- barer Marker Bestandteil der eingeführten DNA ist. Als Marker kann beispielhaft jedes Gen fungieren, dass eine Resistenz gegen ein Biozid z. B. ein Antibiotikum oder Herbizid (wie Kanamycin, <BR> <BR> G 418, Bleomycin, Hygromycin oder Phosphinotricin etc. ) zu ver-<BR> leihen vermag (s. o. ). Transformierte Zellen, die ein solches Markergen exprimieren, sind in der Lage, in der Gegenwart von Konzentrationen eines entsprechenden Antibiotikums oder Herbizi- des zu überleben, die einen untransformierten Wildtyp abtöten.

Der Selektionsmarker erlaubt die Selektion von transformierten Zellen von untransformierten (McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5 : 81-84). Die erhaltenen Pflanzen können in üblicher Weise gezüchtet und gekreuzt werden. Zwei oder mehr Generationen sollten kultiviert werden, um sicherzustellen, dass die genomi- sche Integration stabil und vererblich ist.

Die oben genannten Verfahren sind beispielsweise beschrieben in Jenes B et al. (1993) Techniques for Gene Transfer, in : Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von SD Kung und R Wu, Academic Press, S. 128-143 sowie in Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42 : 205-225). Vor-

zugsweise wird das zu transgene Expressionskonstrukt in einen Vektor kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium tumefaciens zu transformieren, beispielsweise pBinl9 (Bevan et al. (1984) Nucl Acids Res 12 : 8711f).

Sobald eine transformierte Pflanzenzelle hergestellt wurde, kann eine vollständige Pflanze unter Verwendung von dem Fachmann be- kannten Verfahren erhalten werden. Hierbei geht man beispielhaft von Kalluskulturen aus. Aus diesen noch undifferenzierten Zell- massen kann die Bildung von Spross und Wurzel in bekannter Weise induziert werden. Die erhaltenen Sprösslinge können ausgepflanzt und gezüchtet werden. Dem Fachmann sind Verfahren bekannt, um aus Pflanzenzellen, Pflanzenteile und ganze Pflanzen zu regenerieren.

Beispielsweise werden hierzu Verfahren beschrieben von Fennell et al. (1992) Plant Cell Rep. 11 : 567-570 ; Stoeger et al (1995) Plant Cell Rep. 14 : 273-278 ; Jahne et al. (1994) Theor Appl Genet 89 : 525-533 verwendet.

"Transgen"meint-zum Beispiel bezüglich einer Nukleinsäure- sequenz, einem Expressionskonstrukt oder einem Expressionsvektor enthaltend besagte Nukleinsäuresequenz oder einem Organismus transformiert mit besagter Nukleinsäuresequenz, Expressions- konstrukt oder Expressionsvektor-alle solche durch gentech- nische Methoden zustandegekommene Konstruktionen, in denen sich entweder a) die Nukleinsäuresequenz kodierend für ein Tocen-3 Protein gemäß SEQ ID NO : 2, ein funktionelles Äquivalent desselben oder ein funktionell äquivalentes Teil der vorgenannten, oder b) eine mit besagter Nukleinsäuresequenz unter a) funktionell verknüpfte genetische Kontrollsequenz, zum Beispiel ein Promotor, oder c) (a) und (b) sich nicht in ihrer natürlichen, genetischen Umgebung befinden oder durch gentechnische Methoden modifiziert wurden, wobei die Modifikation beispielhaft eine Substitutionen, Additionen, Deletionen, Inversion oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste sein kann. Natürliche genetische Umgebung meint den natürlichen chromosomalen Locus in dem Herkunftsorganismus oder das Vorliegen in einer genomischen Bibliothek. Im Fall einer genomischen Bibliothek ist die natürliche, genetische Umgebung der Nukleinsäuresequenz bevorzugt zumindest noch teil- weise erhalten. Die Umgebung flankiert die Nukleinsäuresequenz zumindest an einer Seite und hat eine Sequenzlänge von mindestens

50 bp, bevorzugt mindestens 500 bp, besonders bevorzugt min- destens 1000 bp, ganz besonders bevorzugt mindestens 5000 bp.

Eine natürlich vorkommendes Expressionskonstrukt-beispiels- weise die natürlich vorkommende Kombination des Promotors eines Gens kodierend für ein Protein gemäß SEQ ID NO : 2 oder ein funktionelles Äquivalent desselben mit seinen entspre- chenden kodierenden Sequenzen wird zu einem transgenen Expres- sionskonstrukt, wenn diese durch nicht-natürliche, synthetische ("künstliche") Verfahren wie beispielsweise einer Mutagenisierung geändert wird. Entsprechende Verfahren sind beschrieben (US 5,565, 350 ; WO 00/15815 ; siehe auch oben).

"Transgen"meint in Bezug auf eine Expression ("transgene Expression") bevorzugt all solche unter Einsatz eines transgenen Expressionskonstruktes, transgenen Expressionsvektor oder trans- genen Organismus-entsprechend dem oben gegebenen Definitionen- realisierten Expressionen.

Als transgene Organismen bevorzugte Wirts-oder Ausgangsorganis- men sind vor allem pflanzliche Organismen gemäß der oben genann- ten Definition. Eingeschlossen sind im Rahmen der Erfindung alle Gattungen und Arten höherer und niedrigerer Pflanzen des Pflan- zenreiches, insbesondere Pflanzen, die für die Gewinnung von Ölen verwendet werden wie beispielsweise Raps, Sonnenblume, Sesam, Färberdistel, Ölbaum, Soja, Mais, Weizen und Nussarten. Einge- schlossen sind ferner die reifen Pflanzen, Saatgut, Sprossen und Keimlinge, sowie davon abgeleitete Teile, Vermehrungsgut und Kul- turen, zum Beispiel Zellkulturen. Reife Pflanzen meint Pflanzen zu jedem beliebigen Entwicklungsstadium jenseits des Keimlings.

