三嗪化合物、 其药用盐、 异构体或水合物及其药物组合物 技术领域

本发明涉及一种三嗪化合物、其药用盐、异构 体或水合物以及包含他们的药物组 合物，尤其涉及一种脾酪氨酸激酶抑制剂。本 发明还涉及所述三嗪化合物及其盐的药 物组合物在制备预防或治疗 Syk(Spleen Tyrosine Kinase: 脾酪氨酸激酶)激酶和 /或 JAK (Janus Kinase) 激酶介导的病症或疾病的用途。 背景技术

随着肿瘤生物学及其相关学科的飞速发展，人 们逐渐认识到细胞癌变的本质是细 胞信号转导通路失调导致的细胞无限增殖。诸 如光线、温度等的外源性信号和诸如激 素、 神经递质、 细胞因子等的内源性信号， 可通过不同途径产生各种细胞效应。 信号 转导是指各类细胞信号通过细胞膜和信号分子 引起的细胞基因表达改变的过程。可以 说，几乎所有重要的生命现象都与细胞内信号 转导有关。细胞信号转导过程的异常会 导致细胞生长、 分化、 代谢和生物学行为障碍， 进而引起各种疾病乃至肿瘤的发生。

酪氨酸蛋白激酶是细胞信号转导过程中极为重 要的物质，具有多种细胞功能，在 正常细胞的调节、通讯和发育生物学方面起着 十分重要的作用。酪氨酸激酶的活性过 高， 会导致其下游信号途径激活， 最终导致肿瘤形成。酪氨酸蛋白激酶按照其结 构可 分为受体酪氨酸蛋白激酶（RTKs )和非受体酪氨酸蛋白激酶（nrPTKs)。 T淋巴细胞 受体、 B淋巴细胞受体、 免疫球蛋白受体等能募集 nrPTKs而后通过酪氨酸磷酸化形 成信号转导复合物， 再激活下游的信号转导如 JAK/STAT等途径， 促进细胞增殖， 导 致肿瘤形成。

根据现阶段的研究，抑制酪氨酸激酶信号转导 的抗肿瘤药物有单克隆抗体和小分 子酪氨酸激酶抑制剂，其中抗体的制备方法和 给药方式在一定程度上限制了其临床应 用。现有的小分子酪氨酸激酶抑制剂种类还很 少， 针对的作用靶点也少， 常需与常规 化疗、放疗联合以达到更好的疗效。 同时， 现有抑制剂的抗药性和副反应也需要新的 药物和治疗方法。 发明内容

本发明的目的是提供一种三嗪化合物、其药用 盐、异构体或水合物，其制备方法， 以及至少一种本发明化合物和至少一种药学上 可接受的载体或赋形剂制备药用组合 物的方法以及一种或多种本发明化合物在制备 治疗 SYK激酶和 /或 JAK激酶介导的病 症或疾病的药物中的用途。

通式 的化合物或其药 物：

其中， 选自具有取代基或不具有取代基的芳基、 具有取代基或不具有取代 基的杂芳基、具有取代基或不具有取代基的 d-do烷基和具有取代基或不具有取 代基的 C ₃ -C ₆ 杂环基， 其中！^中的所述取代基是独立地选自下述基� �的取代基： 、 螺环基、 杂螺环基、

Ci-Cio烷基、 卤代

Ci-Cio Ci-Cio Ci-Cio C ₆ — ₁₀ 芳基、 C ₆ — ₁₀ 杂芳基、 C ₃ -C ₆ 杂环基羰基烷氧基； 或可选地具有选自卤素原子、 C ₂ — _1Q 烯基、 酰胺基、 CN、 酰 基、 d— _1Q 烷基酰基、 d— _1Q 烷基磺酰基、 d— _1Q 烷基、 C ₃ — ₆ 环烷基、 C ₃ -C ₆ 杂环基、 烷基氧基和 C ₃ — ₆ 环烷基氧基的取代基的下述基团： 酰胺基、 烷基磺酰基、 羰 基、 c ₆ — _1Q 芳基杂环基、 c ₃ -c ₆ 杂环基、 c ₃ -c ₆ 杂环基酰胺基、 c ₃ -c ₆ 杂环基羰基、

C ₃ -C ₆ 环烷基胺基、 磺酰基、 氨基磺酰基、 磺酰胺基、 C ₃ -C ₆ 杂环基磺酰基； R ₇ 、 R ₈ 、 R ₉ 独立地选自 。烷基、 。卤代烷基、 。烷基氧基、 。烷基羰基、 或 C ₃ — ₆ 环烷基， R ₈ 、 R ₉ 可以与 N 形成一个原子数为 3-6 的环； 或 R 10 Y一

，其中 Y选自 N、 O或 C; Z独立地为 0、 C、 N、

R ₁₍ )不存在或选自 H、 d— _1Q 烷基、 C ₃ — ₆ 环烷基、 d— _1Q 烷基酰胺基、 d— _1Q 烷基磷酰 基、 _1Q 烷基磺酰基、 d— _1Q 烷基羰基、 d— _1Q 烷基磺酰胺基、 CN、 d— _1Q 烷基胺基、 C ₃ _ ₆ 杂环基、 d-d。卤代烷基、 C^。芳基、 C^。杂芳基、 酯基、 醛基、 Cw。烷基 氰基、 d— ₁₍₎ έϊ代烷基磷酰胺基、 d— _1Q 烷氧基羰基，

R ₂ 、 R ₃ 和 R ₄ 独立地为 11、 具有取代基或不具有取代基的 C ₃ -C ₆ 环烷基、 具有 取代基或不具有取代基的 Crdo烷基、具有取代基或不具有取代基的 d-do烷基 胺基、 d-do烷基氧基、 具有取代基或不具有取代基的 -0>杂环基、 具有取代 基或不具有取代基的 C ₆ — _1Q 芳基、 具有取代基或不具有取代基的 C ₆ — _1Q 杂芳基； 其 中 R ₂ 、 R ₃ 和 R ₄ 中的所述取代基是独立地选自下述基团的 取代基： 卤素、 羟基、 Ci-Cio C2-C10 C ₂ -C ₁₀ 块基、 基幾基、 基、 Ci-Cio l¾ ¾¾¾¾ C1-C10 烷氧基、 d-do烷氧基羰基、 C ₆ - _1Q 芳基、 C ₆ - _1Q 杂芳基、 C ₃ -C ₆ 杂环基、 C ₃ -C ₆ 环烷 基、 磺酰基、 巯基、 氰基、 C ₃ -C ₆ 杂环基胺基、 d-do烷基胺基、 C ₃ -C ₆ 环烷基胺 基、 C ₆ — _1Q 芳基胺基、 C ₆ — _1Q 杂芳基胺基、 d-do芳烷基氧基、 C ₆ — _1Q 苯并杂环基胺基。

在本发明中， 优选当 或 为芳基时， 不为烷基。

其中，

R ₅ 独立地为 11、 卤素、 CN、 羟基、 C ₃ -C ₆ 杂环基、 苯基. 螺环基、 杂螺环基、

C C ₁₀ 烷基、 卤代

C1-C10 ¾¾¾ C1-C10 ¾¾¾$ί¾ Ci-Cio C ₆ - ₁₀ 方基 c ₆ — ₁₀ 杂芳基、 C ₃ -C ₆ 杂环基羰基烷氧基； 或可选地具有选自卤素原子、 d— _1Q 烷基、 C ₃ — ₆ 环烷基、 C ₃ -C, 杂环基、 d _1Q 烷基氧基和 C ₃ — 6环烷基氧基的取代基的下述基团： C ₆ — _1Q 芳基杂环基、 酰胺基、 羰基、 c ₃ -c ₆ 杂环基、 C ₃ -C ₆ 杂环基酰胺基、 C ₃ -C ₆ 杂环基羰基、 C ₃ -C ₆ 环烷基胺基、磺酰基、氨基磺酰基、 C ₃ -C ₆ 杂环基 ，\^

