MOURAS ARMAND (FR)
ARAYA ALEJANDRO (FR)
MOURAS ARMAND (FR)
| WO1990008828A2 | 1990-08-09 |
| EP0412911A1 | 1991-02-13 | |||
| EP0329308A2 | 1989-08-23 |
HERNOULD, M., ET AL.: "Male-sterility induction in transgenic tobacco plants with an unedited atp9 mitochondrial gene from wheat", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF USA, vol. 90, March 1993 (1993-03-01), WASHINGTON US, pages 2370 - 2374
SCHMÜLLING, T., ET AL.: "Restorage of genetically engineered male sterility by antisense mRNA", J. CELL. BIOCHEM. SUPPL., vol. 14E, 1990, pages 357
CONNETT, M.B., ET AL.: "Plant transformation as a test of the relationship between cytoplasmic male sterility, respiratory phenotype, and the PCF gene", J. CELL. BIOCHEM. SUPPL., vol. 13D, 1989, pages 299
| 1. | 1") Planteε tranεgéniqueε, poεεédant danε leurs noyaux, une séquence hybride exprimable (transgène) , comprenant au moins une région codante d'un gène mitochondrial non édité de végétaux supérieurs ' et une séquence susceptible de transférer la protéine expri¬ mée par ladite région codante, vers la mitochondrie, lesquelleε planteε εont caractérisées en ce que : les régions codantes deε gèneε mitochon driaux non éditéε εont choiεiε parmi leε gèneε codant pour une protéine du complexe ATP εynthaεe choiεiε parmi le fragment de gène de 1ΑTP9 de blé, de formule I εui vante : ATG TTA GAA GGT GCT AAA TCA ATA GGT GCC GGA GCT GCT ACA ATT GCT TTA GCC GGA GCT GCT GTC GGT ATT GGA AAC GTC CTC AGT TCT TTG ATT CAT TCC GTG GCG CGA AAT CCA TCA TTG GCT AAA CAA TCA TTT GGT TAT GCC ATT TTG GGC TTT GCT CTC ACC GAA GCT ATT GCA TTG TTT GCC CCA ATG ATG GCC TTT CTG ATC TCA TTC GTT TTC CGA TCG CAT AAA AAG TCA TGA ou le gène de 1ΑTP6, ou parmi leε gèneε codant pour une protéine de la chaîne reεpiratoire choiεiε parmi leε gène deε εouεunitéε 1 à 7 de la NAD déεhydrogénaεe, le gène de 1 'apocytochrome b et leε gènes des εouεunitéε I, II ou III de la cytochromeoxydaεe et la εéquence εuεceptible de tranεférer ladite protéine exprimée verε la mitochondrie eεt sélectionnée danε le groupe conεtitué par leε fragmentε codant pour la tryptophanyl ARNt εynthétaεe de levure, la εouεunité β de l'ATPaεe de Nicotiana piumbaginifolia , et le tranεlocateur ATP/ADP de mais ou un fragment Ecorl/Kpnl de 303 paireε de baεes incluant les codons 1 à 62 de la souεunité IV de la cytochrome oxydase de levure, laquelle' séquence hybride est apte à modifier la ferti¬ lité mâle deε planteε ayant incorporé ledit tranεgène, tout en ne modifiant paε ieε autreε caractériεtiqueε phé notypiqueε deεditeε planteε . 2') Planteε transgéniques selon la revendica¬ tion 1, caractériséeε en ce que ladite εéquence d'acide nucléique hybride comprend la région du gène codant pour la forme non éditée de 1ΑTP9 de blé, de formule εuivante : ATG TTA GAA GGT GCT AAA TCA ATA GGT GCC GGA GCT GCT ACA ATT GCT TTA GCC GGA GCT GCT GTC GGT ATT GGA AAC GTC CTC AGT TCT TTG ATT CAT TCC GTG GCG CGA AAT CCA TCA TTG GCT AAA CAA TCA TTT GGT TAT GCC ATT TTG GGC TTT GCT CTC ACC GAA GCT ATT GCA TTG TTT GCC CCA ATG ATG GCC TTT CTG ATC TCA TTC GTT TTC CGA TCG CAT AAA AAG TCA TGA, à laquelle eεt associée en tant que séquence de trans¬ fert, les codons 1 à 62 de la préséquence de la sous unité IV de la cytochromeoxydase (cox IV) de levure (SEQ. ID n" 1) . 3 ' ) Plantes transgéniqueε selon la revendica¬ tion 1 ou la revendication 2, caractérisées en ce que ladite séquence d'acide nucléique hybride comprend le fragment de région codant pour la forme non éditée de 1ΑTP6 de blé, de formule suivante : ATG GAT AAT TTT ATC CAG AAT CTG CCT GGT GCC TAC CCG GAA ACC CCA TTG GAT CAA TTT GCC ATT ATC CCA ATA ATT GAT CTT CAT GTG GGC AAC TTT TAT TTA TCA TTT ACA AAT GAA GTC TTG TAT ATG CTG CTC ACT GTC GTT TTG GTC GTT TTT CTT TTT TTT GTT GTT ACG AAA AAG GGA GGT GGA AAG TCA GTG CCA AAT GCA TGG CAA TCC TTG GTC GAG CTT ATT TAT GAT TTC GTG CTG AAC CTG GTA AAC GAA CAA ATA GGT GGT CTT TCC GGA AAT GTG AAA CAA AAG TTT TTC CCT CGC ATC TCG GTC ACT TTT ACT TTT TCG TTA TTT CGT AAT CCC CAG GGT ATG ATA CCC TTT AGC TTC ACA GTG ACA AGT CAT TTT CTC ATT ACT TTG GCT CTT TCA TTT TCC ATT TTT ATA GGC ATT ACG ATC GTT GGA TTT CAA AGA CAT GGG CTT CAT TTT TTT AGC TTC TTA TTA CCT GCG GGA GTC CCA CTG CCG TTA GCA CCT TTC TTA GTA CTC CTT GAG CTA ATC TCT TAT TGT TTT CGT GCA TTA AGC TTA GGA ATA CGT TTA TTT GCT AAT ATG ATG GCC GGT CAT AGT TTA GTA AAG ATT TTA AGT GGG TTT GCT TGG ACT ATG CTA TTT CTG AAT AAT ATT TTC TAT TTC ATA GGA GAT CTT GGT CCC TTA TTT ATA GTT CTA GCA TTA ACC GGT CTG GAA TTA GGT GTA GCT ATA TCA CAA GCT CAT GTT TCT ACG ATC TCA ATT TGT ATT TAC TTG AAT GAT GCT ACA AAT CTC CAT CAA AAT GAG TCA TTT CAT AAT TGA, à laquelle est associée en tant que séquence de trans¬ fert, les codons 1 à 62 de la préséquence de la souε unité IV de la cytochromeoxydaεe (cox IV) de levure (SEQ. ID n' 3) . 4') Planteε tranεgéniqueε selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisées en ce que ladite séquence d'acide nucléique hybride comprend le fragment de région codant pour la forme non éditée de cox II de formule εuivante : ATG ATT CTT CGT TCA TTA TCA TGT CGA TTC TTC ACA ATC GCT CTT TGT GAT GCT GCG GAA CCA TGG CAA TTA GGA TCT CAA GAC GCA GCA ACA CCT ATG ATG CAA GGA ATC ATT GAC TTA CAT CAC GAT ATC TTT TTC TTC CTC ATT CTT ATT TTG GTT TTC GTA TCA CGG ATG TTG GTT CGC GCT TTA TGG CAT TTC AAC GAG CAA ACT AAT CCA ATC CCA CAA AGG ATT GTT CAT GGA ACT ACT ATG GAA ATT ATT CGG ACC ATA TTT CCA AGT GTC ATT CTT TTG TTC ATT GCT ATA CCA TCG TTT GCT CTG TTA TAC TCA ATG GAC GGG GTA TTA GTA GAT CCA GCC ATT ACT ATC AAA GCT ATT GGA CAT CAA TGG TAT CGG ACT TAT GAG TAT TCG GAC TAT AAC AGT TCC GAT GAA CAG TCA CTC ACT TTT GAC AGT TAT ACG ATT CCA GAA GAT GAT CCA GAA TTG GGT CAA TCA CGT TTA TTA GAA GTT GAC AAT AGA GTG GTT GTA CCA GCC AAA ACT CAT CTA CGT ATG ATT GTA ACA CCC GCT GAT GTA CCT CAT AGT TGG GCT GTA CCT TCC TCA GGT GTC AAA TGT GAT GCT GTA CCT GGT CGT TCA AAT CTT ACC TTC ATC TCG GTA CAA CGA GAA GGA GTT TAC TAT GGT CAG TGC AGT GAG ATT CGT GGA ACT AAT CAT GCC TTT ACG CCT ATC GTC GTA GAA GCA GTG ACT TTG AAA GAT TAT GCG GAT TGG GTA TCC AAT CAA TTA ATC CTC CAA ACC AAC TAA, à laquelle eεt aεεociée en tant que εéquence de tranε fert, leε codons 1 à 62 de la préεéquence de la εous unité IV de la cytochromeoxydaεe (cox IV) de levure (SEQ. ID n* 5) . 5") Plante tranεgénique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que la plante ayant incorporé ledit transgène eεt du tabac. 6*) Plante tranεgénique εelon l'une quelconque deε revendicationε 1 à 5, caractérisée en ce que la plante ayant incorporé ledit transgène est notamment choisie parmi : le colza, le tournesol, le soja, la tomate, la pomme de terre, le melon, la carotte, le piment, l'endive, le trèfle, le lupin, le haricot, le pois, le mais, le blé, le seigle, l'avoine, l'orge, le riz, le millet, leε agrumeε, le coton. 7*) Séquence d'acide nucléique hybride, com¬ prenant au moins la région codante d'un gène mitochon¬ drial non édité de végétaux supérieurε, à laquelle est asεociée une εéquence susceptible de transférer la pro¬ téine exprimée par ladite région codante, vers la mito¬ chondrie, caractérisée en ce que : les régions codanteε deε gèneε mitochon¬ driaux non édités sont choisis parmi leε gènes codant pour une protéine du complexe ATP synthaεe choiεiε parmi le fragment de gène de 1 'ATP9 de blé ,de formule I εui vante : ATG TTA GAA GGT GCT AAA TCA ATA GGT GCC GGA GCT GCT ACA ATT GCT TTA GCC GGA GCT GCT GTC GGT ATT GGA AAC GTC CTC AGT TCT TTG ATT CAT TCC GTG GCG CGA AAT CCA TCA TTG GCT AAA CAA TCA TTT GGT TAT GCC ATT TTG GGC TTT GCT CTC ACC GAA GCT ATT GCA TTG TTT GCC CCA ATG ATG GCC TTT CTG ATC TCA TTC GTT TTC CGA TCG CAT AAA AAG TCA TGA ou le gène de 1ΑTP6, ou parmi leε gèneε codant pour une protéine de la chaîne respiratoire, choiεiε parmi les gènes des souεunités 1 à 7 de la NAD déshydrogénase, de 1 'apocytochrome b et des sousunités I, II ou III de la cytochromeoxydase, et la séquence nucléique susceptible de tranε férer ladite protéine exprimée verε la mitochondrie eεt sélectionnée danε le groupe conεtitué par deε fragmentε codant pour la tryptophanyl ARNt εynthétaεe de levure, la εouεunité β de l'ATPaεe de Nicotiana plu baginifolia , le tranεlocateur ATP/ADP de maiε et un fragment Ecorl/Kpnl de 303 paires de bases incluant les codons 1 à 62 de la εouεunité IV de la cytochrome oxydase de levure, laquelle séquence hybride est apte à modifier la ferti¬ lité mâle deε plantes l'ayant incorporée. 