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Title:
TREATMENT FOR SPINAL MUSCULAR ATROPHY
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2019/170930
Kind Code:
A1
Abstract:
The present invention relates to a method for treating spinal muscular atrophy (SMA) in the different stages of development thereof, where the method comprises administering suitable amounts of a calpain inhibitor to a subject who may or may not have developed the first symptoms of the disease. The invention also relates to pharmaceutical compositions comprising a calpain inhibitor which is administered in combination with another compound to enhance the effect, such as histone deacetylase inhibitors and autophagy modulators.

Inventors:
SOLER TATCHÉ ROSA MARÍA (ES)
GARCERÁ TERUEL ANA (ES)
DE LA FUENTE RUIZ SANDRA (ES)
Application Number:
ES2018/070177
Publication Date:
September 12, 2019
Filing Date:
March 09, 2018
Export Citation:
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Assignee:
UNIV LLEIDA (ES)
International Classes:
A61K38/00; A61K31/00; A61K38/57; A61K45/06; A61P25/00
Domestic Patent References:
WO2017218592A12017-12-21
Foreign References:
CA2631071A12009-11-09
US5622967A1997-04-22
Other References:
RICHARD S. FINKEL ET AL: "Nusinersen versus Sham Control in Infantile-Onset Spinal Muscular Atrophy", THE NEW ENGLAND JOURNAL OF MEDICINE, - NEJM -, vol. 377, no. 18, 2 November 2017 (2017-11-02), US, pages 1723 - 1732, XP055528610, ISSN: 0028-4793, DOI: 10.1056/NEJMoa1702752
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SANDRA DE LA FUENTE ET AL: "Calpain Inhibition Increases SMN Protein in Spinal Cord Motoneurons and Ameliorates the Spinal Muscular Atrophy Phenotype in Mice", MOLECULAR NEUROBIOLOGY, 16 October 2018 (2018-10-16), US, XP055528539, ISSN: 0893-7648, DOI: 10.1007/s12035-018-1379-z
FINKEL ET AL., N ENGL J MED., vol. 377, 2017, pages 1723 - 1732
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KERNOCHAN ET AL., HUM MOL GENET, vol. 14, 2005, pages 1171 - 82
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FORAN ET AL., NEUROBIOL DIS, vol. 88, 2016, pages 118 - 24
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CHEMICAL ABSTRACTS, Columbus, Ohio, US; abstract no. 179528-45-1
CHEMICAL ABSTRACTS, Columbus, Ohio, US; abstract no. 170713-71-0
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WANG ET AL., PROC NATL ACAD SCI U S A., vol. 93, 1996, pages 6687 - 6692
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TRATADO DE FARMACIA GALÉNICA; C. FAULÍ I TRILLO; LUZÁN 5: "Remington's Pharmaceutical Sciences", 1993, WILLIAMS & WILKINS PA
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CHEMICAL ABSTRACTS, Columbus, Ohio, US; abstract no. 62959-43-7
CHEMICAL ABSTRACTS, Columbus, Ohio, US; abstract no. 1716-12-7
CHEMICAL ABSTRACTS, Columbus, Ohio, US; abstract no. 122110-53-6
CHEMICAL ABSTRACTS, Columbus, Ohio, US; abstract no. 149647-78-9
CHEMICAL ABSTRACTS, Columbus, Ohio, US; abstract no. 404950-80-7
CHEMICAL ABSTRACTS, Columbus, Ohio, US; abstract no. 414864-00-9
CHEMICAL ABSTRACTS, Columbus, Ohio, US; abstract no. 914382-60-8
CHEMICAL ABSTRACTS, Columbus, Ohio, US; abstract no. 497833-27-9
CHEMICAL ABSTRACTS, Columbus, Ohio, US; abstract no. 726169-73-9
CHEMICAL ABSTRACTS, Columbus, Ohio, US; abstract no. 209783-80-2
CHEMICAL ABSTRACTS, Columbus, Ohio, US; abstract no. 54-05-7
CHEMICAL ABSTRACTS, Columbus, Ohio, US; abstract no. 5142-23-4
CHEMICAL ABSTRACTS, Columbus, Ohio, US; abstract no. 88899-55-2
CHEMICAL ABSTRACTS, Columbus, Ohio, US; abstract no. 99-20-7
CHEMICAL ABSTRACTS, Columbus, Ohio, US; abstract no. 53123-88-9
CHEMICAL ABSTRACTS, Columbus, Ohio, US; abstract no. 501-36-0
CHEMICAL ABSTRACTS, Columbus, Ohio, US; abstract no. 458-37-7
GOU-FABREGAS ET AL., J NEUROCHEM, vol. 110, 2009, pages 1842 - 54
GARCERA ET AL., NEUROBIOL DIS, vol. 42, 2011, pages 415 - 26
PRESS; MILBRANDT, J. NEUROSCI., vol. 28, 2008, pages 4861 - 71
Attorney, Agent or Firm:
ARIAS SANZ, Juan (ES)
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Claims:
REIVINDICACIONES

I- Un inhibidor de calpaína para su uso en el tratamiento de la atrofia muscular espinal (AME).

2- El inhibidor de calpaína para su uso según la reivindicación 1 donde la AME es consecuencia de una disrupción homocigótica en el gen SMN1.

3- El inhibidor de calpaína para su uso según reivindicaciones 1-2 donde el paciente que sufre AME se caracteriza por presentar en el locus del gen SMN2 un número de copias igual o inferior a 8.

4- El inhibidor de calpaína para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-3 donde la AME es tipo I, tipo II, tipo III o tipo IV.

5- El inhibidor de calpaína para su uso según las reivindicaciones 1-4 en donde el inhibidor es calpeptina o calpastatina

6- El inhibidor de calpaína para su uso según la reivindicación 5 donde la calpeptina se administra en forma de una composición que comprende un solvente orgánico

7- El inhibidor de calpaína para su uso según la reivindicación 6 donde el solvente orgánico es dimetilsulfóxido (DMSO).

8- El inhibidor de calpaína para su uso según las reivindicaciones 5-7 en donde la calpeptina se administra a una dosis de entre 0,1 y 1 mg/kg.

9- El inhibidor de calpaína para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-10 donde el tratamiento se administra a un paciente que ha desarrollado al menos un síntoma de AME.

10-E1 inhibidor de calpaína para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-10 donde el tratamiento se administra a un paciente que no ha desarrollado ningún síntoma de AME.

I I-E1 inhibidor de calpaína para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-12 donde el tratamiento se administra a un paciente desde el día siguiente al nacimiento.

l2-Composición farmacéutica que comprende un inhibidor de calpaína y un compuesto seleccionado del grupo formado por:

(i) un inhibidor de histona deacetilasa (HDAC) y

(ii) un modulador de autofagia. 13-Composición farmacéutica según la reivindicación 12 en donde el inhibidor de calpaína es calpeptina o calpastatina.

14-Composición según las reivindicaciones 12 o 13 para su uso en el tratamiento de AME.

15- Composición para su uso según la reivindicación 14 en donde la AME es consecuencia de una disrupción homocigótica en el gen SMN1.

16- Composición para su uso según las reivindicaciones 14 o 15 en donde el paciente que sufre AME se caracteriza por presentar en el locus del gen SMN2 un número de copias igual o inferior a 8.

17- Composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16 donde la

AME es tipo I, tipo II, tipo III o tipo IV.

18- Composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17 en donde la composición se administra a un paciente que ha desarrollado al menos un síntoma de AME.

19- Composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18 en donde la composición se administra a un paciente que no ha desarrollado ningún síntoma de AME.

20- Composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 12-19 donde el tratamiento se administra a un paciente desde el día siguiente al nacimiento.

Description:
TRATAMIENTO PARA LA ATROFIA MUSCULAR ESPINAL

CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se relaciona con un tratamiento que permite mejorar los síntomas, el pronóstico y/o el desarrollo de la atrofia muscular espinal (AME), en cualquiera de sus estadios de desarrollo. La invención se puede utilizar para el tratamiento de pacientes que ya han manifestado síntomas de la enfermedad, o que aún no los han manifestado.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La atrofia muscular espinal (AME) es un trastorno neuromuscular recesivo autosómico y la principal causa genética de mortalidad en menores de un año. Se caracteriza por la degeneración de las motoneuronas (MN) de la médula espinal que produce atrofia muscular y debilidad. La enfermedad AME está causada por la alteración homocigota del gen Survival Motor Neuron 1 (SMN1) localizado en el cromosoma 5q3 (región telomérica), que es responsable de la producción de la proteína de supervivencia de motoneuronas (SMN). En seres humanos existe una duplicación del gen SMN en la región centromérica, SMN2, que produce principalmente una isoforma truncada de SMN que es incapaz de compensar la pérdida de SMN1 en pacientes. En AME, el número de copias de SMN2 determina los niveles intracelulares de SMN que definen el inicio y la gravedad de la enfermedad.

Actualmente, los pacientes de AME se clasifican dependiendo de la gravedad de la enfermedad en pacientes de AME tipo I, AME tipo II, AME tipo III o AME tipo IV. Los diferentes tipos de AME se establecen en función de la gravedad de la enfermedad, la edad a la que se inician los síntomas y la fúnción motora máxima que alcanzan los pacientes. El tipo de AME se correlaciona con la cantidadde proteína SMN2 que, a su vez, depende del número de copias de dicho gen en el genoma del paciente.

