Die Technologie der lichtgesteuerten Synthese von Biopolymeren unter Verwendung fotolabiler Schutzgruppen eröffnet die Möglichkeit, Biochips in situ durch Synthese aus Monomer-und Oligomerbausteinen zu erzeugen.

Biochips haben für die Forschung und Diagnostik ganz erheblich an Bedeutung gewonnen, da sie eine schnelle und hochparallele Bearbeitung komplexer biologischer Fragestellungen erlauben. Hierzu werden jedoch Chips von höchster Qualität benötigt, so dass ein hohes Interesse an neuen effektiveren Synthesemethoden besteht.

Bei der lichtgesteuerten Synthese von Nukleinsäure-Chips finden fotolabile Nukleosid-Derivate Verwendung. Hierbei findet der Kettenaufbau der Nukleinsäure-Fragmente üblicherweise mittels Phosphoramidit-Synthonen statt. Die Bausteine tragen jeweils eine temporäre Fotoschutzgruppe, die durch Lichteinstrahlung entfernt werden kann. Das Syntheseprinzip sieht eine zyklische Abfolge von Kondensations-und Deprotektions-Schritten (durch Licht) vor. Die Effizienz, mit der eine solche lichtgesteuerte Synthese erfolgen kann, wird im Wesentlichen durch die verwendeten fotolabilen Schutzgruppen, insbesondere durch die Effizienz, mit der diese im Bestrahlungsschritt entfernt werden können, bestimmt. Bei den bislang zur lichtgesteuerten Synthese verwendeten Fotoschutzgruppen handelt es

sich üblicherweise um die Schutzgruppen NVOC (S. P. A. Fodor et al., Science 251 (1991), 767 ff.), MeNPOC (A. C. Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 91 (1994), 5022 ff. ), DMBOC (M. C. Pirrung, J. Chem. 60 (1995), 1116 ff. ) und NPPOC (A. Hassan et al., Tetrahedron 53 (1997), 4247 ff. ). Weitere bekannte fotolabile Schutzgruppen in der Nukleosid- bzw. Nukleotidchemie sind o-Nitrobenzyl-Gruppen und ihre Derivate (vgl. z. B. Pillai, Org. Photochem. 9 (1987), 225 ; Walker et al., J. Am. Chem. Soc. 110 (1988), 7170). Als weitere fotolabile Schutzgruppe wurde die 2- (o-Nitrophenyl) ethyl-Gruppe (Pfleiderer et al., In : "Biosphosphates an their Analogues-Synthesis, Structure, Metabolism and, Activity", ELSEVIER Science Publishers B. V. Amsterdam (1987), 133 ff. ) sowie Derivate davon (W097/44345 und W096/18634) vorgeschlagen.

Die gegenwärtig für die lichtgesteuerte Synthese von Nukleinsäuren verwendeten fotolabilen Schutzgruppen. (z. B. NVOC, MeNPOC, NPPOC) zeichnen sich im Allgemeinen durch einen vergleichsweise niedrigen Absorptionskoeffizienten beider Wellenlänge der Lichteinstrahlung aus. Die Bestrahlung der fotolabilen Nukleosid-Derivate erfolgt üblicherweise mit Hg- Hochdrucklampen bei einer Wellenlänge von 365 nm. Der niedrige Absorptionskoeffizient der verwendeten fotolabilen Schutzgruppe bei dieser Wellenlänge hat zur Folge, dass nur ein sehr geringer Anteil des eingestrahlten Lichts zur Anregung der Moleküle verwertet werden kann.

Desweiteren handelt es sich bei den verwendeten fotolabilen Schutzgruppen zumeist um farblose Derivate. Dies wiederum hat zur Folge, dass es während der Synthese nicht möglich ist, mit einfachen spektroskopischen Methoden zu detektieren, ob die fotolabile Schutzgruppe sich noch am Nukleosid-Derivat befindet oder bereits teilweise oder vollständig durch den Lichteintrag abstrahiert worden ist. Es lässt sich somit der Vorgang der Abstraktion nur schwer oder gar nicht verfolgen.

Muller et al. (Helvetica Chim. Acta 84 (2001), 3735-3741) beschreiben eine fotolabile Schutzgruppe, bestehend aus einer MeNPOC-Gruppe, an die

ein fluoreszierendes Coumarinderivat über einen Aminolinker gekoppelt ist.

Diese fotolabile Schutzgruppe wird zur Synthese von Oligonuklotiden auf DNA-Microarrays eingesetzt. Die Abspaltung der fotolabilen Schutzgruppe erfolgt in einem einzigen Schritt durch Bestrahlung.

Gemäß vorliegender Erfindung wird eine neuartige Schutzgruppe bereitgestellt, bei der der Aktivierungsschritt lichtinduziert erfolgt und der eigentliche Entschützungsschritt am Reaktionszentrum durch chemische Mittel, z. B. säurekatalysiert, stattfindet (Abb. 1). Diese neuartige Schutzgruppe bzw. diese Schutzgruppe tragende Moleküle können für die Synthese von Biopolymeren eingesetzt werden.

Ein Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Synthese von Biopolymeren durch schrittweisen Aufbau aus Synthesebausteinen, die Schutzgruppen tragen, wobei man mindestens einen Synthesebaustein verwendet, der eine zweistufige Schutzgruppe trägt, die durch einen Belichtungsschritt aktiviert und durch einen anschließenden chemischen Behandlungsschritt abgespalten wird. Der chemische Behandlungsschritt umfasst vorzugsweise eine Behandlung mit Base, eine Behandlung mit Säure, eine Oxidation, eine Reduktion oder/und eine enzymatische Reaktion. Besonders bevorzugt umfasst der chemische Behandlungsschritt eine Säurebehandlung.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung verwendet man als zweistufige Schutzgruppe eine derivatisierte Tritylgruppe.

Tritylgruppen zeichnen sich durch ihre hervorragenden Abspaltbarkeit, insbesondere durch Behandlung mit Säure, aus. Die erfindungsgemäßen zweistufigen Tritylschutzgruppen sind hingegen nicht säurelabil, sondern werden erst nach Aktivierung und Abspaltung einer oder mehrerer fotolabiler Komponenten in eine säurelabile Form überführt. Besonders bevorzugt wird daher ein Synthesebaustein mit einer zweistufigen Schutzgruppe verwendet, der die allgemeine Formel I aufweist :

wobei R1 und R2 jeweils unabhängig ausgewählt sind aus Wasserstoff, OR3, O (CH2) nCOOR3 und NHZ, R3 eine Cl-C. Alkylgruppe, eine C2-C8- Alkenylgruppe, eine C2-C$-Alkinylgruppe oder/und eine C6-C20 Arylgruppe enthält, die gegebenenfalls einen oder mehrere Substituenten aufweisen kann, X den Synthesebaustein darstellt, Y jeweils unabhängig eine fotoaktivierbare Schutzgruppe ist, Z eine Aminoschutzgruppe ist, n eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist und wobei gegebenenfalls RX oder/und R2 durch Y ersetzt sein können.

Die Alkyl-, Alkenyl-und Alkinylgruppen können linear oder cyclisch, geradkettig oder verzweigt sein. Bevorzugte Bedeutungen für R1 und R2 sind Wasserstoff, 0-Methyl, OCOO-Methyl oder eine geschützte Aminogruppe, z. B. eine mit einer geeigneten Carbonsäure in eine Amidfunktion überführte Aminogruppe.

Die Erfindung erfasst auch Verbindungen, die mehrere fotoaktivierbare Schutzgruppen tragen, insbesondere Verbindungen der Formel I, worin zumindest einer von R, oder R2 durch eine fotoaktivierbare Schutzgruppe Y ersetzt ist.

Durch Variation der Reste Ri und R2 und Substitution eines oder beider Reste durch fotoaktivierbare Schutzgruppen lässt sich die Säurelabilität den gewünschten Anforderungen anpassen.