8*) Séquence d'acide nucléique hybride selon la revendication 7, caractérisée en ce qu'elle comprend la région du gène codant pour la forme non éditée de 1 'ATP9 de blé, de formule suivante : ATG TTA GAA GGT GCT AAA TCA ATA GGT GCC GGA GCT GCT ACA ATT GCT TTA GCC GGA GCT GCT GTC GGT ATT GGA AAC GTC CTC AGT TCT TTG ATT CAT TCC GTG GCG CGA AAT CCA TCA TTG GCT AAA CAA TCA TTT GGT TAT GCC ATT TTG GGC TTT GCT CTC ACC GAA GCT ATT GCA TTG TTT GCC CCA ATG ATG GCC TTT CTG ATC TCA TTC GTT TTC CGA TCG CAT AAA AAG TCA TGA, à laquelle est asεociée en tant que séquence de transfert, leε codonε 1 à 62 de la préεéquence de la sousunité IV de la cytochromeoxydase (cox IV) de levure (SEQ. ID n* 1) . 9') Séquence d'acide nucléique hybride selon la revendication 7, caractérisée en ce qu'elle comprend le fragment de région codant pour la forme non éditée de 1 'ATP6 de blé, de formule suivante : ATG GAT AAT TTT ATC CAG AAT CTG CCT GGT GCC TAC CCG GAA ACC CCA TTG GAT CAA TTT GCC ATT ATC CCA ATA ATT GAT CTT CAT GTG GGC AAC TTT TAT TTA TCA TTT ACA AAT GAA GTC TTG TAT ATG CTG CTC ACT GTC GTT TTG GTC GTT TTT CTT TTT TTT GTT GTT ACG AAA AAG GGA GGT GGA AAG TCA GTG CCA AAT GCA TGG CAA TCC TTG GTC GAG CTT ATT TAT GAT TTC GTG CTG AAC CTG GTA AAC GAA CAA ATA GGT ,GGT CTT TCC GGA AAT GTG AAA CAA AAG TTT TTC CCT CGC ATC TCG GTC ACT TTT ACT TTT TCG TTA TTT CGT AAT CCC CAG GGT ATG ATA CCC TTT AGC TTC ACA GTG ACA AGT CAT TTT CTC ATT ACT TTG GCT CTT TCA TTT TCC ATT TTT ATA GGC ATT ACG ATC GTT GGA TTT CAA AGA CAT GGG CTT CAT TTT TTT AGC TTC TTA TTA CCT GCG GGA GTC CCA CTG CCG TTA GCA CCT TTC TTA GTA CTC CTT GAG CTA ATC TCT TAT TGT TTT CGT GCA TTA AGC TTA GGA ATA CGT TTA TTT GCT AAT ATG ATG GCC GGT CAT AGT TTA GTA AAG ATT TTA AGT GGG TTT GCT TGG ACT ATG CTA TTT CTG AAT AAT ATT TTC TAT TTC ATA GGA GAT CTT GGT CCC TTA TTT ATA GTT CTA GCA TTA ACC GGT CTG GAA TTA GGT GTA GCT ATA TCA CAA GCT CAT GTT TCT ACG ATC TCA ATT TGT ATT TAC TTG AAT GAT GCT ACA AAT CTC CAT CAA AAT GAG TCA TTT CAT AAT TGA, à laquelle est associée en tant que séquence de trans¬ fert, les codonε 1 à 62 de la préεéquence de la sous unité IV de la cytochromeoxydase (cox IV) de levure (SEQ. ID n* 3) . 10') Séquence d'acide nucléique hybride selon la revendication 7, caractérisée en ce qu'elle comprend le fragment de région codant pour la forme non éditée de cox II de formule suivante : ATG ATT CTT CGT TCA TTA TCA TGT CGA TTC TTC ACA ATC GCT CTT TGT GAT GCT GCG GAA CCA TGG CAA TTA GGA TCT CAA GAC GCA GCA ACA CCT ATG ATG CAA GGA ATC ATT GAC TTA CAT CAC GAT ATC TTT TTC TTC CTC ATT CTT ATT TTG GTT TTC GTA TCA CGG ATG TTG GTT CGC GCT TTA TGG CAT TTC AAC GAG CAA ACT AAT CCA ATC CCA CAA AGG ATT GTT CAT GGA ACT ACT ATG GAA ATT ATT CGG ACC ATA TTT CCA AGT GTC ATT CTT TTG TTC ATT GCT ATA CCA TCG TTT GCT CTG TTA TAC TCA ATG GAC GGG GTA TTA GTA GAT CCA GCC ATT ACT ATC AAA GCT ATT GGA CAT CAA TGG TAT CGG ACT TAT GAG TAT TCG GAC TAT AAC AGT TCC GAT GAA CAG TCA CTC ACT TTT GAC AGT TAT ACG ATT CCA GAA GAT GAT CCA GAA TTG GGT CAA TCA CGT TTA TTA GAA GTT GAC AAT AGA GTG GTT GTA CCA GCC AAA ACT CAT CTA CGT ATG ATT GTA ACA CCC GCT GAT GTA CCT CAT AGT TGG GCT GTA CCT TCC TCA GGT GTC AAA TGT GAT GCT GTA CCT GGT CGT TCA AAT CTT ACC TTC ATC TCG GTA CAA CGA GAA GGA GTT TAC TAT GGT CAG TGC AGT GAG ATT CGT GGA ACT AAT CAT GCC TTT ACG CCT ATC GTC GTA GAA GCA GTG ACT TTG AAA GAT TAT GCG GAT TGG GTA TCC AAT CAA TTA ATC CTC CAA ACC AAC TAA, à laquelle est asεociée en tant que εéquence de trans¬ fert, les codonε 1 à 62 de la préεéquence de la εouε unité IV de la cytochromeoxydaεe (cox IV) de levure (SEQ. ID n' 5) . 11") Plaεmide, caractérisé en ce qu'il inclut une séquence d'acide nucléique hybride selon l'une quel¬ conque des revendications 7 à 10, asεociée à un promoteur choisi parmi les promoteurs s 'exprimant constitutivement et les promoteurε ε'exprimant au niveau deε anthèreε et à un terminateur convenable. 12") Plaεmide εelon la revendication 11, ca¬ ractérisé en ce que ladite séquence est sous le contrôle du promoteur 35S et du terminateur du gène VI du CaMV. 13") Plasmide selon la revendication 11 ou la revendication 12, caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins un gène marqueur. 14") Procédé de production de planteε tranε géniques selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il comprend, pour la transformation du végétal supérieur εélectionné, l'introduction d'au moinε une copie de la εéquence nucléique hybride εelon l'une quelconque deε revendicationε 7 à 10, danε une plante réceptrice, à l'aide d'un plasmide contenant la¬ dite εéquence, εelon l'une quelconque deε revendicationε 11 à 13. 15") Procédé selon la revendication 14, carac¬ térisé en ce que ladite tranεformation est obtenue par l'une quelconque des méthodes suivantes : transformation de protoplaεteε, agrotranεformation, microinjection, bio listique. 16") Procédé d'inhibition de la production de pollen, chez les végétaux supérieurε, caractérisé en ce qu ' il comprend les étapeε εuivanteε : (a) inεertion d'une séquence d'acide nucléique hybride, selon l'une quelconque de revendications 7 à 10, chez les végétaux sélectionnéε, par tout moyen appro prié ; (b) régénération et culture des végétaux transgéniqueε obtenuε en (a) ; et (c) meεure de la production et de la viabilité du pollen (teεt de germination, notamment) . 17") Procédé de reεtauration de planteε mâle fertiles, à partir de plantes tranεgéniques mâlestérile, selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caracté¬ risé en ce qu'il comprend les étapeε suivantes : (1) transformation du végétal supérieur sélec¬ tionné par l'introduction d'au moins une copie de la sé¬ quence nucléique hybride selon l'une quelconque des re¬ vendications 7 à 10, dans une plante réceptrice, à l'aide d'un plasmide contenant ladite séquence, pour l'obtention de plantes transgéniques mâlestériles (PTMS) ; (2) transformation du même végétal supérieur qu'en (1), par l'introduction d'au moins une copie d'une séquence nucléique hybride antisenε, incluant au moins la même région codante de gène mitochondrial non édité de végétaux que celle incluse dans lesdites planteε tranε géniqueε mâlestérile obtenues en (1) , dans une plante réceptrice, à l'aide d'un plasmide contenant ladite sé¬ quence, pour l'obtention de plantes transgéniques mâle fertiles (PTMF) ; (3) croisement deε planteε tranεgéniques mâle εtérileε obtenues en (1) et des plantes mâlefertiles ob tenueε en (2), pour l'obtention d'hybrideε. 18") Planteε transgéniques, caractérisées en ce qu'elles comprennent dans leurs noyaux une εéquence d'acide nucléique hybride dite antiεens, c'estàdire incluant au moins la même région codante de gène mito¬ chondrial non édité de végétaux que celle incluse dans les plantes transgéniqueε mâleεtérile εelon l'une quel¬ conque deε revendicationε 1 à 6, danε le εenε inverεe, leεquelleε planteε tranεgéniqueε sont aptes à restaurer les plantes transgéniqueε εelon l'une quelconque deε revendications 1 à 6. 19") Plaεmide, caractériεé en ce qu'il inclut une région codante d'un gène mitochondrial non édité de végétaux antisens, associée à un promoteur choisi parmi les promoteurs s 'exprimant constitutivement et les promo¬ teurs s 'exprimant au niveau deε anthères et à un termina¬ teur convenable. |
Le contrôle de la fertilité mâle chez les plantes est un des problèmes clés pour l'obtention d'hy¬ brides, et plus particulièrement de lignées mâle-stériles qui présentent un intérêt sur le plan agronomique, notam¬ ment pour le contrôle et l'amélioration des semences. En effet, la production de semences hybrides à grande échelle, à caractéristiques contrôlées, est une véritable gageure parce que beaucoup de cultures présentent à la fois les organes reproducteurs mâle et femelle (étamines et pistils) . Ceci entraîne un taux important d'auto- pollinisation et rend difficile le contrôle des croise- ents entre lignées, pour l'obtention des hybrides recherchés.
Pour permettre l'obtention de croisements non consanguins qui permettent de produire des semences hybrides, présentant des propriétés intéressantes, les Inventeurs ont mis au point de nouvelles plantes transgé¬ niques mâle-stériles, aptes à être restaurées et qui facilitent le développement de cultures hybrides.
La stérilité mâle cytoplasmique (SMC) se ca¬ ractérise par un avortement du pollen après la méiose. Dans les systèmes alloplasmiques, la SMC est due à une incompatibilité noyau-cytoplasme, qui peut se produire à plusieurs niveaux : réplication de l'ADN,
transcription des gènes, maturation des transcrits, tra¬ duction ou assemblage des complexes multiprotéiques.