其中 Y选自 N、 0或 C; Z独立地为 0、 C、 N、 ； R _1Q 不存在或选自 H、 d— _1Q 烷基、 C ₃ — ₆ 环烷基、 d— _1Q 烷基酰胺基、 d— _1Q 烷基磷酰胺基、 d— _1Q 烷基磺 酰基、 _1Q 烷基羰基、 d— _1Q 烷基磺酰胺基、 CN、 d— _1Q 烷基胺基、 C ₃ — ₆ 杂环基、 Crdo 卤代烷基、 C ₆ — _1Q 芳基、 C ₆ — _1Q 杂芳基、 酯基、 醛基、 d— _1Q 烷基氰基、 C^o 卤代烷基磷酰胺基、 d— _1Q 烷氧基羰基， R ₇ 、 R ₈ 、 R ₉ 独立地选自 d— _1Q 烷基、 Cwo 卤代烷基、 d— _1Q 烷基氧基、 d— _1Q 烷基羰基、 d-do卤代烷基或 C ₃ — ₆ 环烷基， R ₈ 、 R ₉ 可以与 N形成一个原子数为 3-6的环；

R ₆ 独立地为 H或卤素；

X选自 N、 CH或 0。

上述 R ₂ 、 R ₃ 或 R ₄ 独立地选自下述基团： H、 环丙基、 环丁基、 环戊基、 环 己基、 甲基、 乙基、 丙基、 丁基、 乙烯基、 丙烯基、 丁烯基、 三氟甲基、 三氟乙 基、 氯甲基、 氯乙基、 甲氧基、 乙基氧基、 甲基羰基、 乙基羰基、 哌啶基、 哌嗪 基、 吡咯基、 咪唑基、 吡唑基、 吡咯烷基、 吡咯基、 二氢吡咯基、 吡咯啉基、 咪 唑烷基、 咪唑啉基、 吡唑烷基、 喹啉基、 苯并呋喃基、 吡嗪基、 吡唑啉基、 噻二 唑基、 羟基、 氰基、 磺酰基、

步的， 本发明所述化合物为通式 II的化合物:

II

其中， R ₂ 、 R ₃ 、 R ₄ 、 R ₆ 、 X、 Y、 Z和 R ₁₀ 如上所述; 更进一步的， 本发明的化合物具有如下结构:

其中， R _u 、 R ₁₂ 、 Rn R ₁₄ 独立地选自 H、 d-do垸基、 d-do垸基胺基、 C, -C ₁₀ 卤代烷基、 C ₃ _ ₆ 环烷基、 C ₂ -C,。烯基、 CrCw卤代垸基、 CrC^烷氧基、 C _r C

本发明化合物包括但不限于下述化合物： 化合物 1

™、、\

"^J 剛 -一 M 化合物 2 化合物 3 化合物 4 化合物 5

化合物 14 化合物 15

化合物 16 化合物 17

19

化合物 20 化合物 21

化合物 22

化合物 24 化合物 25

化合物 27 化合物 28

化合物 39 化合物 40

化合物 43

F.

化合物 46

顏 _¾

國 Ί ^s

、、\

剛 化合物 47 化合物 48 化合物 49 化合物 50 化 51 化

化

化合物 54 化合物 55 化合物 56 化合物 57

化合物 61 化合物 62 化合物 63 化合物 64 化合物 65 化合物 66

化合物 67 化合物 68 化合物 69 化合物 73 化合物 75

化合物 76 化合物 77 化合物 78

Q 、

广 ： F

( -

化合物 79 化合物 80 化合物 88 化合物 89 化合物 90 化合物 93

 化合物 97 化合物 98

化合物 101 化合物 102

化合物 105 化合物 106

化合物 107 化合物 108 化合物 110

本发明还提供一种组合物，所述组合物含有本 发明所述的化合物或其盐或其异构 体或其水合物和可药用载体或赋形剂。

本发明所述的化合物或其盐或其异构体或其水 合物或其组合物用于预防或治疗 syk激酶和 /或 jak激酶介导的病症或疾病。

一些实施例中，本发明化合物可用作一种或多 种 jak激酶抑制剂；一些实施例中， 本发明化合物用作 syk激酶抑制剂； 一些实施例中本发明化合物用作 jak和 syk双重 抑制剂。 一些实施例中， 本发明化合物用作 jakl激酶抑制剂； 一些实施例中， 本发明化 合物用作 jak2激酶抑制剂； 一些实施例中， 本发明化合物用作 jak3激酶抑制剂。

一些实施例中， 本发明化合物用作与 jak和 /或 syk相关疾病的治疗， 包括任何与 jak和 /或 syk的表达或活性直接或间接相关的疾病或病症 ，包括过度表达和 /或异常的 活性水平， 也包括通过调节 jak和 /或 syk活性得到预防、 缓解或治愈的疾病。

所述 syk激酶和 /或 jak激酶介导的病症或疾病选自血液病、过敏性 哮喘、骨髓纤 维化和类风湿性关节炎。

进一步的， 所述 syk激酶和 /或 jak激酶介导的病症或疾病选自白血病、骨髓增 生 性疾病。

更进一步的， 所述 syk激酶和 /或 jak激酶介导的病症或疾病选自多发性骨髓瘤、 慢性髓原白血病、 原髓细胞白血病、 B细胞淋巴瘤、 单核细胞白血病、 脾大性红细胞 增多、 嗜酸性白细胞增多综合征、 原发性血小板减少症、 系统性巨细胞疾病。

本发明化合物还可与一种或多种其他药物联合 使用以治疗与 jak和 /或 syk相关疾 病， 例如 FAK激酶抑制剂、 类固醇、 免疫抑制剂等。 可以同时或依顺序施用给需要 治疗的患者。 类固醇可以是可的松类固醇， 例如地塞米松。

可将本发明化合物及其药学上可接受的盐或其 异构体或其水合物和 /或组合物与 药学上可接受的赋形剂或载体配制在一起，得 到的组合物可在体内给予哺乳动物， 例 如男人、 妇女和动物， 用于治疗病症、 症状和疾病。 组合物可以是： 片剂、 丸剂、 混 悬剂、 溶液剂、 乳剂、 胶囊、 气雾剂、 无菌注射液。 无菌粉末等。

一些实施例中， 药学上可接受的赋形剂包括微晶纤维素、 乳糖、柠檬酸钠、碳酸 钙、磷酸氢钙、 甘露醇、羟丙基 - β -环糊精、 β -环糊精（增加）、 甘氨酸、崩解剂（如 淀粉、 交联羧甲基纤维素钠、 复合硅酸盐和高分子聚乙二醇）， 造粒粘合剂 (如聚乙烯 吡咯烷酮、 蔗糖、 明胶和阿拉伯胶)和润滑剂 (如硬脂酸镁、 甘油和滑石粉)。

向患者施用本发明化合物或药物组合物的量不 固定，通常按药用有效量给药。同 时， 实际给予的化合物的量可由医师根据实际情况 决定， 包括治疗的病症、选择的给 药途径、给予的实际化合物、 患者的个体情况等。本发明化合物的剂量取决 于治疗的 具体用途、 给药方式、 患者状态、 医师判断。 本发明化合物在药物组合物中的比例或 浓度取决于多种因素， 包括剂量、 理化性质、 给药途径等。