Die Erfindung umfasst auch Verbindungen, die eine oder mehrere fluoreszierende Gruppen tragen, z. B. Verbindungen, bei denen Y eine fluoreszierende Fotoschutzgruppe oder/und R3 bzw. Z fluoreszierende Gruppen darstellen (R. Ramage, F. O. Wahl, Tetrahedron Lett., 34 (1993), 7133) oder Moleküle, bei denen die Fluoreszenz durch Substitution am Tritylgerüst (J. L. Fourrey et al., Tetrahedron Lett., 28 (1987), 5157) eingeführt wurde.

Diese fluoreszierenden Gruppen können, solange die Anregungs-und Emissionswellenlängen mit der lichtinduzierten Aktivierung nicht interferieren, zur Qualitätskontrolle von Biochips herangezogen werden.

Dies kann beispielsweise in Biochip-Trägern gemäß WO 00/13018 geschehen.

Die fotoaktivierbare Gruppe Y der zweistufigen Schutzgruppe kann grundsätzlich aus beliebigen bekannten Fotoschutzgruppen ausgewählt werden, wie etwa Nitroveratryloxycarbonyl (NVOC), a-Methyl-6- nitropiperonyloxycarbonyl (MeNPOC), 3, 5-Dimethoxybenzoincarbonat (DMBOC), 2- (o-Nitrophenyl) propyloxycarbonyl (NPPOC), o-Nitrobenzyl und Derivaten davon, 2-(o-Nitrophenyl) ethyl und Derivaten davon.

Falls mehrere fotoaktivierbare Gruppen Y vorhanden sind, können diese gleich oder verschieden sein.

Die fotoaktivierbare Komponente Y der zweistufigen Schutzgruppe kann durch einen Belichtungsschritt abgespalten werden. Durch Abspaltung der Gruppe Y wird die Labilität der verbleibenden Schutzgruppe erhöht, so dass sie durch einen anschließenden chemischen Behandlungsschritt

abgespalten werden kann, während eine zweistufige Schutzgruppe, welche die fotoaktivierbare Komponente Y noch enthält, unter derartigen Bedingungen im Wesentlichen gegenüber einer Abspaltung resistent ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird zur Synthese von Biopolymeren eingesetzt, wobei das zu synthetisierende Biopolymer schrittweise aus mehreren Synthesebausteinen aufgebaut wird. Besonders bevorzugt wird das Verfahren zur Synthese von Nukleinsäuren, z. B. DNA oder RNA, eingesetzt. Es ist jedoch anzumerken, dass das Verfahren auch zur Synthese von anderen Biopolymeren, wie etwa, Peptiden, Peptidnukleinsäuren (PNA) oder Sacchariden, geeignet ist. Der Synthesebaustein kann ein monomerer Baustein, z. B. ein Nukleosid-Derviat, aber auch ein oligomerer Baustein, z. B. ein Dimer oder Trimer, d. h. beispielsweise ein Di-oder Trinukleosid-Derivat, sein. Besonders bevorzugt ist der Synthesebaustein ein Phosphoramidit-Baustein. Es können jedoch auch andere Nukleotidsynthese-Bausteine, z. B. Phosphat-oder Phosphonat- Bausteine, verwendet werden. Weiterhin können als Synthesebausteine auch Linker-bzw. Spacer-Bausteine, z. B. als Phosphoramidite, eingesetzt werden. Besonders bevorzugte Linker bzw. Spacer als Träger zweistufiger Schutzgruppen sind in DE 100 41 539.3 beschrieben.

Die erfindungsgemäßen, eine zweistufige Schutzgruppe tragenden Synthesebausteine haben im Allgemeinen stärker lipophile Eigenschaften als die bislang die im Stand der Technik verwendeten Synthesebausteine.

Durch diese Lipophilie erhöht sich die Solubilität der Synthesebausteine, insbesondere der Phosphoramidit-Synthone in organischen Lösungsmitteln.

Die dadurch mögliche homogenere Reaktionsführung führt im Vergleich zu den reinen fotolabilen Phosphoramidit-Synthonen zu einer höheren Kopplungseffizienz. Durch die Abspaltung des farbigen Tritylkations der erfindungsgemäßen Fotoschutzgruppen, welches einen wesentlich höheren Absorptionskoeffizienten besitzt als die Abspaltungsprodukte bei anderen Fotoentschützungsprozessen, eröffnet sich weiterhin die Möglichkeit zur

direkten online Prozesskontrolle. Dies führt zu einer Verbesserung bei der Qualitätskontrolle für Biochips.

Die Tritylgruppe der erfindungsgemäßen Fotoschutzgruppen ermöglicht außerdem die selektive Funktionalisierung der 5'-Hydroxyfunktion. Dies führt zu einer enormen Kostenreduzierung, da eine Trennung der 3'-5'- Isomere entfällt.

Besonders bevorzugt sind daher gemäß vorliegender Erfindung Phosphoramidit-Bausteine, die die zweistufige Schutzgruppe am 5'-0-Atom des Zuckers, insbesondere der Ribose oder der Deoxyribose, tragen.

Die Synthese der Biopolymeren kann auf übliche Weise durchgeführt werden, beispielsweise auf einer Festphase. Besonders bevorzugt werden mehrere Biopolymere, die eine unterschiedliche Sequenz von Synthesebausteinen tragen, auf einem einzigen Träger in Form eines Array in situ erzeugt.

Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Verbindungen der allgemeinen Formel I

wobei R1 und R2 jeweils unabhängig ausgewählt sind aus Wasserstoff, OR3, O (CH2) nCOOR3 und NHZ, R3 eine C,-C. Alkylgruppe oder/und eine C6-C20 Arylgruppe enthält, die gegebenenfalls Substituenten aufweisen kann, X einen Synthesebaustein zur Synthese von Biopolymeren oder eine Abgangsgruppe darstellt, Y jeweils unabhängig eine fotoaktivierbare Schutzgruppe ist, Z eine Aminoschutzgruppe ist, n eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist und wobei gegebenenfalls R, oder/und R2 durch Y ersetzt sein können.

Substituenten von Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-bzw. Arylgruppen sind vorzugsweise ausgewählt aus Halogenen, z. B. F, Cl, Br oder 1, OH, SH, -O-,-S-,-S (O)-,-S (0) 2-, NO2, CN und NHZ, wobei Z eine Aminoschutzgruppe ist. Die Substituenten können an dem betreffenden Rest einfach oder mehrfach vorliegen. Arylgruppen können auch Ringsysteme mit Heteroatomen, wie etwa 0, N oder/und S, umfassen.

Alkyl-, Alkenyl-und Alkinylgruppen können in geradkettiger, verzweigtkettiger oder cyclischer Form vorliegen und gegebenenfalls mit einer C6-C20-Arylgruppe substituiert sein, wobei die Arylgruppe wiederum Substituenten wie zuvor angegeben enthalten kann. Substituenten von Arylgruppen werden z. B. ausgewählt aus-OH, Halogen,-C,-C4-Alkyl,-0- C,-C4-Alkyl, wobei die Alkylgruppen wie zuvor angegeben substituiert sein können.

Wenn X eine Abgangsgruppe ist, handelt es sich um eine Gruppe, die bei einer Reaktion der Verbindung (I) mit einer anderen Verbindung abgespalten werden kann. Vorzugsweise ist X eine durch Reaktion mit eine Nukleophil, gegebenenfalls in Gegenwart einer Hilfsbase, wie Pyridin, abspaltbare Abgangsgruppe. Bevorzugte Beispiele für X sind : CI, Br, I, Tosylat, Mesylat, Trifluorsulfonat etc.

Die schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Schutzgruppenkonzepts ist in Abbildung 1 gezeigt. Der Synthesebaustein

(A) trägt eine zweistufige Schutzgruppe (B-C). In einem ersten Belichtungsschritt wird der fotolabile Anteil (B) der Schutzgruppe abgespalten. Durch eine zweiten chemischen Behandlungsschritt, z. B. durch Zugabe von Säure, wird die chemisch labile Komponente (C) der Schutzgruppe abgespalten, so dass der Synthesebaustein (A) in aktiver Form vorliegt.