Keimling meint eine junge, unreife Pflanze in einem frühen Ent- wicklungsstadium.

Die Herstellung der transgenen Organismen kann mit den oben beschriebenen Verfahren zur Transformation oder Transfektion von Organismen realisiert werden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen, transgenen Organismen und der von ihnen abgeleitete Zellen, Zellkulturen, Teile-wie zum Beispiel bei transgenen pflanzlichen Organismen Wurzeln, Blätter etc.-, und transgenes Vermehrungsgut wie Saaten oder Früchte, zur Herstellung von Nahrungs-oder Futtermitteln, Pharmazeutika oder Feinchemikalien, insbesondere von Vitamin E oder Vitamin E- Derivaten wie beispielsweise Vitamin E Acetat.

Sequenzen 1. SEQ ID NO : 1 Nukleinsäuresequenz kodierend für das Tocen-3 Protein 2. SEQ ID NO : 2 Proteinsequenz kodierend für das Tocen-3 Protein 3. SEQ ID NO : 3 Oligonukleotidprimer s110529-5 4. SEQ ID NO : 4 Oligonukleotidprimer s110529-3 5. SEQ ID NO : 5 Nukleinsäuresequenz kodierend für das SalI-PacI-ocs-HindIII Sequenzfragment 6. SEQ ID NO : 6 Oligosequenz kodierend für den sense-Strang eines SwaI-Linkers 7. SEQ ID NO : 7 Oligosequenz kodierend für den antisense- Strang eines SwaI-Linkers 8. SEQ ID NO : 8 Nukleinsäuresequenz kodierend für den Expressionsvektor pSUN2-1 9. SEQ ID NO : 9 Nukleinsäuresequenz kodierend für das rbcS- Transitpeptid 10. SEQ ID NO : 10 Nukleinsäuresequenz kodierend für den Expressionsvektor pSUN2-2 11. SEQ ID NO : 11 Oligonukleotidprimer 0529ex1-5 12. SEQ ID NO : 12 Oligonukleotidprimer 0529exl-3 13. SEQ ID NO : 13 Nukleinsäuresequenz kodierend für den Nitrilase-1 Promotor aus A. thaliana 14. SEQ ID NO : 14 Nukleinsäuresequenz kodierend für den transgenen Expressionsvektor pSUN2/NitP/s110529/ocs

15. SEQ ID NO : 15 Nukleinsäuresequenz kodierend für den transgenen Expressionsvektor pSUN2/NitP/rbcS/sl10529/ocs 16. SEQ ID NO : 16 Nukleinsäuresequenz kodierend für den USP- Promotor aus Vicia faba in pUC-Vektor 17. SEQ ID NO : 17 Oligonukleotidprimer s110529ex2-5 18. SEQ ID NO : 18 Oligonukleotidprimer Sl10529ex2-3 19. SEQ ID NO : 19 Nukleinsäuresequenz kodierend für den transgenen Expressionsvektor pSUN2-USP-sl10529-catT 20. SEQ ID NO : 20 Nukleinsäuresequenz kodierend für das rbcS-MCS-OCS-Fragment rbs : rbs-Transitpeptid ; MCS : Multiple Klonierungsstelle ; OCS : Terminationssignal des Octopin-Synthase Gens.

21. SEQ ID NO : 21 Nukleinsäuresequenz kodierend für den transgenen Expressionsvektor pSUN2/USP/rbcS/sl10529/ocs Abbildungen Fig. 1 : Konstruktkarte von pGEM-Teasy/sl10529 "A"repräsentiert das für Tocen-3 kodierende DNA-Fragment (2196 Basenpaare) Fig. 2 : Konstruktkarte von pGEM-Teasy/sl10529 : : tn903 Fragment A' (83 Basenpaare) : 5'-Bereich von Tocen-3, Fragment B (1286 Basenpaare) : Transposon 903 ; Fragment'A (1621 Basenpaare) : 3-Bereich von Tocen-3.

Die Kanamycin-Kasette des tn903 inserierte in pGEM-Teasy/ s110529 derart, dass die Transkription des Kanamycinresi- stenzgens des Tn903 in entgegengesetzter Richtung zur Transkription des offenen Leserasters von Tocen-3 ver- läuft.

Fig. 3 : Tocopherolproduktion in Synechocystis/sl10-529 : : tn903 Zwei unabhängige Tocen-3 Knockout Mutanten (Klon 3 und Klon 5) zeigten im Vergleich zu den Synechocystis spec.

PCC 6803 Wildtypzellen (WT) eine signifikante Vermine- rung in der Tocopherol-und Tocotrienolproduktion. Eine Mutante, deren Mutation in einem anderen Gen des gleichen Operons liegt (s110528 ; Klone 1, 3,4, 8), zeigt keinen Effekt auf die Tocopherolkonzentration, so dass der s110529-vermittelte Effekt als genspezifisch gelten kann.

Fig. 4 : Konstruktkarte von pSUN2/NitP/s110529/ocs (SEQ ID No : 14) Fragment"A" (1894 bp) : Nitrilase-1 Promotor Fragment"B" (2196 Bp) : offenes Leseraster von Tocen-3 Fragment"C" (219 Bp) : Terminationssignal des Octopin- Synthase Gens.

