MATERIALES NANOESTRUCTURADOS TUBULARES CON

PROPIEDADES MAGNéTICAS ANISOTRóPICAS, PROCEDIMIENTO

DE OBTENCIóN Y SUS APLICACIONES

SECTOR DE LA TéCNICA

La presente invención puede aplicarse en muy diversos campos como Ia biomedicina, en Ia obtención de imágenes mediante métodos de Resonancia Magnética (RM) para el diagnóstico clínico de enfermedades neurodegenerativas y vasculares, como por ejemplo en el diagnóstico precoz de Ia ateroesclerosis. Asimismo, se puede aplicar en campos como Ia física o Ia ingeniería, determinando el flujo laminar o turbulento y, en general, las propiedades Teológicas de fluidos que circulen en conducciones tubulares.

ESTADO DE LA TéCNICA

La Imagen por Resonancia Magnética (IRM) constituye una de las herramientas más poderosas en el diagnóstico clínico actual debido principalmente a su naturaleza no invasiva (V. M. Runge, K. L. Nelson. In

Magnetic Resonance Imaging; D. D. Stark, W. G. Bradley, Ed.; Mosby: St. Louis, 1999; VoI. 1 , pp. 257-275).

Se trata de una técnica que permite obtener imágenes de Resonancia Magnética (RM) de un determinado objeto al introducirlo en un campo magnético estático. De esta manera se obtienen las tres coordenadas del espacio de cada uno de los elementos de volumen de dicho objeto, mediante Ia aplicación de tres gradientes magnéticos ortogonales y uno o más pulsos selectivos de radiofrecuencia. Así, cada elemento de volumen del objeto queda definido espacialmente por sus tres coordenadas x, y, z, impuestas por Ia intensidad de los gradientes magnéticos aplicados en cada dirección. El resultado obtenido representa Ia distribución de las moléculas de agua en el objeto. Cada elemento de Ia imagen (píxel) tiene una intensidad característica que viene determinada

por Ia cantidad de agua en el elemento de volumen original (voxel), sus propiedades de relajación magnética longitudinal (n) y transversal (r ₂ ) y Ia dinámica del flujo de agua a través del objeto.

Dado que el contenido en agua de los tejidos es muy similar, los principales determinantes del contraste entre dos puntos de una imagen

RM son los tiempos de relajación longitudinal (Ti) y transversal (T ₂ ) de los protones del agua (C. Lauterbur, Nature, 1973, 242, 190; P. Mansfield, A.

A. Maudsley, British J. Radiol. 1977, 50, 188).

La IRM es una técnica en constante desarrollo; cada vez se obtienen secuencias de imagen más eficaces y se emplean nuevos agentes de contraste (ACs) que permiten aumentar Ia calidad, resolución y especificidad de las imágenes obtenidas.

Los ACs disminuyen considerablemente los tiempos de relajación en los tejidos en donde se distribuyen. En muchos casos, el uso de estos agentes supone una gran mejora en el diagnóstico clínico, en términos de alta especificidad, mejor caracterización de los tejidos, reducción de artefactos en Ia imagen y aumento de Ia información funcional de los mismos.

Los ACs más empleados en biomedicina son los quelatos paramagnéticos de gadolinio, Gd(III) (H. Gries, Top. Curr. Chem 2002, 221 , 1 ; Tóth, E.; HeIm, L.; Merbach, A.E. In The Chemistry of Contrast Agents in Medical Magnetic Resonance Imaging; Merbach, A. E., Toth, E., Ed.; John Wiley&Sons, Ltd.: Chichester, 2001 , pp. 45-119). La efectividad de esta familia de compuestos para actuar como ACs se valora, en primer lugar, por su relajatividad, ri ₍₂₎ , es decir, por el incremento neto que inducen en Ia relajación de los protones del agua. De esta familia de compuestos, los más utilizados en imagen diagnóstica son los complejos de gadolinio derivados del ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA) y del ácido 1 ,4,7,10-tetraaza-1 ,4,7,10-ciclododecanotetraacético (DOTA) (S. Aime, S. Geninati Crich, E. Gianolio, G. B. Giovenzana, L. Tei, E. Terreno,

Coord. Chem. Rev. 2006, 250, 1562 ; M. Woods, D. E. Woessner, A. D.

Sherry, Chem. Soc. Rev. 2006, 35, 500; Caravan, P.; Ellison, J. J.; McMurry, T. J.; Lauffer, R. B. Chem. Rev. 1999, 99, 2293; Lauffer, R. B. Chem. Rev. 1987, 87, 901 (Figura 6).

