Zwei-Komponentensystem zur Programmierung bakterieller Membranen

Gebiet der Erfindung Die Erfindung betrifft das technische Gebiet der Nanobiologie und der synthetischen Biologie. Insbesondere betrifft sie die Herstellung einer flexiblen, programmierbaren biologischen Oberfläche durch Zwei-Komponentensysteme aus Bakterien für die biochemische Analytik, die Chipherstellung und ein Screeningverfah- ren im großen Maßstab (large scale Screening).

Hintergrund der Erfindung

Die Patentschriften bzw. Patentanmeldungen GB 2 360 788, EP 0 543 407 und DE 43 010 87 beschreiben Bakterien, die als Komponenten für Biosensoren ver- wendet wurden. Es wurden Bakterien der Familien Aeromonas, Pseudomonas, Serratia u.a. an die Membran einer Elektrode gekoppelt und zur Abschätzung des biochemischen Sauerstoffbedarfs benutzt.

Um ein Bakterium und dessen Oberfläche derart zu modifizieren, dass es in ei- nem Biosensor verwendet werden kann, haben die Erfinder des US-Patents

6,274,345 das äußere Membranprotein C (outer membrane protein C - OmpC) des Bakteriums Escherichia coli verwendet, um fremde Proteine mit Hilfe von

OmpC als ein Ankermotiv in der Zelloberfläche des Bakteriums zu exprimieren.

Außerdem wurden Antigene und weitere Proteine mit ähnlichen Ansätzen herge- stellt und in planaren Doppelschichten (bilayers) getestet (Holden et al., 2006).

Eine Möglichkeit, die Eigenschaften eines Bakteriums in eine dünne Schicht zu integrieren, beschreibt das Patent GB 2 373 513. Durch die Immobilisierung von lumineszierenden Bakterien in einer Polyvinylalkohol Dünnschicht können schädli- che Chemikalien und industrielle Gefahrenstoffe in der Umwelt detektiert werden.

Die japanischen Patentschrift JP 8 211 011 offenbart, dass als adäquater Reiz für ein bakterielles Biosensorsystem auch die Anwesenheit von Cyanid (CN) verwendet werden kann. In Bakterien der Gattung Pseudomonas fluorescens, die auf Nitrozellulose immobilisiert sind, wird Cyanid gespalten, was zur Erniedrigung des freien Sauerstoffgehalts in einer Standardlösung führt und das elektronische Ausgangssignal (output Signal) moduliert.

Die internationale Patentanmeldung WO 03/018777 verwendet bereits die Licht- sensitivität von Phytochromen und beschreibt ein System zur Aktivierung von Pro- motoren in Bakterien. Die Aktivierung erfolgt durch die Bindung eines an das Phy- tochrom gebundenen Proteins, das gezielt an eine DNA-bindende Domäne des zu aktivierenden Gens bindet.

Es wurde außerdem beschrieben, dass Bacteriophytochrome die Photosynthese in Bakterien wie Bradyrhizobium sp. und Rhodopseudomonas palustris durch einen Reaktionsweg über direkte Protein-Protein-Bindungen, nicht aber durch eine Phosphorylierungskaskade regulieren (Giraud et al., 2002). Daneben wurden weitere Licht induzierbare Promotorsysteme beschrieben (Bhoo et al., 2001 ; Levskoja et al., 2005).

Dieser Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine biologische Oberfläche, die vorzugsweise von einem Bakterium abgeleitet ist, derart zu verändern bzw. neu herzustellen, dass die von der bakteriellen Zelle synthetisierten Moleküle gesteuert und kontrolliert aufgebracht werden können. Im Rahmen der Erfindung wird eine solche biologische Oberfläche auch als programmierbare Oberfläche bezeichnet. Die programmierbare Oberfläche kann anschließend technisch verwendet werden kann, beispielsweise in der Oberflächenbeschichtung oder der Signalverarbeitung. Eine weitere Verwendung liegt insbesondere in der Nanobiotechno- logie, etwa zur Herstellung einer flexiblen, programmierbaren biologischen Ober- fläche für die Chipherstellung, für ein Screeningverfahren im großen Maßstab (lar-

ge scale Screening), für biochemische Laborassays und für miniaturisierte biochemische Fabrikationsprozesse.

Aus dem Stand der Technik sind zwar zahlreiche unterschiedliche Biosensorsys- teme bekannt. Außerdem wurden Bakterien verwendet, um verschiedene Proteine im großen Maßstab herzustellen. Schließlich wurden auch Versuche zur Herstellung von Oberflächenbeschichtungen durch Bakterien beschrieben, die beispielsweise auf Oberflächenschicht-Membranen (surface-(S)-layer) beruhen.

Ein wesentlicher Nachteil der Verfahren des Standes der Technik liegt aber darin, dass eine Oberflächenbeschichtung nicht oder nur sehr aufwändig und umständlich programmiert werden kann. Ferner wird die erstellte Oberfläche nicht aktiv von den Bakterien abgetrennt, und die Oberflächenmoleküle geben auch kein bakterielles Signal an das technische System zurück. Es wurden zwar bereits Vorversu- che zu Licht programmierbaren Zwei-Komponentensystemen in Bakterien beschrieben (Levskoje et al., 2005). Diese sind aber wenig flexibel und können daher nicht für die oben beschriebenen, gewünschten Anwendungen verwendet werden. Als Hilfsmittel werden deshalb technisch aufwändige äußere Masken verwendet, über die Licht schichtweise auf die Oberfläche einer ursprünglich bak- teriell hergestellten Oberflächenmembran (surface-(S)-Membran) aufgebracht wird. Ebenso wird nach dem Stand der Technik durch weitere aufwändige technische Schritte die Güte der Oberfläche einer Membran beurteilt. Eine anschließende maschinelle Bearbeitung findet zudem in mehreren Fertigungsschritten statt.

Ziel der Erfindung ist es deshalb die verwendeten Bakterien aktiv, über neue Zwei- Komponentensysteme, die mit der bakteriellen Zellmembran in Verbindung stehen, über verschiedene elektromagnetische Wellen zu programmieren, was die Nutzungsmöglichkeiten dieser Zwei-Komponentensysteme wesentlich erhöht. So werden auch die Schritte der Oberflächenanordnung, Qualitätsüberprüfung, Ober- flächenabtrennung und Signalverarbeitung wesentlich verbessert.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein modifiziertes Bakterium mit einem Zwei- Komponentensystem, wobei ein äußeres Signal (3) auf die bakterielle Zellmemb- ran trifft, das äußere Signal (3) durch eine erste Komponente (1 ) des Zwei- Komponentensystems innerhalb des Bakteriums empfangen wird, das Empfangen des äußeren Signals (3) eine Veränderung einer zweiten Komponente (2) des Zwei-Komponentensystems bewirkt, die zweite Komponente (2) in dem Bakterium eine Veränderung im Proteom und/oder Transkriptom (4) bewirkt, die Verände- rung (4) die bakterielle Zellmembran verändert, und die Veränderung der bakteriellen Zellmembran in einem Medium außerhalb des Bakteriums gespeichert wird.

Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ein modifiziertes Bakterium mit einem Zwei-Komponentensystem, wobei ein äußeres Signal (3) durch eine erste Komponente (1) des Zwei-Komponentensystems empfangen wird. Das Empfangen und Weitergeben des Signals an eine zweite Komponente (2) wird systematisch, wie in der Erfindung offenbart, verbessert. Dies geschieht insbesondere, um über Veränderungen von Proteom und Transkriptom (4) nach der Signalweitergabe die Eigenschaften des artifiziellen Bakteriums zu verändern, insbesonde- re die Membraneigenschaften. Dies erlaubt eine vielseitige Verwendung des modifizierten Bakteriums mit seinen veränderten Eigenschaften, insbesondere zur Erzielung einer programmierbaren bakteriellen Zellmembran, zur Nutzung in der Nanotechnologie, zur Herstellung von Chips, für Screening- und Analyseverfahren, in der Informationsverarbeitung, für biomedizinische Anwendungen.