Diferentes aproximaciones terapéuticas para AME han demostrado que elevar la proteína SMN mejora los síntomas de la enfermedad (Finkel et al., 2017, N Engl J Med. 2017, 377: 1723-1732). Aumentar los niveles de SMN se puede lograr por varios mecanismos tales como el aumento en la expresión de SMN2 y el fomento de la estabilidad de la proteína SMN. Los mecanismos implicados en la regulación de la estabilidad de la proteína SMN incluyen el sistema de ubiquitina proteasoma (UPS) (Kwon et al., 2011. Hum Mol Genet. 2011 20:3667-77), oligomerización de SMN (Burnett et al., 2009. Mol Cell Biol. 29: 1107-15), inhibidores de histona desacetilasa (Kernochan et al., 2005. Hum Mol Genet. 14: 1171-82) y autofagia (Garcera et al., 2013. Cell Death Dis. 4:e686; Periyakaruppiah et al., 2016. Exp Neurol. 283:287-97). Algunos de los estabilizadores de SMN se han usado para analizar su efecto sobre el fenotipo de ratones AME. Resultados recientes han demostrado que el tratamiento de ratones SMNA7 usando inhibidores del proteasoma y/o inhibidores de histona desacetilasa mejoran la supervivencia y la función motora (Butchbach et al. Exp Neurol. 2016. 279: 13-26; Foran et al., 2016 Neurobiol Dis. 88: 118-24).

Actualmente no hay terapias eficaces para el tratamiento de AME, especialmente de las formas más severas de la enfermedad, de manera que hay una necesidad en la técnica de terapias alternativas adecuadas para el tratamiento de AME en los diferentes estadios de la enfermedad.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN

En un primer aspecto la invención se relaciona con el uso de un inhibidor de calpaína para el tratamiento de la atrofia muscular espinal (AME).

En un segundo aspecto la invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de calpaína y un compuesto seleccionado del grupo formado por:

(i) un inhibidor de histona deacetilasa (HDAC) y

(ii) un modulador de autofagia.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Efecto de la reducción de calpaína endógena sobre el nivel de proteína SMN en MN de médula espinal en cultivo. Las MN se transdujeron con construcciones de lentivirus shCalp o vectores vaciós (EV) y se mantuvieron en presencia de una mezcla de factores neurotróficos (NTF) (acrónimos incluidos según sus iniciales en inglés). (A) Se sometieron extractos de proteína de cultivos transducidos 3, 6 y 9 días a análisis por inmunotransferencia y se ensayaron con anticuerpos anti-SMN o anti-calpaína. Las membranas se volvieron a ensayar con un anticuerpo anti-a-tubulina, usado como un control de carga. El gráfico representa la expresión de Smn y corresponde a la cuantificación de tres experimentos independientes ± EEM. (B) Imágenes confocales representativas de células transducidas con el vector vacío (EV) y shCalp mantenidas 6 días en presencia de los NTF. Las células se fijaron y se realizó inmunofluorescencia con anticuerpo anti-SMN.

Los asteriscos indican diferencias significativas usando la prueba ANOVA unívoca o prueba de la t de Student.

Figura 2. La atenuación de calpaína previene la reducción de SMN causada por despolarización de la membrana.

Figura 3. El tratamiento con calpeptina aumenta el nivel de proteína SMN en MN. Figura 4. El tratamiento con calpeptina previene la degeneración de neuritas en MN mutantes AME.

Figura 5. La administración de calpeptina extiende la supervivencia de ratones AME grave y AME SMNA7.

Figura 6. El tratamiento con calpeptina mejora la función motora en ratones AME grave, pero no en ratones SMNA7

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Los autores de la presente invención han identificado que el tratamiento con un inhibidor de calpaína en cultivos in vitro de MNs y en modelos animales de AME es capaz de mejorar la supervivencia, los síntomas más aparentes y el curso clínico de la enfermedad atenuando la pérdida de peso y mejorar el comportamiento motor.

Inhibidor de calpaína para su uso en el tratamiento de AME

Los inventores de la presente invención han encontrado que la inhibición de la calpaína en ratones que sufren AME resulta en un aumento en la supervivencia de dichos ratones y en una mejora de la función motora. En consecuencia, en un primer aspecto la invención se relaciona con un inhibidor de calpaína para su uso en el tratamiento de AME. La invención también se relaciona con un método para el tratamiento de la AME que comprende administrar un inhibidor de calpaína.

El término“calpaína” tal como aquí se utiliza se emplea para referirse de forma genérica a una familia de cisteína proteasas neutras no lisosomales cuya actividad es dependiente de calcio. Calpaína 1 (m-calpaína) y Calpaína 2 (m-calpaína) son las calpaínas mejor caracterizadas en humanos y se activan por niveles de calcio micro y milimolar, respectivamente. En humanos calpaína 1 corresponde a la proteína codificada por el gen CAPN1 con número de acceso en ETniprot P07384 (fecha 20 diciembre 2017); calpaína 2 corresponde a la proteína codificada por el gen CAPN2 con número de acceso en Uniprot P17655 (fecha 22 noviembre 2017).

El término“inhibidor de calpaína” tal como aquí se utiliza se entiende como cualquier sustancia o compuesto que sea capaz de impedir o bloquear de forma específica la transcripción y/o la traducción de un gen que codifica la proteína calpaína o que sea capaz de impedir de forma específica que la proteína codificada por dicho gen realice su fúnción (es decir, impedir o bloquear la actividad). En una realización preferida, el inhibidor de calpaína actúa sobre calpaína 1 y 2. En otra realización preferida, el inhibidor de calpaína actúa sobre calpaína 1 sin afectar de forma significativa la actividad o la expresión de calpaína 2. En otra forma de realización preferida, el inhibidor es específico de calpaína 2 sin afectar de forma significativa la actividad o expresión de calpaína 1.

Ejemplos no limitativos de inhibidores de calpaína que actúan reduciendo la expresión calpaína incluyen, sin limitación, un ARN interferente pequeño (ARNip), un ARN horquillado corto (ARNhc), un microARN (miARN), un oligonucleótido antisentido o una ribozima.

El término ARN interferente pequeño (“ARNip”) se refiere a dúplex de ARN inhibidores pequeños que inducen la vía de interferencia de ARN. Estas moléculas pueden variar en longitud (generalmente de 18-30 pares de bases) y contienen grados variables de complementariedad a sus ARNm diana en la cadena antisentido. Algunos ARNip, pero no todos, tienen bases no apareadas sobresalientes en el extremo 5’ ó 3’ de la hebra sentido y/o la hebra antisentido. El término“ARNip” incluye dúplex de dos cadenas separadas. Como se usa aquí, las moléculas de ARNip no están limitadas a moléculas de ARN sino que abarcan además ácidos nucleicos con uno o más nucleótidos químicamente modificados, tales como morfolinos.

El término“ARNhc” o“ARN horquillado corto” como se usa aquí, se refiere a un ARNbc donde las dos cadenas están unidas por una cadena sin interrumpir de nucleótidos entre el extremo 3’ de una hebra y el extremo 5’ de la otra hebra respectiva para formar una estructura dúplex.

El término “micro ARN” o “miARN” se refiere a moléculas de ARN monocatenario cortas, típicamente de alrededor de 21-23 nucleótidos de longitud capaces de regular la expresión génica. Los miARN pueden ser sintéticos (es decir, recombinantes) o naturales.

Lina “secuencia antisentido”, como se usa aquí, incluye oligonucleótidos antisentido o sentido que comprenden una secuencia de ácido nucleico monocatenario (ARN o ADN) capaz de unirse a secuencias de ARNm (sentido) o ADN (antisentido) diana.

Como se usa aquí, el término “ribozima” o “enzima de ARN” o “ARN catalítico” se refiere a una molécula de ARN que cataliza una reacción química.

El ácido nucleico con capacidad de inhibir la expresión de calpaína puede contener una o más modificaciones en las nucleobases, en los azúcares y/o en los enlaces entre nucleótidos.

Las modificaciones a uno o más residuos del esqueleto de los ácidos nucleicos pueden comprender una o más de las siguientes: modificaciones del azúcar en T tal como 2’-0-metil (2’-OMe), 2’-0-metoxietil (2’-MOE), 2’-0-metoxietoxi, T - fluoro (2’-F), 2'-allil, 2’-0-[2-(metilamino)-2-oxoetil], 2’-0-(N-metilcarbamato); modificaciones del azúcar en 4’ incluyendo 4’-tio, puente 4’-CH 2 -0-2’, puente 4- (CH 2 ) 2 -0-2’; ácido nucleico cerrado (LNA, locked nucleic acid); ácido péptido nucleico (APN); ácido nucleico intercalante (INA); ácido nucleico intercalante enrollado (TINA); ácidos nucleicos de hexitol (HNA); ácido arabinonucleico (ANA); ácidos ciclohexano nucleicos (CNA); ácido ciclohexenilnucleico (CeNA); ácido treosil nucleico (TNA); oligonucleótidos morfolinos; Gap-meros; Mix-meros; incorporación de péptidos ricos en arginina; adición de 5’ -fosfato a ARN sintéticos; aptámeros de ARN (Que-Gewirth NS, Gene Ther. 2007 Feb;l4(4):283-9l.); aptámeros de ARN regulados con antídotos en el sujeto del aptámero de ARN específico (ref. Oney S, Oligonucleotides. 2007 Fall; 17(3):265-74) o cualquier combinación de los mismos.

Las modificaciones a uno o más enlaces de nucleósidos de los ácidos nucleicos pueden comprender una o más de las siguientes: fosforotioato, fosforamidato, fosforodiamidato, fosforoditioato, fosforo selenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato y fosforanilidato, o cualquier combinación de los mismos.