En los últimos 15 años, se han publicado numerosos artículos dirigidos al estudio de Ia estructura y Ia dinámica de los complejos de Gd (III) (P. Caravan, Chem. Soc. Rev. 2006, 35, 512-523), proporcionando un gran avance en Ia comprensión de los parámetros estructurales, dinámicos y electrónicos que determinan Ia relajatividad de estos complejos. Actualmente, Ia investigación en este campo se centra en el diseño y síntesis de nuevos agentes quelantes que mantengan gran afinidad por el metal paramagnético correspondiente, así como unas propiedades de relajatividad longitudinal (ri) o transversal (r2), mejoradas.

Recientemente, se ha descrito una nueva serie de ácidos pirazoliletildietilentriaminotetraacéticos cuyos complejos de Gd (III) presentan unas propiedades de relajatividad superiores a las de los complejos previamente empleados (P. Ballesteros García, E. Pérez Mayoral, Ligandos heterocíclicos y sus complejos de gadolinio (III) con aplicaciones biomédicas, PCT Int. Appl., (2006) WO 2006051142; P. Ballesteros García, E. Pérez Mayoral, Agentes complejantes derivados de ácidos pirazoliletildietilentriaminotetraacéticos. Complejos de gadolinio (III) con aplicaciones en el diagnóstico clínico por resonancia magnética, P20050245; P. Ballesteros García, E. Pérez Mayoral, ácidos 1-pirazoliletil- 1 ,4,7,10-tetraazaciclododecano-4,7,10-triacéticos. Aplicación de sus complejos de gadolinio (III) en el diagnóstico clínico, PCT Int. Appl., (2006), WO 2006051142).

Sin embargo, todos los ACs empleados hasta el momento presentan propiedades magnéticas isotrópicas, por Io que no permiten detectar las características físicas del flujo sanguíneo ya que no son capaces de proporcionar imágenes direccionales y/o de diferenciar el flujo laminar o turbulento. Así, Ia relajatividad observada en Ia IRM es independiente de Ia orientación espacial del agente, haciendo imposible distinguir Ia orientación

y dirección del flujo de Ia molécula que origina el cambio en relajatividad observado (Figura 1A) Io que dificulta detectar las patologías neurodegenerativas y/o vasculares que Io modifican como por ejemplo Ia ateroesclerosis. Como se ha explicado anteriormente, los ACs que se emplean hasta el momento en Resonancia Magnética (RM) no permiten distinguir Ia orientación y dirección del flujo de Ia molécula que origina el cambio en relajatividad que se observa en Ia imagen de RM. Lo que indica que Ia relajatividad es independiente de Ia dirección del campo magnético, observándose Ia misma intensidad de Ia señal RM en los tres planos ortogonales de Ia imagen. Esto hace que los ACs empleados hasta el momento no sirvan para detectar las características físicas del flujo. Lo que supone un gran inconveniente a Ia hora de diagnosticar de manera temprana algunas enfermedades graves como es el caso de patologías neurodegenerativas y/o vasculares, y más concretamente Ia ateroesclerosis.

La ateroesclerosis es una enfermedad sistémica que se caracteriza por Ia acumulación de placas lipídicas en las paredes de los vasos sanguíneos, constituyendo Ia principal causa de mortalidad en los países desarrollados a nivel mundial. Para poder hacer hacer un diagnóstico temprano de esta enfermedad, junto con el seguimiento de sus terapias, resulta necesario desarrollar nuevos ACs que permitan distinguir el flujo laminar del turbulento en el sistema vascular.

DESCRIPCIóN DE LA INVENCIóN

Descripción Breve

Un aspecto de Ia invención Io constituye un agente de contraste útil para Ia elaboración de una composición farmacéutica de diagnóstico de RMN, en adelante agente de contraste de Ia invención, basado en un material nanoestructurado organizado de forma tubular, soluble en disoluciones acuosas, con propiedades anisotrópicas y con un contenido

de metales paramagnéticos o estructuras superparamagnéticas o ferromagnéticas, preferentemente Ti, Fe, Co y Ni.

Un aspecto particular de Ia invención Io constituye el agente de contraste de Ia invención en el que el material nanoestructurado es un nanotubo de un material perteneciente, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de Ia invención, al siguiente grupo: carbono (NTCs), silicio, u otros materiales de naturaleza tubular y sus derivados.