Abbildung 2 zeigt eine Beispielsubstanz aus einer bevorzugten Klasse von erfindungsgemäßen zweistufigen Schutzgruppen. Sie basiert auf der säurelabilen Tritylgruppe, enthält jedoch in der p-Position eines Phenylrests eine fotolabile Komponente (hier die NPPOC-Gruppe), welche die Säureempfindlichkeit der Tritylgruppe verringert bzw. vollständig blockiert.

Durch Belichtung und Abspaltung der fotolabilen Komponente wird die Schutzgruppe in eine säurelabile Form überführt und kann anschließend in Gegenwart von Säure unter Freisetzung des ungeschützten Synthesebausteins abgespalten werden.

Abbildung 3 zeigt zwei Varianten zur Synthese einer erfindungsgemäßen zweistufigen Schutzgruppe.

Abbildung 4 zeigt zwei weitere Varianten zur Herstellung erfindungsmäßer Synthesebausteine mit zweistufigen Schutzgruppen.

Abbildung 5 zeigt eine dritte Variante der Synthese zweistufiger Schutzgruppen, wobei zwei der Phenylgruppen an der Tritylgruppe mit einer fotolabilen Gruppe substituiert sind.

Abbildung 6 zeigt konkrete Ausführungsformen für Carbonatderivate der zweistufigen Schutzgruppe und Abbildung 7 zeigt ein Verfahren zur Synthese der S 1-Schutzgruppe.

Ausgehend von 4-Hydroxybenzoesäureethylester und tert.-

Butoxydiphenylchlorsilan in Anwesenheit von Imidazol, gelingt die quantitative Einführung der Silylgruppe. Der silylderivatisierte Ester wird mit dem Grignard-Reagenz des Brombenzols zum 4- (tert.- Butoxydiphenyl- silyloxy) triphenylcarbinol (S1) umgesetzt. In analoger Weise gelangt man durch Verwendung des Bromanisols zum 4,4'-Dimethoxy-4"- (tert. - Butoxydiphenyfsi) yioxy) tritytcarbinoi (S3, ohne Abb.).

Abbildung 8A zeigt die Synthese der S2-Schutzgruppe.

Das Methoxy-Silyloxy-Derivat ist, ausgehend von silylgeschütztem 4-Hydroxybenzophenon, welches in Analogie zum Hydroxybenzoesäureethylester in Gegenwart von Imidazol synthetisiert wird, durch Umsetzung mit dem Grignard-Reagenz des Bromahisols zum 4-tert.-Butoxydiphenylsilyloxytriphenylcarbinol (S2) zugänglich.

Abbildung 8B zeigt ein Syntheseschema für S4/5, R = H oder Orme.

Die Darstellung der Di-Silyloxy-Tritylcarbinolderivate (S4, 5) erfolgt durch Umsetzung eines geschützten 4,4'-Dihydroxybenzophenons, welches entweder mit Brombenzol (R = H) oder mit Bromanisol (R = OMe) reagiert.

Abbildung 9 zeigt die Synthese der S6-Schutzgruppe.

Die Tri-Silyloxy-Tritylcarbinolvariante (S6) wird entweder durch die Umsetzung von 4'-Silyloxy-Brombenzol mit 4'-Silylbenzoesäureethylester oder durch Umsetzung von 4, 4'-Disilyloxybenzophenon und 4'-Silyloxybrombenzot hergestellt.

Die Abspaltung der tert.-Butoxydiphenylsilylgruppe aus den Silyl- geschützten Verbindungen kannn durch einstündige Reaktion mit TBAF ; Reaktionsabbruch durch Zugabe von Pyridin/Methanol/Wasser und Pyridinium-DOWEX erfolgen. Die Derivate können meist direkt mit Nppoc-CI umgesetzt werden.

Bei der anschließenden Halogenierung der Carbinole zeigen sich unterschiedliche Eigenschaften, die durch die Variation der elektronenziehenden-bzw. elektronenschiebenden Substituenten in para-Stellung hervorgerufen werden.

Der Austausch des Alkohols durch ein Halogenid erfolgt nach dem Mechanismus der nukleophilen Substitution 1. Ordnung. Daraus ergibt sich, dass alle Prozesse über ein trigonalplanares Carbeniumion verlaufen.

Entscheidend für diesen Mechanismus ist die Stabilität des Kations, dessen Struktur und die Möglichkeit zur Delokalisation der 7T-Elektronen. Zusätzlich wird es durch elektronenschiebende Substituenten stabilisiert und durch elektronenziehende Substituenten destabilisiert. In diesem Fall geht die Stabilität des Kations direkt mit der Säurebeständigkeit der Schutzgruppe einher. Je stabiler das Kation, desto säurelabiler sind die korrespondierenden Schutzgruppen.

In der Literatur sind eine Reihe von Standardverfahren beschrieben, die zur Halogenierung von Triphenylcarbinolderivaten herangezogen werden.

Erfahrungen mit pyrensubstituierten Dimethoxytritylcarbinolen zeigen, dass sich extrem elektronenreiche Verbindungen innerhalb von Minuten mit Acetylchlorid in Cyclohexan quantitativ chlorieren lassen. Für ausgewählte Schutzgruppen mit elektronenziehenden Para-Substituenten zeigt es sich, dass mit refluxierendem SOC'2 gute Umsätze erzielt werden.

Abbildung 10 zeigt die Herstellung von geschützten Thymidinderivaten.

Für Verbindungen mit mehreren Nppoc-Gruppen werden geringere Ausbeuten erhalten. Unter Verwendung von refluxierendem Acetylbromid bzw. SOBr2 ist es gelungen, die Halogenderivate in Anwesenheit mehrerer Nppoc-Substituenten im analytischen Maßstab darzustellen und ohne weitere Aufarbeitung mit Thymidin umzusetzen.

Abbildung 11 zeigt ein weiteres Verfahren zur Synthese von Nukleotiden, die eine zweistufige Schutzgruppe tragen.

Abbildung 12 und Abbildung 13 zeigen Verfahren zur Herstellung von Nukleotiden, die eine zweistufige Schutzgruppe tragen, ausgehend von Rosolsäure.

Ausgehend von der Rosolsäure gelangt man zu dem Tri-Nppoc-Trityl- Thymidin in einer Eintopfreaktion. Bei diesem Ansatz kann auf die Verwendung teurer Schutzgruppen verzichtet werden. Als Modellverbindung für diesen Reaktionstyp diente das Tri-Pivaloyl- Tritylderivat.

Die Reaktion läuft in einem polar aprotischen Lösungsmittel bei 50 °C innerhalb von Minuten über eine Zwischenstufe, die dann mit den entsprechenden Nukleosiden zu den tandemgeschützten Derivaten weiterreagiert. Die Darstellung erfolgt im präparativen Maßstab.

Beispiele Beispiel 1 : Synthese von Tandemschutzgruppen 1. 1 4-(tert. Butoxydiphenylsilyloxy)-triphenylcarbinol (S1) In einem ausgeheizten Kolben wurden 0,61 g (25,00 mmol, 2,1 eq) Magnesium mit 20 ml THF unter Argon suspendiert. 6,28 g (40,00 mmol, 3,4 eq) Brombenzol wurden mit einem Tropftrichter langsam unter konstantem Sieden zugetropft. Nach Beendigung der Zugabe wurde mit einem Ölbad auf 85 ° C erhitzt und 15 min lang nachgerührt. Das entstandene Magnesiumbromid wurde auf 70 *C abkühlen gelassen und 5,00 g (11, 89 mmol, 1 eq) 4-tert. Butoxydiphenylsilyloxybenzoe- säureethylester gelöst in 20 ml THF zugetropft und für weitere 1,5 h bei

85 ° C erwärmt. Anschließend wurde der Ansatz erkalten gelassen und mit gesättigter Amoniumchlorid-Lösung abgebrochen. Zum Extrahieren wurden 500 ml Ethylacetat zugegeben und 2x mit Amoniumchlorid-Lösung (sat.) und 1x mit Natriumchlorid-Lösung (sat.) extrahiert. Die organische Phase wurde mit Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch an Kieseigel 40-63/im mit dem Eluent Ethylacetat/n-Hexan + 1 % TEA (1 : 7) gereinigt. Man erhält das 4- (tert.