本发明还涉及一种用于制备如权利要求所述的 通式 I的化合物或其药学上可接 升 体或水合物的

中间体 1 中间体 2 附图说明

图 1是化合物 16、 8、 9、 7 、 25在 ΙΟΟηΜ对 JAK2, JAK3 和 SYK的抑制率 ( )； 图 2是化合物 16、 8、 9、 7、 25对 JAK2酶的半数抑制浓度 IC50值； 图 3是化合物 16、 8、 9、 7、 25对 JAK3酶的半数抑制浓度 IC50值； 图 4化合物 16、 8 、 9 、 7、 . 25对 SYK酶的半数抑制浓度 IC50值；

图 5是化合物 16、 8、 9、 7、 25在 100 nM对 JAK1 的抑制率 ( )；

图 6是化合物 16、 8、 9、 7、 25对 〗AK1 的半数抑制浓度 IC50值；

图 7是化合物 16、 8、 9、 7、 25对 WSU-DLCL2细胞的半数抑制浓度 IC50值； 图 8是化合物 16、 8、 9、 7、 25对 L1210细胞的半数抑制浓度 IC50值； 图 9是化合物 16、 8、 9、 7、 25对 THP-1细胞的半数抑制浓度 IC50值； 图 10是化合物 16 、 8 、 9、 . 7 、 25对 K562细胞的半数抑制浓度 IC50值； 图 11是化合物 16. 、 8、 . 9、 , 7- 、 25对 HL-60细胞的半数抑制浓度 IC50值； 图 12是化合物 16 、 8 、 9、 . 7 、 25对 RPMI-8226细胞的半数抑制浓度 IC50值 具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详 细描述，但是本领域技术人员将会 理解， 下列实施例仅用于说明本发明， 而不应视为限定本发明的范围。 实施例中未注 明具体条件者， 按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用 试剂或仪器未注明生产 厂商者， 均为可以通过市购获得的常规产品。

除另有说明外， 本发明使用的縮写为常规术语。 DIPEA指 Ν,Ν-二异丙基乙胺， DCM指二氯甲烷， ΝΜΡ指 1-甲基 -2-吡咯烷酮， m-CPBA指间氯过氧苯甲酸， p-TSA 指对甲苯磺酸， TFA指三氟乙酸， DCE指 1,2-二氯乙烷， DMF指 Ν,Ν-二甲基甲酰胺， HOBt指 1-羟基苯并三唑， Et表示乙基， eq表示电子当量， OAc表示乙酸根。 实施例 1

以 3- (甲基巯基) -5-氧 -4,5-二氢 -1,2,4-三嗪 -6-羧酸乙酯为起始原料， 其制备方法见

Journal of Organic Chemistry,Huang,J.J.,1985,vol.50,p2293。 也可以通过购买途径得到， 如 Cgene Tech

起始原料

中间体 X的制备： 见 Journal of Organic Chemistry,Huang，J.J.，1985，vol.50，p2293。 也可以通过购买途径得到， 如 Cgene Tech。

中间体 X

将起始原料在氯化亚砜中回流 4h， 真空浓縮至干， 得到固体， 即中间体 X。 化合物 1的制备：

步骤 1 :

中间体 X(20 g)溶解于 670 mL干燥的乙腈当中， 加入 DIPEA(16.06 mL), 缓慢滴 加 6.52 mL的环丙胺， 滴加完毕后室温搅拌十五分钟。 随后， 加入氨气饱和的甲醇溶 液 670 mL。 室温继续搅拌 2小时， 减压除去溶剂， 加入 190 mL甲醇和 190 mL二氯 甲烷进行打浆处理， 过滤得到滤饼， 将母液浓縮， 再次过滤得到滤饼， 合并两次滤饼 并用正己烷洗涤后真空干燥得到固体中间体 1 (17g)。

中间体 1

1H-NMR(400MHZ,DMSO)：

0.58-0.62(m, 2H)， 0.79-0.84(m, 2H)， 2.55 (s, 3H)， 2.88-2.91(m,lH), 7.87(s, 1H)， 8.49(s, 1H), 9.13-9.14(s, 1H)

步骤 2:

步骤 1得到的中间体 1 lOOmg ( 0.44mmol)溶解于 lOmL NMP ( 1-甲基 -2-吡咯烷 酮） 中， 加入 1.5eq ( 0.66mmol ) 的 m-CPBA (间氯过氧苯甲酸）， 混合物在室温下搅 拌 30min后加入 leq ( 0.44mmol) 的 p-TSA (对甲苯磺酸） 和 2eq ( 0.88mmol) 的 4- 吗啉基苯胺， 得到的混合液在 11CTC下搅拌 2-4h， 冷却到室温后， 用 lOOmL以上的 乙酸乙酯稀释， 然后用饱和碳酸钠溶液洗涤， 再用水洗， 真空浓縮， 反相 HPLC分离 得到化合物 1。

化合物 1

化合物 2-17、 97-105、 115-117可以用相应的胺与中间体 1用上述方法制备得到。 化合物 2-17、 97-105、 115-117的结构见表 1， 其中， X为 C, R ₃ 、 R ₆ 均为 H，

R4均为环丙基。

ΐεθΐΐΐ/ ΟΖ OAV

?ΐ

(r)6r (HHs 化合物 16:

1H-NMR(400MHZ,DMSO)： 0.59-0.68(m,2H), 0.87-0.94(m,2H), 2.85-2.95(m,lH) 3.16(s,3H), 7.69(s,lH), 7.86(d,2H), 8.16(d,2H), 8.32(s,lH), 9.19(s,lH),10.56(s,lH) 化合物 18:

中间体 1 (5 g)加入到 150 mL干燥的 DMF当中， 加入间氯过氧苯甲酸 (11.5 g)并 在室温搅拌一个小时， 然后加入对甲苯磺酸水合物 (4.2 g)和 l-BOC-4-(4-氨基苯基)哌 啶 (12.3 g)。 将反应温度升至 120°C搅拌 2小时后， 将其冷却至室温， 加入乙酸乙酯进 行稀释并用饱和碳酸钠水溶液和饱和食盐水进 行洗涤，加入无水硫酸镁进行干燥， 减 压浓縮掉 95%乙酸乙酯，大量固体物质析出，过滤并用少 量乙酸乙酯洗涤滤饼后得化 合物 18(3 g).