Un ácido nucleico cerrado (LNA), con frecuencia denominado ARN inaccesible, es un nucleótido de ARN modificado. El grupo ribosa de un nucleótido LNA se modifica con un puente extra que une los carbonos T y 4’ (puente 02’,C4’-metileno). El puente“cierra” la ribosa en la conformación estructural 3’-endo, que con frecuencia se encuentra en la forma A del ADN o ARN. Los nucleótidos LNA se pueden mezclar con bases de ADN o ARN en el ácido nucleico cuando se desee. Tales oligómeros están comercialmente disponibles.

Un ácido péptido nucleico (APN) es un polímero artificialmente sintetizado cuyo esqueleto está compuesto de unidades repetitivas de N-(2-aminoetil)-glicina unidas por enlaces peptídicos. Las diferentes bases de purina y pirimidina están unidas al esqueleto por enlaces metilen-carbonilo.

Un ácido nucleico intercalante (INA) es un análogo de ácido nucleico modificado que comprende desoxirribonucleótidos normales unidos covalentemente a inserciones hidrofóbicas.

Los ácidos nucleicos de hexitol (HNA) son nucleótidos construidos de nucleobases naturales y un esqueleto l,5-anhidrohexitol fosforilado. Las asociaciones moleculares entre HNA y ARN son más estables que entre HNA y ADN y entre ácidos nucleicos naturales (ADNbc, ARNbc, ADN/ARN). Otros oligonucleótidos sintéticamente modificados comprenden ANA (ácido arabinonucleico), CNA (ácidos ciclohexano nucleicos), CeNA (ácido ciclohenexilnucleico) y TNA (ácido treosilnucleico).

Los morfolinos son moléculas sintéticas que son el producto de un rediseño de la estructura natural del ácido nucleico. Estructuralmente, la diferencia entre morfolinos y ADN o ARN es que mientras los morfolinos tienen nucleobases estándar, esas bases están unidas a anillos de 6 miembros de morfolina en lugar de a anillos de desoxirribosa/ribosa y los enlaces fosforodiamidato no iónicos entre las subunidades reemplazan los enlaces fosfodiéster aniónicos. Los morfolinos se denominan algunas veces PMO (oligonucleótido fosforodiamidato de morfolino). El anillo de morfolina de 6 miembros tiene la fórmula química 0-(CH 2 -CH 2 ) 2 -NH.

Los gapmeros o “compuestos oligoméricos con huecos” son sondas oligonucleotídicas quiméricas de ARN-ADN-ARN, donde se insertan ventanas o ‘huecos’ (‘gaps’) de ADN en un oligonucleótido de ARN de otra manera normal o modificado conocidas como “alas”. Esta modificación aumenta la estabilidad del oligonucleótido in vivo y la avidez de la interacción de la sonda con la diana, de modo que se pueden usar sondas más cortas de forma eficaz. Preferiblemente, las alas son oligonucleótidos 2’-0-metil (OMe) o 2’-0-metoxietil (MOE) modificados que protegen el bloque interno de la degradación por nucleasas. Además, los nucleótidos que forman el hueco o las alas pueden estar unidos por enlaces fosfodiéster o por enlaces fosforotioato, que los hace así resistentes a la degradación por RNasa.Además, los nucleótidos que forman las alas también pueden estar modificados por incoporación de bases unidas por enlaces 3’ metilfosfonato.

Inhibidores adecuados para su uso en la presente invención y que actúan por medio del silenciamiento de la expresión del gen o genes que codifican las distintas variantes de calpaína incluyen todos aquellos que provocan una reducción en los niveles de ARNm y/o una reducción en los niveles de la proteína correspondiente de al menos 5%, de al menos 10%, de al menos 15%, de al menos 20%, de al menos 25%, de al menos 30%, de al menos 35%, de al menos 40%, de al menos 45%, de al menos 50%, de al menos 55%, de al menos 60%, de al menos 65%, de al menos 70%, de al menos 75%, de al menos 80%, de al menos 85%, de al menos 90%, de al menos 95%, de al menos 100% con respecto a un valor de referencia, siendo dicho valor de referencia el nivel del ARNm o de la proteína correspondiente en ausencia de inhibidor.

Métodos adecuados para determinar si un inhibidor de calpaína es capaz de disminuir los niveles de calpaína incluyen, sin limitación, ensayos estándar para determinar niveles de expresión de mRNA tales como qPCR, RT-PCR, análisis de protección de RNA, Northern blot, RNA dot blot, hibridación in situ y similares.

Métodos adecuados para determinar si un inhibidor actúa disminuyendo los niveles de calpaína incluyen la cuantificación mediante métodos convencionales, por ejemplo, usando anticuerpos con capacidad para unirse específicamente a calpaína y la posterior cuantificación de los complejos anticuerpo-antígeno resultantes. Hay una amplia variedad de ensayos bien conocidos que pueden usarse en la presente invención, que usan anticuerpos no marcados (anticuerpo primario) y anticuerpos marcados (anticuerpos secundarios); entre estas técnicas se incluyen Western blot o transferencia Western, ELISA (enzimoinmunoanálisis ligado a enzimas), RIA (radioinmunoensayo), EIA (inmunoensayo enzimático) competitivo, DAS-ELISA (doble anticuerpo ELISA tipo sándwich), técnicas inmunocitoquímicas e inmunohistoquímicas, técnicas basadas en la uso de biochips o micromatrices de proteínas que incluyen anticuerpos específicos o ensayos basados en la precipitación coloidal en formatos tales como varillas de inmersión. Otras formas de detectar y cuantificar los niveles de la proteína de interés incluyen técnicas de cromatografía de afinidad, ensayos de ligando de unión, etc.

En otra forma preferida de realización, el inhibidor de calpaína actúa inhibiendo la actividad proteasa. Inhibidores adecuados que actúan inhibiendo la actividad de calpaína y que pueden ser usados en la presente invención incluyen, sin limitación:

Calpeptina o Benziloxicarbonileucil-norleucinal o Z-Leu norleucinal) (número CAS 117591-20-5).

Acetil calpastatina ((Número CAS: 123714-50-1)

Inhibidor de calpaína I (Número CAS: 110044-82-1)

- PD 150606 (Número CAS: 179528-45-1)

Aureusimina B (Número CAS: 170713-71-0)

- ALLM (Número CAS: 136632-32-1),

- ALLN (Número CAS: 110044-82-1)

- Leupeptina (Número CAS: 103476-89-7),

Quinolina carboxiamida tal y como se describen en la patente US5622967A,

- Leu-Abu-CONHEt (AK275), (N-((Phenylmethoxy)carbonyl)-L-leucyl-N- ethyl-L-2-aminobutanamide)

- Cbz-Val-Phe-H (MDL28170) (Número CAS: 88191-84-8)

- Los compuestos PD 150606 y PD151746, correspondientes a derivados de ácido a-mercaptoacrilico descritos en Wang et al. (Proc Nati Acad Sci U S A., 1996, 93: 6687-6692)

- MG-132 [Z-Leu-Leu-Leu-CHO] (número CAS: 133407-82-6)

Aclacinomicina A (número CAS: 57576-44-0) - E64-d (Número CAS: 88321-09-9)

- E64 (Número CAS: 66701-25-5)

El término“concentración de inhibición media” (CI50) tal como aquí se utiliza se entiende como la concentración de un inhibidor necesaria para alcanzar una inhibición de la diana del 50%. La especificidad de un inhibidor determinado se define como la relación entre el valor CI50 de un inhibidor determinado para la diana de interés con respecto a otra diana. En una realización preferida, el inhibidor es un inhibidor de calpaína. Es posible determinar si un compuesto es capaz de inhibir la calpaína de una manera más potente que otras dianas comparando los valores CI50. Por ejemplo, un inhibidor específico de calpaína tendrá un valor de CI50 para calpaína menor que para otras proteasas. Dicho valor CI50 podrá ser al menos 2 veces menor, al menos 4 veces menor, al menos 6 veces menor, al menos 8 veces menor, al menos 10 veces menor, al menos 50 veces menor, al menos 100 veces menor, al menos 1.000 veces menor, al menos 10.000 veces menor que el valor CI50 para otras dianas, entre las cuales se incluirían otras proteasas. En otro ejemplo un inhibidor específico de calpaína tendrá un valor de CI50 para calpaína menor que para otras cisteín proteasas. Dicho valor CI50 podrá ser al menos 2 veces menor, al menos 4 veces menor, al menos 6 veces menor, al menos 8 veces menor, al menos 10 veces menor, al menos 50 veces menor, al menos 100 veces menor, al menos 1.000 veces menor, al menos 10.000 veces menor que el valor CI50 para otras dianas, entre las cuales se incluirían otras cisteín proteasas. En una realización, el inhibidor de calpaína tiene una CI50 igual o inferior a 200nM, igual o inferior a 150hM, igual o inferior a lOOnM, igual o inferior a 90nM, igual o inferior a 80nM, igual o inferior a 70nM, igual o inferior a 60nM, igual o inferior a 55nM, igual o inferior a 50nM, igual o inferior a 45nM, igual o inferior a 40nM, igual o inferior a 35nM, igual o inferior a 30nM, igual o inferior a 25nM, igual o inferior a 20nM, igual o inferior a 15hM, igual o inferior a lOnM, igual o inferior a 5nM.

En una realización preferida, la CI50 del inhibidor de calpaína se encuentra entre 10 nM y 100 nM. En una realización más preferida la CI50 se encuentra entre 30 nM-55 nM. En una realización aún más preferida la CI50 es 52 nM, 34 nM, 15hM, 10hM o 20nM. Un inhibidor específico para su uso en la presente invención puede inhibir la actividad de la calpaína al menos un 5%, al menos un 10%, al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 75%, al menos un 90% y todos los rangos entre 5% y 100%.