Des observations réalisées chez le mais et le pétunia (De ey R.E. et al., Cell, 1986, 44., 439 ; Young E.G. et al., Cell, 1987, ££, 41), émerge l'hypothèse que la SMC est due à une déficience de la machinerie bioéner¬ gétique mitochondriale. En effet, la SMC se manifeste par une réduction du taux d'ATP et de NADP. Au niveau cellu¬ laire, cette déficience est corrélée avec une dégénéres- cence des cellules du tapis de l'anthère, tout en n'ayant pas d'effet sur le développement de la plante.
Un certain nombre de méthodes ont été . propo¬ sées, dans l'Art antérieur, pour obtenir des plantes mâle-stériles. On peut citer notamment les rétrocroisements, qui conduisent à la substitution du génome nucléaire d'une espèce par un autre génome et ce, dans l'environne¬ ment cytoplasmique de la première espèce (alloplasmie) ; cette substitution peut également apparaître spontanément dans les cultures en champ. La SMC peut également être obtenue par fusion de protoplastes (Lonsdale D.M., Gene- tic Engineering, 1987, , 47).
Dans toutes ces situations, les résultats ne sont pas fiables, ni reproductibles ; de plus, dans tous les cas, les manipulations sont longues, fastidieuses et souvent difficiles à contrôler.
Des plantes mâle-stériles ont également été obtenues par transgénose, à l'aide d'un gène codant pour une RNAse, sous le contrôle d'un promoteur anthère-spéci- fique (Mariani C. et al., Nature, 1990, 347. 737) . Ce transgène, lorsqu'il s'exprime, a un effet toxique sur la cellule dans la mesure où les ARNs endogènes sont dégra¬ dés, provoquant ainsi la mort cellulaire.
Un autre système, introduisant également une nouvelle fonction artificielle et destructrice, a été dé¬ crit par orrall D. et al., (The Plant Cell, 1992, 4,
759-771) (système callase) et présente les mêmes inconvé¬ nients que le système RNAse .
D'autres méthodologies ont également proposées pour obtenir des plantes mâle-stérile ; on peut notamment citer les techniques qui tirent profit de la perturbation de certaines voies métaboliques (Van de Meer I.M. et al., The Plant Cell, 1992, 4, 253-262) (expression d'un gène anti-sens chalcone-synthase) ou les techniques qui font appel à l'hybridation somatique asymétrique (Melchers G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 6832-6836) pour mettre en présence, comme dans les lignées mâle-sté¬ riles alloplasmiques, le cytoplasme d'un individu donneur et le noyau d'un partenaire receveur. Ces deux derniers procédés présentent l'inconvénient majeur d'être très aléatoires quant à l'objectif visé, à savoir l'obtention de plantes mâle-stériles, permettant le contrôle de la reproduction de ces plantes.
La Demanderesse s'est, en conséquence, donné pour but de résoudre le problème de l'obtention contrô- lée, fiable et reproductible de plantes transgéniques mâle-stériles, pouvant être utilisées dans des programmes agronomiques d'amélioration de semences.
La présente invention a pour objet des plantes transgéniques, possédant dans leurs noyaux, une séquence hybride exprimable (transgène) , comprenant au moins une région codante d'un gène mitochondrial non édité de végé¬ taux supérieurs et une séquence susceptible de transférer la protéine exprimée par ladite région codante, vers la mitochondrie, lesquelles plantes sont caractérisées en ce que :
- les régions codantes des gènes itochon- driaux non édités sont choisis parmi les gènes codant pour une protéine du complexe ATP synthase choisis parmi le fragment de gène de 1ΑTP9 de blé, de formule I sui- vante :
ATG TTA GAA GGT GCT AAA TCA ATA GGT GCC GGA GCT GCT ACA
ATT GCT TTA GCC GGA GCT GCT GTC GGT ATT GGA AAC GTC CTC AGT TCT TTG ATT CAT TCC GTG GCG CGA AAT CCA TCA TTG GCT AAA CAA TCA TTT GGT TAT GCC ATT TTG GGC TTT GCT CTC ACC GAA GCT ATT GCA TTG TTT GCC CCA ATG ATG GCC TTT CTG ATC TCA TTC GTT TTC CGA TCG CAT AAA AAG TCA TGA ou le gène de 1ΑTP6, ou parmi les gènes codant pour une protéine de la chaîne respiratoire choisis parmi les gène des sous-unités 1 à 7 de la NAD déshydrogénase, le gène de 1 'apocytochrome b et les gènes des sous-unités I, Il ou III de la cytochrome-oxydase et
- la séquence susceptible de transférer ladite protéine exprimée vers la mitochondrie est sélectionnée dans le groupe constitué par les fragments codant pour la tryptophanyl ARNt synthétase de levure (SCHMITZ, U.K. et al., 1989, The Plant Cell, 1, 783-791), la sous-unité β de l'ATPase de Nicotiana plumbaginifolia (BOUTRY et al., 1987, Nature, 328:340-342), et le translocateur ATP/ADP de mais (BATHGATE et al., 1989, Eur. J. Biochem. , 183:303-310) ou un fragment Ecorl/Kpnl de 303 paires de bases incluant les codons 1 à 62 de la sous-unité IV de la cytochrome oxydase de levure (MAARSE et al., 1984, EMBO J. , 3, 2831-2837) , laquelle séquence hybride est apte à modifier la ferti¬ lité mâle des plantes ayant incorporé ledit transgène, tout en ne modifiant pas les autres caractéristiques phé- notypiques desdites plantes.
Selon un mode de réalisation avantageux desdites plantes transgéniques, ladite séquence d'acide nucléique hybride comprend la région codante de formule I du gène codant pour la forme non éditée de 1 'ATP9 de blé, à laquelle est associée en tant que séquence de trans¬ fert, les codons 1 à 62 de la pré-séquence de la sous- unité IV de la cytochrome-oxydase (cox IV) de levure (SEQ. ID n° 1) . Selon un autre mode de réalisation avantageux desdites plantes transgéniques, ladite séquence d'acide
nucléique hybride comprend le fragment de région codant pour la forme non éditée de 1ΑTP6 de blé, de formule II suivante :
ATG GAT AAT TTT ATC CAG AAT CTG CCT GGT GCC TAC CCG GAA ACC CCA TTG GAT CAA TTT GCC ATT ATC CCA ATA ATT GAT CTT CAT GTG GGC AAC TTT TAT TTA TCA TTT ACA AAT GAA GTC TTG TAT ATG CTG CTC ACT GTC GTT TTG GTC GTT TTT CTT TTT TTT GTT GTT ACG AAA AAG GGA GGT GGA AAG TCA GTG CCA AAT GCA TGG CAA TCC TTG GTC GAG CTT ATT TAT GAT TTC GTG CTG AAC CTG GTA AAC GAA CAA ATA GGT GGT CTT TCC GGA AAT GTG AAA CAA AAG TTT TTC CCT CGC ATC TCG GTC ACT TTT ACT TTT TCG TTA TTT CGT AAT CCC CAG GGT ATG ATA CCC TTT AGC TTC ACA GTG ACA AGT CAT TTT CTC ATT ACT TTG GCT CTT TCA TTT TCC ATT TTT ATA GGC ATT ACG ATC GTT GGA TTT CAA AGA CAT GGG CTT CAT TTT TTT AGC TTC TTA TTA CCT GCG GGA GTC CCA CTG CCG TTA GCA CCT TTC TTA GTA CTC CTT GAG CTA ATC TCT TAT TGT TTT CGT GCA TTA AGC TTA GGA ATA CGT TTA TTT GCT AAT ATG ATG GCC GGT CAT AGT TTA GTA AAG ATT TTA AGT GGG TTT GCT TGG ACT ATG CTA TTT CTG AAT AAT ATT TTC TAT TTC ATA GGA GAT CTT GGT CCC TTA TTT ATA GTT CTA GCA TTA ACC GGT
CTG GAA TTA GGT GTA GCT ATA TCA CAA GCT CAT GTT TCT ACG ATC TCA ATT TGT ATT TAC TTG AAT GAT GCT ACA AAT CTC CAT CAA AAT GAG TCA TTT CAT AAT TGA, à laquelle est associée en tant que séquence de trans- fert, les codons 1 à 62 de la pré-séquence de la sous- unité IV de la cytochrome-oxydase (cox IV) de levure (SEQ. ID n" 3) .
Selon un autre mode de réalisation avantageux deεditeε plantes transgéniques, ladite séquence d'acide nucléique hybride comprend le fragment de région codant pour la forme non éditée de cox II de formule III suivante :
ATG ATT CTT CGT TCA TTA TCA TGT CGA TTC TTC ACA ATC GCT
CTT TGT GAT GCT GCG GAA CCA TGG CAA TTA GGA TCT CAA GAC GCA GCA ACA CCT ATG ATG CAA GGA ATC ATT GAC TTA CAT CAC
GAT ATC TTT TTC TTC CTC ATT CTT ATT TTG GTT TTC GTA TCA
CGG ATG TTG GTT CGC GCT TTA TGG CAT TTC AAC GAG CAA ACT AAT CCA ATC CCA CAA AGG ATT GTT CAT GGA ACT ACT ATG GAA ATT ATT CGG ACC ATA TTT CCA AGT GTC ATT CTT TTG TTC ATT GCT ATA CCA TCG TTT GCT CTG TTA TAC TCA ATG GAC GGG GTA TTA GTA GAT CCA GCC ATT ACT ATC AAA GCT ATT GGA CAT CAA TGG TAT CGG ACT TAT GAG TAT TCG GAC TAT AAC AGT TCC GAT GAA CAG TCA CTC ACT TTT GAC AGT TAT ACG ATT CCA GAA GAT GAT CCA GAA TTG GGT CAA TCA CGT TTA TTA GAA GTT GAC AAT AGA GTG GTT GTA CCA GCC AAA ACT CAT CTA CGT ATG ATT GTA ACA CCC GCT GAT GTA CCT CAT AGT TGG GCT GTA CCT TCC TCA GGT GTC AAA TGT GAT GCT GTA CCT GGT CGT TCA AAT CTT ACC TTC ATC TCG GTA CAA CGA GAA GGA GTT TAC TAT GGT CAG TGC AGT GAG ATT CGT GGA ACT AAT CAT GCC TTT ACG CCT ATC GTC GTA GAA GCA GTG ACT TTG AAA GAT TAT GCG GAT TGG GTA TCC AAT CAA TTA ATC CTC CAA ACC AAC TAA, à laquelle est associée en tant que séquence de trans¬ fert, les codons 1 à 62 de la pré-séquence de la sous- unité IV de la cytochrome-oxydase (cox IV) de levure (SEQ. ID n° 5) . Les plantes ayant incorporé le transgène conforme à l'invention (plantes transgéniques) sont, de manière générale, sélectionnées parmi les plantes présen¬ tant un intérêt agronomique, médical ou industriel. De manière plus précise, toute plante transformable et régé- nérable peut constituer la matière première pour l'obten¬ tion d'une plante transgénique conforme à l'invention.
Au sens de la présente invention, on entend par transformable, toute plante ayant la possibilité d'intégrer un gène au niveau nucléaire, de façon stable et transmissible, à sa descendance directe.
Egalement au sens de la présente invention, on entend par régénérable, toute plante ayant l'aptitude de produire des plantes néoforméeε (néoformation ou micro¬ propagation) . De manière non limitative, les plantes sui¬ vantes peuvent faire l'objet d'une transformation
conforme à 1 'invention : tabac, colza, tournesol, soja, tomate, pomme de terre, melon, carotte, piment, endive, trèfle, lupin, haricot, pois, maïs, blé, seigle, avoine, orge, riz, millet, agrumes, coton.