Fig. 5 : Konstruktkarte von pSUN2/NitP/rbcS/sl10529/ocs Fragment"A" (1894 bp) : Nitrilase-1 Promoter Fragment"B" (167 bp) : Fragment kodierend für das rbcS Transitpeptid Fragment"C" (2196 bp) : offenes Leseraster von Tocen-3 Fragment"D" (219 bp) : Terminationssignal des Octopin- Synthase Gens.

Fig. 6 : Konstruktkarte von pSUN2/USP/s110529/3cat Fragment"A" (674 bp) : Promotor des USP Gens aus Vicia faba Fragment"B" (2196 bp) : offenes Leseraster von Tocen-3 Fragment"C" (229 Bp) : Terminationssignal des Cathepsin D Inhibitor Gens.

Fig. 7 : Konstruktkarte von pSUN2/USP/rbcS/sl10529/ocs Fragment"A" (674 bp) : Promotor des USP Gens aus Vicia faba Fragment"B" (174 Bp) : Fragment kodierend für das rbcS Transitpeptiddas Fragment C (2196 bp) : offenes Leseraster von Tocen-3 Fragment D (219 Bp) : Terminationssignal des Octopin- Synthase Gens.

Fig. 8 : Gesamt-Tocopherolgehalt (angegeben in Ag Tocopherol pro Gramm Pflanzenmaterial als Feuchtgewicht (fw) ) in ver- schiedenen transgenen Arabidopsis thaliana Linien im Ver- gleich zum untransformierten"Wildtyp" (Arabidopsis tha- liana Columbia). Die transgene Überexpression resultiert in einem bis zu 40% erhöhtem Tocopherolgehalt.

Beispiele Alle Chemikalien, wenn nicht anders erwähnt, stammen von den Fir- men Fluka (Buchs), Merck (Darmstadt), Roth (Karlsruhe), Serva (Heidelberg) und Sigma (Deisenhofen). Restriktionsenzyme, DNA- modifizierende Enzyme und Molekularbiologie-Kits wurden von den Firmen Amersham-Pharmacia (Freiburg), Biometra (Göttingen), Roche (Mannheim), New England Biolabs (Schwalbach), Novagen (Madison, Wisconsin, USA), Perkin-Elmer (Weiterstadt), Qiagen (Hilden), Stratagen (Amsterdam, Niederlande), Invitrogen (Karlsruhe) und Ambion (Cambridgeshire, United Kingdom). Die verwendeten Rea- genzien wurden entsprechend der Angaben des Herstellers einge- setzt.

Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seite 896-897) erfolgen. Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Klonierungs- schritte wie z. B. Restriktionsspaltungen, Agarosegelelektropho- rese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäu- ren auf Nitrozellulose und Nylonmembranen, Verknüpfen von DNA- Fragmenten, Transformation von E. coli Zellen, Anzucht von Bakte- rien, Vermehrung von Phagen und Sequenzanalyse rekombinanter DNA werden wie bei Sambrook et al. (1989) Cold Spring Harbor Labora- tory Press ; ISBN 0-87969-309-6 beschrieben durchgeführt. Die Sequenzierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgt mit einem Laser- fluoreszenz-DNA-Sequenzierer der Firma ABI nach der Methode von Sanger (Sanger et al. (1977) Proc Natl Acad Sci USA 74 : 5463- 5467).

Beispiel 1 : Allgemeine Verfahren Die Pflanze Arabidopsis thaliana repräsentiert ein Mitglied der höheren Pflanzen (Samenpflanzen). Diese Pflanze ist eng verwandt mit anderen Pflanzenarten aus der Familie der Cruciferen wie z. B. Brassica napus, aber auch mit anderen Pflanzenfamilien der Dikotyledonen. Aufgrund des hohen Grades an Homologie ihrer DNA-Sequenzen bzw. Polypeptidsequenzen kann Arabidopsis thaliana

als Modellpflanze für andere Pflanzenarten eingesetzt werden. a) Anzucht von Arabidopsis Pflanzen Die Pflanzen werden entweder auf Murashige-Skoog Medium mit 0,5 % Saccharose (Ogas et al. (1997) Science 277 : 91-94) oder auf Erde gezogen (Focks & Benning (1998) Plant Physiol 118 : 91-101). Um einheitliche Keimungs-und Blühzeiten zu er- reichen, werden die Samen nach Ausplattieren bzw. Ausstreuen auf Erde zwei Tage bei 4C stratifiziert. Nach der Blüte wer- den die Schoten markiert. Entsprechend der Markierungen wer- den dann Schoten mit einem Alter von 6 bis 20 Tagen nach der Blüte geerntet. b) Anzucht von Synechocystis Die Zellen von Synechocystis sp. PCC 6803 werden in BG11- Medium normalerweise autotroph kultiviert. Sie haben einen Durchmesser von 2,3 bis 2,5 Fm. Bei den hier geschilderten Untersuchungen wurde der Cyanobakterium Synechocystis sp. PCC 6803 Stamm aus der Sammlung von Prof. Dr. Peter Wolk und Prof. Dr. Lee McIntosh (Plant Research Laboratory, Michigan State University, East Lansing, Michigan, USA) eingesetzt.