Butoxydiphenylsilyloxy)-triphenylcarbinol als weißen pulvrigen Feststoff.

Ausbeute : 5,75 g # 91 % d. Th.

Rf Wert IEthylacetat/n-Hexan1 7 +1% TEA) 0, 1 9 1. 2 4, 4'-Dimethoxy-4''-(tert.butoxydiphenylsilyloxy)-triphenylcarb inol (S3) In einem ausgeheizten Ko ! ben wurden 2,78 g (114,14 mmol, 2,4 eq) Magnesium mit 80 ml THF unter Argon suspendiert. 26,68 g (142,67 mmol, 3,0 eq) Bromanisol wurden mit einem Tropftrichter langsam unter konstantem Sieden zugetropft. Nach Beendigung der Zugabe wurde mit einem Ölbad auf 85 °C erhitzt und 15 min lang nachgerührt. Das entstandene Magnesiumbromid wurde auf 70 C abkühlen gelassen und 20,00 g (47,56 mmol, 1 eq) 4-tert. Butoxydiphenylsilyloxybenzoe- säureethylester gelöst in 100 mi THF zugetropft und für weitere 2 h bei 85 °C erwärmt. Anschließend wurde der Ansatz erkalten gelassen und mit gesättigter Amoniumchlorid-Lösung abgebrochen. Zum Extrahieren wurden 500 ml Ethylacetat zugegeben und 2x mit Amoniumchlorid-Lösung (sat.) und 1x mit Natriumchlorid-Lösung (sat.) extrahiert. Die organische Phase wurde mit Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch nach dem Stufengradientenverfahren an Kieselgel 40-63, um mit dem Eluent Ethylacetat/n-Hexan + 1 % TEA (1 : 5

und 1 : 3) gereinigt Man erhält das 4, 4'-Dimethoxy-4''- (tert. butoxy- diphenylsilyloxy)-triphenylcarbinol als weißen pulvrigen Feststoff.

Ausbeute : 25,65 g = 97 % d. Th.

Rf-Wert (Ethylacetat/n-Hexan 1 : 3 +1 1 % TEA) 1.3 4-Methoxy-4'-(tert. butoxydiphenylsilyloxy)-triphenylcarbinol (S2) In einem ausgeheizten Kolben wurden 0,64 g (26,51 mmol, 1,2 eq) Magnesium mit 20 mi THF unter Argon suspendiert. 6,20 g (33,14 mmol, 1,5 eq) Bromanisol wurde mit einem Tropftrichter langsam unter konstantem Sieden zugetropft. Nach Beendigung der Zugabe wurde mit einem Ölbad auf 85 ° C erhitzt und 15 min lang nachgerührt. Das entstandene Magnesiumbromid wurde auf 70'C abkühlen gelassen und 10,00 g (22,09 mmol, 1 eq) 4-tert. Butoxydiphenylsilyloxybenzophenon gelöst in 50 mi THF zugetropft und für weitere 2 h bei 70 °C erwärmt.

Anschließend wurde der Ansatz erkalten gelassen und mit gesättigter Amoniumchlorid-Lösung abgebrochen. Zum Extrahieren wurden 250 ml Ethylacetat zugegeben und 2x mit Amoniumchlorid-Lösung (sat.) und 1x mit Natriumchlorid-Lösung (sat.) extrahiert. Die organische Phase wurde mit Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Auf eine Aufarbeitung wurde verzichtet. Man erhält das 4-Methoxy-4'-(tert. Butoxydiphenyl- silyloxy)-triphenylcarbinol.

Ausbeute : quantitative Umsetzung Rf-Wert (Ethylacetat/n-Hexan 1 : 3 +1 % TEAI 1.4 4, 4'-Di- (tert. butoxydiphenylsilyloxy)-triphenylcarbinol (S4) In einem ausgeheizten Kolben wurden 0,20 g (8, 28 mmol, 1,2 eq) Magnesium mit 20 ml THF unter Argon suspendiert. 1,63 g (10,35 mmol, 1,5 eq) Brombenzol wurde mit einem Tropftrichter langsam unter

konstantem Sieden zugetropft. Nach Beendigung der Zugabe wurde mit einem Ölbad auf 85 C erhitzt und 15 min lang nachgerührt. Das entstandene Magnesiumbromid wurde auf 70 C abkühlen gelassen und 5, 00 g (6, 90 mmol, 1 eq) 4, 4'-di-tert. Butoxydiphenylsilyloxybenzophenon gelöst in 50 ml THF zugetropft und für weitere 2 h bei 70 °C erwärmt.

Anschließend wurde der Ansatz erkalten gelassen und mit gesättigter Amoniumchlorid-Lösung abgebrochen. Zum Extrahieren wurden 250 ml Ethylacetat zugegeben und 2x mit Amoniumchlorid-Lösung (sat.) und 1x mit Natriumchlorid-Lösung (sat.) extrahiert. Die organische Phase wurde mit Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch an Kieselgel 40-63 µm mit dem Eluent Ethylacetat/n-Hexan + 1 % TEA (1 : 7) gereinigt. Man erhält das 4, 4-Di- (tert. butoxydiphenylsilyloxy)-triphenylcarbinol als weißen pulvrigen Feststoff.

Ausbeute : 3,00 g = 54 % d. Th.

Rf Wert (Ethylacetat/n-Hexan 1 7 +1% TEA) 0, 27.

1.5 4, 4'-Di- (tert. butoxydiphenytsilyloxy)-4"-methoxy-triphenylcarbinol (S5) In einem ausgeheizten Kolben wurden 0,20 g (8,28 mmol, 1,2 eq) Magnesium mit 20 ml THF unter Argon suspendiert. 1,94 g (10,35 mmol, 1,5 eq) Bromanisol wurde mit einem Tropftrichter langsam unter konstantem Sieden zugetropft. Nach Beendigung der Zugabe wurde mit einem Ölbad auf 85 C erhitzt und 15 min lang nachgerührt. Das entstandene Magnesiumbromid wurde auf 70 C abkühlen gelassen und 5, 00 g (6,90 mmol, 1 eq) 4, 4'-Di-tert. butoxydiphenylsilyloxybenzophenon gelöst in 50 mi THF zugetropft und für weitere 2 h bei 70 °C erwärmt.

Anschließend wurde der Ansatz erkalten gelassen und mit gesättigter Amoniumchlorid-Lösung abgebrochen. Zum Extrahieren wurden 250 mi Ethylacetat zugegeben und 2x mit Amoniumchlorid-Lösung (sat.) und 1x mit Natriumchlorid-Lösung (sat.) extrahiert. Die organische Phase wurde

mit Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch an Kieselgel 40-63, um mit dem Eluent Ethylacetat/n-Hexan+1 % TEA (1 : 5) gereinigt. Man erhält das 4, 4'-Di- (tert. butoxydiphenylsilyloxy)-4"-methoxy-triphenylcarbinol als weißen pulvrigen Feststoff.

Ausbeute : 3,00 g # 52 % d. Th.

Rf-Wert (Ethylacetat / n-Hexan 1: 5 +1 % TEA) 026 1.6 4, 4', 4''-Tr- (tert. butoxydiphenylsilyloxy)-triphenylcarbinol (S6) In einem ausgeheizten Kolben wurden 0,41 g (16,87 mmol, 1,2 eq) Magnesium mit 20 ml THF unter Argon suspendiert. 18,90 g (20, 86 mmol, 1,5 eq) 4-tert. Butoxydiphenylsilyloxybrombenzol wurde mit einem Tropftrichter langsam unter konstantem Sieden zugetropft. Nach Beendigung der Zugabe wurde mit einem Ölbad auf 85 C erhitzt und 15 Minuten lang nachgerührt. Das entstandene Magnesiumbromid wurde auf 70 °C abkühlen gelassen und 1 eq 10,10 g (13,97 mmol) 4, 4'-di-tert.