Les plantes, à partir desquelles sont obtenus les gènes mitochondriaux non édités, sont sélectionnées de manière à ce que les changements de nucléotides (processus appelé editing) entre la séquence non éditée et la séquence éditée soient importants : au moins 8 codons modifiés, et de préférence au moins 10 codons modifiés.
De manière préférée, les gènes mitochondriaux non édités sont obtenus, de manière non limitative, à partir du blé, du tabac, du pétunia ou de la pomme de terre.
Des pré-séquences de levures sont, en particu¬ lier, fonctionnelles pour l'importation de protéines vers la mitochondrie, chez les plantes. Conformément à l'invention, la plante à partir de laquelle est obtenu ledit gène mitochondrial non édité et la plante ayant incorporé le transgène peuvent être identiques ou différentes.
De manière surprenante, les plantes transfor- ées par une telle séquence présentent, chez au moins 50 % d'entre elles, un phénotype mâle-stérile, tout en ne présentant pas d'autres perturbations, en ce qui concerne le développement de la plante.
Egalement de manière surprenante, de telles plantes transgéniques permettent de contrôler, de manière fiable et reproductible, le processus naturel de la SMC, notamment en évitant l'auto-pollinisation, sans intro¬ duire dans ces dernières de fonctions nouvelles, artifi¬ cielles et destructrices, comme cela est le cas notamment dans les systèmes décrits par Mariani et al. (système RNAse) ou par WORRALL D. et al. (système callase) .
La présente invention a également pour objet une séquence d'acide nucléique hybride, comprenant au moins la région codante d'un gène mitochondrial non édité de végétaux supérieurs, à laquelle est associée une séquence susceptible de transférer la protéine exprimée par ladite région codante, vers la mitochondrie, caracté¬ risée en ce que :
- les régions codantes des gènes mitochon¬ driaux non édités sont choisis parmi les gènes codant pour une protéine du complexe ATP synthase choisis parmi le fragment de gène de 1ΑTP9 de blé, de formule I sui¬ vante :
ATG TTA GAA GGT GCT AAA TCA ATA GGT GCC GGA GCT GCT ACA ATT GCT TTA GCC GGA GCT GCT GTC GGT ATT GGA AAC GTC CTC AGT TCT TTG ATT CAT TCC GTG GCG CGA AAT CCA TCA TTG GCT AAA CAA TCA TTT GGT TAT GCC ATT TTG GGC TTT GCT CTC ACC GAA GCT ATT GCA TTG TTT GCC CCA ATG ATG GCC TTT CTG ATC TCA TTC GTT TTC CGA TCG CAT AAA AAG TCA TGA ou le gène de 1ΑTP6, ou parmi les gènes codant pour une protéine de la chaîne respiratoire, choisis parmi les gènes des sous-unités 1 à 7 de la NAD déshydrogénase, de 1 'apocytochrome b et des sous-unités I, II ou III de la cytochrome-oxydase, et
- la séquence nucléique susceptible de trans- férer ladite protéine exprimée vers la mitochondrie est sélectionnée dans le groupe constitué par des fragments codant pour la tryptophanyl ARNt synthétase de levure, la sous-unité β de l'ATPase de Nicotiana pl umbaginifolia , le translocateur ATP/ADP de mais et un fragment Ecorl/Kpnl de 303 paires de bases incluant les codons 1 à 62 de la sous-unité IV de la cytochrome oxydase de levure, laquelle séquence hybride est apte à modifier la ferti¬ lité mâle des plantes l'ayant incorporée.
Selon un mode de réalisation avantageux de ladite séquence d'acide nucléique hybride, elle comprend la région codante de formule I du gène codant pour la
forme non éditée de 1ΑTP9 de blé, à laquelle est asso¬ ciée en tant que séquence de transfert, les codons 1 à 62 de la pré-séquence de la sous-unité IV de la cytochrome- oxydase (cox IV) de levure (SEQ. ID n' 1) . Selon un autre mode de réalisation avantageux ' de ladite séquence d'acide nucléique hybride, elle comprend le fragment de région codant pour la forme non éditée de 1 'ATP6 de blé, de formule II ci-dessus, à laquelle est associée en tant que séquence de transfert, les codons 1 à 62 de la pré-séquence de la sous-unité IV de la cyto¬ chrome-oxydase (cox IV) de levure (SEQ. ID n" 3).
Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite séquence d'acide nucléique hybride, elle comprend le fragment de région codant pour la forme non éditée de cox II de formule III ci-dessus, à laquelle est associée en tant que séquence de transfert, les codons 1 à 62 de la pré-séquence de la sous-unité IV de la cyto¬ chrome-oxydase (cox IV) de levure (SEQ. ID n' 5) .
La présente invention a également pour objet, un plasmide, caractérisé en ce qu'il inclut une séquence d'acide nucléique hybride conforme à l'invention, asso¬ ciée à un promoteur choisi parmi les promoteurs s 'exprimant constitutivement et les promoteurs s'exprimant au niveau des anthères et à un terminateur convenable.
Selon un mode de réalisation avantageux dudit plasmide, il comprend le promoteur 35S et le terminateur du gène VI du CaMV.
Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit plasmide, il comprend en outre au moins un gène marqueur, notamment, et ce de manière non limitative, un gène de résistance à un antibiotique et de préférence, le gène de résistance à 1 'hygromycine.
Conformément à l'invention, les plantes trans- géniques, telles que définies ci-dessus, sont suscep¬ tibles d'être obtenues à l'aide d'un procédé de produc-
tion de plantes transgéniques qui comprend, pour la transformation du végétal supérieur sélectionné, l'intro¬ duction d'au moins une copie de la séquence nucléique hybride telle que définie ci-dessus, dans une plante réceptrice, à l'aide d'un plasmide contenant ladite séquence, tel que défini ci-dessus.
Une telle transformation peut avantageusement être obtenue par l'une des méthodes suivantes : transfor¬ mation de protoplastes, agrotransformation, microinjec- tion, biolistique.
La présente invention a également pour objet un procédé d'inhibition de la production de pollen, chez les végétaux supérieurs, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : (a) insertion d'une séquence d'acide nucléique hybride, telle que définie ci-dessus, chez les végétaux sélectionnés, par tout moyen approprié ;
(b) régénération et culture des végétaux transgéniques obtenus en (a) ; et (c) mesure de la production et de la viabilité du pollen (test de germination, notamment) .
Egalement de manière surprenante, on peut res¬ taurer la fonction mâle desdites plantes transgéniques mâle-stériles, conformes à l'invention, en croisant leε- dites plantes transgéniqueε mâle-εtérileε avec deε planteε tranεgéniqueε comprenant danε leurε noyaux une séquence d'acide nucléique hybride dite anti-sens, c'est- à-dire incluant au moins la même région codante de gène mitochondrial non édité de végétaux que celle incluse dans lesditeε plantes transgéniqueε mâle-stérile, danε le εens inverse.
La présente invention a également pour objet un procédé de restauration de plantes mâle-fertiles, à partir de plantes transgéniqueε mâle-εtérileε, conformeε à l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivanteε :
(1) transformation du végétal supérieur sélec¬ tionné par l'introduction d'au moins une copie de la séquence nucléique hybride telle que définie ci-dessus, dans une plante réceptrice, à l'aide d'un plasmide conte- nant ladite séquence, pour l'obtention de plantes trans¬ géniques mâle-stérileε (PTMS) ;
(2) transformation du même végétal supérieur qu'en (1), par l'introduction d'au moins une copie d'une séquence nucléique hybride anti-sens, incluant au moins la même région codante de gène mitochondrial non édité de végétaux que celle incluse dans lesdites planteε trans¬ géniques mâle-stérile obtenues en (1) , dans une plante réceptrice, à l'aide d'un plasmide contenant ladite séquence, pour l'obtention de plantes transgéniques âle- fertiles (PTMF) ;
(3) croisement des planteε transgéniques mâle- stériles obtenues en (1) et des plantes mâle-fertiles ob¬ tenues en (2) , pour l'obtention d'hybrides vigoureux, restaurés danε leur fertilité mâle et présentant des caractéristiqueε présélectionnées.
La présente invention a également pour objet des plasmides incluant une séquence hybride anti-senε, telle que définie ci-deεεuε, aεεociée à un promoteur choisi parmi les promoteurε constitutifs et les promo- teurs spécifiques des anthères et également associée à un terminateur convenable.
Outre les dispositions qui précèdent, l'inven¬ tion comprend encore d'autres dispositions, qui ressorti- ront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la pré¬ sente invention.
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
EXEMPLE 1 : Construction d'un gène chimérique conforme à l'invention cox IV-ATP9 (SEQ ID n" 1) .
Les séquences codant pour 1 'ATP9 sont obtenues à partir d'un ADNc correspondant aux formes éditées et non éditées d'ARNm mitochondrial de blé.
LΑTP9 est fusionné à un fragment EcoRI/Kpnl de 303 paires de base à partir d'un plasmide dénommé 19.4
(MAARSE et al., EMBO J., 1984, 3, 2831-2837), incluant les codons 1 à 62 de la souε-unité IV ( cox IV) de la cytochrome oxydaεe de levure.
Le fragment réεultant, obtenu aprèε digeεtion par l'enzyme HincII eεt ligaturé au niveau du εite de reεtriction Smal du plasmide pDH51 (PIETRZAK et al., 1986, Nucleic Acids Reε . , 14:5857-5868) . Le gène de réεiεtance à 1 'hygromycine eεt inεéré au niveau du εite KindIII du plasmide pDH51, du plasmide pEA903 (forme édi¬ tée de 1ΑTP9, figure 1) et du plasmide pEA904 (forme non éditée de 1ΑTP9, figure 2) donnant naissance respective¬ ment aux plasmides pHl (figure 3), pH5 (figure 4) et pH2 (figure 5) . Le plasmide pH4 (figure 6) est constitué du plasmide pEA904 danε lequel la partie codante cox IV/ATP9 eεt placée en orientation inverεe par comparaison avec le plasmide pH2.
Les séquenceε cox IV-ATP9 non-édité et cox IV- ATP9 édité sont représentées aux figures 12 et 13.
Tous ces gèneε εont εouε le contrôle du promo¬ teur CaMV 35S et du terminateur de gène VI de CaMV.
Leε εéquenceε conformeε à 1 ' invention peuvent εpécifiquement être amplifiéeε à l'aide deε amorceε oli- gonucléotidiqueε suivantes :
(a) 5 ' -CACTACGTCAATCTATAAG-3 ' , s ' étendant du codon 3 au codon 9 de la pré-εéquence de la εous-unité IV de la cytochrome oxydase de levure et
(b) 5 ' -TATGCTCAACACATGAGCG-3 ' , localisée au niveau du terminateur du gène VI du CaMV (45 paires de base en amont du signal de poiyadénylation) .
L'ARNm d'ATP9 chez le blé subit des change¬ ments de nucléotides C—U (proceεεuε appelé edi ting) , au niveau de 8 codonε. Ceε modificationε ont pour consé¬ quence le changement de 5 aminoacides dans la protéine correspondante (protéine éditée) et la perte, par rapport à la séquence déduite du gène, de 6 résidus dans la ré¬ gion C-terminale, perte provoquée par la création d'un codon stop.
