技术领域

本发明涉及一种菌株及其制剂， 更具体地说涉及一种防治草莓黄萎病的棘孢木 霉 GY20 (Trichoderma asperellum) 及其膏状制剂， 属于水果防病治病技术领域。

背景技术

草莓（Fragaria ananassa )属于蔷薇科（Rosaceae)草莓属多年生草本植物� � 目前世界草莓 每年的产量已经超过 500万吨， 在世界小浆果生产中其产量荣居首位， 近年来大棚栽培草莓 在逐渐兴起， 种植面积逐渐扩大， 但却存在着轮作换地与设施固定的矛盾， 连作障碍日益明 显， 草莓连作病害是目前制约草莓生产的主要因素 ， 尤其是草莓黄萎病， 世界各国草莓产区 普遍流行此病， 该病害的发生， 轻者导致减产减收， 重者绝收， 严重制约了草莓的可持续发 展。

草毒黄姜病 (Fusarium oxysporum Schl.f.sp.lagenaria Wnks et W) 是草毒禾中植中——禾中常见 的土传性病害， 由大丽花轮枝孢菌 (Verticllium albo-atrum Reinke dt Berthold和 Verticillium dahliae Klrmahn) 病原菌侵染引起病害， 中文别名， 草莓桔萎病。 该病发病时， 植株发育不 良， 叶变黄， 叶表面粗糙， 失去鲜亮感， 自叶缘开始变黄褐色向内凋萎、 干枯， 甚至全株枯 死。

据调查显示， 第二年连茬栽种草莓地草莓黄萎病发病率达 82.9 %， 第三年发病率可达 100 %。为此， 草莓黄萎病的生物防治特别是生物农药的研究 与开发是草莓生产可持续发展的 需要。 微生物农药对环境的选择压力较小， 且不易使靶标病原菌产生抗药性， 因此， 生物源 农药的研究将会为人们提供更安全更高效的防 治草莓黄萎病的途径。

现在已用于防治草莓黄萎病的微生物主要有枯 草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ) 、 假单胞菌 ( Pseudomonas sp. ) 、 沙雷氏菌（ Serratia sp. ) 、 VAM真菌等， 剂型主要为可湿性粉剂、 悬浮 剂、 油悬浮剂等。 但是到目前为止， 尚没有用棘孢木霉菌株 （Trichoderma asperellum) 及其 膏状制剂防治草莓黄萎病的报道和相关专利申 请。 发明内容

本发明所要解决的技术问题是，公开一种防治 草莓黄萎病的棘孢木霉 GY20 ( Trichoderma asperellum) 及其膏状制齐 Ll。 本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明的防治黄瓜枯萎病的菌株 GY20 , 该菌株 GY20 为棘孢木霉， 拉丁文学名为 Trichoderma asperellum, 该菌种己于 2011年 5月 25日在中国微生物生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心保藏，保藏号为： CGMCC NO: 4899ο所述菌种 GY20具有如下特征： 25 °C 黑暗条件下培养 4d， 菌落直径 53-55mm， 菌丝体白色， 絮状， 茂盛； 分生孢子结构大量产生， 产孢区均匀分布， 灰绿色； 瓶梗式产孢， 分生孢子椭圆形、 近球形， 表面有细剌。 木霉菌对 多种重要植物病原真菌有作用， 如腐霉菌、 轮枝菌、 镰刀菌、 长孺孢菌、 交链孢菌、 丝核菌、 葡萄孢菌等。

用本发明的防治黄瓜枯萎病菌株 GY20制备的生防膏状制剂，其制备方法包括以� �步骤:

(A) 菌液的获得

用无菌接种刀挑取事先在马铃薯葡萄糖培养基 （PDA) 培养基上培养好的 GY20孢子， 接种于装有 200ml 马铃薯葡萄液体培养基（PD)的容积为 750 ml的三角瓶中， 于 26 °C、 150 rpm/min条件下振荡培养 48 h，将上步所得培养液 200 ml等份接种于 4个装有 500ml PD培养 液的容积为 2000 ml的三角瓶中， 150 rpm、 26°C条件下振荡培养 48 h; 把所得的 2000ml培 养液接种于装有 20L培养液的容积为 30L的发酵罐 （镇江东方 GUS-30), 20L发酵培养液含 量为： 甜菜液 400.0g、 七水硫酸镁 4.0g、 磷酸二氢钾 40.0g， 设置发酵条件为： 溶氧 100%， 搅拌速度为 350 rpm， 发酵温度 26 °C， 发酵时间 48 h， pH 7.0-7.2。

(B) 膏状制剂加工工艺

将发酵好的发酵液按如下方法加工成膏状制剂 ： 先将发酵液在 8000rpm/min条件下离心 lOmin, 得菌丝及厚垣孢子混合体， 用盐酸调节 pH至 3.0~4.0， 并加入 0.001~0.05%的铜离子 抑制剂， 最后加入 5~10%的可溶性淀粉， 搅拌均匀即制成了膏状制剂。