Ein weiterer Gegenstand ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Bakteriums in der Nanotechnologie, synthetischen Biologie, zur Herstellung von Chips, für Screeningverfahren und/oder für biochemische Assays.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung eine programmierbare, bakterielle Zellmembran, die aus einem erfindungsgemäßen Bakterium durch Isolieren der Zellmembran von dem Bakterium herstellbar ist.

Kurzbeschreibung der Figuren

Figur 1 zeigt ein erfindungsgemäßes Bakterium mit einem Zwei-Komponentensystem, das zum Programmieren von bakteriellen Membranen verwendet wird.

Figur 2 zeigt eine alternative Ausführungsform des erfindungsgemäßen Bakteriums.

Figur 3 zeigt verschiedene bakterielle Konstrukte, die durch das erfindungsgemä- ße Zwei-Komponentensystem gezielt verwendet oder verändert werden.

-igur 4 zeigt erfindungsgemäße Sensorkinasen, Receiver- und Reporterkonstruk- e.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung Die vorliegende Erfindung betrifft zunächst ein modifiziertes Bakterium mit einem ξwei-Komponentensystem, wobei ein äußeres Signal (3) auf die bakterielle Zellmembran trifft, das äußere Signal (3) durch eine erste Komponente (1) des Zwei- <omponentensystems innerhalb des Bakteriums empfangen wird, das Empfangen des äußeren Signals (3) eine Veränderung einer zweiten Komponente (2) des Zwei-Komponentensystems bewirkt, die zweite Komponente (2) in dem Bakterium sine Veränderung im Proteom und/oder Transkriptom (4) bewirkt, die Veränderung (4) die bakterielle Zellmembran verändert, und die Veränderung der bakteriellen Zellmembran in einem Medium außerhalb des Bakteriums gespeichert wird.

Eine bakterielle programmierbare Membranoberfläche durch Nutzung neuer Zwei- Komponentensysteme wird als vielseitig verwendbares neues Werkzeug für die

Nutzung in der Nanobiotechnologie und für die Nutzung in der synthetischen Biologie beschrieben, etwa für die Chipherstellung, für large-scale Screeningverfah- ren, für biochemische Laborassays und weitere miniaturisierte biochemische Fabrikationsprozesse.

Eine bakterielle Membranoberfläche wird durch Nutzung und gezielte Veränderung von bakteriellen Zwei-Komponentensystem Signalkaskaden programmiert. Erzielt wird dies durch (i) spezifische Chimären der Kinasenkomponente, (ii) gezieltes Design aller beteiligten Komponenten der Zwei-Komponentensystem Sig- nalkaskade. Zur Herstellung verwendete Bakterien können aktiv, über neue Zwei- Komponentensysteme an der Membran über verschiedene elektromagnetische Wellen programmiert werden. So werden auch die Oberflächenanordnung, Qualitätsüberprüfung, Oberflächenabtrennung und Signalverarbeitung der programmierten Membran verbessert.

Außerdem wird durch diese Erfindung jeweils systematisch verbessert: (i) Eingabe über neue Zwei-Komponentensysteme und deren weitere Optimierung über Screeningverfahren

(ii) Programmierung von Ein- und Ausgabe-Eigenschaften der Membran (iü) Ausgabe und Rückkoppelung der Eingabe mit und in ein technisches System (iv) Membranstrukturierung.

Das modifizierte Bakterium wird erzielt durch die Nutzung und gezielte Veränderung von bakteriellen Zwei-Komponentensystem-Signalkaskaden. Dies wird er- reicht durch (i) spezifische Chimären der Kinasenkomponente oder (ii) gezieltes, wie hier offenbartes Design verschiedener beteiligter Komponenten der Zwei- Komponentensystem-Signalkaskade.

Umfasst sind außerdem die Nutzung bakterieller programmierbarer Membran- Oberflächen sowie die Steuerung anderer Prozesse, wobei sich die Nutzung dieser neuen Zwei-Komponentensysteme als vielseitig verwendbare neue Werkzeu-

ge für die Nutzung in der Nanobiotechnologie und für die Nutzung in der synthetischen Biologie, in der Nutzung für die Chipherstellung, für large-scale Screening- verfahren, für biochemische Laborassays und weitere biochemische Fabrikationsprozesse und deren Miniaturisierung eignen.

Dabei können die verwendeten Bakterien aktiv, über neue Zwei-Komponentensysteme an der Membran auch über verschiedene elektromagnetische Wellen programmiert werden. Diese erzielte neue Anwendung ist ebenso umfasst wie die durch die Zwei-Komponentensysteme erzielte verbesserte Oberflächenanord- nung, Qualitätsüberprüfung, Oberflächenabtrennung und Signalverarbeitung der programmierten Membran und die erzielten neuen Eigenschaften der Membran, nämlich (i) die Eingabe über die genannten neuen Zwei-Komponentensysteme und deren weitere Optimierung, insbesondere der Empfindlichkeit auch der Chro- mophore, Kinasenkomponenten und anderen beteiligten Komponenten des Zwei- Komponentensystems für eingehende Signale, auch bezüglich verschiedener Wellenlängen, und auch über die hier offenbarten Screeningverfahren; (ii) die Programmierung von Ein- und Ausgabe-Eigenschaften der oben bezeichneten Membran; (iii) die Ausgabe und Rückkoppelung der Eingabe in die bakterielle Membran mit und in technische Systeme sowie (iv) die ermöglichte Membranfein- strukturierung.

In einer ersten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein modifiziertes Bakterium, wobei die erste (1) und/oder die zweite (2) Komponente Bestandteile von Kinasen, DNA-bindenden Domänen und/oder Protein-bindenden Domänen aufweisen.

In einer weiteren Ausführungsform ist die erste Komponente (1) des Zwei- Komponentensystems eine Kinase, ein Kanalprotein und/oder ein Transmembranprotein. Besonders bevorzugt ist ein neues lichtempfindliches Kinasen- system. Bekannt sind hierbei lichtempfindliche Kinasesysteme, welche die licht- empfindliche natürliche Komponenten von beispielsweise Synecocystis sp. verwenden.

Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung ist die Erzielung von neuen Sensorkinasen indem neue Chimären der Kinasekomponente auf von außen zugeführte elektromagnetische Wellen, wie beispielsweise Licht, UV und/oder Radiowellen anspre- chen. Umfasst ist auch ein Screeningverfahren, um ein optimiertes Chromophor zu erzielen. Der Erfinder stellt zusätzlich eine effizientere neu konstruierte Kina- senchimäre bereit, die das Sensorsystem von Deinococcus radiodurans bzw. Proteine, die hierzu sequenz- oder zumindest funktionshomolog sind, vorteilhaft nutzt und mit anderen Proteindomänen aus beispielsweise E. coli kombiniert.

Eine vorteilhafte Verwendung ist die Korrektur der Programmierung der Bakterienoberfläche durch technische Systeme, weil beispielsweise ein technischer Lichtreiz eine Kinase erregt, das in der Kombination zum korrekten Speichern eines Textes in der programmierbaren Membran führt. Eine Verwendung zum elekt- ronischen Einlesen eines Textes, wofür lichtempfindliche Fotodioden bei einem technischen Datenträger bzw. Leuchtdioden für die Umprogrammierung der Bakterienoberfläche durch Lichtsignale genutzt werden können, ist möglich.