Dieser ist Glukose-tolerant, d. h. er kann auch heterotroph im Dunkeln, mit nur wenigen Minuten schwacher Blaulicht-Beleuch- tung pro Tag, wachsen. Diese Kulturbedingungen wurden von Anderson und McIntosh (Anderson und McIntosh (1991) J Bacte- riol 173 : 2761-2767) entwickelt und"Light-activated hetero- trophic growth" (LAHG) genannt. Damit ist es möglich, diese Cyanobakterien ohne laufende Photosynthese und damit ohne Produktion von Sauerstoff zu kultivieren.

BG 11 Kulturmedium für Synechocystis Stammlösung 100 x BG11 : NaN03 1,76 M = 149, 58 g MgS04 x 7 H20 30,4 mM = 7, 49 g CaCl2 x 2 H20 24,5 mM = 3, 6 g Zitronensäure 3,12 mM = 0, 6 g Na EDTA pH 8 0,279 mM = 0, 104 g Die abgewogenen Substanzen werden in 900 ml H20 gelöst und mit 100 ml des Trace metal mix stock 1000x auf 1000 ml aufge-

füllt. Diese gewonnene Lösung dient als Stammlösung.

Trace metal mix stock 1000x : H3B03 46, 3 mM = 2,86 g/l MnCl2 x 4 H20 4,15 mM = 1,81 g/1 ZnS04 x 7 H20 0,77mM = 0. 222 g/1 Na2Mo04 x 2 H2O 1, 61 mM = 0,39 g/1 CuSO4 x 5 HsO 0,32 mM = 0,079 g/1 Co (N03) 2 x 6 H20 0,17 mM = 0,0494 g/1 Für 1 Liter BG11 Kulturlösung werden folgende Lösungen benö- tigt : 1. 10 ml der Stammlösung 100 x BG 11 2. 1 ml Na2C03 (189 mM) 3.5 ml TES (1 M, pH 8) 4. 1 ml K2P04 (175 mM) Während Lösung 2. und 3. steril filtriert werden sollten, muß Lösung 4 autoklaviert werden. Die gesamte BG11 Kulturlösung muß vor Gebrauch autoklaviert und anschließend mit 1 ml Ei- sen-Ammonium-Citrat (6 mg/ml), das zuvor steril filtriert wurde, versetzt werden. Das Eisen-Ammonium-Citrat sollte auf keinen Fall autoklaviert werden. Für Agarplatten werden 1,5 % (w/v) Bactoagar pro Liter BG11 Medium zugesetzt.

Beispiel 2 : Amplifikation und Klonierung von Tocen-3 aus Synecho- cystis spec. PCC 6803 Die DNA kodierend für Tocen-3 wurde mittels"Polymerase Chain Reaction" (PCR) aus Synechocystis spec. PCC 6803 gemäß der Methode nach Crispin A. Howitt (Howitt CA (1996) BioTechniques 21 : 32-34) unter Verwendung eines sense spezifischen Primers (s110529-5'; SEQ ID NO : 3) und eines antisense spezifischen Pri- mers (s110529-3' ; SEQ ID NO : 4) amplifiziert.

Primer s110529-5' : 5'-GGATCCATGACCGTCGCCTCCACC-3' (SEQ ID NO : 3) Primer s110529-3' : 5'-GTCGACCTAGGGCAACAATGCCTTGG-3' (SEQ ID NO : 4)

Die PCR erfolgte in einem 50 Al Reaktionsansatz in-dem enthalten war : 5 Fl einer Synechocystis spec. PCC 6803 Zellsuspension 0,2 mM dATP, dTTP, dGTP, dCTP 1,5 mM Mg (OAc) 2 5 Rg Rinderserum-Albumin 40 pmol Oligonukleotidprimer s110529-5' 40 pmol Oligonukleotidprimer s110529-3' 15 gel 3,3X rTth DNA Polymerase XL Puffer (PE Applied Biosystems) 5U rTth DNA Polymerase XL (PE Applied Biosystems) Die PCR wurde unter folgenden Zyklus-Bedingungen durchgeführt : Schritt 1 : 5 Minuten 94°C (Denaturierung) Schritt 2 : 3 Sekunden 94°C Schritt 3 : 1 Minute 52°C (Annealing) Schritt 4 : 2 Minuten 72°C (Elongation) 35 Wiederholungen der Schritte 2 bis 4 Schritt 5 : 10 Minuten 72°C (Post-Elongation) Schritt 6 : 4°C (Warteschleife) Das Amplifikat (2208 Basenpaare) wurde unter Verwendung von Stan- dardmethoden in den PCR Klonierungsvektor pGEM-Teasy (Promega) kloniert. Das Konstrukt hat die Bezeichnung pGEM-Teasy/sl10529.

Die Identität des erzeugten Amplikons wurde durch Sequenzierung unter Verwendung des T3-und des T7-Primers bestätigt (vgl. SEQ ID NO : 1). Fig. 1 stellt pGEM-Teasy/sl10529 dar, wobei"A"das für Tocen-3 kodierende DNA-Fragment (2196 Basenpaare) represen- tiert.

Beispiel 2 : Erzeugung einer Tocen-3 Knock out Mutante Ein DNA Konstrukt zur Erzeugung einer Deletionsmutante von Tocen-3 in Synechocystis spec. PCC 6803 wurde unter Anwendung von Standardklonierungstechniken erzeugt. Der Vektor pGEM-Teasy/ s110529 wurde unter Verwendung des Restriktionsenzyms MscI ver- daut, wobei ein internes 498 Basenpaar-Fragment deletiert wird.