Métodos adecuados para determinar si un inhibidor actúa disminuyendo la actividad de calpaína incluyen la cuantificación mediante métodos convencionales conocidos en la técnica. Por ejemplo incluyen, sin limitación, ensayos de velocidad inicial, ensayos de curva de progreso, ensayos de cinética transitoria y ensayos de relajación. Los ensayos continuos de actividad enzimática incluyen, sin limitación, ensayos espectrofotométricos, fluorométricos, calorimétricos, quimioluminiscentes, de dispersión de luz y de termoforesis a microescala. Los ensayos discontinuos de actividad enzimática incluyen, sin limitación, ensayos radiométricos y cromatográficos. Como los expertos en la materia entienden, los factores que pueden influir en la actividad enzimática comprenden factores tales como la concentración de sal, temperatura, pH y concentración de sustrato.

El término“tratamiento” tal como aquí se utiliza, se refiere a cualquier tipo de terapia, que tenga como objetivo la terminación, mejora o reducción de la susceptibilidad a padecer AME. Así,“tratamiento”,“tratar” y sus términos equivalentes se refieren a la obtención de un efecto deseado farmacológica o fisiológicamente, que cubre cualquier tratamiento de AME en un mamífero, incluyendo el ser humano. El efecto puede ser profiláctico en términos de proporcionar prevención total o parcial de un trastorno y/o efecto adverso atribuible al mismo. Es decir, "tratamiento" incluye (1) inhibir la enfermedad, por ejemplo deteniendo su desarrollo, (2) interrumpir o finalizar el desorden o por lo menos los síntomas asociados al mismo, por lo que el paciente ya no sufriría la enfermedad o sus síntomas, por ejemplo provocar la regresión de la enfermedad o sus síntomas mediante la restauración o reparación de una función perdida, ausente o defectuosa, o estimular un proceso ineficiente, o (3), aminorar, aliviar o mejorar la enfermedad, o los síntomas asociados a la misma, donde aminorar se utiliza en un sentido amplio para referirse a, al menos, una reducción en la magnitud de un parámetro o síntoma, tal como inflamación, dolor, dificultad respiratoria o incapacidad para desplazarse autónomamente. El término“Atrofia muscular espinal” (AME) como se utiliza en el presente documento es un término aplicado a un variado número de trastornos que tienen en común una etiología genética y que se manifiestan como debilidad debida a lesiones de las neuronas motoras. El término “neurona motora” o“motoneurona” (MN) hace referencia, en vertebrados, a la neurona del sistema nervioso central que proyecta su axón hacia un músculo o glándula.

De manera no limitativa, entre los síntomas que caracterizan la AME se encuentran: tono muscular pobre, debilidad muscular, falta de desarrollo motor, debilidad facial, fasciculación de la lengua, dificultad para deglutir y alimentarse, temblor postural de los dedos, contracturas leves (a menudo en las rodillas, ocasionalmente en los codos) ausencia de reflejos tendinosos, o dificultad respiratoria.

Preferiblemente, la AME se origina como consecuencia de una disrupción en el gen SMN1 (Survival Motor Neuron 1), también conocido como copia telomérica codificante de SMN. En una forma preferida de realización, la AME se origina como consecuencia de una disrupción homocigota del gen SMN1.

“SMN1” (o“TelSMN”), tal y como se usa en la presente invención, se refiere al gen SMNJ telomérico, que codifica la proteína SMN {Survival Motor Neuron Proteiri). En humanos tiene la secuencia mostrada en la base de datos Uniprot con número de acceso Q16637 (fecha 31/01/2018).

En una forma preferida de realización, el paciente a ser tratado de acuerdo a la presente invención contiene una amplificación del gen SMN2 también conocido como copia centromérica no codificante de SMN. En formas preferidas de realización, al menos uno de los loci del gen SMN2 contiene al menos una copia, al menos dos copias, al menos tres copias, al menos cuatro copias, al menos cinco, al menos seis, al menos siete copias o al menos ocho copias del gen SMN2. En una realización más preferida, al menos uno de los loci del gen SMN2 contiene 1 o 2 copias del gen. En otra forma preferida de realización, los dos loci del gen SMN2 contienen al menos una copia, al menos dos copias, al menos tres copias, al menos cuatro copias, al menos cinco, al menos seis, al menos siete copias o al menos ocho copias del gen SMN2. En una realización aún más preferida, al menos los dos loci del gen SMN2 contienen 1 o 2 copias del gen. “SMN2” (o“CenSMN”), tal y como se usa en la presente invención, se refiere al gen SMN2 , centromérico, que codifica una forma truncada de la proteína SMN incapaz de compensar totalmente la pérdida del gen SMN1. En humanos tiene la secuencia mostrada en la base de datos Uniprot con número de acceso I2E4S9 (fecha 10/05/2017).

En una forma preferida de realización, el paciente que es tratado con el inhibidor de calpaína de acuerdo a la presente invención es un paciente afectado de AME tipo I, AME tipo II, AME tipo III o AME tipo IV. Hay cuatro tipos de AME, dependiendo de los niveles de SMN2, que condicionan la gravedad de la enfermedad, la edad a la que se inician los síntomas y la función motora máxima que alcanzan los pacientes, si bien la correlación entre los niveles de SMN2 y el tipo de AME no es absoluta, de manera que el número de copias del gen SMN2 no resulta predictivo del tipo de AME que finalmente pueda desarrollar un determinado paciente, ni limitativo de la presente invención. La AME tipo I se diagnostica entre 1 y 4 meses de edad. Se caracteriza porque el número de copias de SMN2 está entre 1 y 3, siendo preferiblemente de 2. Los pacientes afectados de AME tipo I son incapaces de sentarse y muestran: hipotonía, debilidad (especialmente en el control de la cabeza y el cuello, y debilidad muscular), dificultad para alimentarse y respirar. En una realización preferida, el paciente de AME tipo I es diagnosticado por presentar al menos un síntoma de la enfermedad. En una realización aún más preferida, el paciente de AME tipo I es diagnosticado antes de presentar ningún síntoma de la enfermedad.

De forma general no limitativa, la AME tipo II se diagnostica entre 7 y 18 meses de edad. Se caracteriza porque el número de copias de SMN2 está entre 2 y 4, siendo preferiblemente de 3. Los pacientes afectados de AME tipo II son capaces de llegar a sentarse sin ayuda y algunos llegan a ponerse de pie, si bien son incapaces de caminar de manera independiente. En una realización preferida, el paciente de AME tipo II es diagnosticado por presentar al menos un síntoma de la enfermedad. En una realización aún más preferida, el paciente de AME tipo II es diagnosticado antes de presentar ningún síntoma de la enfermedad.

De forma general no limitativa, la AME tipo III se diagnostica entre 18 meses y 10 años de edad. Cuando los síntomas aparecen antes de los 3 años se trata de AME tipo Illa, cuando es posterior a los 3 años se trata de AME tipo Illb. Se caracteriza porque el número de copias de SMN2 está entre 3 y 5, siendo preferiblemente de 3 ó 4. Los pacientes afectados de AME tipo III llegan a de caminar de manera independiente. En una realización preferida, el paciente de AME tipo III es diagnosticado por presentar al menos un síntoma de la enfermedad. En una realización aún más preferida, el paciente de AME tipo III es diagnosticado antes de presentar ningún síntoma de la enfermedad.

De forma general no limitativa, la AME tipo IV se diagnostica después de los 35 años de edad. Se caracteriza porque el número de copias de SMN2 está entre 4 y 8, siendo preferiblemente de 4 ó 5. El síntoma más característico de AME tipo IV es que se trata de pacientes que son capaces de caminar de manera independiente y desarrollan síntomas muy leves, si bien sufren de una degeneración motora progresiva a partir de los 35 años.

En una realización preferida, el inhibidor de calpaína es calpastatina. En una realización aún más preferida, el inhibidor de calpaína es calpeptina.

El inhibidor de calpaína para su uso según la presente invención puede formar parte de una composición farmacéutica que contenga un vehículo adecuado para su administración a un sujeto, de manera que el inhibidor de calpaína se administrará a un sujeto en una forma farmacéutica de administración adecuada para ello e incluirá, al menos, un vehículo farmacéuticamente aceptable. Por tanto, en una realización particular, el inhibidor de calpaína y, preferiblemente, la calpeptina, se encontrará formando parte de una composición farmacéutica que comprende, además de calpeptina como ingrediente activo, al menos un vehículo, preferentemente, un vehículo farmacéuticamente aceptable. El término “vehículo” incluye, en general, cualquier diluyente o excipiente con el que se administra un ingrediente activo. Preferentemente, dicho vehículo es un vehículo farmacéuticamente aceptable para su administración a un sujeto, es decir, es un vehículo (e.g., un excipiente) aprobado por una agencia reguladora, por ejemplo, la Agencia Europea del Medicamento (EMA), la“Food & Drug Administration” (FDA) norteamericana, etc., o están incluidos en una farmacopea (e.g., la Farmacopea europea, estadounidense, etc.) reconocida en general para su uso en animales, y, más particularmente, en seres humanos.

El inhibidor de calpaína puede disolverse para su administración en cualquier medio adecuado. Ejemplos ilustrativos, no limitativos de medios en los que el ingrediente activo se puede disolver, suspender o con los que se pueden formar emulsiones, incluyen: DMSO, agua, etanol, mezclas agua-etanol o agua-propilenglicol, etc., aceites, incluyendo aceites derivados del petróleo, aceites de animales, aceites vegetales o aceites sintéticos, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo, etc. En una realización preferida, la calpeptina se administra en forma de una composición farmacéutica que comprende un solvente orgánico. Ejemplos no limitativos de solventes orgánicos son: acetona, alcohol metílico, alcohol etílico, etilenglicol, propilenglicol, glicerina, éter dietílico, cloroformo, benceno, tolueno, xileno, etilbenceno, pentano, hexano, ciclohexano, tetrahidrofurano, tetracloruro de carbono, cloroformo, cloruro de metileno, tricloroetileno, percloroetileno, dimetilsulfóxido (DMSO).