化合物 18

化合物 19: 将化合物 18与 TFA/DCM ( 1:1 ) (三氟乙酸 /二氯甲烷） 混合后， 室 温下搅拌， 反 相 HPLC柱分离得到化合物 19。

化合物 19

化合物 20: leq化合物 19溶解于 3mL NMP ( 1-甲基 -2-吡咯烷酮） 中， 加入 3eq DIPEA (Ν,Ν-二异丙基乙胺）和 2eq溴乙腈，得到的混合液在室温下搅拌 2h，用 TFA (三氟乙酸） 酸化， 反相 HPLC柱分离得到化合物 20。

化合物 20

化合物 21 : lOOmg 化合物 19溶解于 3mL DMF (Ν,Ν-二甲基甲酰胺） 中， 密封 管中 12CTC下搅拌 2天， 用水稀释， TFA (三氟乙酸） 酸化， 反相 HPLC柱分离得到 化合物 21。

化合物 21

化合物 22: leq化合物 19溶解于 3mL NMP ( 1-甲基 -2-吡咯烷酮） 中， 0°C下向 混合物中加入 3eq DIPEA (Ν,Ν-二异丙基乙胺）和 2eq甲磺酰氯， 得到的混合液搅拌 lh后， 用 TFA (三氟乙酸） 酸化， 反相 HPLC柱分离得到化合物 22。

化合物 22

化合物 23:

化合物 23

步骤 1 : 化合物 18(2.5 g)加入 50 mL盐酸饱和的甲醇溶液中， 室温搅拌 3小时后 将溶剂减压旋干得到固体中间体 Y(2.2 g)。

上述得到的固体中间体 Y (500 mg)加入到 15mL干燥的 DMF溶液当中， 加入溴 代异丙烷 (472 mg， 分两次加入)， 无水碳酸钾 (353 mg)和碘化钾 (212 mg)， 50°C加热搅 拌 20小时后， 减压除掉 DMF, 随后加入 35mL DCM/MeOH (5:1)并过滤， 滤液浓縮 后用

1H-NMR(400MHZ,DMSO):

0.58-0.65 (m，2H) ,0.82-0.91 (m，2H) ,1.18-1.32 (d,6H) ,1.79-1.93 (m，2H) ,1.95-2.08 (m,2H) ,2.74-2.93 (m,2H) ,3.00-3.15 (m,2H) ,3.39-3.58 (m,3H) ,7.18 (d,2H) ,7.60 ( s,lH) ,7.82 (d,2H) ,8.23 ( s,lH) ,9.08 ( s,lH) ,10.05 ( s,lH)。 化合物 24:

化合物 24

中间体 Y (720 mg)加入到 72mL 乙腈溶液当中，无水碳酸钾 (640 mg),碘化钾 (370 mg)和溴乙烷 （900 mg， 分批次加入)， 50°C加热搅拌 48小时后， 减压除掉乙腈， 随 后加入 50mL DCM/MeOH(5:l)并过滤， 滤液浓縮用二氯甲烷和甲醇（DCM： MeOH=20:l)过

24

1H-NMR(400MHZ,DMSO):

0.55-0.68 (m，2H) ,0.79-0.81 (m，2H) ,1.22-1.31 (m，3H) ,1.72-1.91 (m，2H) ,1.95-2.12 (m,2H) ,2.73-2.91 (m,2H) ,2.93-3.08 (m,2H) ,3.10-3.22 (m,2H) ,3.48-3.62 (m,2H) ,7.19 (d,2H) ,7.60 ( s,lH) ,7.86 (d,2H) ,8.23 ( s,lH) ,9.09 ( s,lH) ,10.06 ( s,lH) . 化合物 25:

化合物 25

中间体 Y (500 mg)加入到 15mL干燥的 DMF溶液当中，加入溴代环戊烷 (572 mg, 分两次加入)， 无水碳酸钾 (353 mg)和碘化钾 (212 mg)， 80 °C加热搅拌 20小时后， 减 压除掉 DMF, 随后加入 35mL DCM/MeOH(5:l)并过滤， 滤液浓縮后用二氯甲烷和甲 醇 (DCM: MeOH=20:l)过柱得到化合物 25 (200 mg)。

中间体 25

1H-NMR(400MHZ,DMSO)： 0.62-0.63(m,2H),0.85-0.87(m,2H),1.63-1.65(m,4H),1.68-1.71(m, 8H) ,1.83-1.91(m,lH),2.1 5-2.16(m,2H),2.86-2.87(m,2H),3.11-3.13(m,2H) ,7.18(d,2H)„7.56(s,lH) ,7.81(d,2H) ,8.21( s,lH) ,9.07(s,lH),9.98(s,lH)

化合物 26:

化合物 26 中间体 Y(600 mg)加入到 50mL DMF溶液当中，无水碳酸钾 (530 mg)，碘化钾 (256 mg)和溴代环己烷 （lg， 分批次加入)， 100°C加热搅拌 48小时后， 减压除掉 DMF， 随后加入 50mL DCM/MeOH(5:l)并过滤， 滤液浓縮用二氯甲烷和甲醇 (DCM： MeOH=20:l)过柱得化合物 26 (32 mg, yield: 5% )。

1H-NMR(400MHZ,DMSO)：

0.61-0.68

( m，2H ) ,0.83-0.91(m,2H),1.08-1.48(m,6H),1.56-1.64(m,lH),1.78-1.86(m ,4H),1.97-2.04 (m,4H),2.71-2.75(m,lH),2.82-2.87(m,lH),2.90-3.08(m,2H),3.37- 3.44(m,2H),7.24(d,2H,8. 8Hz),7.83(d, 2H,8.8Hz)

实施例 2

化合物 27的制备：

步骤 1 :

中间体 X中加入 20mL干燥乙腈溶解后， 加入 450μί (2.6mmol) DIPEA (Ν,Ν- 二异丙基乙胺）和 2.6mmol环丁基胺。混合物在室温下搅拌 5h后，加入 20mL 7N NH ₃ 的甲醇溶液， 得到的混合液搅拌过夜， 真空浓縮， 用 0-7%的 DCM (二氯甲烷） 甲醇 溶液过硅胶柱， 分离得到中间体 2， 收率 75%。

中间体 2

步骤 2:

步骤 1得到的中间体 2(0.44mmol)溶解于 lOmL NMP中，加入 1.5eq(0.66mmol) 的 m-CPBA， 混合物在室温下搅拌 30min后， 混合物中加入 leq (0.44mmol)的 pTSA 和 2eq (0.88mmol) 的 4-吗啉基苯胺， 得到的混合液在 110°C下搅拌 2-4h， 冷却到室 温后， 用 lOOmL以上的乙酸乙酯稀释， 然后用饱和碳酸钠溶液洗涤， 再用水洗， 真 空浓縮， 反相 HPLC分离得到化合物 27。

化合物 27

化合物 28-45、 106-114、 118可以用中间体 2与相应的胺通过上述方法制备得到。 化合物 28-45、 106-114、 118的结构见表 2， 其中， X为 C， R ₃ 、 R ₆ 均为 H，

R4均为环丁基。

上述表 2 中相应的胺可以市购得到， 不能市购得到的， 可以通过前述方法制备 得到。 化合物 46: 将化合物 43与 TFA/DCM(1:1)混合后， 室温下搅拌， 反应完成后得 到的混合液真空 反相 HPLC分离 化合物 46。

化合物 46

化合物 47: leq化合物 46溶解于 3mL NMP中，加入 3eq DIPEA和 2eq溴乙腈， 得到的混合液在室 得到化合物 47 _;

化合物 47

化合物 48: lOOmg 化合物 46溶解于 3mL DMF中，密封管中 120 °C下搅拌 2天， 用水稀释， TFA酸化， 反相 HPLC柱分离得到化合物 48。

化合物 48

化合物 49: leq化合物 46溶解于 3mL NMP中， 0°C下向混合物中加入 3eq DIPEA 和 2eq甲磺酰氯， 得到的混合液搅拌 lh后， 用 TFA酸化， 反相 HPLC柱分离得到化 合物 49。

化合物 49

化合物 50: 100mg( leq) 化合物 46溶解于 5mL DCE、5mL二氧六环和 5eq DIPEA 的混合液中， 搅拌下， 向混合液中加入 20eq丙酮， 得到的反应液搅拌 lh后， 加入 10eq醋酸和 5eq NaBH(OAc) ₃ ， 反应液搅拌过夜， 加入 lmL水后， 真空浓縮干燥， 得 到的产物用甲醇

化合物 50

用化合物 46和溴乙烷为原料， 用与化合物 24类似的成方法可以得到化合物 51.