In diese mit stumpfen Enden vorliegende MscI-Schnittstelle des offenen Leseratsers von Tocen-3 wurde die Aminoglycosid-3'Phosp- hotransferase des Transposons Tn903 kloniert. Dazu wurde das Tn903 als EcoRI Fragment aus dem Vektor pUC4K (Vieira J und Mes-

sing J (1982) Gene 19 : 259-268) isoliert, die überstehenden Enden des Restriktionsverdaus nach Standardmethoden in glatte Enden überführt und in den MscI geschnittenen Vektor pGEM-Teasy/sl10529 ligiert. Der Ligationsansatz wurde zur Transformation von E. coli Xll Blue Zellen verwendet. Transformanden wurden durch Verwendung von Kanamycin und Ampicillin selektioniert. Ein rekombinantes Plasmid (pGEM-Teasy/sl10529 : : tn903 ; siehe Fig. 2) wurde isoliert und zur Transformation von Synechocystis spec. PCC 6803 gemäß der Methode nach Williams (Williams (1987) Methods Enzymol 167 : 776-778) eingesetzt.

Die Kanamycin-Kassette des tn903 inserierte in pGEM-Teasy/ s110529 derart, dass die Transkription des Kanamycinresistenzgens des Tn903 in entgegengesetzter Richtung zur Transkription des offenen Leseratsers von Tocen-3 verläuft.

In Fig. 2 beinhaltet Fragment A' (83 Basenpaare) den 5-Bereich von Tocen-3, Fragment B das Transposon 903 (1286 Basenpaare) und Fragment'A (1621 Basenpaare) den 3-Bereich von Tocen-3.

Synechocystis spec. PCC 6803 Transformanden wurden auf Kanamycin haltigem (km) BG-11 Festmedium (Castenholz (1988) Methods in En- zymology Seite 68-93) bei 28°C und 30 Mmol Photonen* (m2*s) ~1 se- lektioniert. Zwei unabhängige Knockout Mutanten konnten nach fünf Selektionsrunden (Passagen von Einzelkolonien auf frisches BG-llkm Medium) erzeugt werden. Der vollständige Verlust des To- cen-3 Endogens bzw. der Austausch gegen die rekombinante To- cen-3 : : tn903 DNA wurde durch PCR Analysen bestätigt.

Beispiel 3 : Tocopherolproduktion in Synechocystis spec. PCC 6803 Wildtypzellen und den Tocen-3 Knockout Mutanten Die auf den BG-llkm Agarmedium kultivierten Zellen von jeweils zwei unabhängigen Synechocystis spec. PCC 6803 Tocen-3 Knockout Mutanten sowie untransformierte Wildtypzellen (auf BG11 Agarme- dium ohne Kanamycin) wurden zum Animpfen von Flüssigkulturen ver- wendet. Dazu wurden Zellen der Mutante bzw. des Wildtyps Synecho- cystis spec. PCC 6803 von Platte in jeweils 10 ml Flüssigkultur überführt. Diese Kulturen wurden bei 28°C und 30 gmol Photo- nen* (m2*s)-1 (30 RE) für ca. 3 Tage kultiviert. Nach Bestimmung der OD730 der einzelnen Kulturen, wurde die OD730 aller Kulturen durch entsprechende Verdünnungen mit BG-11 (Wildtypen) bzw.

BG-llkm (Mutanten) synchronisiert. Diese auf Zelldichte synchro- nisierten Kulturen wurden zum Animpfen von drei Kulturen der Mu- tante bzw. der Wildtypkontrolle verwendet. Die biochemischen Ana- lysen konnten somit unter Verwendung von jeweils drei unabhängig

gewachsenen Kulturen einer Mutante und der entsprechenden Wildty- pen durchgeführt werden. Die Kulturen wurden bis zu einer opti- schen Dichte von OD730=0, 3 angezogen.

Das Medium der Zellkultur wurde durch zweimalige Zentrifugation bei 14000 rpm in einer Eppendorf Tischzentrifuge entfernt. Der daran anschließende Aufschluß der Zellen und Extraktion der Toco- pherole und Tocotrienole erfolgte durch zweimalige Inkubation im Eppendorfschüttler bei 30°C, 1000rpm in 100% Methanol für 15 Minu- ten, wobei die jeweils erhaltenen Überstände vereinigt wurden.

Weitere Inkubationsschritte ergaben keine weitere Freisetzung von Tocopherolen oder Tocotrienolen.

Um Oxidation zu vermeiden, wurden die erhaltenen Extrakte direkt nach der Extraktion mit Hilfe einer Waters Allience 2690 HPLC-An- lage analysiert. Tocopherole und Tocotrienole wurden über eine Reverse Phase Säule (ProntoSil 200-3-C30, Bischoff) mit einer mo- bilen Phase von 100% Methanol getrennt und anhand von Standards (Merck) identifiziert. Als Detektionssystem diente die Fluores- zenz der Substanzen (Anregung 295 nm, Emmision 320 nm), die mit Hilfe eines Jasco Fluoreszensdetektors FP 920 nachgewiesen wurde.

Die Tocen-3 Knockout Mutanten zeigten überraschenderweise im Ver- gleich zu den Synechocystis spec. PCC 6803 Wildtypzellen eine Re- duktion der Tocopherol-und Tocotrienolproduktion (Fig. 3).