Butoxydiphenylsilyloxybenzophenon gelöst in 50 ml THF zugetropft und für weitere 2 h bei 70 °C erwärmt. Anschließend wurde der Ansatz erkalten gelassen und mit gesättigter Amoniumchlorid-Lösung abgebrochen. Zum Extrahieren wurden 250 ml Ethylacetat zugegeben und 2x mit Amoniumchlorid-Lösung (sat.) und 1 x mit Natriumchlorid-Lösung (sat.) extrahiert. Die organische Phase wurde mit Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch an Kieselgel 40-63, um mit dem Eluent Ethylacetat/n-Hexan + 1 % TEA (1 : 10) gereinigt.

Man erhältdas 4,4',4''-Tri-(tert.Butoxydiphenylsilyloxy)-triphenylcarbinol als weißen pulvrigen Feststoff.

Ausbeute : 10,20 g = 68 % d. Th.

Rf Wert (Ethylacetat/n-Hexan 1 10 +1 % TEA) 0, 23

1. 7 4- (2- [2-Nitrophenyl]-propyloxycarbonyloxy)-triphenytcarbinol Zu 2,87 g (5,41 mmol, 1 eq) 4-tert. Butoxydiphenylsilyloxytriphenylcarbinol gelöst in 20 ml THF wurden 6,00 ml (6,00 mmol, 1,1 eq) einer 1M-TBAF- Lösung getropft und 1 h bei Raumtemperatur (RT) gerührt. Um die Reaktion abzubrechen wurden 5 ml Pyridin/MeOH/Wasser (3 : 1 : 1) und Pyridinium- Dowex zugegeben. Nach 30 min wurde abfiltriert und mit Pyridin gespült.

Anschließend wurde die Lösung mehrmals mit Pyridin coevaporiert. Zu dem in 60 mi Pyridin/Methylenchlorid (2 : 1) gelösten Ansatz wurden 1,97 g (8, 12 mmol, 1,5 eq) Nppoc-CI gelöst in 10 ml Methylenchlorid getropft und 16 h bei RT gerührt. Danach wurde eingeengt und in Methylenchlorid aufgenommen, 2x mit Natriumhydrogencarbonat-Lösung (1N) und 1x mit Natriumchlorid-Lösung (sat.) extrahiert. Die organische Phase wurde getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch an Kieselgel 40-63 um mit dem Eluent Ethylacetat/n-Hexan + 1 % TEA (1 : 2) gereinigt. Man erhält das 4-Nppoc-triphenylcarbinol als weißen festen Schaum.

Ausbeute : 2,16 g == 83 % d. Th.

Rf-Wert (Ethylacetat / n-Hexan 1:1 +1 % TEA): 0,68 1.8 4-Methoxy-4'- (2- [2-nitrophenyl]-propyloxycarbonyloxy)-triphenyl- carbinol (S2) Zu 8,00 g (14,27 mmol, 1 eq,) 4-Methoxy-4'-tert. Butoxydiphenylsilyl- oxytriphenylcarbinol gelöst in 50 ml THF wurden 15,70 ml (15,70 mmol, 1,1 eq) 1M-TBAF-Lösung getropft und für 1 h bei RT gerührt. Um die Reaktion abzubrechen wurden 20 ml Pyridin/MeOH/Wasser (3 : 1 : 1) und Pyridinium-Dowex zugegeben. Nach 30 min wurde abfiltriert und mit Pyridin gespült. Anschließend wurde die Lösung mehrmals mit Pyridin coevaporiert. Zu dem in 60 ml Pyridin/Methylenchlorid (2 : 1) gelösten Ansatz wurden 6,50 g (26,75 mmol, 1,9 eq) Nppoc-CI gelöst in 15 mi Methylenchlorid getropft und 16 h bei RT gerührt. Danach wurde eingeengt

und in Methylenchlorid gelöst und 2x mit Natriumhydrogencarbonat- Lösung (1N) und 1 x mit Natriumchlorid-Lösung (sat.) extrahiert. Die organische Phase wurde getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch nach den Stufengarientverfahren an Kieselgel 40-63 µm mit dem Eluent Ethylacetat/n-Hexan+1 % TEA (1 : 3 und 1 : 2) gereinigt. Man erhält das 4-Methoxy-4'-Nppoc-triphenylcarbinol als weißen festen Schaum.

Ausbeute : 5,5 g = 75 % d. Th.

Rf-Wert IEthylacetat/n-Hexan1 : 1 +1 % TEA) 13C-NMR: (125.75 MHz, CDCl3, TMS) : d=17. 70 (CH3-nppoc), 33.19 (CH-nppoc), 55.16 (CH3-0), 72.09 (CH2-nppoc), 81.31 (C-trityl), 113.23 (C-3, 5-methoxyphenyl (trityl)), 120.04 (C-3, 5-nppocphenyl (trityl)), 124.36 (C-3-phenyl-nppoc), 126.83 (C-4-phenyl(trityl)), 127.71 (C-2,6- phenyl (trityl)), 127.91 (C-6-phenyl-nppoc), 128. 28 (C-4-phenyl-nppoc), 129.03 (C-3, 5-phenyl (trityl)), 129.11 (C-2, 6-nppocphenyl (trityl)), 129.35 (C-2, 6-methoxyphenyl (trityl)), 132.76 (C-5-phenyl-nppoc), 136.63 (C-1- phenyl-nppoc), 138.88 (C-1-methoxyphenyl(trityl)), 144. 87 (C-1- nppocphenyl(trityl)), 146.75 (C-1-phenyl (trityl)), 149.93 (C-2-phenyl- nppoc), 150.18 (O (CO) O), 153.35 (C-4-nppocphenyl (trityl)), 158.71 ppm (C-4-methoxyphenyl (trityl)).

1.9 4, 4'-Dimethoxy-4"- (2- [2-nitrophenyl]-propyloxycarbonyloxy)-tri- phenylcarbinol (S3) Zu 4,00 g (7,23 mmol, 1 eq) 4, 4'-Dimethoxy-4''-tert. Butoxydiphenylsilyl- oxytriphenylcarbinol gelöst in 20 ml THF wurden 8,00 ml (8,00 mmol, 1,1 eq) 1 M-TBAF-Lösung getropft und 1 h bei RT nachgerührt. Um die Reaktion abzubrechen wurden 10 ml Pyridin/MeOH/Wasser (3 : 1 : 1) und Pyridinium-Dowex zugegeben. Nach 30 min wurde abfiltriert mit Pyridin gespült und eingeengt. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch nach dem Stufengradientverfahren über Kieselgel 40-63 um, Eluent

Ethylacetat/n-Hexan + 1 % TEA (1 : 3 und 1 : 1), gereinigt. Zu 0,40 g (1, 25 mmol) des gewonnenen 4, 4'-Dimethoxy-4''-hydroxytriphenylcarbinols, gelöst in 30 ml Pyridin/Methylenchlorid (2 : 1), wurden 0,40 g (1,70 mmol, 1,4 eq) Nppoc-CI, gelöst in 5 ml Methylenchlorid, zugetropft. Der Ansatz wurde 16 h bei RT gerührt. Danach wurde eingeengt, in Methylenchlorid gelöst und 2x mit Natriumhydrogencarbonat-Lösung (1 N) und 1 x mit Natriumchlorid-Lösung (sat.) extrahiert. Die organische Phase wurde getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch an Kieselgel 40-63 um mit dem Eluent Ethylacetat/n-Hexan + 1 % TEA (1 : 3) gereinigt. Man erhält das 4, 4'-Dimethoxy-4''-Nppoc-triphenylcarbinol als weißen festen Schaum.