Asimismo, se incluyen preparaciones en forma sólida de la composición farmacéutica destinadas a convertirse, poco antes de su uso, en preparaciones en forma líquida para administración por vía oral o parenteral. Las formas líquidas de este tipo incluyen disoluciones, suspensiones y emulsiones. Lina revisión de las distintas formas farmacéuticas de administración de ingredientes activos, de los vehículos a utilizar, y de sus procedimientos de fabricación puede encontrarse, por ejemplo, en el Tratado de Farmacia Galénica, C. Faulí i Trillo, Luzán 5, S.A. de Ediciones, 1993 y en Remington's Pharmaceutical Sciences (A.R. Gennaro, Ed.), 20 a edición, Williams & Wilkins PA, USA (2000).

En una realización, el medio en el que el inhibidor de calpaína se puede disolver contiene un disolvente orgánico. En una realización preferida, el medio contiene DMSO. En una realización más preferida el inhibidor de calpaína es calpeptina. En una realización aún más preferida, la calpeptina se disuelve en DMSO a una concentración de 25mg/ml. En una realización aún más más preferida la calpeptina se administra a una concentración de entre 0, 1 y 1 mg/kg. En otra realización más preferida el inhibidor de calpaína es calpastatina.

De forma no limitativa, entre las vías de administración del inhibidor de calpaína se encuentran vías de administración farmacológica no invasivas, tales como vía oral, gastroentérica, nasal o sublingual, y las vías de administración invasivas, como la vía parenteral. En una realización particular, el inhibidor de calpaína se administra en una forma farmacéutica de administración por vía parenteral (e.g., intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intratecal, etc...). Por “vía parenteral de administración” se entiende aquella vía de administración que consiste en administrar los compuestos de interés mediante una inyección, requiriendo por tanto el uso de jeringa y aguja. Hay diferentes tipos de punción parenteral según el tejido al cual llega la aguja: intramuscular (el compuesto se inyecta en tejido muscular), intravenosa (el compuesto se inyecta en vena), subcutánea (se inyecta bajo la piel) e intradérmica (se inyecta entre las capas de la piel). La vía intratecal se utiliza para la administración en el Sistema Nervioso Central de fármacos que atraviesan mal la barrera hemato- encefálica, de manera que el fármaco se administra en el espacio que rodea la médula espinal (espacio intratecal). En una realización preferida, la administración es intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea o intratecal. En una realización preferida, la vía de administración es subcutánea.

En otra realización preferida, la administración se realiza mensualmente, preferiblemente, una vez cada 4 meses, una vez cada 3 meses, una vez cada 2 meses, una vez al mes. En otra realización preferida, la administración se realiza semanalmente, preferiblemente, una vez cada 4 semanas, una vez cada 3 semanas, una vez cada dos semanas, una vez a la semana. En otra realización preferida, la administración se realiza diariamente, preferiblemente, una vez cada 6 días, una vez cada 5 días, una vez cada 4 días, una vez cada 3 días, una vez cada 2 días. En otra realización preferida, la administración se realiza diariamente, preferiblemente, 1 vez al día, 2 veces al día, 3 veces al día o 4 veces al día.

El término“sujeto” o“paciente” tal como se usa aquí, incluye seres humanos, hombre o mujer, de cualquier edad o raza. En una realización preferida, el sujeto es diagnosticado de AME. En una realización más preferida el sujeto es diagnosticado de AME por haber desarrollado al menos un síntoma de la enfermedad, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5. En otra realización más preferida el sujeto es diagnosticado por medio de un ensayo genético sin manifestación sintomática. En otra realización preferida, el sujeto es un ser humano con al menos 1 día, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7 días de vida. En otra realización preferida, el sujeto es un ser humano recién nacido con al menos 1 semana, al menos 2, al menos 3, al menos 4 semanas de vida. En otra realización preferida, el sujeto es un ser humano recién nacido con al menos 1 mes, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12 meses de vida. En otra realización preferida, el sujeto es un ser humano de al menos 1 año, al menos 2 años, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10 años de edad.

En una realización preferida, la AME es tipo I, II, III o IV. En una realización más preferida, la AME es tipo I. En una realización aún más preferida, el tratamiento se administra por primera vez a un paciente desde el día siguiente a su nacimiento, 2 días después, 3 días después, 4 días después, 5 días después, 6 días después, 7 días después; preferiblemente, se administra desde el día siguiente a su nacimiento. En otra realización preferida, el tratamiento se administra por primera vez a un paciente desde la semana siguiente a su nacimiento, 2 semanas después, 3 semanas después, 4 semanas después. En otra realización preferida, el tratamiento se administra por primera vez a un paciente desde el mes siguiente a su nacimiento, 2 meses después, 3 meses después, 4 meses después, 5 meses después, 6 meses después, 7 meses después, 8 meses después, 9 10 meses después, 11 meses después, 12 meses después. En otra realización preferida, el tratamiento se administra por primera vez a un paciente desde el año siguiente a su nacimiento, 2 años después, 3 años después, 4 años después, 5 años después, 6 años después, 7 años después, 8 años después, 9 años después, 10 años después.

Composiciones farmacéuticas que comprenden inhibidores de calpaína y uso de las mismas en el tratamiento de AME.

Los inventores de la presente invención han encontrado que el inhibidor de calpaína se puede administrar como una terapia de combinación con otros compuestos útiles para el tratamiento de la AME. En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para el tratamiento de la AME que comprende administrar un inhibidor de calpaína en combinación con un compuesto adicional. Por lo tanto, en un segundo aspecto, la invención se refiere a una composición que comprende un inhibidor de calpaína y un ingrediente activo adicional diferente capaz de incrementar la mejoría de los pacientes seleccionado del grupo de: un inhibidor de histona deacetilasa o un modulador de autofagia. En una realización preferida, la composición farmacéutica de acuerdo a la presente invención comprende un inhibidor de calpaína y un inhibidor de histona deacetilasas o HDAC. Por“inhibidor de HDAC”, tal y como se emplea en la presente invención, se refiere a un compuesto que inhibe la actividad de histona deacetilasa (HDAC), enzima implicada en la eliminación de los grupos acetilo de los residuos de lisina de las histonas. Los inhibidores de HDAC también tienen efectos en proteínas no histonas que están relacionadas con el proceso de acetilación, entre ellas HSP90.

Para saber si un compuesto es un inhibidor de HDAC es posible emplear cualquier ensayo conocido en el estado de la técnica para analizar la actividad histona deacetilasa, tal y como el kit comercial EpiQuick HDAC Activity/Inhibition Assay Kit de Epigentek, de manera que si el compuesto a ensayar inhibe la actividad histona deacetilasa, dicho compuesto es un inhibidor de HDAC. Ejemplos no limitativos de inhibidores de histona deacetilasas son:

ácido valproico (número CAS 99-66-1),

- valproato magnésico (número CAS 62959-43-7),

fenilbutirato sódico (número CAS 1716-12-7),

pivanex (número CAS 122110-53-6),

vorinostat (número CAS 149647-78-9),

panobinostat (número CAS 404950-80-7),

belinostat (número CAS 414864-00-9),

tefinostat (número CAS 914382-60-8),

givinostat (número CAS 497833-27-9),

mocetinostat (número CAS 726169-73-9) y,

entinostat (número CAS 209783-80-2).

En una realización más preferida, el inhibidor de calpaína es calpastatina. En una realización aún más preferida, el inhibidor de calpaína es calpeptina.

En otra forma de realización preferida, la composición farmacéutica de acuerdo a la presente invención comprende un inhibidor de calpaína y un modulador de autofagia. La autofagia, tal como se utiliza en la presente invención, es un proceso celular por el cual se produce un reciclaje de los componentes celulares mediante su incorporación a li sosomas a través de la formación de unas vesículas denominadas autofagosomas. ETn“modulador de autofagia” como se usa en el presente documento se refiere por tanto a un compuesto que aumenta o disminuye un mecanismo celular catabólico que involucra la degradación de componentes celulares innecesarios o disfuncionales tales como proteínas intracelulares, agregados proteicos, orgánulos celulares, membranas celulares, orgánulos membranas y otros componentes celulares, a través de la acción de los lisosomas. Aunque está estrechamente vinculado con la apoptosis, la autofagia está primordialmente caracterizada como un mecanismo catabólico por el que se mantiene la homeostasis de la energía celular. Para saber si un compuesto es modulador de autofagia es posible emplear cualquier ensayo conocido en el estado de la técnica para analizar la autofagia, tal como inmunohistoquímica.

Ejemplos no limitativos de moduladores de autofagia son:

cloroquina (número CAS 54-05-7),

3-metiladenina (número CAS 5142-23-4),

bafilomicina Al (número CAS 88899-55-2),

- trehalosa (número CAS 99-20-7 ),

rapamicina (número CAS 53123-88-9),

resveratrol (número CAS 501-36-0 )y

curcumina (número CAS 458-37-7).

En una realización más preferida, el inhibidor de calpaína es calpastatina. En una realización aún más preferida, el inhibidor de calpaína es calpeptina.

Los términos y limitaciones descritos anteriormente en relación con el uso de un inhibidor de calpaína de la invención son igualmente aplicables a este aspecto.

* * *

La invención se describe a continuación por medio de los siguientes ejemplos, meramente ilustrativos y no limitativos del ámbito de protección de la invención.