Beispiel 4 : Manipulation der Tocopherol-Biosynthese in Nicotiana tabacum Samsun NN, Arabidopsis thaliana und Brassica napus durch transgene Expression von Tocen-3 Es werden transgene Pflanzen erzeugt, die Tocen-3 zum einen unter Kontrolle des konstitutiven Promoters des Nitrilase-1 (nitl) Gens aus A. thaliana (GenBank Acc. -No. : Y07648.2, Nukleotide 2456-4340, Hillebrand et al. (1996) Gene 170 : 197-200) und zum an- deren unter Kontrolle des samenspezifischen Promotors des USP (unknown seed protein) Gens aus Vicia faba (Bäumlein et. al.

(1991) Mol Gen Genet 225 : 459-467) exprimieren. Darüber hinaus wird Tocen-3 als Fusionsprotein mit dem Transitpeptid des rbcS- Proteins (Guerineau et al. (1988) Nucl Acid Res 16 : 11380) sowohl konstitutiv als auch samenspezifisch exprimiert. Als Expressions- vektor dienen Derivate des pSUN-Vektors (WO 02/00900).

Für die konstitutive Expression wurde der Vektor pSUN2 unter An- wendung von Standardmethoden so verändert, dass der ocs-Termina- tor (Gielen et al. (1984) EMBO J 3 : 835-846) als SalI-PacI-ocs- HindIII Fragment (Sequenz ID No : 5) eingebracht wird. Durch Ein-

führung eines Linkers wird zusätzlich eine SwaI Schnittstelle in den Polylinker eingeführt (SEQ ID No : 6 and SEQ ID No : 7). Das resultierende Plasmid wird mit pSUN2-1 bezeichnet (Sequenz ID NO : 8).

Für die Expression als Fusionsprotein mit dem rbcS-Transitpeptid wird das DNA-Fragment kodierend für das rbcS-Transitpeptid als SacI-SwaI-Fragment amplifiziert (Sequenz ID No : 9) und in den pSUN2-1 eingeführt. Der Vektor wird als pSUN2-2 bezeichnet (Sequenz ID NO : 10).

Zur Expression von Tocen-3 unter konstitutiver Kontrolle wird der ORF als SwaI-PacI-Fragment unter Verwendung von Standardmethoden mit Hilfe der Primer 0529ex1-5 und 0529ex1-3 (SEQ ID No. 11 und SEQ ID No. 12) amplifiziert. Das entstehende 2212 bp-Fragment wird in den pCR4Blunt-TOPO (Invitrogen) nach Angaben des Herstel- lers kloniert und mit Hilfe des T3-und T7-Primers sequenziert.

Ein korrekter Klon wird mit SwaI und PacI geschnitten und unter Anwendung von Standardmethoden in einen mit SwaI und PacI ge- schnittenen pSUN2-1 ligiert. In das resultierende Konstrukt, das mit Ec1136II geschnitten wird, wird der Nitrilase-Promoter als XhoI-Fragment (SEQ ID No : 13), dessen überhängende Enden mit Kle- now-Polymerase nach Standardmethoden aufgefüllt werden, kloniert.

Dieses Plasmid wird mit pSUN2/NitP/s110529/ocs bezeichnet (SEQ ID No : 14) und zur Erzeugung transgener Pflanzen verwendet (vgl.

Fig. 4).

Zur Konstruktion eines Plasmides, das Tocen-3 als Fusionsprotein mit dem Transitpeptid des rbcS-Proteins unter Kontrolle des kon- stitutiven Promoters NitP exprimiert, wird pSUN2-2 mit SwaI und PacI geschnitten. Der so geschnittene Vektor wird mit dem Tocen-3 Fragment ligiert, das nach Verdau mit SwaI und PacI aus pCR4Blunt-TOPO/sl10529 isoliert wird. In das resultierende Plas- mid, das mit Ec1136II geschnitten wird, wird der Nitrilase-Promo- ter (SEQ ID NO : 13) als XhoI-Fragment, dessen überhängende Enden mit Klenow-Polymerase nach Standardmethoden aufgefüllt werden, ligiert. Diese Klonierung erlaubt die Expression eines Fusion- sproteins, das das Transitpeptid des rbcS-Proteins und Tocen-3 enthält (vgl. Fig. 5, SEQ ID No. 15).

Zur Erzeugung eines Plasmides, welches die samenspezifische Ex- pression von Tocen-3 in Pflanzen ermöglicht, wird der samenspezi- fiche Promotor des USP Gens aus Vici faba verwendet, der als

EcoRI-NcoI-Fragment in einem pUC-Derivat vorliegt (SEQ ID NO : 16).

Für die Klonierung unter Kontrolle des USP-Promoters wird das of- fene Leseraster von Tocen-3 unter Verwendung von Standard-PCR-Me- thoden so amplifiziert, dass am 5'-Ende eine BbsI-Schnitstelle und am 3'-Ende eine EcoRV-Schnittstelle generiert werden. Dazu werden nachfolgende Oligonukleotidprimer verwendet : sll0529ex2-5 : CCGAAGACTTCATGACCGTCGCCTCCACCGC (SEQ ID NO : 17) und S110529ex2-3' : CCGATATCCTAGGGCAACAATGCCTTGG (SEQ ID No : 18) Das Amplifikat wird in pCR4Blunt-TOPO kloniert und sequenziert.

Das PCR-Produkt wird als BbsI-EcoRV-Fragment in den mit NcoI (überhängende Enden kompatibel mit 5-Überhang des PCR-Produktes) und EcoRV geschnittenen Vektor ligiert. Das Expressionskonstrukt wird als PmeI-PauI-Fragment in den mit EcoRV geschnittenen pSUN2 ligiert. Das resultierende Plasmid heisst pSun2-USP-sl10529-catT (vgl. Fig. 6, SEQ ID NO : 19).