Ausbeute : 0, 57 g = 86 % d. Th.

RfWert IEthylacetat/n-Hexan1 : 1 +1 % TEA) 1.10 4, 4'-Di-(Z-[2-nitrophenyl]-propyloxywarbonyloxy)-triphenylcarb inol (S4) Zu 2,00 g (2,40 mmol, 1 eq) 4,4'-Di-tert. Butoxydiphenylsilyloxy- triphenylcarbinol, gelöst in 30 ml THF, wurden 5,28 ml (5,28 mmol, 2,2 eq) 1 M-TBAF-Lösung zugetropft und 1 h bei RT gerührt. Um die Reaktion abzubrechen wurden 20 ml Pyridin/MeOH/Wasser (3 : 1 : 1) und Pyridinium-Dowex zugegeben. Nach 30 min wurde abfiltriert und mit Pyridin gespült. Anschließend wurde die Lösung mehrmals mit Pyridin coevaporiert. Zu dem in 60 ml Pyridin/Methylenchlorid (2 : 1) gelösten Ansatz wurde 2,19 g (9,00 mmol, 3,7 eq) Nppoc-CI, gelöst in 10 ml Methylenchlorid, zugetropft und 16 h bei RT gerührt. Danach wurde eingeengt, in Methylenchlorid gelöst und 2x mit Natriumhydrogencarbonat- Lösung (1 N) und 1 x mit Natriumchlorid-Lösung (sat.) extrahiert. Die organische Phase wurde getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch an Kieselgel 40-63, um mit dem Eluent

Ethylacetat/n-Hexan + 1 % TEA (1 : 1) gereinigt. Man erhält das 4, 4'-Di-Nppoc-triphenylcarbinol als weißen festen Schaum.

Ausbeute : 0, 75g # 40, 9 % d. Th.

Rf-Wert (Ethylacetat / n-Hexan 1:1 + 1 % TEA) : (), 55 1. 11 4-Methoxy-4', 4"-di- (2- [2-nitrophenyl]-propyloxycarbonyloxy)-tri- phenylcarbinol (S5) Zu 7,85 g (9,44 mmol, 1 eq) 4-Methoxy-4', 4''-di-tert. butoxydiphenyl- silyloxytriphenylcarbinol, gelöst in 50 ml THF, wurden 20, 77 ml (20,77 mmol, 2,2 eq) 1 M-TBAF-Lösung zugetropft und 1 h bei RT gerührt. Um die Reaktion abzubrechen wurden 20 ml Pyridin/MeOH/Wasser (3 : 1 : 1) und Pyridinium-Dowex zugegeben. Nach 30 min wurde abfiltriert und mit Pyridin gespült. Anschließend wurde die Lösung mehrmals mit Pyridin coevaporiert. Zu dem in 60 ml Pyridin/Methylenchlorid (2 : 1) gelösten Ansatz wurden 6,10 g (25,03 mmol 2,6 eq) Nppoc-CI, gelöst in 10 ml Methylenchlorid, zugetropft und 16 h bei RT gerührt. Danach wurde eingeengt, in Methylenchlorid gelöst und 2x mit Natriumhydrogencarbonat- Lösung (1 N) und 1 x mit Natriumchlorid-Lösung (sat.) extrahiert. Die organische Phase wurde getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch nach dem Stufengradientenverfahren an Kieselgel 40-63, um mit dem Eluent Ethylacetat/n-Hexan+ 1 % TEA (1 : 2, 2 : 3 bis 1 : 1) gereinigt. Man erhält das 4-Methoxy-4', 4''-di-Nppoc- triphenylcarbinol als weißen festen Schaum.

Ausbeute : 3,0 g = 43 % d. Th.

Rf-Wert (Ethylacetat/n-Hexan1 : 1 +1 % TEA}

1.12 4,4', 4"-Tri- (2- [2-nitrophenyl]-propyloxycarbonyloxy)-triphenyl- carbinol (S6) Zu 10,20 g (9,53 mmol, 1 eq) 4,4', 4''-Tri-tert. Butoxydiphenylsilyloxy- triphenylcarbinol, gelöst in 200 m) THF, wurden 31, 45 m ! (31,45 mmol, 3,3 eq) 1M-TBAF-Lösung zugetropft und 1 h bei RT gerührt. Um die Reaktion abzubrechen wurden 20 ml Pyridin/MeOH/Wasser (3 : 1 : 1) und Pyridinium-Dowex zugegeben. Nach 30 min wurde abfiltriert und mit Pyridin gespült. Anschließend wurde die Lösung mehrmals mit Pyridin coevaporiert. Zu dem in 120 mi Pyridin/Methylenchlorid (2 : 1) gelösten Ansatz wurde 9,29 g (38,12 mmol, 4,0 eq) Nppoc-CI, gelöst in 20 mi Methylenchlorid, zugetropft und 16 h bei RT gerührt. Danach wurde eingeengt, in Methylenchlorid gelöst und 2x mit Natriumhydrogencarbonat- Lösung (1N) und 1 x mit Natriumchlorid-Lösung (sat.) extrahiert. Die organische Phase wurde getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch nach dem Stufengradientenverfahren an Kieselgel 40-63 um mit dem Eluent Ethylacetat/n-Hexan+1 % TEA (1 : 2, bis 1 : 1) gereinigt. Man erhält das 4,4', 4''-Tri-Nppoc-triphenylcarbinol als weißen festen Schaum.

Ausbeute : 3,9 g = 44 % d. Th.

Rf-Wert (Ethylacetat/n-Hexan1 : 1 +1 % TEA) 04 3C-NMR : (125.75 MHz, CDCI3, TMS) : #=17. 68 (CH3-nppoc), 33.17 (CH-nppoc), 72.14 (CH2-nppoc), 80.89 (C-trityl), 120.31 (C-3, 3', 3'', 5, 5', 5''-trityl), 124.35 (C-3-phenyl-nppoc), 127. 83 (C-6-phenyl- nppoc), 128.27 (C-4-phenyl-nppoc), 128.99 (C-2,2', 2'', 6, 6', 6''-trityl), 132. 77 (C-5-phenyl-nppoc), 136.62 (C-1-phenyl-nppoc), 144.09 (C-1, 1', 1''-trityl), 150.14 (O (CO) O), 150.17 (C-2-phenyl-nppoc), 153.36 ppm (C-4, 4',4''-trityl).

MS (TOF, ES+) : 952,29 [M+Na], 968,25 [M+K].

MS (TOF, ES-) : 928,42 [M-H], 694,37 [M-CI].

C49H43N3O16:929, 90

1.13 Halogenierung und Veretherung zu den 5'-O-Nppoc-triphenyl- methyl-Thymidin Derivaten 1 eq des Triphenylcarbinol-Derivates wurden mit 100 eq Thionylchlorid für 3 h bei 90 0 C erhitzt. Anschließend wurde Methylenchlorid zugegeben und weitere 2 h erhitzt. Danach wurde mit Cyclohexan 3x eingeengt. Das entstandene Triphenylmethylchlorid-Derivat wurde in Methylenchlorid gelöst und unter Schutzgas 2 eq Thymidin, gelöst in Pyridin und Methylenchlorid, zugetropft. Nach 16 h Rühren bei RT wurde die Reaktion durch Zugabe von Ethanol abgebrochen. Danach wurde eingeengt, in Methylenchlorid gelöst und 2x mit Natriumhydrogencarbonat-Lösung (1 N) und 1x mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung extrahiert. Die organische Phase wurde getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch gereinigt an Kieselgel 40-63, um. Laufmittel und Ausbeuten sind der folgenden Tabelle 1 zu entnehmen : Tabelle 1 :

Substanz Kochzeit Rf-Wert : Eluent Ausbeute SOC12 + 1 % TEA 5'-0- (4-Nppoc-trityl)- 2+3 h (CHzC + 5 % 95 % thymidin MeOH) 0,26 5'-O-(4-Methoxy-4'- 3 + 2 h (EE/Hex 2:1) 50 % Nppoc-trityl)-thymidin 0, 18 5'-0- (4, 4'-Dimethoxy- 2 + 3 h (CH2Cl2 + 5 % 83 % | 4"Nppoc-trity) l-thymidin MeOH) 0,30 5'-0- (4, 4'-DiNppoc-trity) l- 4 1 h (EE/Hex 3 : 1) 26 % thymidin 0,34 5'-O-(4-Methoxy-4',4''- 4 + 1 h (EE/Hex 2 : 1) 44 % diNppoc-trityl)-thymidin 0,21 5'-O-(4,4'4''-TriNppoc- 4 + 1 h (EE/Hex 3:1) 13 % trityl)l-thymidin 0,25

Man erhält das 5'-Triphenylmethyl-Thymidin Derivate als weißen festen Schaum in Ausbeuten zwischen 13-95 % d. Th.