本发明的有益效果是：

( 1 ) 本发明所得 GY20菌种的膏状剂型的生物农药组合物由农药� �分与辅料组成， 农 药组分为木霉菌丝与木霉厚垣孢子， 木霉厚垣孢子分散在木霉菌丝中， 特征是辅料为淀粉； 本发明的组合物和用本方法制备成的膏状剂型 生物农药最大的优点是产品质量稳定， 可室温 保存 18个月， 冷藏条件下保存 3年， 菌剂对黄瓜枯萎病有良好防效。 温室试验结果表明， 该 菌剂对黄瓜枯萎病的防治效果均达 90%以上。

(2) 由于本发明的 GY20菌株为可安全释放的真菌， 所以没有因化学农药的使用所带 来的一系列环境负效应。 该制剂的使用极大的减少黄瓜生产中化学农药 的施用量， 为黄瓜无 公害生物防治提供可靠保证， 造福于现代高效农业。

(3 ) 菌剂生产成本低， 企业获取的利润空间极大。 具体实施方式

实施例

本发明的防治黄瓜枯萎病的菌株 GY20 , 该菌株 GY20 为棘孢木霉， 拉丁文学名为 Trichoderma asperellum, 该菌种已于 2011年 5月 25日在中国微生物生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心保藏，保藏号为： CGMCC NO: 4899ο所述菌种 GY20具有如下特征： 25 °C 黑暗条件下培养 4d， 菌落直径 53-55mm， 菌丝体白色， 絮状， 茂盛； 分生孢子结构大量产生， 产孢区均匀分布， 灰绿色； 瓶梗式产孢， 分生孢子椭圆形、 近球形， 表面有细刺。 木霉菌对 多种重要植物病原真菌有作用， 如腐霉菌、 轮枝菌、 镰刀菌、 长孺孢菌、 交链孢菌、 丝核菌、 葡萄孢菌等。

用本发明的防治黄瓜枯萎病菌株 GY20制备的生防膏状制剂，其制备方法包括以� �步骤:

(A) 菌液的获得

用无菌接种刀挑取事先在马铃薯葡萄糖培养基 （PDA) 培养基上培养好的 GY20孢子， 接种于装有 200ml 马铃薯葡萄液体培养基（PD)的容积为 750 ml的三角瓶中， 于 26 °C、 150 rpm/min条件下振荡培养 48 h，将上步所得培养液 200 ml等份接种于 4个装有 500ml PD培养 液的容积为 2000 ml的三角瓶中， 150 rpm、 26°C条件下振荡培养 48 h; 把所得的 2000ml培 养液接种于装有 20L培养液的容积为 30L的发酵罐 （镇江东方 GUS-30), 20L发酵培养液含 量为： 甜菜液 400.0g、 七水硫酸镁 4.0g、 磷酸二氢钾 40.0g， 设置发酵条件为： 溶氧 100%, 搅拌速度为 350 rpm， 发酵温度 26 °C， 发酵时间 48 h， pH 7.0-7.2。

(B) 膏状制剂加工工艺

将发酵好的发酵液按如下方法加工成膏状制剂 ： 先将发酵液在 8000rpm/min条件下离心 lOmin, 得菌丝及厚垣孢子混合体， 用盐酸调节 pH至 3.0~4.0， 并加入 0.001~0.05%的铜离子 抑制剂， 最后加入 5~10%的可溶性淀粉， 搅拌均匀即制成了膏状制剂。 本发明活菌制剂的大田施用方法如下：

防治草莓黄萎病的应用方法为， 按 1KG制剂用 100〜150L水稀释， 先将菌剂与水混合均 匀， 在草莓苗移栽时灌根 （每株 100 ml)、 或蘸根 （浸 5 min) 使用。 本发明的实施效果

对草莓黄萎病田间防效试验

试验地条件： 本试验安排在江苏丘陵地区镇江农业科学研宄 所果树研宄室草莓连作 （20 年） 大棚田， 黄萎病为重发。 草莓于 2010年 9月 15日移载， 供试草莓品种为明宝。 试验处理方法： 于草莓苗移栽时蘸根处理。 即， 将成品 GY20膏状制剂按 1KG制剂用 100-150L水稀释后， 在黄瓜苗移栽时浸根处理 5min， 空白对照用清水代替， 对照生防药剂 为 "EM菌根" 500倍液浸根处理 5 min， 每处理 300棵苗， 分 3重复， 小区随机排列， 移载 后 50 d调查发病情况， 计算病株率和防效。

结果：温室试验结果（表 1 )表明， GY20对草莓黄萎病的防治效果 90.5%，显著高于 "EM 菌根"对草莓黄萎病的防治效果为 56.8。

GY20菌剂对草莓黄萎病的田间防治试验结果

枯萎病

处理

病株率 （％) 防效 （％)

GY20 1.7B 91.5A

EM菌根 7.3A 56.8B

CK 13.5 0 注： 不同大写字母表示差异显著水平 P=0.01。

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下面的说明与本申请说明书中此处提到的

保藏的微生物或其他生物材料相关：

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-3 保藏事项

-3-1 保藏单位名称 CG CC 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心 -3-2 保藏单位地址 Institute of icrobiology, Chinese Academy of

Sciences, No. 1, West Beichen Road, Chaoyang District, Bei j ing 100101, China

-3-3 保藏日期 2011年 5月 25日 （25.05.2011)

-3-4 保藏号 CGMCC 4899

-5 本说明是对下列指定国 所有指定国

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这些说明将随后提交给国际局 由受理局填写 -4 本表格与国际申请一起收到：

(是或否）

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