Otro objeto de Ia presente invención Io constituye un nuevo método para obtener y purificar, por intercambio osmótico, el agente de contraste nanoestructurado de Ia invención mediante el empleo de membranas de diálisis sumergidas en agua desionizada, y renovadas periódicamente hasta que no se observan cambios de pH, simplificando substantivamente Ia separación de los materiales nanoestructurados, de los subproductos.

Así, otro aspecto de Ia invención Io constituye una composición farmacéutica útil para el diagnóstico de RMN, en adelante composición farmacéutica de Ia invención, constituida por una composición que comprende al menos un agente de contraste de Ia invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable, ya sea un agente de un único tipo o una mezcla de varios agentes distintos de Ia invención. Finalmente, otro aspecto de Ia presente invención Io constituye el uso de Ia composición farmacéutica de diagnóstico de Ia invención, en adelante uso de Ia invención, en un procedimiento mediante RMN de determinación de un flujo laminar o turbulento y/o las propiedades Teológicas de fluidos que circulan en conducciones tubulares.

Descripción Detallada

El agente de contraste nanoestructurados de Ia presente invención solventa los problemas anteriormente descritos, ya que Ia intensidad de Ia señal de RM que proporcionan los agentes de contraste nanoestructurados con geometría tubular de Ia presente invención, depende de Ia orientación promedio del ACs con respecto al campo

magnético aplicado (Figura 1 B). Los agentes de Ia presente invención se alinean espontáneamente con el campo magnético, originando un máximo de relajatividad en Ia dirección del campo B ₀ , y un mínimo, en el plano perpendicular. Esto hace posible determinar Ia naturaleza laminar o turbulenta del flujo a través de un capilar, mediante medidas de relajatividad magnética por IRM en soluciones de nanotubos, como indica Ia Figura 1. La magnetización de una solución de nanotubos circulando en flujo laminar a través de un capilar es Ia resultante del producto vectorial del vector del campo magnético por el del vector del flujo. Dado que ambos mantienen su magnitud y dirección en el tiempo, Ia resultante es un vector único de magnetización constante durante el tiempo de adquisición RM, que origina una señal RM de relajatividad definida. Sin embargo, cuando Ia disolución de nanotubos circula en flujo turbulento, el vector de magnetización resultante es menor. Esto se debe a que es el producto vectorial de un vector con dirección y módulo constante (el vector de campo magnético Bo), y un vector de módulo constante (Ia magnetización del nanotubo) y dirección variable, (Ia orientación del nanotubo respecto al flujo). En este caso, Ia magnetización resultante es inferior a Ia del flujo laminar, debido a Ia cancelación de los momentos magnéticos de aquellos nanotubos que giran y se mueven en dirección opuesta, debido a Ia turbulencia.

Así, un aspecto de Ia invención Io constituye un agente de contraste útil para Ia elaboración de una composición farmacéutica de diagnóstico de RMN, en adelante agente de contraste de Ia invención, basado en un material nanoestructurado organizado de forma tubular, soluble en disoluciones acuosas, con propiedades anisotrópicas y en un contenido de metales paramagnéticos o estructuras superparamagnéticas o ferromagnéticas, preferentemente Ti, Fe, Co y Ni.

Un aspecto particular de Ia invención Io constituye el agente de contraste de Ia invención en el que el material nanoestructurado es un nanotubo de un material perteneciente, a título ilustrativo y sin que limite el

alcance de Ia invención, al siguiente grupo: carbono (NTCs), silicio, u otros materiales de naturaleza tubular y sus derivados.

Una realización particular de Ia invención Io constituye un agente de contraste de Ia invención en el que los metales paramagnétivcos se encuentran en el rango comprendido entre 0-1 ,5 % de Ti, 0-1 % de Fe, 0-3 % de Co, y 0-1 % de Ni (% en peso). Así, una realización más particular de Ia invención Io constituye el agente de contraste de Ia invención en el que los metales paramagnétivcos se encuentran en un rango comprendido entre 0-1 ,5% de Ti, 0-1% de Fe, 0-3% de Co, y 0-1 % de Ni (% en peso). Otro objeto de Ia presente invención Io constituye un nuevo método para obtener y purificar, por intercambio osmótico, el agente de contraste nanoestructurado de Ia invención mediante el empleo de membranas de diálisis sumergidas en agua desionizada, y renovadas periódicamente hasta que no se observan cambios de pH, simplificando substantivamente Ia separación de los materiales nanoestructurados, de los subproductos.