EJEMPLOS

Materiales y métodos

Aislamiento y cultivo de MN de médula espinal

Se prepararon cultivos de MN de médula espinal de ratón CD1 o AME de 12,5 días (El2,5) o 13 días (El 3) embrionarios esencialmente como se ha descrito (Gou-Fabregas et al, 2009. J Neurochem. 110: 1842-54; Garcera et al., 2011. Neurobiol Dis. 42:415- 26). Las células aisladas se juntaron en un tubo que contenía medio de cultivo y se sembraron en placa. Las MN aisladas se sembraron o bien en placas de cultivo de cuatro pocillos (Nunc, Thermo Fisher Scientific, Madrid, España) para experimentos de supervivencia (15.000 células /pocillo), evaluación de la degeneración de neuritas (10.000 células/pocillo), y análisis por inmunotransferencia (50.000 células/pocillo) o en cubreobjetos de vidrio de 15 mm colocados en placas de cultivo de cuatro pocillos para inmunofluorescencia. Los pocillos y cubreobjetos de vidrio se recubrieron con poliornitina/laminina (Sigma) como se ha descrito (Soler et al., 1998). El medio de cultivo era medio Neurobasal (Gibco, Invitrogen, Paisley, RU) suplementado con B27 (2% v/v, Gibco), suero de caballo (2% v/v, Fisher Scientific), L-glutamina (0,5 mM, Gibco), y 2-mercaptoetanol (25 mM, Sigma) y una mezcla de NTF recombinantes (factor neurotrófico derivado de cerebro 1 ng/ml, factor neurotrófico derivado de línea celular glial 10 ng/ml, factor neurotrófico ciliar 10 ng/ml, cardiotrofina-l 10 ng/ml y factor de crecimiento de hepatocitos 10 ng/ml; Gibco).

Animales AME

Los ratones AME utilizados son FVB Cg-Tg (SMN2) 89Ahmb Smnl tmlMsd /J(rnutAME) y FVB Cg-Tg (SMN2 * delta7)4299 Ahmb Tg(SMN2) 89Ahmb Srnnl tmlMsd /J (SMNA7). Se cruzaron animales heterocigotos para obtener homocigotos mutAME o SMNA7 Se usaron crías de la misma camada wild type (WT) para los experimentos control. Para la purificación de las MN se retiraron embriones de El 2, 5 del útero y se cortó un trozo de la cabeza para el genotipado; para el tratamiento in vivo las crías neonatales se tatuaron y se recogió un fragmento de la cola. Se usó el kit REDExtract-N-Amp Tissue PCR Kit (Sigma, St Louis, MO, EE UU) para extracción de ADN genómico y organización de PCR, con los siguientes cebadores: WT directo 5'-CTCCGGGATATTGGGATTG-3', AME inverso 5'-GGTAACGCCAGGGTTTTCC-3' y WT inverso 5'- TTTCTTCTGGCTGTGCCTTT-3 '.

Plásmidos y producción de partículas de lentivirus

Para los experimentos de interferencia de ARN, se generaron construcciones en pSUPER. retro. puro (Oligo- Engine, Seattle, WA, EE UU) usando oligonucleótidos específicos (Invitrogen) que se dirigen a la secuencia de calpaína-l (shCalp) indicada por letras mayúsculas como sigue, directo: 5'- gatccccGCGCCAAGCAGGTAACTTAttcaagagaTAAGTTACCTGCTTGGCGCttttt- 3' e inverso: 5'- agctaaaaaGCGCCAAGCAGGTAACTTAtctcttgaaTAAGTTACCTGCTTGGCGCggg- 3. Se utilizaron los plásmidos: pLVTHM, pSPAX2 y pMD2G. Se usaron virus a 4 x 10 5 -1 x 10 6 UT/ml para los experimentos. Se usó el vector vacío (EV) como un control. Para la transducción de lentivirus, las MN se sembraron en placas de cuatro pocillos. Se añadió medio que contenía lentivirus (2 UT/célula) 3 h después, y luego se cambió después de 20 h. En cada experimento, se contaron las células positivas para proteína fluorescente verde (GFP) directamente para seguir la eficacia de la infección. La frecuencia de infección ascendió al 99%.

Reactivos y tratamientos

El día 6 después de sembrar, las MN cultivadas se trataron con calpeptina (Calbiochem®) que se disolvió en DMSO (Sigma) o con cloruro de potasio (KC1, Sigma). La calpeptina se disolvió a una concentración final de 25 mM y se añadió al cultivo. El KC1 se disolvió con NBM a una concentración final de 30 mM. Para el control de vehículo, se añadió la misma cantidad de solvente (DMSO) al medio de cultivo.

Supervivencia de MN y análisis de degeneración de neuritas

Para la evaluación de la supervivencia de las MN las células se sembraron en medio completo que contenía una mezcla de NTF recombinantes o en medio basal sin suplementos o medio completo que contenía las condiciones experimentales. Tres días después del tratamiento, se contaron neuronas de fase brillante grandes con prolongaciones neuríticas largas presentes en fotomicrografías de diferentes áreas microscópicas de las placas de cultivo (4 áreas centrales por pocillo, 3 pocillos para cada condición por experimento). El número de células presente en cada placa el día 0 se consideró el 100% inicial. Los recuentos se realizaron cada 3 días en las mismas áreas microscópicas que el recuento inicial. La supervivencia se expresó como el porcentaje de células contadas con respecto al valor inicial (100%). El análisis morfométrico de la degeneración de neuritas se realizó como se ha descrito (Press y Milbrandt, 2008. J. Neurosci. 28:4861-71), con modificaciones. Brevemente, las MN disociadas se cultivaron y transdujeron como se ha descrito anteriormente. Seis, 9 y 12 días después de la transducción, se obtuvieron imágenes de microscopía de contraste de fase con una lente 40x. Se creó una rejilla sobre cada imagen con el software NIH ImageJ, usando el complemento de rejilla (área de línea=50,000). Se usó el complemento de recuento de células para puntuar cada neurita. Se contaron células en degeneración y sanas en al menos 10 campos de gran aumento por imagen (30-50 neuritas) para cada pocillo. Se contaron tres pocillos diferentes para cada condición (con el observador sin saber la condición) y los experimentos se repitieron al menos tres veces diferentes. Los segmentos de neuritas se consideraron degenerados si mostraban evidencia de hinchamiento y/o ampollas.

Administración de calpeptina in vivo

Los ratones se enjaularon individualmente en jaulas de propileno (33 cm c 18 cm x 14 cm) a una temperatura ambiente de 22±2°C y una humedad relativa del 40%±10%. A los ratones reproductores se les proporcionó agua ad libitum y pienso de roedores. Los ratones se mantuvieron en un ciclo de luz:oscuridad de 12 h: l2 h (periodo de luz de 07:30 hasta las 19:30). Se asignaron crías de las mismas camadas mutAME y SMNA7 (mutantes y WT) aleatoriamente para recibir tratamiento o vehículo. La calpeptina (Calbiochem®, Merck, Madrid, España) se disolvió a una concentración de 50 mM en DMSO y se inyectó a una dosis de 0,006 mg por gramo de peso en solución salina. Los grupos de vehículo recibieron volúmenes iguales de solución salina con la misma cantidad de DMSO. La administración fue mediante inyección subcutánea (SC, región interescapular) una vez al día empezando desde P0 hasta la muerte con una jeringa estéril de polipropileno (icogamma plus, 1 ml) y con una aguja de 30G (BD Microlance). Los animales WT recibieron tratamiento o vehículo hasta un máximo de 3- 4 semanas. El nacimiento se definió como día postnatal 0 (P0) para los experimentos. Se analizaron la supervivencia de los animales, así como la masa corporal, tamaño y pruebas de comportamiento (reflejo postural y prueba del tubo).

Análisis de comportamiento Todas las pruebas se realizaron durante el periodo de luz entre las 09:00 y la 12:00 y antes de la administración. Para el reflejo postural cada cría se volvió sobre el lomo sobre una superficie plana y se registró el tiempo que tardó en colocarse establemente sobre las cuatro patas en suelo (tiempo límite de 30 s). En la prueba del tubo, los animales se colocaron con la cabeza hacia abajo, colgando por las patas traseras en un tubo de centrífuga de plástico de 50 ml con un colchón de una bola de algodón en el fondo para proteger la cabeza de los animales tras su caída. Se evaluó la latencia a caerse desde el borde del tubo durante un periodo de 30 s. Se realizaron tres repeticiones para cada prueba con un mínimo de 2 minutos de descanso entre repeticiones. Las pruebas de comportamiento se realizaron a diario empezando en Pl hasta P10.

Análisis por inmunotransferencia

Para realizar las inmunotransferencias se separaron Usados celulares totales en geles de poliacrilamida y SDS y se transfirieron a filtros de membrana de transferencia de difluoruro de polivinilideno Immobilon-P (Millipore, Billerica, MA, EE ETU) usando un aparato semiseco Trans-Blot de Amersham Biosciences (Buckinghamshire, REÍ). Las membranas se ensayaron con anticuerpo anti-SMN (1 :5000; BD Biosciences), anticuerpo anti-calpaína-l (1 : 1000; Biomol International Inc., Exeter, REÍ) y anti- fodrina clon AA6 (1 :4000; Biomol). Para controlar el contenido específico de proteína por carril, las membranas se volvieron a ensayar con un anticuerpo monoclonal anti-a- tubulina (1 :50000; Sigma). Las membranas se revelaron usando Luminata™ ForteWestem HRP Substrate (Millipore).