Andere Möglichkeiten der Rückkoppelung mit einem technischen System sind die gezielte Expression von Kanalproteinen oder von Proteinen, die elektromagnetische Wellen emittieren für andere Wellenlängen, als Alternative zu dem grün fluoreszierenden Protein (GFP), die nicht Fluoreszenslicht, sondern Radiowellen bzw. Infrarotlicht emittieren. Die Rückkoppelung zwischen technischem und biologischem System spielt hierbei eine entscheidende Rolle.

In einer weiteren Ausführungsform weist die erste (1) und/oder die zweite (2) Komponente des Zwei-Komponentensytems mindestens eine weitere Komponente (7) auf, die von einem heterologen Organismus stammt.

In einer weiteren Ausführungsform umfasst die erste (1) Komponente ein Chromophor (8). Diese Ausführungsform erzeugt mit dem hier offenbarten systemati-

schen Design verbesserte Kinasekomponenten und Empfänger-(Receiver)- komponenten für die Nutzung als Zwei-Komponentensystem zur Programmierung von Bakterien und insbesondere deren Membranoberfläche. Dabei werden systematisch DNA-Bindematritzen für das verbesserte Design der Bindeeigenschaf- ten der Empfänger-(Receiver)-komponente an die DNA sowie Struktur- und Interaktionsüberlegungen für das Design neuer Chimären und verbesserter Interaktion der Kinasekomponenten und der Empfänger-(Receiver)-komponenten genutzt.

Das für elektromagnetische Wellen empfindliche Chromophor der Kinasekompo- nente wird ebenfalls unter Nutzung von Strukturinformation verbessert, und alle Komponenten werden durch ungerichtete Mutationen, wie zufällige oder unexakte PCR, Nitrosoguanidin oder gerichtete Selektionsschemata für die Nutzung als programmierbare Zwei-Komponentensysteme für die Programmierung von Bakterienmembranen oder die gezielte Steuerung anderer Prozesse in den Bakterien verwendet.

Insgesamt wird damit die Möglichkeit eröffnet, dass die offenbarten Zwei- Komponentensysteme auf unterschiedlichste Reize oder Signale, wie etwa auch durch Nutzung von Kinasekomponenten ohne Chromophor, optimal reagieren können und mit den anderen beteiligten Komponenten, wie der Empfänger- (Receiver)-komponente oder den DNA-Bindestellen, verschiedene Gene ansteuern können.

Das Design der Komponente ermöglicht, dass als äußere Signal (3) sichtbares Licht, UV-Licht, Infrarot Licht, Fluoreszenzlicht, eine Fotodiode, eine Leuchtdiode, Röntgenstrahlung, Radiowellen und/oder eine weitere elektromagnetische Welle verwendet wird.

In einer weiteren Ausführungsform werden auf die bakterielle Zellmembran vor dem Auftreffen des äußeren Signals (3) weitere Schichten aufgedampft. Auf diese

Weise kann die Vorstrukturierung der Membran durch technische Eingriffe weiter

verbessert werden. Die Membraneigenschaften werden verändert, die Membran reagiert verändert auf äußere Signale (3) oder Reize, wird widerstandsfähiger und stabiler gegen biologische Veränderungen.

Ferner ist es bevorzugt wenn die Transkription des Gens zur Expression eines Proteins, insbesondere zur Expression des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) führt.

In einer alternativen Ausführungsform wird die Veränderung der bakteriellen ZeII- membran in einem technischen Datenspeicher oder in einem biologischen System gespeichert, beeinflusst das technische oder biologische System oder kommuniziert mit ihm. Die Veränderung bakterielle Zellmembran beeinflusst die einen technischen Datenspeicher oder ein biologisches System (Speicherung, Modifizierung) oder es wird von ihm beeinflusst (Programmierung). Die hierdurch erzielte und offenbarte Rückkoppelung zwischen technischen bzw. weiteren biologischen Systemen ist ebenfalls umfasst.

Es hat sich ferner als vorteilhaft erwiesen wenn die Bewegungsrichtung des Bakteriums von außen gesteuert wird. Dies ist insbesondere möglich wenn das Che- System angesteuert wird, was der Anwendung als drahtlose Fernsteuerung gleichkommt. Vorteilhaft ist außerdem die Verwendung nieder- bzw. hochfrequenter elektromagnetischer Wellen, wie beispielsweise Radiowellen oder UV-Licht.

In einer weiteren Ausführungsform verwendet das Zwei-Komponentensystem min- destens eine DNA Sequenz, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 1 bis SEQ ID NR: 60 ausgewählt ist. Das Zwei-Komponentensystem bindet mindestens eine dieser DNA Sequenzen optimiert.

Ein weiterer Gegenstand ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Bakteriums jn der Nanotechnologie, synthetischen Biologie, zur Herstellung von Chips, für Screeningverfahren und/oder für biochemische Assays.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung eine programmierbare, bakterielle Zellmembran, die aus einem erfindungsgemäßen Bakterium durch Isolieren der Zellmembran von dem Bakterium herstellbar ist. Vorteilhaft ist die gezielte Expression verschiedener Proteine und Membraneigenschaften durch das erfindungsgemäße Zwei-Komponentensystem. über dieses Zwei-Komponentensystem wird die Membran programmierbar weil die von außen zugeführten elektromagnetischen Wellen in eine Aktivität von Signalkaskaden durch das Zwei-Komponentensystem umgewandelt werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Zellmembran zum Speichern oder Modifizieren von Information in der Membran verwendet. Das elektronische Einlesen der Membran und das Programmieren der Membran sind ebenfalls umfasst.

im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird ein synthetisches Bakterium für gezieltes Design zur (i) Mustervergrößerung oder -Verkleinerung durch Wachstum der Kolonie (Muster aus synthetischen Bakterien oder in der Membran der synthetischen Bakterien) oder (ii) Nutzung als unbelebtes Speichersystem, insbesondere der bakteriellen Membran, durch gezieltes Stoppen der biologischen Wachstums- und Replikationsvorgänge, wie beispielsweise durch einen induzierbaren Promotor oder ein Apoptoseprogramm, erzielt.

Mit dem erfindungsgemäßen programmierbaren Zwei-Komponentensystem wird außerdem mittels eines Screeningverfahrens spezifisch nach Sensorkinasechimä- ren gesucht, die nicht durch Licht, sondern durch andere elektromagnetische Wellen angeregt werden.

Es ist außerdem vorteilhaft wenn die gespeicherte Information an ein zweites modifiziertes Bakterium oder an eine weitere programmierbare bakterielle Zellmemb- ran weitergegeben wird bzw. vererbbar ist. Das System kann beispielsweise dafür genutzt werden, dass ein Lichtmuster, wie etwa über GFP Expression in einem

ersten Bakterienrasen, an einen zweiten Bakterienrasen mit ebenfalls lichtempfindlicher Kinase weitergegeben werden kann. Hierbei handelt es sich um eine gegenseitige Verschaltung und Vernetzung zweier programmierbarer bakterieller Membranen. Umfasst ist auch die Nutzung des beschriebenen modifizierten Bak- teriums zur Mustervergrößerung oder -Verkleinerung einer bakteriellen Oberfläche sowie eine Nutzung nach Abtötung des modifizierten Bakteriums als nicht lebendes Speichersystem.

Vorteilhaft ist es weiterhin, wenn die Oberflächenstruktur und/oder die Feinstruktur der Membran weitergegeben wird bzw. vererbbar ist/sind.

Umfasst ist ferner die Selbstoptimierung der Membran durch biologische Selektion und technisch gesteuerte Rückkoppelung. Alle Verwendungen sind umfasst.