La protéine non éditée est plus hydrophile avec 6 résidus supplémentaires au niveau C-terminal ; de plus, cette forme non éditée d'ATP9 sélectionnée, consti¬ tue un modèle de protéine modifiée particulièrement avan- ι tageux car il constitue un élément du canal à proton de l'ATP synthase et, en conséquence, il est indiεpenεable à la fonction de ce complexe ; ce fragment eεt également avantageux en raiεon de la taille réduite de la εéquence codante, qui facilite la manipulation et le fait que 1ΑTP9 peut avoir une localiεation nucléaire ou mitochon- driale. EXEMPLE 2 : Production de plantes transgéniques mâle- stériles.
Auεεi bien la construction plasmidique conforme à l'invention (voir exemple 1, plaεmide pH2) que leε conεtructionε contrôles (plasmide pHl) et les constructionε correspondant à la forme éditée de 1ΑTP9 plasmide pH5) sont utiliséeε pour la transformation de protoplastes d'une lignée de Nicotiana tabacum cv. Petit Havana, dénommée SRI.
* Transformation des protoplastes : Les protoplasteε utilisés pour la transforma¬ tion sont isolés à partir des feuilles de plantes de Nicotiana tabacum SRI, cultivés en condition axénique et âgées d'un mois. Les jeunes feuilles εont prélevéeε, débarraεεéeε de la nervure centrale et coupéeε en fineε lamelleε. Leε fragmentε εont ensuite incubés à l'obscu¬ rité à 26"C, pendant une nuit, dans une solution enzy a-
tique constituée du milieu K3 (NAGY et MALIGA, 1976) additionnée de cellulase Onozuka RIO (1,2 %) , de macéro- zyme Onozuka RIO (0,4 %) et de driselase Fluka (0,1 %) (pH 5,6). Avant la récolte, la solution enzymatiσue est diluée avec une solution de saccharose 0,6 M, MES 0,1 % (p/v) (pH 5,6) dans leε proportionε reεpectiveε 2v/lv.
Leε protoplastes εont εéparéε deε tissus non digérés par filtration à travers un tamiε de 100 μm. La suspension est recouverte d'une solution W5 (MENCZEL et al., Theor. Appl. Genetics, 1981, 59:191-195) en prenant soin de ne pas mélanger les phases liquides. Après cen- trifugation à 600 rpm pendant 10 min, les protoplastes sont rassemblés sous forme d'une bande à l'interface entre la solution W5 et la εolution enzymatique. Ils sont recueillis soigneuεe ent et lavéε deux fois avec la εolu¬ tion 5 pour éliminer leε traceε d'en∑y eε. Leε proto- plaεteε εont placéε danε une chambre froide à 4-6"C pen¬ dant 1-2 heures. Après une nouvelle centrifugation à 750 rpm pendant 5 min, ilε εont remiε en suspension dans une εolution mannitol/magnésium (Mannitol Merck 0,5 M ; MgCl 2 , 6H 2 0 Prolabo 1,5 mM, MES Sigma 0,1 %, pH 5, 6) et leur concentration est ajustée à 1,6 x 10° proto- plaεteε/ml. Leε protoplaεtes sont soumiε à un choc ther¬ mique à 45'C pendant 5 minutes. Aprèε retour à la température ambiante, 300 μl de suspenεion de protoplaεteε (5 x 10^ protoplastes) sont répartis dans un tube conique de 12 ml. Ensuite, 20 μg de plasmide pH2 (ou de plasmide pH4) , selon la plante trans¬ génique que l'on souhaite obtenir, 300 μl d'une solution de PEG 4000 [(PEG 4000 Merck ; 40 % (p/v), mannitol Merck, 0,4 M ; Ca(N0 3 ) 2 4H 2 0 Merck ; pH 8 (εolution sté¬ rilisée par filtration à 0,45 μm) ] et 60 μg d'ADN de thy¬ mus de veau comme ADN entraîneur, sont ajoutés dans la suspenεion de protoplaεteε. Ce mélange est incubé à tem- pérature ambiante pendant 25-30 minutes, et agité douce¬ ment de temps en temps. La suεpenεion de tranεformation
est ensuite diluée progressivement en ajoutant petit à petit 10 ml de 5 sur une période de 10 minutes. Les pro- toplaεteε sont récupérés par centrifugation et repris dans 1 ml de milieu K3. * Culture des protoplastes et régénération de plantes : les protoplasteε εont cultivéε à raiεon de 5x10^ protoplastes/ml, dans 3 ml d'un mélange de milieux K3 et H (KAO et MICHAYLUK, 1975) en proportion 1:1 (v/v) , solidifié avec de l'agarose (0,8 %) . Leε colonieε résul¬ tantes sont successivement cultivées, en présence de l'agent de sélection hygro ycine à 20 mg/1, dans le milieu A50m (milieu A contenant 50 g/1 mannitol) (CABOCHE, 1980) pendant le premier mois, puis sur le milieu A30m (le milieu A contenant 30 g/1 mannitol) durant le deuxième mois, et enfin sur le milieu A-m (milieu A sanε mannitol), milieu contenant 40 mg/ml d'hy¬ gromycine, durant le troiεième moiε. Pour la régénéra¬ tion, les cals sont transféréε sur le milieu AR. Le milieu AR est le milieu A contenant seulement 20 g/1 saccharose comme source d'hydrate de carbone et 0,25 mg/1 BAP comme hormone de croiεεance. Leε plantuleε iεεueε de calε εont cultivéeε εur le milieu T (NITCH et NITCH, 1969) . Le milieu MSoo eεt utiliεé pour l'entretien deε plantes.
EXEMPLE 3 : Analyse phénotypique des plantes trans¬ géniques obtenues.
Les tailles des plantes âgées de 14 semaines, obtenues conformément à l'exemple 2 sont précisées dans le Tableau I ci-après :
TABLEAU I
1 F = fertile, F/S = εemi-fertiie, S = mâle-stérile valeur moyenne de production de graine par capsule après auto-polliniεation. lignée Hl = planteε transgéniqueε obtenues avec le plasmide pHl, lignée H2 = plantes transgéniqueε obtenueε avec le plaεmide pH2, lignée H5 = plantes transgéniques obtenues avec le plasmide pH5. . lignée contrôle SRI (plante non transformée) .
La taille des planteε n'est pas significative- ment différente de celle des lignéeε SRI non tranεfor- méeε. Le nombre de noeuds moyen est similaire dans les trois lignées transgéniques différentes (19 à 24 noeuds par plante) .
Apparemment, il n'y a pas de modification dans le fonctionnement des méristèmes végétatifs danε la dif¬ férenciation des noeuds et des feuilles des plantes transgéniqueε.
La floraison dans les lignées Hl, H2 et H5 est induite 7 à 14 semaineε après la transplantation. Les fleurs des plantes tranεgéniqueε εont εimilaireε danε leurs formes et dans leurs couleurs à celles des fleurs
SRI (pétaleε roεeε-rougeε et anthèreε danε chaque fleur) . Leε planteε mâleε-εtérileε ont deε anthèrëε blancheε, contenant quelqueε grainε de pollen ou aucun (figureε 7A1 et 7B) , tandiε que leε planteε fertiles ont deε anthères blanc-jaunes avec des grains de pollen normaux (figures 7A2 et 7C) . Il n'y a aucune différence dans la forme et dans la couleur du piεtil entre les plantes mâles- εtérileε et mâleε-fertileε. EXEMPLE 4 : Analyse de la fertilité des plantes trans- géniques.
Les transformantε Hl et H5 produiεent des plantes fertiles, alors que les transformantε H2 préεen- tent deε caractéristiques de fertilité, de semi-fertilité ou de stérilité définies sur la base de la germination du pollen ou par la réaction au diacétate de fluorescéine.
Dans les planteε tranεgéniqueε fertileε, la viabilité du pollen eεt compriεe entre 31 et 75 %, proche deε valeurε trouvéeε danε la lignée de contrôle SRI ; danε leε .planteε semi-fertiles, la viabilité du pollen est d'environ 10 à 20 % ; dans les plantes mâles-sté¬ riles, la viabilité est généralement inférieure à 2 %.
La fertilité des plantes est également déter¬ minée par la production de graines après auto-pollinisa¬ tion ou rétrocroisement. Leε résultats sont également illustrés au Tableau I ci-desεuε.
Leε lignéeε Hl et H5 ont une production moyenne de graineε de 100 mg/capεule comparable à celle deε lignéeε contrôleε SRI (110 mg/capsule) . Les lignées H2 qui correspondent à des plantes stériles ne produisent aucune graine, les plantes semi-fertiles produisent entre 12 et 50 mg/capsule, leε planteε fertileε produiεent en moyenne 100 mg/capεule. Ces valeurs sont bien corrélées avec la viabilité pollinique.
La caractériεtique de fertilité femelle, pour les plantes εtérileε et semi-fertileε, eεt déterminée par rétrocroiεement avec leε lignéeε SRI comme parent mâle.
Toutes leε planteε mâleε-εtérileε εont fe¬ melles fertiles et produisent une quantité normale de graines viables (63 à 92 mg/capsule), avec une valeur de viabilité des graineε εupérieure à 77 %. Ainεi le carac- tère εtérile ou εemi-fertile danε 50 % deε lignéeε H2 eεt dû à l'abεence ou à la production trèε faible de pollen viable.
La transmisεion deε transgènes est analysée à travers la εégrégation génétique du gène de 1 'hygromycine phosphotransferase (hpt ) chez les descendantε (entre 200 et 500 deεcendantε analyεéε) . Aprèε auto-fécondation (planteε fertileε et/ou εemi-fertileε) , la réεiεtance à l 'hygromycine est transmiεe danε la majorité deε caε comme un caractère mendélien (mono ou di-génique) . Aprèε rétrocroiεement avec le parent SRI
(plante εtérile) , 4 deε 5 planteε mâleε-εtérileε héritent du caractère de réεiεtance à l'hygromycine comme un ca¬ ractère mendélien digénique, ceci exprimant 2 loci actifε. Ceε analyεeε montrent que leε planteε stériles sont uniquement affectées dans la production de pollen, puisqu'elleε εont femelles fertiles et produiεent une quantité de graineε par fruit (100 à 150 mg) , comparable, voir supérieure à celle des témoins. EXEMPLE 5 : Analyse moléculaire des transformants.
Pour mettre en évidence la présence et la transcription du transgene ATP9, l'analyse des produits de transcription est effectuée par hybridation de type Southern et Northern. L'ADN total eεt isolé à partir des lignées H2 (stérileε, εemi-fertileε et fertileε) et des lignées H5. Par ailleurs, le gène chimérique eεt analyεé par amplification PCR.
* Méthodeε utiliεéeε :
- L'ADN total eεt iεolé à partir de 10 g de tiεεuε de feuilles esεentiellement comme décrit danε SAGHAL-MAROOF M.A. et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 81, 8014-8018. 1 μg d'ADN est amplifié dans un volume final de 100 μl, en utiliεant 0,5 unité de Taq polyméraεe, 0,18 mM dNTPε et 100 pmol de chacune deε amorceε. Leε amorceε utiliεéeε εont celleε préciεéeε à l'exemple 1. L'utiliεation de ceε amorceε exclut l'ampli¬ fication de 1ΑTP9 endogène (voir figure 8C) .