化合物 51

用化合物 46与溴代环戊烷为原料， 用与化合物 25类似的合成方法可以得到化 合物 52.

化合物 52

用化合物 46与溴代环己烷为原料， 用与化合物 26类似的合成方法可以得到化 合物 53.

化合物 53 实施例 3

化合物 54-87可以用实施例 1和实施例 2类似的方法制备。

表 3列出了化合物 54-87制备所用的区别原料以及得到的目标化合� ��的结构， 其中， R ₂ 、 为 表 3 化合物 54-87所用部分原料及目标化合物结构

实施例 4

化合物 88-96的制备:

首先制备

中间体 3

步骤 1 :

在 25毫升的无水乙醇溶液中加入中间体 X( 10毫摩尔）及 R ₃ R4NH(25毫摩尔）， 反应混合物在 35°C下搅拌过夜， 反应结束后减压抽干溶剂， 所得混合物过柱分离得 到产物 3-1。

3-1

步骤 2:

在 100 毫升的圆底三口反应瓶中加入步骤 1 得到的产物 3-1 ( 10 毫摩尔）， ( 12毫摩尔）， DMF (25 mL), 反应混合物在 75-80°C下搅 拌反应 5小时。 反应结束后过柱分离 （石油醚： 乙酸乙酯 （100: 0-0： 100) 得产物 3-2。

3-2

步骤 3:

在 100毫升的圆底三口反应瓶中加入步骤 2得到的产物 3-2 ( 10毫摩尔）， LiOH ( IN, 10 mL) ,MeOH(25 mL), 反应混合物在 25 °C下搅拌反应 10小时。 反应结束后 加入 1N盐酸调节 pH至 1。 反应产物用乙酸乙酯萃取， 干燥， 减压除去溶剂， 得产 物 3-3。

R ₂

3-3 步骤 4:

在在 100毫升的圆底三口反应瓶中加入 DMF (25毫升），步骤 3得到的产物 3-3

( 10毫摩尔）， 三乙胺 （10毫摩尔）， HOBt ( 10毫摩尔）， 反应混合物在室温搅拌反 应 1小时， 在搅拌下通入无水氨气 （450毫升）， 室温反应 5小时。 反应结束后加入 冰水 100毫升。 乙酸乙酯萃取反应液三次 （100mLx3)， 合并乙酸乙酯萃取液， 以无 水 Na ₂ S0 ₄ 干燥一小时。 减压除去溶剂， 过柱分离得产物 3-4。

3-4

步骤 5:

在 100毫升的圆底三口反应瓶中加入二氯甲烷（25� ��升），步骤 4得到的产物 3-4 ( 10毫摩尔） 及三氟乙酸 （5毫升）， 0 °C下搅拌 6小时， 反应完毕后减压除去溶剂 得中间体 3A-1到 3A-10o

表 4: 部分中间体 3结构

化合物 88-96制备：

在 5毫升的三口瓶中加入无水四氢呋喃（1毫升）� ��分别加入中间体 3A-1到 3A-10

）， 0 °C下搅拌 1小时，然后加入 R ₁₃ S0 ₂ C1或 R ₁₄ COCl 0°C下反应 3小时。 反应完毕后过柱分离得化合物

88-96。 表 5 化合物 88-96结构

实施例 5、

可通过本领域中已知的各种方法测定本发明化 合物在体外和体内抑制 syk激酶和 jak激酶的活性。 IC _5Q 值越小， 抑制 syk/jak活性的能力越高。 （IC _5Q 值为使 syk/jak蛋白水 解活性抑制 50%所需化合物的浓度。）

用于检测和测定对 syk的抑制活性的体外测定方法如下：

抑制 syk酪氨酸磷酸化活性

通过测定实验化合物抑制 syk介导的 syk特异性的酪氨酸磷酸化的能力，评价候选 分子抑制 syk酪氨酸磷酸化活性的效力。

采用由 Perkin Elmer Life and Analytical Sciences (Boston, MA)开发的 LANCE™ 技术， 测定 SYK酪氨酸磷酸化活性。 LANCE™是指均相时间分辨荧光分析， 该方法 采用例如时间分辨荧光共振能量转移测定技术 （TR-FRET) (通常参见 Perkin Elmer Application Note-如何优化用基于时间分辨荧光分析的 LANCE检测的酪氨酸激酶测定 (How to Optimize a Tyrosine Kinase Assay Using Time Resolved Fluorescence-Based LANCE Detection)中的方法）。该测定主要涉及利用从� �酸特异性铕标记抗体转移到 作为受体的链亲和素 -别藻蓝素的能量转移测定磷酸化底物。

为测试候选分子抑制 SYK酪氨酸磷酸化活性的能力，将分子在 30%的 DMSO中复 溶， 按 1:3的比例进行系列稀释， 最终稀释液含 DMSO但不含候选分子。 在测定中， 最终 DMSO浓度为 3%。 通过两部分反应进行激酶实验。 第一部分反应为激酶反应， 反应物含有候选分子、 全长活性重组 SYK酶 （Millipore, CA) 和生物素标记的 SYK 特异性底物即生物素 -DEEDYESP-OH。 第二部分反应涉及激酶反应的终止且同时加 入检测试剂-铕标记的抗磷酸酪氨酸试剂 （Eu-W1024-PY100， Perkin Elmer, Boston, MA)和链亲和素 -别藻蓝素检测试剂（SA-APC,Prozyme， CA)。 在黑色 U形底 96孔微 量板中进行激酶反应。 用含 50mM Tris pH7.5、 5mM Mgcl ₂ BlmM DTT的缓冲液稀释 至终反应体积为 50μί， 含 ΙηΜ终浓度的活性 SYK酶、 550nM SYK底物和 ΙΟΟμΜ ATP。 使反应在室温下进行 1小时。淬灭缓冲液含有 100 mM Tris pH7.5、 300mM NaCl、 20mM EDTA, 0.02%Brii35和 0.5BSA。 按以下稀释度， 将检测试剂加入反应混合物： 对于 EU-W1024-PY100而言，按 1:500加入，对于 SA-APC而言，按 1:250加入。通过加入 50μΙ^ 含检测试剂的淬灭缓冲液将激酶反应终止， 在室温下检测 1小时。 在抑制剂存在或不 存在的情况下， 在 TR-FRET仪 Analyst HT (Molecular Probes, Sunnyvale, CA) 中检 测磷酸化底物， 用 CriterionHost Release2.0 (Molecular Probes, Sunnycale, CA) 设置 测定条件。 使用的参数设置如下： 激发波长 360nm， 发射波长 665-7.5nm， 分束器 350nm50/50, 闪光 100脉冲， 迟滞 60us， 积分 400us， z-高度 2mm。 与不存在抑制剂的 情况相比， 根据在抑制剂的存在下观察到的最大响应计算 SYK-酪氨酸激酶活性的抑 制。 通过非线性回归分析得出 IC _5Q 值， 在表 6中以 1。 ₅₍₎ 范围形式列出。

用于检测和测定抑制 jak激酶的活性的体外测定方法如下：

可通过本领域中已知的各种方法 （例如测试化合物抑制人血浆 jak激酶活性的能 力的试验）测定本发明化合物对人 jak激酶活性的作用， 通过 IC _5Q 值测定本发明化合物 显示出的对人 jak激酶抑制的有效亲和力。 得到的 IC ₅₍₎ 值在表 6中列出。