Wie oben erwähnt kann die von erfindungsgemäßen Zwei-Komponentensystemen vorstrukturierte Membran die gespeicherte Anordnung an die Tochtermembran weitergeben. Dies ist beispielsweise bei Bakterien möglich. Im Rahmen der Erfindung hat dies interessanterweise dazu geführt, dass bei geeigneten Bedingungen auch die programmierte Anordnung der Proteine weitergegeben wird, wenn an der Membran eine neue Membran synthetisiert wird. Besonders bevorzugt und beispielhaft hierfür ist die Expression von Avidin, die nur bei Belichtung erfolgt. Ein Muster bzw. ein Schriftzug wird anschließend beispielsweise durch Licht mit Hilfe des erfindungsgemäßen Zwei-Komponentensystems programmierbar.

Ferner ist das Erzeugen einer Polarität auf der Membran möglich. Das unbelichte- te oder mit weniger Lichtintensität belichtete Konstrukt führt zur Expression eines anderen Proteins, beispielsweise eines Oberflächenproteins, das zur Ablösung der Bakterienschicht vom Untergrund führt. Dies erfolgt nach Austitrieren der Proteinkonzentration der Empfänger-(Receiver)-komponente, die bei niedrigeren Lichtintensitäten und damit niedrigerer Konzentration der aktiven Empfänger- (Receiver)-komponente durch ein anderes Protein, wie beispielsweise einem

Transkriptionsfaktor oder einem anderen DNA-bindenden Protein, von ihrer normalen Promotorbindestelle durch Kompetition entfernt wird. Dies führt zur Expression eines alternativen Proteins in den Bereichen der Bakterienkolonie, die weniger Lichtintensität erhalten. Hierbei kann es sich um beispielsweise Licht abge- wandte, untere Bereiche handeln, die eine andere Proteinexpression an den Licht abgewandten Bakterienmembranen zeigen.

In einer alternativen Ausführungsform können gewünschte Eigenschaften der Membran selektiert werden. Die Membraneigenschaften tragen dazu bei (ein- schließlich Selbstoptimierung).

In einer bevorzugten Ausführungsform wird das äußere Signal (3) von einem technischen Datenträger abgegeben bzw. eingelesen.

Abschließend sei angemerkt, dass sämtlichen Merkmalen, die in den Anmeldungsunterlagen und insbesondere in den anhängigen Ansprüchen genannt sind, trotz dem vorgenommenen formalen Rückbezug auf einen oder mehrere bestimmte Ansprüche, auch einzeln oder in beliebiger Kombination eigenständiger Schutz zukommen soll.

Detaillierte Beschreibung der Figuren

Figur 1 stellt das erfindungsgemäße Zwei-Komponentensystem zur Programmierung von bakteriellen Membranen und anderer bakterieller Prozesse dar. Gezeigt ist das Prinzip der Programmierung. Das Zwei-Komponentensystem wird in Bakte- rien exprimiert. Die erste Komponente 1 , die im vorliegenden Beispiel eine Kinase ist, wird spezifisch für die Reaktion auf eine gewünschte elektromagnetische Welle 3 oder andere Signale optimiert und steuert eine zweite Komponente 2, die im vorliegenden Fall eine Empfänger-(Receiver)-komponente ist, an. Die Empfänger- (Receiver)-komponente 2 bindet an ein wichtiges Gen 4, steuert dessen Transkription 5 und verändert dadurch die bakterielle Membranbeschaffenheit bzw. weitere bakterielle Prozesse 6. Wichtig ist die ermöglichte allgemeine Nut-

zung verschiedener elektromagnetischer Wellen 3 für die Kinasekomponente 1. Es werden zudem neue Kinase- 1 und Empfänger-(Receiver)-komponenten 2 generiert. Dies führt zu besseren Möglichkeiten, weitere Gene 4 anzusteuern, was auch das gezielte Einführen von Bindestellen umfasst, um anschließend die bak- terielle Membran 6 in ihrer Beschaffenheit zu ändern und zu programmieren. Entscheidend ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Rückkoppelung der Eingabe mit und in technische Systeme sowie zur Membranstrukturierung und die Weitergabe dieser Strukturierung.

Figur 2 zeigt eine bevorzugte Ausführungsform und Weiterentwicklung des Zwei- Komponentensystems aus Figur 1. Die Ziffern 1 bis 6 bezeichnen die gleichen Komponenten wie in Figur 1. Eine Optimierung der Schalteffizienz des Zwei- Komponentensystems erfolgt durch chimäre Proteine 7, die für die erste und/oder zweite Komponente 1 , 2 eingesetzt werden können. Zur Aufnahme des externen Signals 3 kann zusätzlich ein Chromophor 8 in der Kinasendomäne 1 verwendet werden, was die Empfindlichkeit gegenüber dem externen Signal 3 erhöht oder die Aufnahme anderer Wellenlängen ermöglicht. Durch ein spezielles Domänendesign wird das System durch Zugabe von Liganden 9 oder anderen interagieren- den Partnern moduliert. Weiterhin kann eine DNA-Bindestelle der Empfänger- (Receiver)-domäne 2 gezielt an andere Genorte 10 transplantiert werden. Daneben kann die Protein-Protein und Protein-DNA Interaktion 11 des Systems durch Verfahren der gezielten Proteinveränderung (protein engineering) verändert werden.

Figur 3 A zeigt die natürliche Situation in Deinococcus radiodurans. Gezeigt sind die folgenden Gene: 1 = ß-Ketothiolase, 2 = Mannose-6-phosphat-isomerase, 3 = Resistenzgen, BphO = bacteriophytochrome heme oxygenase; Es konvertiert Häm in Billiverdin in Deinococcus radiodurans, BphP = Bacteriophytochrome (Phytochrome-like protein in Deinococcus radiodurans), BphR = Bacteriophytoch- rome response regulatorisches Gen in Deinococcus radiodurans. Die letzten drei Gene kodieren dann die Proteine für das entsprechende Zwei-Komponenten-

system in D.radiodurans. Das natürliche Zwei-Komponentensystem enthält nun eine neue Domänenzusammensetzung durch gezieltes Domänendesign.

Figur 3 B zeigt die folgenden Domänen: PAS leitet sich von 3 Proteinen ab: Per- period circadian protein; Amt- Ah receptor nuclear translocator protein; SJm- sin- gle-minded protein. GAF (GAF domain, beschrieben in Aravind L., Ponting C. P.; The GAF domain: an evolutionary link between diverse phototransducing proteins. Trends Biochem. Sei. 22: 458-459 (1997)). HisKA = Histidin Kinase A. HATPase C = histinde kinase-,B-,phytochrome-like ATPase.

In dieser Anordnung kann kurz vor der Histidine Kinase A (Phosphoakzeptordo- mäne) geschnitten werden. Die Region zwischen der Loopregion und der HisKA enthält die Aminosäuren 467- 521 (das entspricht den Nukleotiden 1401- 1563).

Figur 3 C zeigt die Domänenanordnung von envZ aus E. coli K12. Das envZ Gen kodiert die Histidinkinase (HisKA) des Zwei-Komponentensystems EnvZ/OmpR in E. coli. Reguliert werden dadurch u.a. die Membranproteine OmpC und OmpF, wobei die bakterielle Membran mit diesem Sensorsystem auf eine osmotische änderung (osmotic upshift) reagiert. In diese E. coli Histidinkinase (HisKA) wird der N-terminale, lichtsensitive Teil der obigen Kinasedomäne von Deinococcus radiodurans (vgl. Figur 3 A und B) eingesetzt. In E coli K12 wird hierfür vor der Aminosäure 221 enzymatisch geschnitten, die genau in der HAMP Domäne (Domäne für Histidinkinasen, Adenylylzyklasen, Methyl-bindenden Proteinen und Phosphatasen) liegt. Das Schneiden beeinträchtigt die Aktivität der Chimäre nicht. Vorteilhaft ist hierbei eine Ndel-Schnittstelle, an der passend geschnitten wird und die zur Generierung der Kinasen-Chimäre genutzt wird. Dabei bleibt der Leserahmen intakt.