El agente de contraste de Ia invención, el cual se ha demostrado que es soluble en disoluciones acuosas, puede utilizarse ya sea en forma pura de un tipo de agente o como mezcla de varios de ellos para elaborar una composición farmacéutica conjuntamente con soluciones, suspensiones o preparaciones farmacéuticas, preferentemente de complejos paramagnéticos, estructuras superparamagnéticas o ferromagnéticas, que actúan como vehículos farmacéuticamente aceptables.

Así, otro aspecto de Ia invención Io constituye una composición farmacéutica útil para el diagnóstico de RMN, en adelante composición farmacéutica de Ia invención, constituida por una composición que comprende al menos un agente de contraste de Ia invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable, ya sea un agente de un único tipo o una mezcla de varios agentes distintos de Ia invención. Finalmente, otro aspecto de Ia presente invención Io constituye el uso de Ia composición farmacéutica de diagnóstico de Ia invención, en

adelante uso de Ia invención, en un procedimiento mediante RMN de determinación de un flujo laminar o turbulento y/o las propiedades Teológicas de fluidos que circulan en conducciones tubulares.

Otro aspecto particular Io constituye el uso de Ia invención en el que el procedimiento consiste en Ia determinación del flujo laminar y perfusión de fluidos biológicos con el objeto de realizar un diagnóstico clínico en macro- y microvasculatura normal y patológica, y en particular en Ia caracterización de Ia neovasculatura tumoral y las microvasculaturas cerebral y cardiaca en enfermedades neurodegenerativas y cardiovasculares, más concretamente, en Ia detección de placas ateroescleróticas en el sistema vascular, mediante Ia diferenciación del flujo sanguíneo laminar o turbulento, que caracterizan Ia microcirculación en Ia vasculatura normal o aterogénica (Figura 2) y Ia detección de lesiones en órganos (cerebro, corazón, hígado, riñon, etc.) afectados por cambios en Ia naturaleza del flujo sanguíneo laminar o turbulento.

Otro aspecto particular Io constituye el uso de Ia invención en el que el procedimiento de diagnóstico mediante RMN determina Ia direccionalidad de Ia relajación magnética anisotrópica, preferentemente mediante Ia obtención de imágenes RM ortogonales adquiridas en Ia dirección paralela y perpendicular al campo magnético (B ₀ ).

DESCRIPCIóN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Esquema ilustrativo de imágenes ortogonales IRM derivadas de Ia utilización de agentes de contraste isotrópicos convencionales (A) o de los nuevos agentes de contraste anisotrópicos descritos en Ia presente invención. (B).

Figura 2. Distinción entre flujo laminar, característico de los capilares normales (panel superior) y flujo turbulento, presente en capilares con placas aterogénicas vulnerables (panel inferior), mediante IRM empleando los nanotubos con relajatividad anisotrópica descritos en Ia presente invención.

Figura 3. Maniquíes conteniendo tubos con disoluciones acuosas de NTCs y agua sobre una plataforma de plastilina, empleados para Ia adquisición de Imágenes normalizadas ortogonales RM de relatividad anisotrópica. Figura 4. Imagen TEM de los NTCs empleados en Ia presente invención. Figura 5. A) Imagen normalizada (perpendicular a B ₀ ), B) Imagen normalizada (paralela a Bo) y C) Histograma de intensidades de las imágenes A) y B) normalizadas con respecto al agua. Figura 6. Complejos de gadolinio derivados del ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA) y del ácido 1 ,4,7, 10-tetraaza-1 , 4, 7,10- ciclododecanotetraacético (DOTA).

EJEMPLOS DE REALIZACIóN Ejemplo 1. Obtención y caracterización de los nanotubos Se emplean NTCs comerciales, de pared sencilla, de 0,7-1 ,2 nm de diámetro y 2-20 m de longitud, sintetizados por el método de CVD (método de deposición química en fase de vapor) y con un enriquecimiento en NTCs del 10-40 %. Las muestras comerciales contienen el siguiente porcentaje de metales (% en peso): 1 ,27% Ti; 0,07% Fe; 2,25% Co y 0,75% Ni, identificados mediante de R-X por Reflexión Total (TXRF).

Los NTCs se oxidan mediante el procedimiento descrito por Bourlinos et al. (Bourlinos, A. B., Georgakilas, V., Tzitzios, V., Boukos, N., Herrera, R., Giannelis, E. P. Small 2006, 2, 1188) con variaciones en el aislamiento y purificación de los mismos, que no afectan a sus propiedades tal y como se describe a continuación.