表 6提供了本发明化合物在 syk和 jak实验中的活性： +++++=IC _5Q < 0.001 μΜ， ++++=0.001μΜ < IC ₅₀ < Ο.ΟΙμΜ, +++=0.01μΜ < IC ₅₀ < Ο.ΙμΜ, ++=0.1μΜ < IC ₅₀ < ΙμΜ,

表 6 本发明化合物在 syk和 jak实验中的活性

ΐεθΐΐΐ/ ΟΖ OAV +++ ++ 08

++ +++ 6L

++ +++ 8乙

++ +++ LL

++ +++ 9L

++ ++ iL

++ ++ PL

++ ++ £L

++ ++ ZL

++ +++ \L

++ +++ 0L

++ ++ 69

++ ++ 89

++ ++ L9

++ ++ 99

++ +++ 99

++ +++ P9

+++ +++ £9

+++ +++ Z9

+++ ++ 19

+++ ++ 09

+++ ++ 6i

++ ++ 8S

++ ++ Li

+++ +++ 9i

++ +++ ςς

++ +++ ρς

++ +++ ζς

+++ ++ ζς

ΐεθΐΐΐ/ ΟΖ OAV 81 ++

82 ++

83

84

85

86

87

88

89

90

91

92

93

94

95

96

所有本发明化合物均为有效的 _S yk和 /或 jak激酶抑制剂， 在某些实施方案中， 本 发明化合物可为 syk/jak双重抑制剂， 也就是说它们在一定程度上既抑制 syk激酶， 又 抑制 jak激酶。 在其他实施方案中， 本发明化合物可选择性抑制 syk激酶， 但不显著抑 制一种或多种 jak激酶。 在其他实施方案中， 本发明化合物可选择性抑制 jak激酶， 但 不显著抑制一种或多种 syk激酶。 实施例 6 部分化合物进行 JAK2, JAK3和 SYK的抑制活性筛选

一. 实验目的

测定 5个化合物： 16， 8， 9， 7和 25对激酶 JAK2, JAK3和 SYK的抑制活性。 选取 100 nM 的浓度进行初筛， 分别计算相应浓度的化合物对不同酶的活性抑 制率。 根据 初筛的结果， 进一步测定上述 5个化合物对 JAK2, JAK3和 SYK酶的半数抑制浓度 IC50 值。

二. 材料和仪器 2104 EnVision® Multilabel Reader (PerkinElmer)

White Opaque 384-well low volume MicroPlate(Cat.3674, Corning)

HTRF kinEASE TK (Cat.62TKOPEC, Cisbio)

JAK2酶 (Cat: 08-045, Carna)

JAK3酶 (Cat: 08-045, Carna)

SYK酶 (Cat: 08-176, Carna)

ATP 10 mM (Cat.PV3227, Invitrogen)

DTT 1 M (Cat.D5545, Sigma)

MgCl ₂ 1 M (Cat.M8266, Sigma)

MnCl ₂ 1 M (Cat.244589, Sigma)

三. 实验步骤

1 试剂配制

JAK2 ， JAK3和 SYK三种激酶试剂配制

种激酶的反应体系各组分及浓度表

1 X JAK2酶缓冲液 （Enzymatic Buffer) ：

ImL I X激酶缓冲液 （Kinase Buffer) 中含有 200 L 5 X酶缓冲液， 5 μ L 1M MgCl ₂ , 1 μ L 1M DTT, 794 μ L ddH ₂ 0 (去离子水）。

1 X JAK3酶缓冲液 （Enzymatic Buffer) ：

ImL 1 X激酶缓冲液中含有 200 μ L 5 X酶缓冲液， 5 μ L 1M MgCl ₂ , 1 L 1M DTT, 794 μ L ddH ₂ 0。

I X SYK酶缓冲液：

ImL I X激酶缓冲液中含有 200 L 5 X酶缓冲液， 5 μ L 1M MgCl ₂ , 1 L 1M MnCl ₂ , 1 μ L 1M DTT, 793 μ L ddH ₂ 0。 5 X酪氨酸激酶底物 （Substrate- TK) 和 ATP工作液

酪氨酸激酶底物和 ATP的具体浓度见表 7。

用 I X激酶缓冲液 （Kinase Buffer) 稀释 Substrate-TK (酪氨酸激酶底物） 和 ATP 至反应浓度的 5倍。

5 X酶工作液

三种激酶 （JAK2 ,JAK3和 SYK) 的浓度优化已在之前的工作中完成， 筛选浓度 见表 7。 用 I X激酶缓冲液配制 5 X酶工作液。

4 X Sa-XL665 工作液

Sa-XL665在反应中的浓度参见表 1。 用检测缓冲液 （Detection Buffer ) 配制 4 X Sa-XL665 工作液。

4 X TK-Ab-cryptate 工作液

用检测缓冲液 将 TK-Ab-Cryptate稀释 100倍作为工作液。

2. 实验流程

所有试剂按照上述方法配好后， 除酶外， 平衡到室温以后， 开始进行加样。 生物素标记的酪氨酸激酶 （TK-biotin ) 底物， ATP， 酶以及一定浓度的化合物 在 50 mM Hepes/NaOH H 7.0， 0.02 NaN ₃ , 0.01% BSA , 0.1 mM原钒酸盐 ( orthovanadate) , 5 mM MgCl ₂ , 1 mM MnCl ₂ , 1 mM DTT溶液中室温反应。 待测 化合物的抑制浓度进行 4倍梯度稀释 ， 使用 2.5%的 DMSO作为共溶剂。 向所有反应孔 中加入 Ιθ μΐ 经 50 mM Hepes/NaOH pH 7.0， 0.1% BSA, 0.8 M KF, 20 mM EDTA稀释 的 Streptavidin-XL665 和 TK antibody europium cryptate(l : 100) (铕荧光纳米颗粒标记 的酪氨酸抗体） 混合检测液， 室温反应 lh后， 用 ENVISION (Perkinelmer) 仪器检测 荧光信号（320 nm刺激, 665 nm， 615 nm发射）。通过全活性孔和背景信号孔计算出 每个孔的抑制率， 复孔取平均值， 同时用专业的画图分析软件 PRISM 5.0 对每个待测 化合物进行半数抑制活性 （IC50 ) 的拟合。

实验加样流程图如下：

冲液 液

τκ 2 L 2 μ

Substrate -biotin L 2 L

激酶 2 μ L 2 μ L激酶缓冲液 2 μ L

把板密封， 室温下孵育 10分钟

ATP 2 μ L 2 L 2 μ L

把板密封， 室温下孵育

检测步骤 (10 μ L)

Sa-XL665 5 L 5 L 5 L

TK-Ab-Cry板 5 L 5 L 5 L

把板密封， 室温下孵育 1小时

320 nm激发， 665 nm， 615 nm发射

3. 数据分析

发射光比率 （ER， Emission Ratio)= 665 nm发射信号 / 615 nm发射信号 抑制率 = (ER 阳性一 ER样品) /(ER 隱一 ER 酣) *100%

运用软件 Graphpad Prism 5 并采用计算公式 log (抑制剂）对标准化响应 (normalized response) -可变斜率（Variable slope) 进行 IC50曲线拟合并计算出 IC50 值.