Für die Konstruktion eines Plasmides, das die samenspezifische Expression als Fusionsprotein mit dem rbcS Transitpeptid erlaubt, wird das rbcS-Fragment zusammen mit dem ocs-Terminator als NcoI- HindIII-Fragment (SEQ ID No : 20) aus pSUN2-2 amplifiziert und in das pUC-Derivat kloniert, der den USP Promoter enthält. Promoter, rbcS und ocs werden als EcoRI-HindIII-Fragment in den mit EcoRI und HindIII geschnittenen pSUN2 kloniert. In diesen Expressions- vektor wird Tocen-3 als SwaI-PacI-Fragment kloniert. Das resul- tierende Plasmid heisst pSUN2/USP/rbcS/sl10529/ocs (Fig. 7, SEQ ID No : 21).

Beispiel 5 : Herstellung transgener A. thaliana Pflanzen Wildtyp A. thaliana Pflanzen (Columbia) werden mit dem Agrabacte- rium tumefaciens Stamm (EHA105) auf Grundlage einer modifizierten Methode (Steve Clough und Andrew Bent (1998) Plant J 16 (6) : 735- 743) der Vacuum Infiltrationsmethode nach Bechtold et al. (Bech- told N et al. (1993) CRAcad Sci Paris 1144 (2) : 204-212) transfor- miert.

Die verwendeten A. tumefaciens Zellen werden im Vorfeld mit den Plasmiden pSUN2/NitP/s110529/ocs (SEQ ID NO : 14), pSUN2/NitP/ rbcS/sl10529/ocs (SEQ ID NO : 15), pSUN2/USP/sl10529/catT (SEQ ID

NO : 19) bzw. pSUN2/USP/rbcS/sl10529/ocs (SEQ ID NO : 21) transfor- miert.

Samen der Agrobacterium-transformierten Primärtransformanden wer- den auf Grundlage der Antibiotikaresistenz selektioniert. Anti- biotika resistente Keimlinge werden in Erde gepflanzt und als vollentwickelte Pflanzen zur biochemischen Analyse verwendet.

Beispiel 6 : Herstellung transgener Brassica napus Pflanzen Die Herstellung transgener Raps Pflanzen orientiert sich an einem Protokoll von Bade JB und Damm B (in Gene Transfer to Plants, Potrykus, I. und Spangenberg, G., eds, Springer Lab Manual, Springer Verlag, 1995,30-38), in welchem auch die Zusammenset- zung der verwendeten Medien und Puffer angegeben ist.

Die Transformationen erfolgen mit den Agrobacterium tumefaciens Stämmen EHA105 bzw. GV3101. Zur Transformation werden die Plas- mide pSUN2/NitP/s110529/ocs (SEQ ID NO : 14), pSUN2/NitP/rbcS/ s110529/ocs (SEQ ID NO : 15), pSUN2/USP/sl10529/catT (SEQ ID NO : 19) bzw. pSUN2/USP/rbcS/sl10529/ocs (SEQ ID NO : 21) verwendet.

Samen von Brassica napus var. Westar werden mit 70% Ethanol (v/v) oberflächensteril gemacht, 10 Minuten bei 55 ? C in Wasser gewa- schen, in 1% iger Hypochlorit-Lösung (25% v/v Teepol, 0, 1% v/v Tween 20) für 20 Minuten inkubiert und sechsmal mit sterilem Was- ser für jeweils 20 Minuten gewaschen. Die Samen werden drei Tage auf Filterpapier getrocknet und 10-15 Samen in einem Glaskolben mit 15 ml Keimungsmedium zur Keimung gebracht. Von mehreren Keim- lingen (ca. 10 cm groß) werden die Wurzeln und Apices entfernt und die verbleibenden Hypokotyle in ca. 6 mm lange Stücke ge- schnitten. Die so gewonnenen ca. 600 Explantate werden 30 Minuten mit 50 ml Basalmedium gewaschen und in einem 300 ml Kolben über- führt. Nach Zugabe von 100 ml Kallusinduktionsmedium wurden die Kulturen für 24 Stunden bei 100 U/min inkubiert.

Vom den einzelnen mit den Plasmiden pSUN2/NitP/s110529/ocs (SEQ ID NO : 14), pSUN2/NitP/rbcS/sl10529/ocs (SEQ ID NO : 15), pSUN2/USP/sl10529/catT (SEQ ID NO : 19) bzw. pSUN2/USP/rbcS/ s110529/ocs (SEQ ID NO : 21) transformierten Agrobacterien Stämmen wird jeweils eine Übernachtkultur bei 29°C in Luria Broth-Medium mit Kanamycin (20mg/l) angesetzt, davon 2 ml in 50 ml Luria Broth-Medium ohne Kanamycin für 4 Stunden bei 29°C bis zu einer OD600 von 0,4-0, 5 inkubiert. Nach der Pelletierung der Kultur bei 2000 U/min für 25 min wird das Zellpellet in 25 ml Basalmedium resuspendiert. Die Konzentration der Bakterien in der Lösung wird

durch Zugabe von weiterem Basalmedium auf eine OD6oo-von 0,3 ein- gestellt.