L'étape de dénaturation eεt réalisée à 95"C pendant 1 min, l'étape d'hybridation est réalisée pendant 2 min à 52 * C et l'étape de polymérisation est réalisée pendant 1 min à 72'C.
25 cycles sont réalisés, les échantillons sont soumis à une électrophorèse danε un gel d'agarose à 1,5 % et transférés sur une membrane Hybond-N + (Amersham) , comme décrit dans SAGHAL-MAROOF M.A. al. (référence citée). Les filtres sont pré-hybridés à 42'C danε de la formamide déioniεée à 50 %, 5 x SSC, 8 x Denhardt et SDS à 0,5 %. Leε filtres sont hybrides avec la séquence codante de 300 paires de base de 1ΑTP9, fragment EcoRI/HindIII marqué au 32 P. Une bande (correspondant à un produit compre¬ nant 700 paires de baseε) est observée danε la plupart deε lignéeε H2 et H5 comme prévu. La figure 8A montre les résultatε obtenuε avec l'ADN H2.2 et H2.16, iεεu de planteε mâleε-εtérileε (piεteε 1 et 2) et avec deε planteε fertileε (ADN H5.6 et H5.15, piεteε 3 et 4). L'ADN issu des plantes non transformées SRI ne donne aucun signal (piste 5) .
- L'ARN total des lignées SRI, H2 et H5 est extrait, à partir des feuilles, comme suit : 5 g de feuilles sont cryobroyés ; puiε on procède à une première extraction à partir de la poudre congelée, avec 5 ml d'un mélange phénol:chloroforme:alcool iεoamylique (25:24:1 ; v:v:v) et 5 ml de TNES+DTT (0,1 M NaCl, 10 mM Triε-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,1 % SDS et 2 mM dithiothréitol) ; on procède enεuite à une deuxième extraction, à partir de la phaεe àqueuεe, deux foiε avec un volume égal de chloro-
forme et d'alcool isoamylique (24:1 ; v:v) et l'ARN eεt précipité avec un volume égal de chlorure de lithium 4 M à 0 * C pendant une nuit.
Leε ARNs sont dissous dans une eau traitée au DEPC. La concentration d'ARN est mesurée par la densité optique (DO) à 260 nm. Les ARNs poly(A) + sont purifiés par chromatographie d'affinité oligo(dT) -cellulose. 20 μg d'ARN total et 1 μg d'ARN poly(A) + εont soumis à une électrophorèse εur gel d'agarose 1,5 %, tampon formaldé- hyde/formamide, puis transférés sur des membranes de ny¬ lon Hybond-N + . Les hybridationε avec la sonde ATP9 sont réaliséeε comme décrit ci-deεεuε.
Une bande de 0,48 kb eεt obtenue avec leε li¬ gnéeε contrôle SRI (figure 8B, piεte 1). Cette bande eεt présente dans toute les lignéeε et correspond à l ' ARNm endogène mitochondrial.
Un transcrit additionnel, correεpondant à une bande de 0,98 kb eεt présente seulement chez les plantes transformées. Comme illustré à la figure 8B, ces molé- cules peuvent être séparéeε de l'ARNm endogène par chro¬ matographie oligo(dT) -celluloεe, confirmant εon origine cytoplaεmique.
La figure 8B, (piεtes 3 et 4) , montre les résultats obtenus avec les plantes mâles-εtériles H2.2 et H2.16 et avec les plantes fertileε H5.6 et H5.15, (pistes
5 et 6) . Le transcrit de 0,98 kb est absent deε contrôleε non transformés (piste 2).
- En parallèle, par la technique de la PCR de l'ADNc, il eεt poεεible d'obtenir deε tranεcrits prove- nant du transgène grâce aux séquenceε ajoutées au cours de la manipulation in vi tro telles que les régions de la pré-séquence provenant de la levure { cox IV) et la région de terminaison du CaMV. De plus, seul le transcrit de 0,98 kb hybride avec une sonde provenant de la séquence cox IV fusionnée à 1 'ATP9.
EXEMPLE 6 : Analyse de la production de la protéine chi¬ mère.
Pour comprendre si leε tranεgènes affectent l'expresεion du gène mitochondrial ATP9 endogène, l'ARN total deε plantes transforméeε H2 et H5 ainεi que deε plantes contrôles ont été hybridéε avec une εonde mito- chondriale spécifique.
Comme le montre la figure 9, aucune différence substantielle n'est observée lorsque le transgène est édité ou non édité et le marquage est similaire à celui du contrôle.
La production de la protéine transgénique eεt analyεée par immunoblotting deε extraitε mitochondriaux et cytosoliques. Deε anticorpε dirigéε contre leε frag- mentε 21 à 54 de la partie pré-séquence de cox IV de le¬ vure, faisant partie du transgène, sont obtenus chez le lapin.
On procède comme suit : un fragment Xbal/Kpnl contenant les codons 21 à 54 de cox IV de levure est isolé à partir du plasmide 19.4 précité.
Ce fragment est ligaturé au plasmide pGEX-A (figure 10) en phase avec la séquence codante de la glu- tathion S-transférase, souε le contrôle du promoteur de la β-galactoεidaεe. La protéine de fusion est induite après transformation de cellules d'E. coli DH5α par l'IPTG. Ces cellules produisent environ 80 mg de protéines/litre de culture.
La protéine fusionnée est purifiée à partir d'un extrait d ' E. coli par chromatographie d'affinité sur une colonne de glutathion-agarose. La protéine éluée par du glutathion eεt obtenue avec un taux de pureté de l'ordre de 95 %. La protéine de fuεion eεt utilisée comme antigène pour produire des anticorps anti-cox IV chez le lapin.
Les feuilles de plantes de serre sont uti-
liεéeε pour le fractionnement cellulaire. 100 μg de pro- téineε cytoεoliqueε et mitochondriales sont fractionnés par urée/SDS-PAGE. L'immunoréaction est réalisée en uti¬ lisant un anti-sérum anti-cox IV dilué au l/500ème selon la méthode de DARLEY-USMAR et al. [1987, Mitochondria, a practi cal approach, eds DARLEY-USMAR, (IRL Preεε Ltd.) pp. 113-152)]. Les protéines des plantes transgéniqueε portant le phénotype mâle-stérile sont révélées par des anticorps IgG anti-lapin conjugués à de la peroxydase. Aucun signal n'est observé, ni avec la frac¬ tion mitochondriale (figure 11B, piste 1), ni avec la fraction cytosolique de la lignée SRI non tranεformée.
La fraction mitochondriale deε plantes mâleε- εtérileε H2.2 et fertileε H5.15 (figure 11B, piεtes 2 et 4 respectivement) montre une bande de 12 kDa correspon¬ dant à la taille attendue pour la protéine (voir figure 11A, qui précise la εtructure du précurseur de 15 kDa et de la protéine importée de 12 kDa) .
Les protéines cytosoliques de ceε lignéeε (figure 11B, piεteε 3 et 5) montrent 2 bandeε, l'une à
15 kDa, la taille attendue pour le polypeptide précurεeur chimérique, et l'autre à 14 kDa. La nature de ce dernier polypeptide reste à déterminer ; il s'agit probablement d'un produit de dégradation du précurseur de 15 kDa. La protéine associée avec la fraction mito¬ chondriale de la lignée H5.15 (figure 11, piste 4) migre à peu prèε au même endroit que la protéine mitochondriale H2.2, maiε légèrement en aval. Cette différence eεt due au fait que les gènes chimériques diffèrent au niveau de la position du codon stop. En effet, comme déjà préciεé ci-deεεuε, la protéine éditée présente 6 résiduε en oinε que la protéine non éditée due à la génération d'un codon εtop lorε de l'editing de l'ARN. EXEMPLE 7 : Etude de la respiration des mitochondries des plantes transgéniques.
L'effet du tranεgène au niveau εubcellulaire
doit se traduire par un dysfonctionnement de la fonction respiratoire de la mitochondrie. L'analyse de la respira¬ tion des parties non chlorophylliennes des plantes trans¬ géniques a été réalisée. La détermination des vitesses de respiration des organes non chlorophylliens (racines) , en présence ou en absence de découplants est effectuée par analyse de la consommation d'oxygène à l'aide d'une électrode de Clark. Des études plus fines ont été conduites sur des mitochon- dries purifiées par centrifugation différentielle et en gradient de Ficoll. L'effet de découplants sur la respi¬ ration et les rapports ADP/0 ont été déterminés sur deε mitochondries issues de lignées mâles-stériles et comparé aux plantes contrôles transformées ou sauvageε. Ceε différentes mesures montrent que la fonc¬ tion mitochondriale est réduite dans les plantes mâle- stériles par rapport au témoin non transformé ou trans¬ formé avec le plasmide pH5. Cette situation est proche de celle rencontrée chez les planteε mâle-stérile natu- relies.
Il reεεort de ce qui précède que l'expreεεion dans des plantes transgéniqueε de tabac d'une séquence d'ADN codant pour de 1ΑTP9 mitochondrial non édité de blé n'a pas d'effet εur la plupart des caractères phéno- typiques des planteε tranεformées, à l'exception de l'ap¬ parition de la stérilité mâle.
En effet, la taille, la viteεεe de croiεεance, le nombre de noeuds, la forme et la taille des feuilles et des fleurs εont εimilaireε chez les planteε transgé- niques et chez les plantes contrôles. Toutefois, des ef¬ fets significatifε sont observés au niveau des organes de la reproduction mâle lorsque la séquence d'ATP9 de blé, sous sa forme non éditée, est exprimée dans les ' planteε de tabac. En fait, leε expérimentationε de tranεforma- tionε réalisées avec le plasmide pH2 conduit à la produc-
tion de beaucoup de plantes (50 %) modifiées danε leur fertilité. Approximativement 19 % εont εemi-fertileε et 31 % sont entièrement stériles.
Toutes les lignées semi-fertileε et stériles H2 expriment le transgène sous la forme d'ARNm polyadé- nylé. Les lignées. H2 fertiles ne présentent pas le trans¬ crit de 0,98 kb, même lorsque le transgène est détecté après amplification par PCR, ceci indiquant que dans ce dernier cas le transgène est inactif. Deε réεultats montrent également, de manière inattendue, que le phénotype mâle-stérile est corrélé uniquement avec la présence de séquence non éditée d'ATP9 tandis que les transformants obtenus avec la forme éditée d'ATP9 sont tous fertiles. Dans tous les cas, les plantes stériles sont seulement mâles-stériles et peuvent être pollinisées avec un pollen étranger, ceci reflétant une fertilité femelle normale. EXEMPLE 8 : Production des planteε transgéniques présen- tant une séquence hybride conforme à l'invention anti¬ sens.
On procède comme danε l'exemple 2, la trans¬ formation de protoplaεtes étant toutefois réalisée à 1 'aide des plasmideε pH4. En croiεant ceε planteε mâle-fertileε avec leε planteε transgéniques mâle-stériles, conformes à l'inven¬ tion, on obtient des hybrides mâle-fertiles non consan¬ guins. EXEMPLE 9 : Construction d'un gène chimérique conforme à l'invention cox IV-ATP6 (SEQ ID n * 3).
Les séquence codant pour 1 'ATP6 sont obtenueε à partir d'un ADNc correεpondant aux formeε éditéeε et non éditéeε d'ARNm mitochondrial de blé.
Le fragment d'ATP6 non édité sélectionné pré- sente la séquence de formule II définie ci-desεuε et est fusionné à la séquence de transfert cox IV de levure
telle que définie ci-deεεuε.