NMR-Daten zu 5'-0-(4-Methoxy-4'-(2-[2-nitrophenyl]-propyloxyCarbonyl- oxy)-trityl)-thymidin 13C-NMR: (125. 75 MHz, CDCl3, TMS) : #=11. 78 (5-CH3), 17.60 (CH3- nppoc), 33.10 (CH-nppoc), 40.72 (C-2'), 55.15 (0-CH3), 63.67 (C-5'), 70.95 (C-3'), 72.11 (CH2-nppoc), 84. 65 (C-4'), 85.03 (C-1'), 86. 64 (C-trityl), 111.20 (C-5), 113.25 (C-3, 5-methoxyphenyl (trityl)), 120.35 (C-3, 5-nppocphenyl (trityl)), 124.27 (C-3-phenyl-nppoc), 127.27 (C-4-phenyl (trityl)), 127.69 (C-6-phenyl-nppoc), 127.79 (C-2, 6-phenyl (trityl)), 128. 19 (C-4-phenyl-nppoc), 128.98 (C-4-phenyl-nppoc), 129. 07 (C-2, 6-nppocphenyl (trityl)), 134.35 (C-1-methoxyphenyl (trityl)), 135.54 (C-6), 136.52 (C-1-phenyl-nppoc), 141 60 (C-1-nppocphenyl (trityl)), 144.91 (C-1-phenyl (trityl)), 149.80 (C-2-phenyl-nppoc), 150.08 (0 (CO) O), 150.61 (C-2), 153.31 (C-4-nppocphenyl (trityl)), 158.74 (C-4- methoxyphenyl (trityl)), 164.17 ppm (C-4).

1. 14 4-Methoxy-4'- (2- [2-nitrophenyl]-propyloxycarbonyloxy)-triphenyl- carbinol (S2) Zur schutzgruppenfreie Synthese wurden in einem ausgeheizten Kolben 0,50 g (20,60 mmol, 1,2 eq) Magnesium mit 20 ml THF unter Argon suspendiert. 3,2 ml (25,70 mmol, 1,5 eq) Bromanisol wurden mit einem Tropftrichter langsam unter konstantem Sieden zugetropft. Nach Beendigung der Zugabe wurde mit einem Ölbad auf 85 °C erhitzt und 15 Minuten lang gerührt. Das entstandene Magnesiumbromid wurde auf 70 ° C abkühlen gelassen und 3, 40 g (17, 17 mmol, 1 eq) 4-Hydroxybenzophenon, gelöst in 50 ml THF, zugetropft und für weitere 2 h bei 70 °C gerührt. Anschließend wurde der Ansatz erkalten gelassen und mit gesättigter

Amoniumchlorid-Lösung die Reaktion abgebrochen. Zum Extrahieren wurden 250 ml Ethylacetat zugegeben und 2x mit Amoniumchlorid-Lösung (sat.) und 1x mit Natriumchlorid-Lösung (sat.) extrahiert. Die organische Phase wurde mit Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Auf eine Aufarbeitung wurde verzichtet und mit Pyridin mehrfach coevaporiert.

Zu dem in 40 ml Pyridin/Methylenchlorid (1 : 1) gelösten Ansatz wurden 11, 00 g (45,00 mmol) Nppoc-CI gelöst, in 15ml Methylenchlorid, zugetropft und 16 h bei RT gerührt. Danach wurde eingeengt, in Methylenchlorid gelöst, 2x mit Natriumhydrogencarbonat-Lösung (1 N) und 1 x mit Natriumchlorid-Lösung (sat.) extrahiert. Die organische Phase wurde getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch nach dem Stufengradientenverfahren an Kieselgel 40-63, um, Eluent Ethylacetat/n-Hexan + 1 % TEA (1 : 3 und 1 : 2), gereinigt.

Man erhält das 4-Methoxy-4'-Nppoc-triphenylcarbinol als weißen festen Schaum.

Ausbeute : 3,7 g = 42 % d. Th.

Rf Wert (Ethylacetat/n-Hexan 1 : 1 +1 % TEA) : 0,54 1.15 5'-0-(4, 4', 4''-Tri-pivaloyl-triphenylmethyl)-Thymidin aus Rosolsäure Zu 5 g (17,22 mmol) p-Rosolsäure, gelöst in 75 ml Pyridin und 2,5 ml 2,6-Lutidin, wurden 10 ml (9, 8 mmol, 4,7 eq) Pivaloylsäurechlorid zugetropft. Anschließend wurde bei 70 C für 80 min gerührt. Beim Erkalten lassen bildeten sich Kristalle, die isoliert und mit Pyridin gespült wurden. 1 g (1,73 mmol) der Kristalle wurden in 25 ml Methylenchlorid gelöst, unter DMAP-Katalyse (20 mg, 0,17 mmol), mit 20 ml 2,6-Lutidin und 220 mg (0,86 mmol) Thymidin umgesetzt. Danach wurde eingeengt, in Methylenchlorid gelöst und 2x mit Natriumhydrogencarbonat-Lösung (1N) und 1x mit Natriumchlorid-Lösung (sat.) extrahiert. Die organische

Phase wurde getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde <BR> <BR> <BR> säulenchromatographisch nach dem Stufengradientenverfahren an Kieselgel 40-63, um, Eluent Ethylacetat/n-Hexan + 1 % TEA (1 : 3,1 : 2), gereinigt.

Man erhält das 5'-0- (4, 4', 4''-Tri-pivaloyl-triphenylmethyl)-Thymidin als weißen festen Schaum.

Ausbeute : 0,18 g = 13,15 % d. Th.

13C-NMR : (125.75 MHz, CDCl3, TMS) : d=12. 11 (5-CH3), 27.02 (CH3- piv), 38.93 (C-piv), 41.02 (C-2'), 63.92 (C-5'), 70.33 (C-3'), 84.53 (C-4'), 85.92 (C-1'), 86.20 (C-trityl), 110.82 (C-5), 120. 97 (C-3,3', 3'', 5, 5', 5''-trityl), 129.59 (C-2, 2', 2", 6,6', 6''-trityl), 135.09 (C-6), 140.47 (C-1, 1',1''-trityl), 151.00 (C-2), 154.21 (C-4, 4', 4''-trityl), 164.10 (C-4), 176.78 ppm (C = O-piv).