Figur 4 A zeigt neue Sensorkinasen, die dadurch erzielt werden, dass neue Chi- mären der Kinasekomponente auf neue Reize, beispielsweise Licht ansprechen.

Eine Ausführung sieht hierzu Chimären zwischen EnvZ (E.coli Sensorkinase) und

BphP (lichtempfindliche Sensokinase aus Deinococcus radiodurans) vor. Gezeigt sind in Figur 4 A, in der der Maßstab 100 Aminosäuren zeigt, die beiden Ausgangsgene, nun bioinformatisch in ihre Domänen aufgelöst. BphP enthält die folgenden Domänen (Figur 4 A oben) in Richtung vom N-terminus zum C-terminus: PAS ₁ GAF, HisKA und HAPTase). Bei EnvZ (nächste Zeile in Figur 4 A) folgen die Domänen HAMP, HisKA und HATPase. Die Konstrukte wurden durch die offenbarten Techniken so erzielt, dass die Domänenfunktionalität sich komplementiert (u.a. Ergänzung der Domänen, Berücksichtigung der Struktur und Funktion) und damit Chimären mit neuen Eigenschaften entstanden sind. Aufgelistet sind in den Zeilen darunter maßstabsgetreu vier Ausführungsbeispiele, die jeweils so berechnet wurden, dass sich die Funktionalitäten der Domänen in den neuen Chimären vorteilhaft ergänzen.

Dies kann insbesondere genutzt werden, um nun ein anderes gewünschtes, be- liebig zu wählendes Gen über das modifizierte zwei Komponentensystem und insbesondere den Kinaseteil in der Membran anzusteuern.

Dargestellt sind in Figur 4 B neue Receiverkonstrukte, die ebenso hergestellt wurden. Angegeben ist in Domänendarstellung das Grundgerüst für verschiedene Ausführungen (der Maßstab gibt 100 Aminosäuren an). Mit den offenbarten Techniken können insbesondere die beiden Domänen - REC = Receiverdomäne und Trans_reg_C = Transaktivierungsdomäne - von verschiedenen Organismen kombiniert werden, wobei auch Domänenchimären, wie oben für die Kinasenkompo- nente dargestellt, erzielt werden können und damit sowohl Receiverdomänenei- genschaften wie auch Transaktivierungseigenschaften gezielt verändert werden.

Figur 4 C zeigt schließlich neue Reporterkonstrukte, die ebenfalls hergestellt wurden. Durch die offenbarten Techniken (Sequenzprotokoll, Promotordesign) können insbesondere auch chromosomale Gene mit minimalem Aufwand so ange- passt werden, dass sie auf die Aktivierung des spezifisch veränderten Zweikomponentensystems reagieren. Dies kann in verschiedenen Reporterkonstrukten

genutzt, gezeigt oder getestet werden. Dargestellt ist die Modifikation eines bekannten Reporterkonstruktes (Nutzung des Lac Operons; Maßstab sind 500 Nukleotide), bei dem nun die Promotorregion (um OmpC) gezielt verändert wurde (Promotoranpassung über verschiedene Genomvergleiche Konsensusprofile u.a. für verschiedene E. coli Stämme, vgl. Sequenzprotokolle). Das Reporterkonstrukt kann dann ein Gen oder verschiedene Genkombinationen (etwa aus dem Lac Operon) ansteuern.

Wichtig ist natürlich, das alle drei Komponenten gemeinsam genutzt werden kön- nen, um besonders effizient neue Zwei-Komponentensysteme und dadurch dann auch programmierbare bakterielle Membranen zu erhalten. So können beispielsweise statt Lac-Operon-Proteinen neue Oberflächenproteine, Antigene oder Antikörper über einen gewünschten, beispielsweise durch Radiowellen induzierten Stimulus exprimiert werden, wobei die Signal/Noise Güte durch Optimierung des Zwei-Komponentensystems mit den dargestellten Techniken erzielt wurde.

In Tabelle 1 sind DNA Bindungsstellen im Antwort-( response) Regulator auf Proteinebene gezeigt.

Im Folgenden ist beispielhaft der Aufbau eines Sensors sowie eines Responders angegeben.

Aufbau Sensor P1

- bildet die H-Domäne (4Helix Bündel auch bei envz), P2: (1joy, 1sr2) HAMP cytoplasmatisches Segment dockt CheY für den Phosphotransfer von P1 an CheY an Phosphorylierungsstelle für den ResponseRegulator ist ein His Autophosphorylierung und Phosphotransfer 4 Helixbundle

His ist Bindestelle zu ResponseRegulator, in der Mitte der Helix angeordnet weist flexible und einen festeren Teil auf am meisten konservierte Aminosäure (His gegenüber, Tyr - Pro nebeneinander) liegen im flexiblen Teil Saure Cluster aus Asp und GIu Hydrophober Kern

- funktioniert nur im Dimer

- Vergleich zur HAMP-Sequenz: der Beginn der Sequenz ist dominiert von keinen, hydrophoben AS, evt. der hydrophobe Kern

- Prolin ist konserviert im dritten Viertel, evt. der flexible Teil - GIu(E) und Asp(D) sind konserviert im dritten Viertel und bilden damit das saure düster

P3: vermittelt die Dimerisierung

P4 (1 bxd, V\5c) H ATPase

- bindet ATP (alpha/beta Sandwitch)

- verwandt mit der ATP-Bindungsdomäne aus einer Klasse von ATPasen, die als die GHL Familie 14 bezeichnet wird

- ß-Faltblatt bildet die Rückwand der Aussparung, die ATP aufnimmt

- Oberfläche, auf welcher der Adeninring Wasserstoff an einen invarianten Rest Asp449 bindet

- benötigt Mg ²⁺ für die Aktivität - extensiver hydrophober Kern, vergrößert durch ein kleines antiparalleles ß-Faltblatt

- Vergleich zur HATPase Sequenz: hydrophober Teil im ersten und letzten Viertel

- ATP Bindung am konservierten Asp(D) im zweiten Viertel - Im letzten Viertel findet sich viel GIy(G), mögliche Funktion als Helixbre- cher und flexibler Teil

P5: reguliert die Kinaseaktivität als Antwort auf Chemorezeptoren

Aufbau Responder

(1 b00, 1fqw, 1 ml): Response_Reg

- Aktive Stelle: Asp, Asp, (Glu/Tyr), Lys . Homodimer

- Alpha/ beta Bündel

- Hydrophober Kern

- Lys stabilisiert die Struktur

- Vergleich zur Struktur Response_reg: kleine, hydrophobe Aminosäuren jm dritten und vierten Viertel bilden evtl den hydrophoben Kern

- Lys ist konserviert und im letzten Viertel evt. der Stabilisator der aktiven Stelle, daneben findet sich immer ein Pro

- Aktive Stelle im ersten und dritten Viertel mit vielen D, G und T

Detail des zweiten Ausführungsbeispiels: Nutzung von DNA-Bindematritzen, entsprechend der andere DNA-Regionen angepasst und von der Empfänger- (Receiver)-Komponente angesteuert werden können.

Die neu erstellte DNA-Bindematrix für OmpR wurde als Beispiel gewählt (vgl. auch die Sequenzen des beigefügten Sequenzprotokolls). Außerdem können genauso zahlreiche andere Empfänger-(Receiver)-domänen genutzt und ihre DNA-Bindung optimiert werden. Wichtig ist für das Design das Wissen um die Varianten der Konsensussequenz. In die Erfindung sind mehrere neu sequenzierte Teilbereiche aus E. coli Stämmen eingeschlossen. Durch die im Sequenzprotokoll angegebenen Sequenzen können Bindungen bzw. Inhibition der DNA-Bindung von OmpR weiter optimiert werden. Insbesondere kann so auch die Bindestelle künstlich an anderer Stelle eingesetzt bzw. transplantiert werden. Es können auch andere Bin- destellen an die Konsensussequenz durch Mutationen angepasst werden.