Una suspensión de NTCs comerciales (200 mg) en HNO3 (25 mL) se calienta a reflujo durante 24 h. La mezcla de reacción se deja enfriar y se diluye con agua desionizada (100 mL). A continuación, Ia suspensión se centrifuga (3000 rpm durante 10 min), y el precipitado resultante se resuspende en agua desionizada (50 mL), y se introduce en una membrana de diálisis (Spectra/Por 45 mm ancho x 10 cm de largo, 3500

Dalton) que se sumerge en agua desionizada. El agua se renueva periódicamente hasta que alcance un pH ~ 5,5. Seguidamente, Ia suspensión se centrifuga en las condiciones anteriormente mencionadas y los NTCs se secan el un desecador. Los CNTs utilizados se han caracterizado mediante:

- Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM), empleando un microscopio electrónico de transmisión JEOL JEM 1010 (100 KV). (ver Figura 4)

- Infrarrojo de transformada de Fourier (FT-IR), empleando un equipo FT- IR Bruker vector 22 con accesorio ATR. El IR de los nanotubos de Ia presente invención revela dos bandas características a 3304 y 1715 cm ^"

1

- Termogravimetría (TG), empleando un equipo de análisis térmico (TG- DTA) TA-SDT Q-600. El perfil termogravimétrico obtenido confirma una pérdida de peso de aproximadamente un 10% en el rango de temperaturas entre 200-300 ⁰ C, atribuible a Ia pérdida de CO ₂ .

- Fluorescencia de R-X por Reflexión Total (TXRF), empleando un espectrómetro de TXRF EXTRA-II, Rich & Seifert (Germany). Los NTCs oxidados de Ia presente invención contienen el siguiente porcentaje de metales (% en peso): 1 ,8% Co y 0,7% Ni.

Ejemplo 2. Métodos de Resonancia Magnética (RM).

Para Ia obtención de imágenes RM se emplean maniquíes (microtubos eppendorf Safe-Lock de 1 ,5 mL, 38 mm de alto y 10 mm de diámetro interno), insertados en un bloque de plastilina (60 x 30 mm ² y 25 mm de altura), que contienen tubos con agua y con disoluciones acuosas de CNTs paramagnéticos (2 mg en 1 mL) (Figura 3). Las imágenes RM se adquieren en un espectrómetro Bruker Pharmascan (imán horizontal 7.0 Tesla / 16 cm de diámetro) conectado a una consola Hewlett-Packard (Linux; Bruker Medical Gmbh, Ettlingen, Germany). Las imágenes se adquieren con ponderación en Ti, empleando una secuencia de imagen

SPIN-ECO (MTX = 256 x 256, TR = 500 ms, TE = 10,6 ms; anchura de sección = 1 mm, AV = 3, F.O.V = 3,8 x 3,8 cm), realizando cortes de los maniquíes en dirección paralela y perpendicular al campo magnético (B ₀ ). El procesado y cuantificado de las imágenes se llevan a cabo utilizando un software desarrollado en el laboratorio de los inventores con el programa MATLAB 7.4.0 (R2007a) (The MathWorks, Inc., copyright 1984-2007; http:// www.mathworks.com). En Ia figura 5 se representan las imágenes normalizadas ortogonales de los maniquíes estudiados y sus correspondientes histogramas de intensidad de Ia señal frente a Ia frecuencia de repetición de Ia intensidad de Ia señal.

La Figura 5 ilustra en sus paneles superiores, como Ia intensidad de Ia imagen RM, normalizada con respecto al agua, obtenida en Ia dirección paralela al campo magnético (panel superior derecho) es muy superior a Ia intensidad de Ia imagen obtenida en Ia dirección perpendicular (panel superior izquierdo). De hecho los histogramas de intensidad demuestran que, todos los píxeles de Ia imagen superior derecha (en rojo), presentan una intensidad superior a los píxeles de Ia imagen superior izquierda (en azul).

En definitiva, estos resultados muestran que Ia intensidad de Ia imagen RM, utilizando los materiales paramagnéticos anisotrópicos de Ia presente invención, depende de Ia orientación del corte en Ia imagen, siendo superior en los cortes paralelos al campo magnético estático, que en los cortes perpendiculares al mismo. Estos datos indican que los nanotubos marcados magnéticamente, se orientan con el campo magnético como si fuesen Ia aguja de una brújula, marcando Ia dirección del campo con mayor intensidad.