Le fragment résultant est similaire à celui obtenu à l'exemple 1.
L'ARNm d'ATP6 chez le blé subit des change- ents de nucléotideε { edi ting) , au niveau de 12 codons. Les modifications ont pour conséquence le changement de 11 aminoacides et la perte, par rapport à la séquence déduite du gène, de 7 résiduε, danε la région C- terminale, perte provoquée par la création d'un codon stop.
EXEMPLE 10 : Construction d'un gène chimérique conforme à l'invention cox IV-cox II (SEQ ID n * 5).
Les séquence codant pour cox II sont obtenues à partir d'un ADNc correspondant aux formes éditées et non éditées d'ARNm mitochondrial de blé.
Le fragment du gène cox II non édité présente la séquence de formule III définie ci-dessuε et est fusionné à la séquence de transfert cox IV de levure telle que définie ci-dessuε. Le fragment résultant est similaire à celui obtenu à 1 ' exemple 1.
L'ARNm chez le blé subit des changements de nucléotides (editing) , au niveau de 16 codonε . Les modifications ont pour conséquence le changement de 16 aminoacides par rapport à la séquence déduite du gène cox
II.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de seε modeε de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui vien- nent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en em¬ brasse au contraire toutes les varianteε qui peuvent ve¬ nir à l'eεprit du technicien en la matière, εanε ε' écar¬ ter du cadre, ni de la portée de la préεente invention.
LISTE DE SEQUENCES
( 1 ) INFORMATION GENERALE :
( i ) DEPOSANT :
(A) NOM: Centre National de la Recherche Scientifique
C.N.R.S.
(B) RUE: 3 rue Michel-Ange
(C) VILLE: Paris
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 75016
(ii) TITRE DE L' INVENTION: PLANTES TRANSGENIQUES INCLUANT UNE SEQUENCE D'ACIDE NUCLEIQUE HYBRIDE, COMPORTANT UN FRAGMENT DE GENE MITOCHONDRIAL NON EDITE DE VEGETAUX SUPERIEURS ET LEUR PROCEDE D'OBTENTION.
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 6
(iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (OEB)
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 568 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
( i i ) TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm
( ix ) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE :
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 99..527
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
GTCAACGTAT TCTTCTCCCT GAAGAAACAG TATACTAACA ATACTCACCC ATTTCGATTT 60
TGATGTTGCC ATACAAATAG ATAACAAGCA CAAGCACA ATG CTT TCA CTA CGT 113
Met Leu Ser Leu Arg 1 5
CAA TCT ATA AGA TTT TTC AAG CCA GCC ACA AGA ACT TTG TGT AGC TCT 161 Gin Ser Ile Arg Phe Phe Lys Pro Ala Thr Arg Thr Leu Cys Ser Ser lu 15 20
AGA TAT CTG CTT CAG CAA AAA CCC GTG GTG AAA ACT GCC CAA AAC TTA 209
Arg Tyr Leu Leu Gin Gin Lys Pro Val Val Lys Thr Ala Gin Asn Leu
25 30 35
GCA GAA GTT AAT GGT CCA GAA ACT TTG ATT GGT CCT GGT GCT AAA GAG 257
Ala Glu Val Asn Gly Pro Glu Thr Leu Ile Gly Pro Gly Ala Lys Glu 40 45 50
GGT ACC CGG GGA TCC TCT AGA GTC GAG ATG TTA GAA GGT GCT AAA TCA 305
Gly Thr Arg Gly Ser Ser Arg Val Glu Met Leu Glu Gly Ala Lys Ser 55 60 65
ATA GGT GCC GGA GCT GCT ACA ATT GCT TTA GCC GGA GCT GCT GTC GGT 353
Ile Gly Ala Gly Ala Ala Thr Ile Ala Leu Ala Gly Ala Ala Val Gly 70 75 80 85
ATT GGA AAC GTC CTC AGT TCT TTG ATT CAT TCC GTG GCG CGA AAT CCA 401
Ile Gly Asn Val Leu Ser Ser Leu Ile His Ser Val Ala Arg Asn Pro 90 95 100
TCA TTG GCT AAA CAA TCA TTT GGT TAT GCC ATT TTG GGC TTT GCT CTC 449
Ser Leu Ala Lys Gin Ser Phe Gly Tyr Ala Ile Leu Gly Phe Ala Leu
105 110 115
ACC GAA GCT ATT GCA TTG TTT GCC CCA ATG ATG GCC TTT CTG ATC TCA 497
Thr. Glu Ala Ile Ala Leu Phe Ala Pro Met Met Ala Phe Leu Ile Ser 120 125 130
TTC GTT TTC CGA TCG CAT AAA AAG TCA TGAGATCAAA AAAGAAATGT 544
Phe Val Phe Arg Ser His Lys Lys Ser 135 ' 140
GTGAATGTAG TTACAGATGT CGAC 568
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 142 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
Met Leu Ser Leu Arg Gin Ser Ile Arg Phe Phe Lys Pro Ala Thr Arg 1 5 10 15
Thr Leu Cys Ser Ser Arg Tyr Leu Leu Gin Gin Lys Pro Val Val Lys 20 25 30
Thr Ala Gin Asn Leu Ala Glu Val Asn Gly Pro Glu Thr Leu Ile Gly
35 40 45
Pro Gly Ala Lys Glu Gly Thr Arg Gly Ser Ser Arg Val Glu Met Leu
50 55 60
Glu Gly Ala Lys Ser Ile Gly Ala Gly Ala Ala Thr Ile Ala Leu Ala
65 70 75 80
Gly Ala Ala Val Gly Ile Gly Asn Val Leu Ser Ser Leu Ile His Ser 85 90 95
Val Ala Arg Asn Pro Ser Leu Ala Lys Gin Ser Phe Gly Tyr Ala Ile
100 105 110
Leu Gly Phe Ala Leu Thr Glu Ala Ile Ala Leu Phe Ala Pro Met Met
115 120 125
Ala Phe Leu Ile Ser Phe Val Phe Arg Ser His Lys Lys Ser 130 135 140
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1106 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc oour ARNm
!ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
(A) NOM/CLE: CDΞ
(B) EMPLACEMENT: 99..1106
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
GTCAACGTAT TCTTCTCCCT GAAGAAACAG TATACTAACA ATACTCACCC ATTTCGATTT 60
TGATGTTGCC ATACAAATAG ATAACAAGCA CAAGCACA ATG CTT TCA CTA CGT 113
Met Leu Ser Leu Arg 1 5
CAA TCT ATA AGA TTT TTC AAG CCA GCC ACA AGA ACT TTG TGT AGC TCT 161 Gin Ser Ile Arg Phe Phe Lys Pro Ala Thr Arg Thr Leu Cys Ser Ser 10 15 20
AGA TAT CTG CTT CAG CAA AAA CCC GTG GTG AAA ACT GCC CAA AAC TTA 209 Arg Tyr Leu Leu Gin Gin Lys Pro Val Val Lys Thr Ala Gin Asn Leu 25 30 35
GCA GAA GTT AAT GGT CCA GAA ACT TTG ATT GGT CCT GGT GCT AAA GAG 257
Ala Glu Val Asn Gly Pro Glu Thr Leu Ile Gly Pro Gly Ala Lys Glu
40 45 50
GGT ACC CGG GGA TCC TCT AGA GTC GAG ATG GAT AAT TTT ATC CAG AAT 305
Gly Thr Arg Gly Ser Ser Arg Val Glu Met Asp Asn Phe Ile Gin Asn
55 60 65
CTG CCT GGT GCC TAC CCG GAA ACC CCA TTG GAT CAA TTT GCC ATT ATC 353
Leu Pro Gly Ala Tyr Pro Glu Thr Pro Leu Asp Gin Phe Ala Ile Ile
70 75 80 85
CCA ATA ATT GAT CTT CAT GTG GGC AAC TTT TAT TTA TCA TTT ACA AAT 401
Pro Ile Ile Asp Leu His Val Gly Asn Phe Tyr Leu Ser Phe Thr Asn 90 95 100
GAA GTC TTG TAT ATG CTG CTC ACT GTC GTT TTG GTC GTT TTT CTT TTT 449
Glu Val Leu Tyr Met Leu Leu Thr Val Val Leu Val Val Phe Leu Phe
105 110 115
TTT GTT GTT ACG AAA AAG GGA GGT GGA AAG TCA GTG CCA AAT GCA TGG 497
Phe Val Val Thr Lys Lys Gly Gly Gly Lys Ser Val Pro Asn Ala Trp
120 125 130
CAA TCC TTG GTC GAG CTT ATT TAT GAT TTC GTG CTG AAC CTG GTA AAC 545
Gin Ser Leu Val Glu Leu Ile Tyr Asp Phe Val Leu Asn Leu Val Asn
135 140 145
GAA CAA ATA GGT GGT CTT TCC GGA AAT GTG AAA CAA AAG TTT TTC CCT 593
Glu Gin Ile Gly Gly Leu Ser Gly Asn Val Lys Gin Lys Phe Phe Pro
150 155 160 165
CGC ATC TCG GTC ACT TTT ACT TTT TCG TTA TTT CGT AAT CCC CAG GGT 641
Arg Ile Ser Val Thr Phe Thr Phe Ser Leu Phe Arg Asn Pro Gin Gly 170 175 180
ATG ATA CCC TTT AGC TTC ACA GTG ACA AGT CAT TTT CTC ATT ACT TTG 689
Met Ile Pro Phe Ser Phe Thr Val Thr Ser His Phe Leu Ile Thr Leu
185 190 195
GCT CTT TCA TTT TCC ATT TTT ATA GGC ATT ACG ATC GTT GGA TTT CAA 737
Ala Leu Ser Phe Ser Ile Phe Ile Gly Ile Thr Ile Val Gly Phe Gin
200 205 210
AGA CAT GGG CTT CAT TTT TTT AGC TTC TTA TTA CCT GCG GGA GTC CCA 785
Arg His Gly Leu His Phe Phe Ser Phe Leu Leu Pro Ala Gly Val Pro
215 220 225
CTG CCG TTA GCA CCT TTC TTA GTA CTC CTT GAG CTA ATC TCT TAT TGT 833
Leu Pro Leu Ala Pro Phe Leu Val Leu Leu Glu Leu Ile Ser Tyr Cys
230 235 240 245
TTT CGT GCA TTA AGC TTA GGA ATA CGT TTA TTT GCT AAT ATG ATG GCC 881
Phe Arg Ala Leu Ser Leu Gly Ile Arg Leu Phe Ala Asn Met Met Ala 250 255 260