1. PDB-Code für OmpR

Als homologes Template sollte 1mvoA (PhoP Receiver Domäne von B. subtilis) bzw. 1gxqA (die PhoB E. coli Daten enthalten die kritischen DNA- bindenden Transaktivierungsreste) genutzt werden.

2. BphO

BphO steht für „bacteriophytochrome heme oxygenase"; Genbank Zugangsnummer: AAM00353; um ein Chromophor auch in E. coli herzustel- ien, damit auch der lichtempfindliche Teil der Zwei-Komponentenkinase von

Deinococcus radiodurans genutzt werden kann. Das PDB file d1j77a bzw. a.132.1.2. nach SCOP („Gram-negative bacterial heme oxygenase" (λ/e/s- seria meningitidis)) kann als Template für die Modellierung und anschließende Strukturmodifizierung bzw. in diesem Fall die gezielte Veränderung der Chromophordomäne über Mutagenese des Enzyms verwendet werden.

EP2008/000545

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3. BphP

1ZTU_A - direkte Strukturauflösung genau dieses Phytochroms. Optimierung der Protein-Protein Passung (Holm und Park, 2000) nach Identifikation der beteiligten Strukturdomänen (Schmidt et al., 2002) und Methoden der Sequenz-, Domänen- und Strukturanalyse (Gaudermann et al., 2006). Gezieltes Suchen und Einpassen von modulierenden Interaktionspartnern durch die Proteininteraktionsdatenbank STRING (v. Mering et al., 2003).

4. Weitere Strukturinformationen Weitere Strukturinformationen, die für weiteres Strukturdesign zur Verfügung stehen, insbesondere zur Generierung alternativer Zwei- Komponentensystem-Sensor-Chimären sind: EnvZ von E. coli: Für die Histidinkinasedomäne liegt eine NMR Struktur vor (PDB Code: 1 bxd). Für den Responseregulator zur Histidinkinase BphP in Deinococcus radiodu- rans steht eine homologe Kristallstruktur zur Verfügung, nämlich 1 I3C,

„response regulator for cyanobacterial phytochrome" RCP1 aus Synecho- systis sphaeroides.

5. Chromophor-Optimierung Die Chromophor-Optimierung ist möglich, indem man insbesondere das

Chromophor durch Proteindesign verändert. Unter Nutzung der kürzlich publizierten Strukturdaten (Wagner et al., 2005) kann insbesondere nach Domänenanalyse auch der „light-sensing knot" in einer lichtempfindlichen Sensordomäne durch Design und Mutagenese gezielt verändert und für andere Lichtwellenlängen angepasst werden.

6. Domänen-Rekombination:

Insbesondere wird in der vorliegenden Erfindung die Histidinkinase-

Empfindlichkeit eines Bakterienstammes (erste Domänenhälfte bis zur hier- zu ausgewählten Restriktionsenzymschnittstelle) verwendet, um anschlie-

ßend mit Hilfe einer Chimäre das Zwei-Komponentensystem in einem anderen Bakterienstamm (insbesondere E. coli) zu steuern.

Bevorzugte Ausführungsformen und detaillierte Beispiele Die folgenden Beispiele stellen die Erfindung näher dar. Sie sind exemplarisch angegeben und sollen den Schutzbereich der Erfindung nicht beschränken.

Im Unterschied zu anderen Innovationen auf dem Gebiet der Nanobiotechnologie wurde im Rahmen dieser Erfindung nicht versucht, allgemein beliebige Promoto- ren zu modifizieren oder zu aktivieren, sondern es werden gezielt veränderte Signalkaskaden aus der Mikrobiologie, insbesondere Zwei-Komponentensysteme verwendet. Ebenso ist nicht Ziel der Erfindung lediglich ein gewünschtes Protein zu exprimieren, sondern eine interaktive, programmierbare bakterielle Zelloberfläche zu erzielen, die insbesondere direkt durch Lichtreize umprogrammiert werdenE kann und Proteine dadurch exprimiert bzw. nicht exprimiert werden.

Auch erlaubt es die Erfindung, mehrere Responseregulatoren und Binderegionen in der weiteren Ausgestaltung zu verwenden, um durch äußere Signale, wie beispielsweise zwei verschiedene Farben, unterschiedlich Proteine zu exprimieren oder Proteinkomplexe unterschiedlich anzuordnen.

Die Erfindung zeichnet sich durch die Rückkopplung (feedback loop) in der bakteriellen Membranoberfläche zur technischen Eingabe (Input) aus, was ein geschlossenes System bildet. Ein fluoreszierendes Protein kann ein eindeutiges, insbesondere maschinenlesbares Signal an der Zelloberfläche erzeugen. Alternativ dazu kann ein elektronisches Signal durch öffnen eines Kanalproteins, das sich deshalb öffnet, weil über das Zwei-Komponentensystem eine entsprechende Kaskade aktiviert wurde, generiert werden.

Für die Erfindung ist die Kombination natürlich vorhandener Signalsysteme in den Bakterien entscheidend, die weiter modifiziert werden, um die obigen Bearbei-

tungsschritte exakter, billiger und schneller voranzubringen. Die Nutzung und Modifikation von Zwei-Komponentensignalsystemen aus verschiedenen Spezies, zugehörige Operons und zelleigener Signalsysteme beispielsweise zur Sporulation erlaubt es, eine solche biologische Vorverarbeitung von Membranen und ihre akti- ve Schaltbarkeit bezüglich Oberflächenbeschichtung wesentlich effektiver zu gestalten.

Im Folgenden wird eine bakterielle programmierbare Membranoberfläche unter Verwendung von Zwei-Komponentensystemen als vielseitig verwendbares neues Werkzeug, speziell für die Verwendung in der Nanobiotechnologie und der synthetischen Biologie beschrieben.

Es wird damit eine programmierbare Membranoberfläche durch Nutzung und gezielte Veränderung von bakteriellen Komponenten wie Membran und Zwei- Komponentensystem Signalkaskaden erzeugt.

Dabei ergeben sich die folgenden spezifischen vier Ausgestaltungsaspekte für die Membranoberfläche, die durch die Erfindung jeweils systematisch vorteilhaft be- einflusst werden.

1. Eingabe

Erzielung von neuen Sensorkinasen indem neue Chimären der Kinase- komponente auf elektromagnetische Wellen (z.B. Licht, UV, Radiowellen) ansprechen.

Neues lichtempfindliches Kinasesystem: Bekannt sind hierbei lichtempfindliche Kinasesysteme, welche die lichtempfindliche natürliche Komponente von Synechocystis benutzen. Es wird ein neu konstruiertes Zwei- Komponentensystem u.a. mit Kinasechimäre vorgeschlagen, die z.B. das Sensorsystem von Deinococcus radiodurans bzw. Proteine, die hierzu se-

quenz- oder zumindest funktionshomolog sind, vorteilhaft verwenden, und mit anderen Proteindomänen (z.B. aus E. coli) kombinieren.

Gezieltes Design des Zwei-Komponentensystems

Zwei-Komponentensystem, durch Design gezielt optimiert, einerseits lichtempfindlich (Beiträge aus Deinococcus radiodurans), andererseits garantieren E. coli Genetik und E. coli Interaktionen als weitere Komponenten des Systems wenig experimentellen Aufwand. Besonders wichtig für diese erste Ausführung ist das gezielte Erzeugen einer neuen Kinasen-Chimäre zwischen den Organismen, wie in Figur 3 gezeigt ist.