Inmunofluorescencia

Las MN cultivadas se sembraron en cubreobjetos de vidrio y se trataron con lentivirus que contenían EV o shCalp. Seis días después de la transducción con lentivirus las células se fijaron con paraformaldehído al 4% (Sigma) 10 minutos y con metanol (Sigma) durante 10 minutos adicionales. Las MN se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,2% y se incubaron durante 1 h con BSA al 5% en PBS. El anticuerpo primario (anticuerpo contra SMN, 1 : 100) se diluyó en PBS y se incubó durante la noche. Después de lavar el anticuerpo secundario anti-ratón ALEXA555 (Invitrogen) se añadió a una dilución 1 :400. Se realizó la tinción con Hoechst (1 :400, Sigma) para identificar la localización nuclear en el soma de las MN. Las muestras se montaron usando medio de montaje Mowiol (Calbiochem®). Las observaciones de microscopía se realizaron en un microscopio confocal FV10I Olympus (Tokio, Japón).

Análisis estadístico

Todos los experimentos se realizaron al menos tres veces. Los valores se expresaron como media ± E.E.M. Las diferencias entre grupos se evaluaron por ANOVA unívoco de cultivos transducidos por lentivirus en cada punto de tiempo; si eran significativas, se hicieron comparaciones múltiples post-hoc usando la prueba de Bonferroni; se consideraron significativos valores P <0,05.

Resultados

La atenuación de calpaína aumenta el nivel de proteína SMN en MN de médula espinal en cultivo

Para analizar el efecto de la reducción de calpaína sobre SMN en MN de médula espinal se usó un método de interferencia de ARN de lentivirus para disminuir el nivel de proteína calpaína en estas células. Se aislaron MN de médula espinal embrionaria (El2,5) y se sembraron en pocillos de cultivo. Tres horas después se transdujeron con lentivirus que contenían el vector vacío (EV) o secuencias de ARN horquillado corto dirigidas a sitios específicos de calpaína de ratón (shCalp) y se mantuvieron en presencia de una mezcla de factores neurotróficos (NTF) (factor neurotrófico derivado de cerebro 1 ng/ml, factor neurotrófico derivado de línea celular glial 10 ng/ml, factor neurotrófico ciliar 10 ng/ml, cardiotrofina-l 10 ng/ml y factor de crecimiento de hepatocitos 10 ng/ml). A los 3, 6 y 9 días después de la transducción, se recogieron Usados celulares y se sometieron a inmunotransferencia usando un anticuerpo anti- SMN. Se observó un nivel de proteína SMN significativamente aumentado en células shCalp después de 3 (1,30 ± 0,09, / 0,0l), 6 (1,69 ± 0,19, / O,OI) y 9 (1,75 ± 0,46, p< 0,05) días de transducción, comparado con el EV (Fig. 1A). El análisis de la transferencia control usando un anticuerpo anti-calpaína demostró que la proteína calpaína se reduce en la condición shCalp comparado con EV. Para analizar si esta reducción en SMN se localiza preferentemente en el soma de las células o las neuritas, se midieron los niveles de SMN mediante inmunofluorescencia usando microscopía confocal. Las MN se sembraron en cubreobjetos de vidrio y se transdujeron usando las construcciones de EV o shCalp. Seis días después de la transducción, las células se fijaron y se realizó la inmunotinción de SMN con un anticuerpo anti-SMN. La cuantificación de los niveles de fluorescencia específicos mostró que SMN aumenta tanto en el soma de MN (115,8 ± 7,27, /><0,00l), como en las neuritas (12,29 ± 2,21, /><0,0005) en células shCalp cuando se compran con el EV (85,43 ± 5,34 y 6,18 ± 0,56, respectivamente) (Fig. 1B).

Para aclarar el efecto de la reducción de calpaína en la viabilidad de las MN, se realizaron experimentos de supervivencia. Las células se sembraron a baja densidad para evitar efectos mediados por contacto celular (7.890 células /cm 2 ) y se cultivaron en varias condiciones: en ausencia (NBM) o presencia de una mezcla de NTF y la condición de NFT tratada con EV o shCalp. Tres, seis y nueve días después del cultivo, las células se contaron en tres pocillos de cada condición. Considerando el 100% el número inicial de células presentes en un pocillo el día 0, la supervivencia se estimó como el porcentaje de células restantes en el mismo pocillo. Como se muestra en la figura 1C, usando el microscopio de contraste de fase observamos que después de 9 días sin NTF, las MN estaban en gran media degeneradas (Press y Milbrandt 2008. J. Neurosci. 28:4861-71) mostrando un porcentaje significativamente menor de células supervivientes (día 3, NBM 3,38 ± 5,86, frente a NTF 64,38 ± 3,90, /><0,00l). Sin embargo, la presencia de EV o shCalp no modifica la supervivencia de las MN cuando se compara con la condición de NTF (día 9, 40,76 ± 2,63, 44,11 ± 5, 12 y 42,35 ± 2,51 respectivamente). Estos resultados establecieron que la reducción de calpaína endógena no altera la viabilidad normal de las MN.

La atenuación de calpaína previene la reducción de SMN causada por la despolarización de la membrana

La adición de una elevada concentración de potasio (K + ) en el medio de cultivo induce la despolarización crónica de la membrana plasmática neuronal, que a su vez activa los canales de calcio regulados por voltaje (VGCC), lo que produce una entrada de Ca 2+ y aumento de la concentración de Ca 2+ intracelular. Para aclarar cuál es el efecto del aumento del Ca 2+ intracelular en el nivel de SMN y el papel de calpaína en mediar este efecto, se aislaron MN de médula espinal de ratones El 2, 5 y se estableció un cultivo primario en presencia de NTF. Las células se transdujeron con las construcciones EV o shCalp. Seis días después, las células se trataron con 30 mM de KC1 (30K) durante 3 horas y se obtuvieron extractos de proteína y se sometieron a inmunotransferencia usando anticuerpo anti-SMN. Los resultados en la figura 2 muestran que la proteína SMN estaba significativamente reducida en cultivos tratados con 30K EV (reducción de 1,81 veces, p<0, 0001) comparado con control EV sin tratar. Sin embargo, las células transducidas con shCalp no mostraron cambios en SMN con tratamiento con KC1. Por tanto, no se observaron diferencias significativas del nivel de SMN en 30K shCalp cuando se compararon con la condición control shCalp. En consecuencia, el tratamiento con una elevada concentración de potasio (K + ) en el medio de cultivo indujo reducción de la proteína SMN a través de la actividad de calpaína en MN de médula espinal cultivadas.

El tratamiento con calpeptina aumenta el nivel de proteína SMN en MN de médula espinal en cultivo

Para evaluar adicionalmente el papel de la actividad calpaína en el nivel de proteína SMN en MN, se utilizó el inhibidor permeable en células de calpaína, calpeptina. Primero se analizó el efecto de calpeptina en condiciones de cultivo básales. Se aislaron y cultivaron MN de El2,5 en presencia de NTF. Seis días después de sembrar el medio de cultivo se cambió a medio nuevo que contenía NTF o NTF más calpeptina 25 mM. Se obtuvieron Usados celulares totales a las 3, 9, 16, 20 y 24 horas después del tratamiento y se sometieron a análisis de proteína por inmunotransferencia usando un anticuerpo anti-SMN. Los resultados mostrados en la figura 3A demuestran que el nivel de proteína SMN está significativamente aumentado después de 3, 9, 16 y 20 horas de tratamiento con calpeptina (3,34 ± 0,56, p< 0,005, 4,40 ± 0,58, p< 0,005, 2,89 ± 0,61, p< 0,05 y 2,06 ± 0,50, p< 0,05 respectivamente). Sin embargo, no se observaron cambios en SMN en células tratadas 24 horas. Estos resultados en conjunto indican que la inhibición de calpaína aumenta SMN hasta las 20/24 horas de tratamiento.

Para estudiar si el efecto del tratamiento con calpeptina en MN con membranas despolarizadas crónicas regula el nivel de proteína SMN, se establecieron cultivos primarios de MN. Seis días después de sembrar, las células se trataron con NTF (control) o NTF más 30K o calpeptina 25 mM o calpeptina 25 mM + 30K. Tres horas después del tratamiento se obtuvieron Usados celulares y se sometieron a inmunotransferencia usando anticuerpos anti-a-fodrina o anti-SMN. La degradación de a-fodrina a los productos de degradación de fodrina específicos de 150/145 kDa indica activación de calpaína. Los niveles del producto de 150/145 kDa en células tratadas con NTF más 30K (30K) estaban significativamente aumentados comparados con la condición control NTF (1,33 ± 0,13, /><0,0001). Sin embargo, la adición de calpeptina a las condiciones de control NTF o 30K redujo significativamente los productos de degradación de fodrina (0,66 ± 0,05, ><0, 001 y 0,63 ± 0,07, /K0, 001, respectivamente) (Fig. 3B). Este resultado sugiere que la calpaína se activa después de la despolarización de la membrana en MN de ratón. El nivel de proteína SMN en células tratadas con calpeptina+30K (1,67 ± 0,26, / <0,05) estaba significativamente aumentado comparado con las condiciones 30K y control (Fig. 3B). Estos resultados en conjunto indican que SMN está reducida en células tratadas con 30K y este efecto se puede prevenir por tratamiento con calpeptina.