四 结果

1)待测化合物在 100 nM对 JAK2, JAK3 禾 B SYK抑制活性测定

应用 HTRF kinEASE TK试剂盒检测化合物 16、 8、 9、 7、 25在 100 nM时对 JAK2, JAK3 和 SYK 的抑制活性， 同时选取星孢菌素 作为参考化合物。

图 1显示了所有化合物 16、 8、 9、 7、 25对 JAK2， JAK3 和 SYK的抑制率。

2)化合物 16、 8、 9、 7、 25对 JAK2, JAK3 和 SYK酶的半数抑制浓度 IC50值测 定

应用 HTRF kinEASE TK试剂盒检测 5个化合物 16、 8、 9、 7、 25对 JAK2， JAK3 和 SYK酶的半数抑制浓度 IC50值。 进行 JAK2禾 B JAK3 测定时， 化合物 16、 8、 9、 7、 25的作用终浓度从 10 μΜ开始， 4倍梯度稀释， 10个浓度； 进行 SYK测定时， 化合物 16、 8、 9、 25从 100 μΜ开始， 4倍梯度稀释， 10个浓度， 化合物 7从 10 μΜ 开始 4倍梯度稀释， 10个浓度， 控制 DMSO的终浓度为 1%， 每个浓度为复孔测试。 并同步检测参考化合物星孢菌素对 JAK2， JAK3 和 SYK酶的半数抑制浓度，从 1 μΜ 开始 4倍梯度稀释， 10个浓度， 控制 DMSO浓度为 1%， 每个浓度为复孔测试。 实 验结果见图 2-4。 实施例 Ί 化合物对 JAK1 的抑制活性筛选

一. 实验目的

测定 5个化合物 16、 8、 9、 7、 25 JAK1的抑制活性。 选取 100 nM 的浓度进 行初筛， 分别计算相应浓度的化合物对酶的活性抑制率 。根据初筛的结果判断， 进一 步测定上述 5个化合物对 JAK1酶的半数抑制浓度 IC50值。

二. 材料和仪器

Spectra Max M5 Plate Reader (Molecular Devices)

Corning low volume black Opaque 384-well MicroPlate (Cat.3676, Corning) Z' -Lyte™ Kinase Assay试剂盒 - TYR 6 Peptide (Cat: PV4122, Invitrogen) Z' -LYTE™ Tyr 6肽底物 （Cat: PV4123, Invitrogen)

Z' -LYTE™ Tyr 6 磷酸化 -月太 （Cat: PV4124, Invitrogen)

5X 激酶缓冲液 (HEPES 250 mM (pH7.5), 50 mM MgC12, 5 mM EGTA , 0.05% Brij-35)(Cat: PV3189, Invitrogen)

10 mM ATP (Cat: PV3227, Invitrogen)

检测试齐 U (Development Reagent) A (Cat: PV3297, Invitrogen)

检测缓冲液 (Development Buffer) (Cat: P3127, Invitrogen)

终止试剂 （Stop Reagent) (Cat: P3094, Invitrogen)

JAK1 (Cat: PV4774, Invitrogen)

三. 实验步骤

1 试剂配制

I X激酶缓冲液 A

用无菌水稀释 5 X激酶缓冲液到 1 X激酶缓冲液 A， 此时 lx 激酶缓冲液 A含 有 HEPES 50 mM (pH7.5), 10 mM MgCl ₂ , ImM EGTA和 0.01% Brij-35。 整个激酶反 应中， 采用 IX激酶缓冲液 A稀释 ATP溶液， 底物， 酶和化合物。

4 X 化合物工作液

待测化合物用 DMSO溶解至 10 μΜ作为储存液， 各取 1 加入 24 1 X 激酶 缓冲液 Α中，得到 400 nM 含 4% DMSO的化合物溶液，每个稀释溶液各取 2.5 加 入 384孔板中，这样在最后的 10 激酶反应体系中化合物的终浓度就分别是 100 nM 并含有 1% DMSO, IC50测定时稀释方法与此类似。 2X Z' -LYTE™肽底物 /JAK1 工作液

用 1 X 激酶缓冲液 A配制肽底物和 JAK1酶至反应终浓度的 2倍。例如配制 300 μΐ 2 X Z' -LYTE™肽底物 /JAK1 工作液，用 IX 激酶缓冲液 A将 Z' -LYTE™ Tyr 6 肽底物稀释到 4 μΜ (1.2 μΐ 1 mM Z' -LYTE™ Tyr 6肽底物） ， 同时将 JAK1稀释为 10 ng/μΐ (10 μΐ 310 ng/μΐ JAK1), 对于化合物筛选试验， 加入 5 μΐ 2Χ Z' -LYTE™肽 底物 /JAK1 工作液到酶反应体系中， 最终 Z' -LYTE™肽底物和 JAK1的终浓度都是 分别为 2 μΜ和 50 ng/孔。

2X磷酸化-肽 (Phospho-peptide) 工作液

用 1 X 激酶缓冲液 A溶液配制 2X磷酸化 -肽工作液。 例如吸取 1.2 μΐ of 100 μΜ Z' -LYTE™ Tyr 11磷酸化 -肽至 28.8 W of IX激酶缓冲液 A充分混匀， 此工作液作 为 100% 磷酸化（phosphorylation)对照孔使用，代替 2X Z' -LYTE™肽底物 /JAK1 工 作液， 对于化合物筛选试验， 加入 5 μΐ 2 Χ Z' -LYTE ^TM Phospho-Peptide工作液到酶 反应体系中， 最终 Z' -LYTE™磷酸化-肽的终浓度为 2 μΜ。

4ΧΑΤΡ工作液

用 1 X激酶缓冲液 Α配制酶工作液。例如取 3 μΐ 10 mM ATP储液 至 lj 72 μΐ IX 激酶缓冲液 Α得到 400 μΜ工作液， 加入 2 .5 μΐ ATP工作液到反应体系中， 最终 ATP的用量为 100 μΜ。

3 X检测混合液

根据检测试剂 （Development Reagent ) B 的 COA 说明， 用检测缓冲液 ( Development Buffer) 1： 128倍稀释检测试齐 U (Development Reagent) A配制 3 X 检测混合液， 例如配制 256 μΐ 3Χ检测混合液， 需要 2 μΐ检测试剂 （Development Reagent) B 储液以及 254 μΐ lx检测缓冲液 （ Development Buffer), 充分混匀， 不 要涡旋。 对于化合物筛选试验， 加入 5 W 3 Χ 检测混合液到酶反应体系中。

2. 实验流程

所有试剂按照上述方法配好后， 除酶外， 平衡到室温以后， 开始进行加样。

Z ' -LYTE™ Tyr 6 肽底物底物， ATP， 酶以及一定浓度的化合物在 50 mM Hepes/NaOH H 7.5, 0.01% NaN3， 5 mM MgC12, 1 mM EGTA和 0.01% Brij-35溶 液中室温反应 60分钟。 向所有反应孔中加入 5 μΐ 经 IX检测缓冲液 （ Development Buffer)稀释的检测试剂（Development Reagent) A混合检测液， 室温反应 lh后， 向 所有反应孔中加入 5 μΐ Stop Reagent来终止反应，用 Spectra Max M5仪器检测荧光信 号 （405 nm刺激, 435 nm和 530 nm发射）。 通过全活性孔和背景信号孔计算出每个 孔的抑制率， 复孔取平均值， 同时用专业的画图分析软件 PRISM 5.0 对每个待测化 合物进行抑制率的图示。

实验加样流程图如下:

3. 数据分析

发射光比率 (ER)= 435 nm发射信号 / 530 nm发射信号

100%抑制对照的平均发射光比率记为： ER100%

0%抑制对照的平均发射光比率记为： ER0%

计算抑制率

抑制率用以下公式计算：

抑制率 = (ER样品- ER0 )/ (ER100 - ER0 ) X 100

运用软件 Graphpad Prism 5 并采用计算公式 log (抑制剂）对标准化响应 ( normalized response) -可变斜率 ( Variable slope)进行 IC50曲线拟合并计算出 IC50 值.