In der Erfindung wird gezieltes Design verwendet. Insbesondere wird in der Erfindung ein gezielter Match zwischen Transkriptionsfaktorbindestelle an der DNA und dem - von der Kinase aktivierten - Empfänger-(Receiver)- protein erzielt. In der einfachen Ausführung wird dies durch die Chimärenbildung und eine geschickte Wahl der Schnittstelle erzielt, weil anschließend die weitere Interaktion in E. coli erfolgt und dort das E. coli Empfän- ger-(Receiver)-protein bereits zu der entsprechenden Empfängerbindestelle in der DNA passt und die Transkription anschließend auslöst und steuert.

In der weiter verbesserten Ausführung wird eine optimale Passung gezielt durch Design erzielt und erlaubt dadurch eine höhere Vielfalt und Auswahl der Implementierung der Erfindung:

(i) Es werden in einer weiteren Ausführung Konsensus-Receiver- Bindestellen genutzt. Erfindungsgemäß wird dies durch Erstellen einer erweiterten Matrix („position specific scoring matrix" (PSSM) oder weiter bevorzugt, „Hidden Markov Model" (HMM)) für das zentrale Motiv erreicht, um die Bindestelle bei E. coli unter Nutzung homologer Sequenzen verschiedener, auch neu sequenzierter E. coli Genome optimiert zu erzeugen (vgl.

Sequenzprotokoll). Das Sequenzprotokoll bezieht sich auf die OmpR Bindestelle. Alignments erlauben auch die Generierung von PSSMs oder HMMs um Varianten der Bindestelle sicher zu erkennen, ohne aber zuviel Varianz, zuzulassen. Dies ist noch wichtiger bei anderen Zwei- Komponentensystemen weil OmpR eine relativ gut konservierte Konsensussequenz aufweist. Damit können auch andere Gene angepasst werden, oder die Bindestelle kann direkt hiervor transplantiert werden.

(ii) Analog hierzu wird zusätzlich oder alternativ ein allgemeines „Sequence- Structure-Template" (Methodik zum Erstellen des Templates: vgl. z.B. Holm und Park, 2000; Schmidt et al., 2002; Gaudermann et al., 2006), das spezifisch für Empfänger-(Receiver)-domänen ist, etwa vom OmpR Typ, erstellt.

Damit können sowohl die Nukleotidbindestelle in anderen Nukleotidse- quenzen wie auch die benötigte Bindedomäne in anderen Proteinen identifiziert oder künstlich eingesetzt werden.

(iii) Ebenso wird ausgehend von bekannten 3D Strukturen das Strukturtemplate für die Interaktion zwischen Histidin-Kinase und Receiver-Domäne genutzt; um weitere Domänen und Proteine durch gezielte Mutationen für die Erfindung zu nutzen und anzupassen, die weitere erstrebenswerte Eigenschaften aufweisen. Möglich ist hier beispielsweise eine gute Ausbeute bei ihrer Expression oder weiteren Sensoreigenschaften, eine einfache technische Handhabung oder ein gewünschter Organismus etc.

Schließlich können die offenbarten Verfahren (i) bis (iii) auch mit Protein- Engineering Schritten zum Erstellen neuer Proteinchimären kombiniert werden.

Ein erfindungsgemäßes Bakterium mit dem Zwei-Komponentensystem kann als „synthetisches" Bakterium genutzt werden. Der Einsatzbereich

bewegt sich vorwiegend im Fachgebiet der so genannten „synthetic biolo- gy". Möglich ist der Einsatz als Bakterium mit gezieltem Design zur Mikro- mustervergrößerung oder -Verkleinerung. Dabei wird ein Rasen aus synthetischen Bakterien mit Licht programmiert. Die Bakterien exprimieren an- schließend in den belichteten Bereichen ein gewünschtes Protein oder

Peptid. Durch geeignete Wahl des genetischen Konstruktes ist nach dem Belichten die Histidinkinase ständig aktiv weil die Lichtaktivierung auch eine Rekombinase aktiviert und die Histinkinase einen konstitutiven Promotor erhält. Damit kann ein programmiertes Expressionsmuster mit dem Rasen mitwachsen. Ebenso können mehrere Muster, für die mehrere Lichtquellen und verschiedene Histinkinasen mit verschiedenen Chromophoren verwendet werden sowie induzierbare und reversible Konstrukte genutzt werden, die auch zur gezielten Musterverkleinerung eingesetzt werden können.

Die programmierten Membranen können auch ohne Zellen genutzt werden, z.B. als Speichermedium wenn das exprimierte Protein technisch, wie beispielsweise optisch, angesteuert wird und in zwei unterschiedlichen Zuständen anwesend sein kann, wie beispielsweise Rhodopsine, Prionprotei- ne oder Antikörper. Ferner kann durch ein anderes Signal, z.B. Antibiotika induzierbarer Promotor, gezielt die übrigen Bakterienzellen abtöten bzw. von der Membran gelöst werden.

1.2 Design des Chromophors

Das Chromophor macht die Histidinkinase lichtempfindlich. Aus früheren Arbeiten ist hierzu beispielsweise das BphO Gen von Deinococcus radiodu- rans bekannt (Bhoo et al., 2001). Für die technische Anwendung ist eine höhere Flexibilität für andere Reize oder Signale, insbesondere der Wellenlänge, sehr vorteilhaft. Ferner ist es bevorzugt wenn das Chromophor auch auf andere elektromagnetische Wellen spezifisch reagiert. Hierfür verwen- det die vorliegende Erfindung ein Screeningverfahren für geeignete Chro- mophore. Das Screeningverfahren sieht wie folgt aus:

(i) Vormutagenese des Konstruktes bzw. des Chromophor erzeugenden Enzymsystems etwa durch zufällige (random), nicht exakte PCR Mutage- nese oder die Verwendung von Mutagenen wie Nitrosoguanidin in Bakteri- enstämmen, die bereits das neue synthetische Zwei-Komponentensystem in einer ersten Form tragen.

(ii) Ein gezieltes Design des Chromophors wird durch die Kombination und Nutzung der Daten von Rockwell et al. (2006), van Thor et al. (2006), Bo- rucki et al. (2005) und Wagner et al. (2005) ermöglicht.

(iii) Noch vorteilhafter ist das gezielte Selektieren des veränderten Chromophors über einen Selektionsassay: Das mutierte Chromophor (vgl. (i), (ii)) muss für die veränderte Wellenlänge sensitiv sein und über das Zwei- Komponentensystem für Antibiotika Expression sorgen, weil sonst eine negative Selektion auftritt, die zum Absterben der Bakterien durch das Antibiotikum führt. Triviale „Escape-Mutanten" werden durch entgegen gesetztes Screening (Counterscreening) weiter reduziert. Hierfür ist es entscheidend, dass das Zwei-Komponentensystem funktionieren muss, sonst wird ein Metabolit toxisch verstoffwechselt. Beispielhaft ist hierfür 4-Fluoruracil.

1.3 Weitere Ausgestaltungen

Das derart gewonnene, neue empfindliche Zwei-Komponenten- Sensorsystem in Bakterienmembranen kann wie folgt weiter ausgestaltet werden:

a) Mit dem erfindungsgemäßen Screeningverfahren wird spezifisch nach Sensorkinasechimären gesucht, die nicht durch Licht, sondern durch andere elektromagnetische Wellen erregt werden.

b) Neue, hier offenbarte Anwendungen sind insbesondere eine Fernsteuerung der Bewegungsrichtung von Bakterien durch das System, wenn etwa das Che-System über das Zwei-Komponentensystem angesteuert wird. Als Anwendung kommt zum Beispiel die drahtlose Fernsteuerung in Betracht.

c) Ferner können nieder- oder hochfrequente elektromagnetische Wellen, wie Radiowellen oder UV-Licht verwendet werden.