Calpaína procesa directamente SMN en MN cultivadas

Para identificar si SMN es procesada directamente por calpaína, los productos de degradación N- y C-terminales se purificaron de MN de El2,3 de ratón CD1 y se cultivaron durante 6 días en presencia de NTF. Las células se trataron durante 3 horas con 30 o 50 mM de KC1, o con calpeptina 25 mM y los Usados celulares se analizaron por inmunotransferencia usando anticuerpos monoclonales anti-SMN específicos de N- terminal/longitud completa (clon 8, BD Bioscience) y C-terminal (Acm 9F2) para detectar los productos de degradación. La cuantificación de SMN de longitud completa mostró que el tratamiento con potasio reduce significativamente los niveles de proteína mientras que el tratamiento con calpeptina aumenta los niveles de SMN. Los fragmentos C-terminales se detectaron en la membrana cuando se sobreexpuso la banda de SMN de longitud completa. Como se muestra en la figura 4 la degradación de SMN se inhibió mediante la adición de calpeptina. El tratamiento con calpeptina aumenta el nivel de proteína SMN y previene la degeneración de neuritas en MN mutantes de AME

Para determinar si el tratamiento con calpeptina regula SMN en MN de embriones El2,5 del modelo de ratón transgénico de AME grave (FVB Cg-Tg (SMN2)89AhmbSmnltmlMsd/J), se genotiparon ratones y se disecaron las médulas espinales de tipo salvaje (WT) y muíante (mutAME). Se cultivaron MN aisladas de WT y mutAME en presencia de NTF. Seis días después de sembrar las células se trataron con calpeptina 25 mM durante 3 horas. Se recogieron extractos de proteína y se sometieron a análisis por inmunotransferencia usando un anticuerpo anti-SMN. Los resultados indican que SMN aumenta en la condición WT tratado con calpeptina ((2,43 ± 0,35, /K0, 05) comparado con control WT (figura 5A gráfico izquierdo). Además, en cultivos de mutAME el tratamiento con calpeptina también aumentó significativamente la proteína SMN comparado con células sin tratar (5,l8±1.48, p<0.05) (figura 5 A izquierda y derecha).

Los hinchamientos axonales focales se han descrito previamente en tejidos y MN de ratón con SMN reducida y en biopsias musculares de pacientes de AME grave. Para determinar la presencia de degeneración de neuritas en el modelo de cultivo primario de MN, se aislaron células del modelo de ratón de AME en El 2, 5 y se cultivaron a una baja densidad (5.200 células/cm 2 ). Se evaluó la degeneración de neuritas cuantificando los segmentos de neuritas en un área determinada de la placa usando microscopía de contraste de fase en los días 6, 9 y 12. Las neuritas se consideraron degeneradas si mostraban evidencia de hinchamientos y/o ampollas (véase, Materiales y Métodos). Nueve y 12 días después de sembrar en presencia de NTF, las MN de mutAME muestran mayor porcentaje de degeneración que las MN WT. Para analizar el efecto de la reducción de calpaína en la reducción de la degeneración de neuritas, células mutAME y WT se transdujeron con el lentivirus que porta las construcciones shCalp o EV. Después de 6 días de transducción, no se observaron diferencias significativas entre grupos. Sin embargo, 9 días después de la transducción, se detectó una diferencia significativa en la morfología de las neuritas cuando se compararon cultivos shCalp mutAME (l6,64±5,67% de neuritas degeneradas) con EV mutAME (28,l8±6,22% de neuritas degeneradas) (p<0,0l). Después de 12 días, los signos de degeneración aumentaron a más del 36% de las neuritas presentes en cultivos EV mutAME, mientras que los cultivos de shCalp mutAME mostraron el 26%. Este porcentaje no era diferente a los observados en EV WT (26,29±4,69) y shCalp WT (25,62±3,6l). Todos estos resultados en conjunto demuestran que calpaína regula el nivel de proteína SMN y la degeneración de neuritas en MN con SMN reducida.

La administración de calpeptina extiende la supervivencia de ratones con AME grave y AME SMNA7

Las evidencias aportadas sugieren que calpaína regula directamente el nivel de proteína SMN. Se decidió examinar si la administración de calpeptina tiene un efecto positivo en ratones con AME. Para evaluar adicionalmente esta hipótesis se empezó un protocolo de tratamiento usando dos modelos de ratón de AME diferentes: el FVB Cg- Tg (SMN2)89AhmbSmnltmlMsd/J (ratones con AME grave, mutAME), y el FVB.Cg- Grm7Tg(SMN2)89Ahmb SmnltmlMsd Tg (SMN2*delta7)4299Ahmb/J (o SMNA7). Para determinar si calpeptina afectaba a la duración de la vida y al peso corporal de estos ratones, se tatuaron y genotiparon animales el día postnatal 0 (P0). Crías de la misma camada WT y mutantes se agruparon en grupos de referencia y tratamiento y las inyecciones subcutáneas empezaron en Pl, con una dosis diaria de 0,006 mg de calpeptina por gramo de peso. Los resultados mostraron que la administración de calpeptina incrementó significativamente la duración de la vida de mutAME calpeptina (días de media 8, n=l l) comparado con el mutAME de referencia (días de media 4,5, h=12, p<0,000l) (Fig. 6A). Asimismo, la duración de la vida de ratones SMNA7 calpeptina (días de media 14, n=l l) estaba significativamente aumentada comparada con SMNA7 de referencia (días de media 11,5, n=6, p<0,000l) (Fig. 6B).

Mientras que la duración de la vida se extendía, no se observó un aumento en el peso en animales mutantes tratados con calpeptina. En contraste, el peso estaba ligeramente aumentado en los grupos WT tratados con calpeptina comparados con los grupos WT de referencia a partir del día trece de tratamiento hasta el final del experimento (MutSMA, día 15, WT tratado 11,87 ± 0,23 gr, n=2 vs. WT Sham 9,49 ± 0,33 gr, n=8, p<0,000l) (SMNA7, día 15, WT tratado 11,14 ± 0,59 gr, n=2 vs. WT Sham 7,74 ± 0,66 gr, n=5, p<0,00l) (Figura 6 C y D). El tratamiento con calpeptina mejora la función motora en ratones con AME

Puesto que los modelos de ratón mutAME y SMNA7 se caracterizan por alteración grave de la función motora, se analizó si el aumento en la duración de la vida observado en ambos modelos después del tratamiento con calpeptina se correlaciona con mejora de la función motora. Se realizaron dos pruebas de comportamiento diferentes: la prueba del reflejo postural y la prueba del tubo.

La respuesta del reflejo postural se basa en la capacidad de ratones neonatales de volver a sus cuatro patas después de haber sido colocados en posición supina. Se puede medir en crías tan pronto como P1-P2 y evaluar hasta P9-P10. Esta prueba evalúa la fuerza y coordinación corporal global. Debido a su simplicidad, permite el estudio longitudinal de la evolución del deterioro locomotor que se presenta como un aumento en el tiempo para enderezarse. La prueba se realizó en ratones en los siguientes grupos: WT de referencia y tratados con calpeptina, y grupos mutantes (mutAME y SMNA7) de referencia y calpeptina. La prueba se diseñó con un tiempo máximo de 30 segundos y se realizaron medidas a diario antes de la inyección de calpeptina de Pl a P10. La prueba se hizo por triplicado para cada animal con 5 minutos de tiempo de reposo entre pruebas. Los resultados obtenidos en los grupos WT de ambos modelos de ratones mutAME y SMNA7, muestran que el tiempo de reflejo postural era consistentemente más rápido que en los grupos mutantes. En mutAME tratado con calpeptina no hubo diferencias significativas desde el inicio del tratamiento (Pl) a P7 comparado con mutAME de referencia. Sin embargo, desde P7 hasta el final del experimento el tiempo de reflejo postural disminuyó progresivamente en mutAME tratados con calpeptina (Fig. 7A). Cuando se analizaron ratones SMNA7 se observó una ligera reducción en el tiempo hasta enderezarse del grupo tratado con calpeptina desde P7 hasta el final del experimento (Fig. 7B).

La prueba del tubo es una prueba de la función motora no invasiva específicamente diseñada para roedores neonatales. Evalúa la fuerza del músculo de las patas traseras, debilidad y fatiga. La edad ideal del animal varía para esta prueba desde P2 a P8. En cada ensayo, el ratón se coloca con la cabeza hacia abajo, colgando por las patas traseras en un tubo. Se evaluaron dos parámetros en el presente estudio: latencia para caerse del borde del tubo (en segundos, gráficos de tiempo) y la puntuación de las patas traseras (gráficos HLS) que evalúa la colocación de las patas y la cola. Los ratones con debilidad motora muestran tiempo reducido hasta caerse y baja puntuación de HLS. La prueba se realizó en los mismos grupos de referencia y tratados de ratones descritos. La prueba se diseñó con un tiempo máximo de 30 segundos y se realizaron medidas en triplicado a diario antes de la inyección de calpeptina desde Pl hasta P8. Cuando se analizó el tiempo de latencia en el modelo mutAME, se observó que desde Pl a P5 todos los grupos de ratones no presentaron diferencias en el tiempo hasta caerse. Sin embargo, los días 6 y 7 después del tratamiento (P6 y P7) los ratones mutAME tratados con calpeptina mostraron hasta caerse significativamente un tiempo aumentado comparado con el grupo mutAME de referencia (día 6, MutSMA tratado 15,62 ± 10,66, n= 7 vs. Mut SMA Sham 3,85 ± 1,92, n=3 p<0,05; y día 7, MutSMA tratado 17,78 ± 10,62, vs. Mut SMA Sham 0,167 ± 0,41, p<0,00l) y sin diferencias significativas respecto a los grupos WT (Fig. 7C). En el modelo SMNA7 el tratamiento con calpeptina de mutantes aumentó significativamente el tiempo de latencia comparado con controles mutantes de referencia desde P3 hasta el final del experimento (Fig. 7D). En ambos modelos de AME, las medidas de HLS revelaron que el tratamiento con calpeptina de ratones mutantes aumentó significativamente la puntuación comparado con mutantes de referencia (Fig. 7E y 7F). En conjunto los resultados obtenidos de las pruebas de comportamiento realizadas sugieren que el tratamiento con calpeptina mejora la función motora de ratones mutantes AME de modelos graves.