Aus den Raps-Explanten wird das Kallus-Induktionsmedium mit ste- rilen Pipetten entfernt, 50 ml Agrobacterium-Lösung hinzugefügt, vorsichtig gemischt und für 20 min inkubiert. Die Agrobacterien- Suspension wird entfernt, die Raps-Explante für 1 min mit 50 ml Kallus-Induktionsmedium gewaschen und anschließend 100 ml Kallus- Induktionsmedium hinzugefügt. Die Co-Kultivierung wird für 24 h auf einem Rotiationsschüttler bei 100 U/min durchgeführt. Die Co-Kultivierung wird durch Wegnahme des Kallus-Induktionsmediums gestoppt und die Explante zweimal für jeweils 1 min mit 25 ml und zweimal für 60 min mit jeweils 100 ml Waschmedium bei 100 U/min gewaschen. Das Waschmedium mit den Explanten wird in 15 cm Petri- schalen überführt und das Medium mit sterilen Pipetten entfernt.

Zur Regeneration werden jeweils 20 bis 30 Explante in 90 mm Petrischalen überführt, welche 25 ml Sproß-Induktionsmedium mit Kanamycin enthalten. Die Petrischalen werden mit 2 Lagen Leukopor verschlossen und bei 25°C und 2000 lux bei Photoperioden von 16 Stunden Licht/8 Stunden Dunkelheit inkubiert. Alle 12 Tage wer- den die sich entwickelnden Kalli auf frische Petrischalen mit Sproß-Induktionsmedium überführt. Alle weiteren Schritte zur Regeneration ganzer Pflanzen werden wie von Bade JB und Damm B (in Gene Transfer to Plants, Potrykus, I. und Spangenberg, G., eds, Springer Lab Manual, Springer Verlag, 1995,30-38) beschrie- ben durchgeführt.

Beispiel 7 : Herstellung transgener Nicotiana tabacum Pflanzen 10 ml YEB-Medium mit Antibiotikum (5 g/1 Rinder-Extrakt, 1 g/1 Hefe-Extrakt, 5 g/1 Pepton, 5 g/1 Saccharose und 2 mM MgS04.) wer- den mit einer Kolonie der einzelnen mit den Plasmiden pSUN2/NitP/ s110529/ocs (SEQ ID NO : 14), pSUN2/NitP/rbcS/sl10529/ocs (SEQ ID NO : 15), pSUN2/USP/sl10529/catT (SEQ ID NO : 19) bzw. pSUN2/USP/ rbcS/sl10529/ocs (SEQ ID NO : 21) transformierten Agrobacterium tumefaciens Stämme beimpft und über Nacht bei 28°C kultiviert. Die Zellen werden 20 min bei 4°C, 3500 U/min in einer Tischzentrifuge pelletiert und danach in frischem YEB-Medium ohne Antibiotika un- ter sterilen Bedingungen resuspendiert. Die Zellsuspension wird für die Transformation eingesetzt.

Die Wildtyp-Pflanzen aus Sterilkultur werden durch vegetative Replikation erhalten. Dazu wird nur die Spitze der Pflanze abge- schnitten und auf frisches 2MS-Medium in ein steriles Einweckglas überführt. Vom Rest der Pflanze werden die Haare auf der Blatt-

oberseite und die Mittelrippen der Blätter entfernt. Die Blätter werden mit einer Rasierklinge in etwa 1 cm2 große Stücke geschnit- ten. Die Agrobakterienkultur wird in eine kleine Petrischale überführt (Durchmesser 2 cm). Die Blattstücke werden kurz durch diese Lösung gezogen und mit der Blattunterseite auf 2MS-Medium in Petrischalen (Durchmesser 9 cm) gelegt, so daß sie das Medium berührten. Nach zwei Tagen im Dunkeln bei 25°C werden die Explan- tate auf Platten mit Kallusinduktionsmedium überführt und in der Klimakammer auf 28°C temperiert. Das Medium muß alle 7 bis 10 Tage gewechselt werden. Sobald sich Kalli bildeten, werden die Explan- tate in sterile Einweckgläser auf Sproßinduktionsmedium mit Cla- foran (0, 6% BiTec-Agar (g/v), 2,0 mg/1 Zeatinribose, 0,02 mg/1 Naphtylessigsäure, 0,02 mg/1 Gibberelinsäure, 0,25 g/ml Claforan, 1, 6% Glukose (g/v) und 50 mg/1 Kanamycin) überführt. Nach etwa einem Monat tritt Organogenese ein und die gebildeten Sprosse können abgeschnitten werden. Die Kultivierung der Sprosse wird auf 2MS-Medium mit Claforan und Selektionsmarker durchgeführt.

Sobald sich ein kräftiger Wurzelballen gebildet hat, können die Pflanzen in Pikiererde getopft werden.

Beispiel 8 : Charakterisierung der transgenen Pflanzen Um zu bestätigen, dass durch die Expression von Tocen-3 die Vita- min E Biosynthese in den transgenen Pflanzen beeinflußt wird, werden die Tocopherol-und Tocotrienol-Gehalte in Blätter und Samen der mit den beschriebenen Konstrukten transformierten Pflanzen (Arabidopsis. thaliana, Brassica napus und Nicotiana tabacum) analysiert. Dazu werden die transgenen Pflanzen im Gewächshaus kultiviert und Pflanzen, die das Gen kodierend für Tocen-3 exprimieren, auf Northern-Ebene identifiziert. In Blät- tern und Samen dieser Pflanzen wird der Tocopherolgehalt und der Tocotrienolgehalt ermittelt. In der Mehrzwahl der Transformanten ist die Tocopherol-bzw. Tocotrienol-Konzentration im Vergleich zu nicht transformierten Pflanzen erhöht. Die transgene Über- expression von Tocen-3 resultiert in einem bis zu 40 % erhöhten Gesamt-Tocopherolgehalt (vgl. Fig. 8).