GGT CAT AGT TTA GTA AAG ATT TTA AGT GGG TTT GCT TGG ACT ATG CTA 929 Gly His Ser Leu Val Lys Ile Leu Ser Gly Phe Ala Trp Thr Met Leu 265 270 275
TTT CTG AAT AAT ATT TTC TAT TTC ATA GGA GAT CTT GGT CCC TTA TTT 977 Phe Leu Asn Asn Ile Phe Tyr Phe Ile Gly Asp Leu Gly Pro Leu Phe 280 285 290
ATA GTT CTA GCA TTA ACC GGT CTG GAA TTA GGT GTA GCT ATA TCA CAA 1025 Ile Val Leu Ala Leu Thr Gly Leu Glu Leu Gly Val Ala Ile Ser Gin 295 300 305
GCT CAT GTT TCT ACG ATC TCA ATT TGT ATT TAC TTG AAT GAT GCT ACA 1073 Ala His Val Ser Thr Ile Ser Ile Cys Ile Tyr Leu Asn Asp Ala Thr 310 315 320 325
AAT CTC CAT CAA AAT GAG TCA TTT CAT AAT TGA 1106
A.sn Leu His Gin Asn Glu Ser Phe His Asn 330 335
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 335 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
Met Leu Ser Leu Arg Gin Ser Ile Arg Phe Phe Lys Pro Ala Thr Arg 1 5 10 15
Thr Leu Cys Ser Ser Arg Tyr Leu Leu Gin Gin Lys Pro Val Val Lys 20 25 30
Thr Ala Gin Asn Leu Ala Glu Val Asn Gly Pro Glu Thr Leu Ile Gly 35 40 45
Pro Gly Ala Lys Glu Gly Thr Arg Gly Ser Ser Arg Val Glu Met Asp 50 Ξ5 60
Asn Phe Ile Gin Asn Leu Pro Gly Ala Tyr Pro Glu Thr Pro Leu Asp 65 70 75 80
Gin Phe Ala Ile Ile Pro Ile Ile Asp Leu His Val Gly Asn Phe Tyr 85 90 95
Leu Ser Phe Thr Asn Glu Val Leu Tyr Met Leu Leu Thr Val Val Leu 100 105 110
Val Val Phe Leu Phe Phe Val Val Thr Lys Lys Gly Gly Gly Lys Ser 115 120 125
Val Pro Asn Ala Trp Gin Ser Leu Val Glu Leu Ile Tyr Asp Phe Val 130 135 140
Leu Asn Leu Val Asn Glu Gin Ile Gly Gly Leu Ser Gly Asn Val Lys 145 150 155 160
Gin Lys Phe Phe Pro Arg Ile Ser Val Thr Phe Thr Phe Ser Leu Phe 165 170 175
Arg Asn Pro Gin Gly Met Ile Pro Phe Ser Phe Thr Val Thr Ser His 180 185 190
Phe Leu Ile Thr Leu Ala Leu Ser Phe Ser Ile Phe Ile Gly Ile Thr 195 200 205
Ile Val Gly Phe Gin Arg His Gly Leu His Phe Phe Ser Phe Leu Leu 210 215 220
Pro Ala Gly Val Pro Leu Pro Leu Ala Pro Phe Leu Val Leu Leu Glu 225 230 235 240
Leu Ile Ser Tyr Cys Phe Arg Ala Leu Ser Leu Gly Ile Arg Leu Phe 245 250 255
Ala Asn Met Met Ala Gly His Ser Leu Val Lys Ile Leu Ser Gly Phe 260 265 270
Ala Trp Thr Met Leu Phe Leu Asn Asn Ile Phe Tyr Phe Ile Gly Asp 275 280 285
Leu Gly Pro Leu Phe Ile Val Leu Ala Leu Thr Gly Leu Glu Leu Gly 290 295 300
Val Ala Ile Ser Gin Ala His Val Ser Thr Ile Ser Ile Cys Ile Tyr 305 310 315 320
Leu Asn Asp Ala Thr Asn Leu His Gin Asn Glu Ser Phe His Asn 325 330 335
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1067 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
( i i ) TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARN
( ix ) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE :
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 99..1067
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
GTCAACGTAT TCTTCTCCCT GAAGAAACAG TATACTAACA ATACTCACCC ATTTCGATTT 60
TGATGTTGCC ATACAAATAG ATAACAAGCA CAAGCACA ATG CTT TCA CTA CGT 113
Met Leu Ser Leu Arg 1 5
CAA TCT ATA AGA TTT TTC AAG CCA GCC ACA AGA ACT TTG TGT AGC TCT 161 Gin Ser Ile Arg Phe Phe Lys Pro Ala Thr Arg Thr Leu Cys Ser Ser 10 15 20
AGA TAT CTG CTT CAG CAA AAA CCC GTG GTG AAA ACT GCC CAA AAC TTA 209 Arg Tyr Leu Leu Gin Gin Lys Pro Val Val Lys Thr Ala Gin Asn Leu 25 30 35
GCA GAA GTT AAT GGT CCA GAA ACT TTG ATT GGT CCT GGT GCT AAA GAG 257 Ala Glu Val Asn Gly Pro Glu Thr Leu Ile Gly Pro Gly Ala Lys Glu 40 45 50
GGT ACC CGG GGA TCC TCT AGA GTC GAG ATG ATT CTT CGT TCA TTA TCA 305 Gly Thr Arg Gly Ser Ser Arg Val Glu Met Ile Leu Arg Ser Leu Ser 55 60 65
TGT CGA TTC TTC ACA ATC GCT CTT TGT GAT GCT GCG GAA CCA TGG CAA 353 Cys Arg Phe Phe Thr Ile Ala Leu Cys Asp Ala Ala Glu Pro Trp Gin 70 75 80 65
TTA GGA TCT CAA GAC GCA GCA ACA CCT ATG ATG CAA GGA ATC ATT GAC 401 Leu Gly Ser Gin Asp Ala Ala Thr Pro Met Met Gin Gly Ile Ile Asp 90 95 100
TTA CAT CAC GAT ATC TTT TTC TTC CTC ATT CTT ATT TTG GTT TTC GTA 449 Leu His His Asp Ile Phe Phe Phe Leu Ile Leu Ile Leu Val Phe Val 105 110 115
TCA CGG ATG TTG GTT CGC GCT TTA TGG CAT TTC AAC GAG CAA ACT AAT 497 Ser Arg Met Leu Val Arg Ala Leu Trp His Phe Asn Glu Gin Thr Asn 120 125 130
CCA ATC CCA CAA AGG ATT GTT CAT GGA ACT ACT ATG GAA ATT ATT CGG 545 Pro Ile Pro Gin Arg Ile Val His Gly Thr Thr Met Glu Ile Ile Arg 135 140 145
ACC ATA TTT CCA AGT GTC ATT CTT TTG TTC ATT GCT ATA CCA TCG TTT 593
Thr Ile Phe Pro Ser Val Ile Leu Leu Phe Ile Ala Ile Pro Ser Phe
150 155 160 165
GCT CTG TTA TAC TCA ATG GAC GGG GTA TTA GTA GAT CCA GCC ATT ACT 641
Ala Leu Leu Tyr Ser Met Asp Gly Val Leu Val Asp Pro Ala Ile Thr 170 175 180
ATC AAA GCT ATT GGA CAT CAA TGG TAT CGG ACT TAT GAG TAT TCG GAC 689
Ile Lys Ala Ile Gly His Gin Trp Tyr Arg Thr Tyr Glu Tyr Ser Asp 185 190 195
TAT AAC AGT TCC GAT GAA CAG TCA CTC ACT TTT GAC AGT TAT ACG ATT 737
Tyr Asn Ser Ser Asp Glu Gin Ser Leu Thr Phe Asp Ser Tyr Thr Ile 200 205 210
CCA GAA GAT GAT CCA GAA TTG GGT CAA TCA CGT TTA TTA GAA GTT GAC 785
Pro Glu Asp Asp Pro Glu Leu Gly Gin Ser Arg Leu Leu Glu Val Asp
215 220 225
AAT AGA GTG GTT GTA CCA GCC AAA ACT CAT CTA CGT ATG ATT GTA ACA 833
Asn Arg Val Val Val Pro Ala Lys Thr His Leu Arg Met Ile Val Thr
230 235 240 245
CCC GCT GAT GTA CCT CAT AGT TGG GCT GTA CCT TCC TCA GGT GTC AAA 881
Pro Ala Asp Val Pro His Ser Trp Ala Val Pro Ser Ser Gly Val Lys 250 255 260
TGT GAT GCT GTA CCT GGT CGT TCA AAT CTT ACC TTC ATC TCG GTA CAA 929
Cys Asp Ala Val Pro Gly Arg Ser Asn Leu Thr Phe Ile Ser Val Gin 265 270 275
CGA GAA GGA GTT TAC TAT GGT CAG TGC AGT GAG ATT CGT GGA ACT AAT 977
Arg Glu Gly Val Tyr Tyr Gly Gin Cys Ser Glu Ile Arg Gly Thr Asn 280 285 290
CAT GCC TTT ACG CCT ATC GTC GTA GAA GCA GTG ACT TTG AAA GAT TAT 1025
His Ala Phe Thr Pro Ile Val Val Glu Ala Val Thr Leu Lys Asp Tyr
295 300 305
GCG GAT TGG GTA TCC AAT CAA TTA ATC CTC CAA ACC AAC TAA 1067
Ala Asp Trp Val Ser Asn Gin Leu Ile Leu Gin Thr Asn
310 315 320
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 322 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
Met Leu Ser Leu Arg Gin Ser Ile Arg Phe Phe Lys Pro Ala Thr Arg 1 5 10 15
Thr Leu Cys Ser Ser Arg Tyr Leu Leu Gin Gin Lys Pro Val Val Lys 20 25 30
Thr Ala Gin Asn Leu Ala Glu Val Asn Gly Pro Glu Thr Leu Ile Gly 35 40 45
Pro Gly Ala Lys Glu Gly Thr Arg Gly Ser Ser Arg Val Glu Met Ile 50 55 60
Leu Arg Ser Leu Ser Cys Arg Phe Phe Thr Ile Ala Leu Cys Asp Ala 65 70 75 80
Ala Glu Pro Trp Gin Leu Gly Ser Gin Asp Ala Ala Thr Pro Met Met 85 90 95
Gin Gly Ile Ile Asp Leu His His Asp Ile Phe Phe Phe Leu Ile Leu 100 105 110
Ile Leu Val Phe Val Ser Arg Met Leu Val Arg Ala Leu Trp His Phe 115 120 125
Asn Glu Gin Thr Asn Pro Ile Pro Gin Arg Ile Val His Gly Thr Thr 130 135 140
Met Glu Ile Ile Arg Thr Ile Phe Pro Ser Val Ile Leu Leu Phe Ile 145 150 155 160
Ala Ile Pro Ser Phe Ala Leu Leu Tyr Ser Met Asp Gly Val Leu Val 165 170 175
Asp Pro Ala Ile Thr Ile Lys Ala Ile Gly His Gin Trp Tyr Arg Thr 180 185 190
Tyr Glu Tyr Ser Asp Tyr Asn Ser Ser Asp Glu Gin Ser Leu Thr Phe 195 200 205
Asp Ser Tyr Thr Ile Pro Glu Asp Asp Pro Glu Leu Gly Gin Ser Arg 210 215 220
Leu Leu Glu Val Asp Asn Arg Val Val Val Pro Ala Lys Thr His Leu 225 230 235 240
Arg Met Ile Val Thr Pro Ala Asp Val Pro His Ser Trp Ala Val Pro 245 250 255
Ser Ser Gly Val Lys Cys Asp Ala Val Pro Gly Arg Ser Asn Leu Thr 260 265 270
Phe Ile Ser Val Gin Arg Glu Gly Val Tyr Tyr Gly Gin Cys Ser Glu 275 280 285
Ile Arg Gly Thr Asn His Ala Phe Thr Pro Ile Val Val Glu Ala Val 290 295 300
Thr Leu Lys Asp Tyr Ala Asp Trp Val Ser Asn Gin Leu Ile Leu Gin 305 310 315 320
Thr Asn