2. Programmierung:

2.1 Eingabe und Ausgabe Eigenschaften der Membran

Die Eingabe und Ausgabe Eigenschaften der Membran werden durch die Membranstrukturierung verändert. Verwendet wird die gezielte Expression verschiedener Proteine und erzielter Membraneigenschaften durch das er- findungsgemäße Zwei-Komponentensystem. über dieses Zwei-

Komponentensystem-System wird die Membran programmierbar weil ein elektromagnetischer Wellen-Input stattfindet. Wichtig ist dabei, dass die Chimäre gezielt verändert und moduliert werden kann. Es findet eine Umwandlung der Aktivität von Signalkaskaden durch das Zwei- Komponentensystem statt. Das Design der Membranoberfläche betrifft z.B. die gezielte Expression von Lektinen, um bestimmte Gewebe oder Membranen besiedeln zu können, die gezielte Expression von monoklonalen Antikörpern, um Peptide gezielt binden zu können oder Transmembran-(TM)- Rezeptoren bzw. lonenkanäle oder Designerproteine (z.B. Kinasen) um auf andere Signale gezielt mit der Membran reagieren zu können. Dabei können insbesondere auch die Membraneigenschaften verändert werden.

2.2 Weitere Ausgestaltung

Diese Vorstrukturierung der Membran kann durch technische Eingriffe wei- ter verbessert werden, beispielsweise durch (i) Aufdampfen von Schutzschichten. Dies verändert die Membraneigenschaften, macht sie wider-

standsfähiger und stabilisiert sie gegen biologische Veränderungen. Außerdem ist eine (ii) verbesserte Programmierbarkeit der Membranoberfläche durch lokalisiertes Aufbringen (Epitaxie oder durch Fotolithografie oder andere schonende Verfahren, z.B. UV-induziertes Kleben in belichteten Be- reichen) von organischen oder metallischen Leitern, Halbleitern oder Isolatorschichten mit der Membranoberfläche oder von Peptiden, Aptameren, Imprints oder selektiven Bindepartnern möglich.

3. Ausgabe und Rückkoppelung Die Ausgabe auf einen Input kann durch Expression verschiedener Proteine an der Membran erfolgen. Möglich ist die Expression des grün fluoreszierenden Proteins (green fluorescence protein (GFP)), die ein Lichtsignal bzw. über die Expression eines Kanalproteins ein elektronisches Signal erzeugt. Im Rahmen der Erfindung wird dies für eine Rückkoppelung in a) ein technisches Datenspeichersystem, wie beispielsweise einen

Massenspeicher, einen Computer oder ein Speichermedium; oder b) ein biologisches System aus Rezeptoren oder anderen Designer Kaskaden etc. verwendet.

3.1 Weitere Ausgestaltung: a1) Möglich ist eine Nutzung zur Korrektur der Programmierung der Bakterienoberfläche durch technische Systeme. Beispielhaft hierfür sind

Leuchtdioden für die Umprogrammierung der Bakterienoberfläche durch

Lichtsignale. Ein technischer Lichtreiz programmiert eine Kinase des Zwei- Komponentensystems, das anschließend in der Kombination zum korrekten Speichern eines Textes in der programmierbaren Membran führt.

a2) Der Output der programmierten Membran kann umgekehrt elektro- nisch eingelesen werden wobei dazu lichtempfindliche Fotodioden bei dem technischen Datenträger genutzt werden können. So führt beispielsweise

eine selektive Proteinexpression in der bakteriellen Membran, wie die selektive GFP Expression zu gespeicherten Bits bzw. Wörtern im technischen System. Die Rückkoppelung ist wiederum ein entscheidendes Merkmal.

b) Die Erfindung eröffnet auch die Nutzung, dass ein Lichtmuster an einen zweiten Bakterienrasen mit ebenfalls lichtempfindlicher Kinase weitergegeben werden kann. Dabei kann GFP und die erfindungsgemäße Designerkaskade durch eine dünne, insbesondere lichtdurchlässige Membran vom nächsten Bakterienrasen getrennt sein, oder es kann ein direkter Kon- takt erfolgen.

c) Andere Möglichkeiten der Rückkoppelung mit einem technischen System sehen vor:

- die gezielte Expression von Kanalproteinen, etwa Na ⁺ , K ⁺ , Cl ^" lonenkanä- Ie, die wiederum elektronische Effekte ausüben und so vom technischen

System abgelesen werden können.

- Die Emittierung von anderen Wellenlängen durch so genannte „emitting proteins", die alternativ zu GFP eingesetzt werden können, die kein Fluo- reszenslicht, sondern Radiowellen bzw. Infrarot emittieren.

d) Das Gesamtsystem erlaubt damit deutlich mehr als die Summe der einzelnen Teile: Beispielsweise sind auch „feedback loop" Fluoreszenz Proteine an der Oberfläche und technisches Einlesen möglich, worauf hin sich der Lichtinput in das biologische System ändert, der anschließend über das

Zwei-Komponentensystem wieder zu einer anderen Proteinexpression führt. Hierdurch wird eine Feinbearbeitung der Oberfläche möglich. Denkbar ist ferner eine Qualitätssicherung der exprimierten Proteine, etwa hinsichtlich der Güte oder Leistungsfähigkeit der exprimierten lonenkanäle o- der eine lichtgestützte bzw. elektromagnetische überprüfung der Anti- gen/Antikörpereigenschaften der programmierten Membran.

4. Membranstrukturierung und -imprint

Die von Zwei-Komponentensystemen vorstrukturierte Membran kann die gespeicherte Anordnung an die Tochtermembran weitergeben, etwa bei Bakterien. In der Erfindung führt dies interessanter Weise dazu, dass nun bei geeigneten Bedingungen auch die vorher programmierte und erzielte

Anordnung der Proteine weitergegeben wird, wenn an der Membran eine neue Membran synthetisiert wird. Dieser hier verwendete und beschriebene, durch die biologische Membran angestoßene Prozess der Musterrepli- kation ist eine exaktere, biologische und schnellere Alternative zu neueren technischen Verfahren, etwa der Musterreplikation durch elektrische Felder in Polymeren (Morariu et al., 2002) oder durch modifiziertes Trocknen („de- wetting") von Polymerfilmen (Harkema et al., 2003). Dies kann außerdem zusätzlich alle weiteren Arten von Membran-Imprint und Strukturierung einbeziehen.

4.1 Beispiel

Das grün fluoreszierende Protein (GFP) wird nur bei Belichtung exprimiert; es entsteht ein GFP-Muster, wie z.B. ein Schriftzug, der durch Licht programmierbar ist (Levskaya et al., 2005). Dieser Effekt wird erfindungsge- maß über ein neues, hochflexibles Zwei-Komponentensystem erzielt. Entscheidend dabei ist, dass im Rahmen der Erfindung eine programmierbare Membranoberfläche entsteht. Es wird beispielsweise eine Polarität erzeugt, so dass das unbelichtete oder wenig belichtete Designer-Konstrukt die Expression eines anderen Proteins, etwa eines Oberflächenproteins, das zur Ablösung der Bakterienschicht vom Untergrund führt, erlaubt. Anschließend wird das Musters weitergegeben, weil die nächste Bakterienschicht wiederum ein lichtempfindliches Zwei-Komponentensystem aufweist und dieses nun die GFP Expression erneut steuert. ähnlich können auch Membra- nimprints; Proteinausstülpungen oder Proteingruben von einem Bakterien- rasen an den nächsten durch das erfindungsgemäße Zwei-

Komponentensystem weiter gegeben werden.

4.2 Weitere Ausgestaltung

Möglich ist auch eine Selbstoptimierung der Membran, zunächst entsprechend dem hier offenbarten Selektionsschema, anschließend über die technischen „feedback loops", wie oben beschrieben. Die jeweils neue

Membrankonfiguration wird so Schritt für Schritt in den Bakterien bzw. gemeinsam mit dem technischen System optimiert.

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