四 结果

1)待测化合物在 100 nM时对 JAK1 的抑制活性测定

应用 Z' -Lyte™ Kinase Assay试剂盒 - Tyr 6肽检测 5个化合物在 100 nM时对 JAK1 的抑制活性， 同时选取星孢菌素 作为参考化合物。 图 5显示了所有待测化合 物对 JAK1酶的抑制率。 2)待测化合物对 JAK1 酶的半数抑制浓度测定

应用 Z' -Lyte ^TM Kinase Assay试剂盒 - Tyr 6肽检测 5个化合物 16、 8、 9、 7、 25 对 JAK1酶的半数抑制浓度 IC50值。 化合物 8、 9、 7、 25从 100 μΜ开始 4倍梯度稀 释， 10个浓度； 化合物 16从 10 μΜ开始 4倍梯度稀释， 10个浓度， 控制 DMSO终 浓度为 1%， 每个浓度为复孔测试。 并同步检测参考化合物星孢菌素对 JAK1酶的半 数抑制浓度， 从 1 μΜ开始 4倍梯度稀释， 10个浓度， 控制 DMSO浓度为 1%， 每个 浓度为复孔测试。 实验结果见图 6。

总结：

实施例 8 使用 BaF3/EpoR/JAK2和 BaF3/EpoR/JAK2V617F细胞 （下称 BEJ细胞， 可以通过 QUINTA' S-CARDAMA et al， BLOOD, 15 APRIL 2010， VOLUME 115, NUMBER 15， 3109-3117中第 3110页 METHODS部分第一段所述的方法由商购的细 胞得到。） 对化合物 25、 化合物 26进行体外测定对细胞株生长的影响

药效学研究。

试验方法（参考 QUINTA' S-CARDAMA et al， BLOOD, 15 APRIL 2010， VOLUME 115， NUMBER 15， 3109-3117第 3110页 METHODS部分的 Cell proliferation assay、 immunoblotting部分)：

BEJ细胞接种在 2000/孔白色底 96孔板中， 然后加入不同浓度的化合物 （0.2 % DMSO的终浓度）的处理， 并在 37 °C， 5 C02下孵育 48小时。使用 GLO ( Promega 公司） 荧光素酶试剂测定细胞内 ATP。 并根据数据分析 IC50。

同时， 使用 Western Blot测定药物对 JAK2信号传导途径磷酸化的影响。

结果： IC50 (化合物 25 ) : 1.248uM

IC50 (化合物 26 ) : 0.7352uM 实施例 9 应用 CCK-8检测试剂盒检测 5个候选化合物 （16、 8、 9、 7、 25)对 4 个肿瘤细胞株 （RPMI-8226, K562, HL-60 & THP-1 ) 的细胞毒性 IC50值； 以及采用 CellTite-Glo检测试剂盒检测 5个候选化合物 （16、 8、 9、 7、 25 ) 对 2个肿瘤细胞株 (WSU-DLCL2 & L1210) 的细胞毒性 IC50值。

1、 材料和方法

细胞株：

RPMI-8226 人多发性骨髓瘤细胞株 （订购于美国 ATCC)

K562人慢性髓原白血病细胞株 （订购于中科院上海细胞资源中心）

HL-60人原髓细胞白血病细胞株 （订购于中科院上海细胞资源中心）

WSU-DLCL2 人 B细胞淋巴瘤细胞株 （订购于美国 ATCC)

THP-1人单核细胞白血病细胞株 （订购于中科院上海细胞资源中心）

L1210 小鼠白血病细胞株 （订购于中科院上海细胞资源中心）

2、 试剂和耗材：

Cell Counting Kit-8 (Cat# CK04-13, Dojindo)

CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay (Cat# G7572, Promega)

96孔培养板 （Cat# 3599， Cat# 3903, Corning Costar)

胎牛血清 （Cat#10099-141， GIBCO)

培养基 (In vitro gen )

台式酉每标仪 SpectraMax M5 Microplate Reader ( Molecular Devices )

微孔板检测仪 2104 EnVision® Multilabel Reader (PerkinElmer)

3、 实验步骤

3.1 试剂配制

1 ) 培养基的配制

L1210 DMEM+10 FBS

2) 化合物的制备：

用 DMSO稀释化合物使终浓度为 10mM。

3.2 IC50实验

收集对数生长期细胞， 计数， 用完全培养基重新悬浮细胞， 调整细胞浓度至合适 浓度 （依照细胞密度优化试验结果确定）， 接种 96孔板， 每孔加 100 μ ΐ细胞悬液。 细胞在 37 。C， 100 %相对湿度， 5 % C02培养箱中孵育 24小时。

用培养基将待测化合物稀释至 500 μ Μ后按稀释倍数依次梯度稀释 8 次， 按 25 μ ΐ/孔加入细胞。 化合物的作用终浓度从 100 μ Μ至 0 μ Μ， 4倍梯度稀释， 共 10 个浓度点。

细胞置于 37 。C， 100 %相对湿度， 5 % C02 培养箱中孵育 72小时。

对于 RPMI-8226,K562, HL-60 和 THP-1细胞， 直接加入 10 μ ΐ 的 CCK-8 于细 胞培养基中， 置于 37 °C培养箱中孵育 2-4 小时。 轻轻震荡后在 SpectraMax M5 Microplate Reader上测定 450 nm波长处的吸光度， 以 650 nm处吸光度作为参比， 计算抑制率。

对于 WSU-DLCL2和 L1210细胞， 直接加入等体积 的 CellTiter-Glo Reagent于 细胞培养基中， 轻轻震荡混匀后置于室温放置 lOmin, 在 2104 EnVision® Multilabel Reader上测定 Luminescence信号值（RLU)， 计算抑制率。

3.3 数据处理

按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率： 肿瘤细胞生长抑制率％ = [(Ac-As)/(Ac-Ab)] X 100%

As: 样品的 OA/RLU (细胞 +CCK-8+待测化合物）

Ac: 阴性对照的 OA/RLU (细胞 +CCK-8+DMSO)

Ab: 阳性对照的 OA/RLU (培养基 +CCK-8+DMSO)

运用软件 Graphpad Prism 5 并采用计算公式 log(inhibitor)vs. normalized response-Variable slope进行 IC50曲线拟合并计算出 IC50值.

4、 实验结果

本实验测试了 5个候选化合物（16、 8、 9、 7、 25)对 6个肿瘤细胞株（RPMI-8226, K562, HL60, WSU-DLCL2, THP-1 和 L1210) 的细胞毒性作用。 实验结果如图 7-12所示，采用作图软件 Graphpad Prism 5.0 拟合出 5个化合物对各个细胞株的曲线 图和 IC50值。 化合物的作用终浓度从 100 μ Μ开始, 4倍梯度稀释, 10个浓度点. 其中 有些化合物在最高作用浓度 100 μ Μ 时对某些细胞株的细胞毒性作用的百分抑制率 未达到 50%或抑制作用不明显,无法拟合出有效可靠的 IC50值， 因此在表格中表示为 IC50>100 μ Μ或无效果 （No effect)。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描 述，本领域技术人员将会理解。根 据已经公开的所有教导， 可以对那些细节进行各种修改和替换， 这些改变均在本发明 的保护范围之内。 本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等 同物给出。