1. 16 5'-0- (4, 4', 4''-Tri- (2- [2-nitrophenyl]-propyloxycarbonyloxy)-tri- phenylmethyl)-deoxythymidin aus Rosolsäure 10 g (34,44 mmol) p-Rosolsäure, gelöst in 120 ml Pyridin und 30 ml 2,6-Lutidin, wurde auf 50 °C erwärmt und 44 g (178,28 mmol) Nppoc-CI zugetropft. Nach 16 h Reaktionszeit bei 50 C wurde überschüssiges Chlorid durch Zugabe von t-Buthanol gequencht. Die Umsetzung wurde mittels DC überprüft (Rf-Wert (Ethylacetat / n-Hexan 1:1 +1 % TEA): 0,35). Nach weiteren 30 min Reaktionszeit wurden bei einer Temperatur von 45 °C 8,2 g Thymidin und 750 mg DMAP zugegeben. Nach 16 h Rühren wurde eingeengt, in Methytenchtorid getost, 2x mit Natriumhydrogencarbonat- Lösung (1 N) und 1 x mit Natriumchlorid-Lösung (sat.) extrahiert. Die organische Phase wurde getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch an Kieselgel 40-63, um, Eluent Ethylacetat/n-Hexan +1 % TEA (3 : 1), gereinigt. Man erhält das 5'-0- (4, 4', 4''-Tri-(2-[2-nitrophenyl]-propyloxycarbonyloxy)-triphenyl- methyl)-deoxythymidin als weißen festen Schaum.

Ausbeute : 10 g = 25 % d. Th.

Rf-Wert (Ethylacetat/n-Hexan 3 : 1 + 1 % TEA): 0,25 13C-NMR : (125.75 MHz, CDCl3, TMS) : d=12. 00 (5-CH3), 17.59 (CH3- nppoc), 33.06 (CH-nppoc), 40.50 (C-2'), 63.74 (C-5'), 71.48 (C-3'), 72. 14 (CH2-nppoc), 84.55 (C-4'), 85.52 (C-1'), 86.16 (C-trityl), 111.13 (C-5), 120.58 (C-3,3', 3'', 5, 5', 5''-trityl), 124.26 (C-3-phenyl-nppoc), 127.63 (C-6-phenyl-nppoc), 128.19 (C-4-phenyl-nppoc), 129.58 (C- 2, 2', 2'', 6, 6',6''-trityl), 135.29 (C-6), 136.47 (C-1-phenyl-nppoc), 140.53 (C-1, 1',1''-trityl), 150. 09 (C-2-phenyl-nppoc), 150.34 (O (CO) O), 150.34 (C-2), 153.13 (C-4, 4',4''-trityl), 163. 73 ppm (C-4).

MS (TOF, ES+) : 1175,89 [M+Na], 1191, 83 [M+K].

MS (TOF, ES-) : 1152,87 [M-H].

C59H55N502o : 1154, 12 1. 17 5'-0- (4, 4', 4''-Tri- (2-I2-nitrophenyl]-propyloxycarbonyloxy)-tri- phenylmethyl)-N4-isobutryl-deoxycytidin 2,8 g (9,64 mmol) p-Rosolsäure, gelöst in 20 ml Pyridin und 20 ml 2,6-Lutidin, wurden auf 50 °C erwärmt und 14,0 g (56,72 mmol) Nppoc-CI zugetropft. Nach 30 min wurde überschüssiges Chlorid durch Zugabe von t-Butanol gequencht. Die Umsetzung wurde mittels DC überprüft (Rf-Wert (Methylenchforid/Methanol 5% +1 % TEA) : 0, 36). Nach weiteren 30 min Reaktionszeit bei einer Temperatur von 45 ° C wurden 3,80 g N4-lsobutryl-deoxycytidin und 250 mg DMAP, gelöst in 30ml DMF, zugegeben. Nach 36 h wurde eingeengt, in Methylenchlorid gelöst und 2x mit Natriumhydrogencarbonat- Lösung (1N) und 1x mit Natriumchlorid-Lösung (sat.) extrahiert. Die organische Phase wurde getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch an Kieselgel 40-63, um, Eluent Ethylacetat/n-Hexan +1 % TEA (3 : 1), gereinigt. Man erhält das <BR> <BR> <BR> 5'-0-(4, 4', 4''-Tri-(2-[2-nitrophenyl]-propyloxycarbonyloxy)-triphenyl- methyl)-N4-isobutryl-deoxycytidin als weißen festen Schaum.

Ausbeute : 2,6 g # 16, 8 % d. Th.

Rf-Wert (Ethylcetat / n-Hexan 3:1 + 1 % TEA): 0,25 13C-NMR : (125.75 MHz, CDCl3, TMS) : d=17. 61 (CH3-nppoc), 18.89 (CH3-ibu), 33.10 (CH-nppoc), 36.10 (CH-ibu), 41.69 (C-2'), 63.39 (C-5'), 70.67 (C-3'), 72.10 (CH2-nppoc), 85.90 (C-4'), 86.18 (C-trityl), 87.06 (C-1'), 96.45 (C-5), 120.60 (C-3, 3', 3'', 5, 5', 5''-trityl), 124.27 (C-3- phenyl-nppoc), 127.62 (C-6-phenyi-nppoc), 128.21 (C-4-phenyl-nppoc), 129.55 (C-2, 2', 2'', 6,6', 6''-trityl), 132.72 (C-5-phenyl-nppoc), 136.50 (C-1-phenyl-nppoc), 140.50 (C-1, 1', 1''-trityl), 143.85 (C-6), 150.08 (O (CO) 0), 150.08 (C-2-phenyl-nppoc), 153.15 (C-4, 4', 4''-trityl), 155. 32 (C-2), 162.32 (C-4), 176.91 ppm (C=O-ibu).

MS (TOF, ES+) : 1209,48 [M + H], 1231,48 [M + Na].

MS (TOF, ES.) : 1209,48 [M-H].

C62H60N6H20 : 1209, 20 1.18 5'-0- (4, 4', 4''-Tri- (2- [2-nitrophenyl]-propyloxycarbonyloxy)-triphe- nylmethyl)-N6-pivaloyl-deoxyadenosin 2, 8 g (9,64 mmol) p-Rosolsäure, gelöst in 20 ml Pyridin und 20 ml 2,6-Lutidin, wurden auf 50 °C erwärmt und 14,0 g (56,72 mmol) Nppoc-Cf zugetropft. Nach 30 min wurde überschüssiges Chlorid durch Zugabe von t-Butanol gequencht. Die Umsetzung wurde mittels DC überprüft (Rf-Wert (Methylenchlorid/Methanol5% +1 % TEA) 0,36). Nach weiteren 30 min Reaktionszeit bei einer Temperatur von 45 ° C wurden 5,7 g N6-Pivaloyl-deoxyadenosin und 250 mg DMAP, gelöst in 30 ml DMF, zugegeben. Nach 36 h wurde eingeengt, in Methylenchlorid gelöst und 2x mit Natriumhydrogencarbonat- Lösung (1 N) und 1 x mit Natriumchlorid-Lösung (sat.) extrahiert. Die organische Phase wurde getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch an Kieselgel 40-63, um, Eluent Ethylacetat/n-Hexan +1 % TEA (3 : 1), gereinigt. Man erhält das 5'-O-(4,4',4''-Tri-(2-[2-nitrophenyl]-propyloxycarbonyloxy)- triphenyl- methyl)-N6-pivaloyl-deoxyadenosin als weißen festen Schaum.

Ausbeute : 1,3 g = 6,8 % d. Th.

13C-NMR : (125.75 MHz, CDCl3, TMS) : #=17. 56 (CH3-nppoc), 27.40 (CH3-piv), 33.04 (CH-nppoc), 39.69 (C-2'), 40.32 (C-piv), 63.73 (C-5'), 71.48 (C-3'), 72.35 (CH2-nppoc), 84. 45 (C-4'), 85.82 (C-trityl), 85.90 (C-1'), 120.39 (C-3,3', 3", 5, 5', 5"-trityl), 122.61 (C-5), 124.21 (C-3- phenyl-nppoc), 127.58 (C-6-phenyl-nppoc), 128.17 (C-4-phenyl-nppoc), 129.51 (C-2,2', 2'', 6, 6', 6''-trityl), 132.59 (C-5-phenyl-nppoc), 136. 67 (C-1-phenyl-nppoc), 140.68 (C-1, 1',1''-trityl), 141.32 (C-8), 149.90 (C-4), 149.93 (C-2-phenyl-nppoc), 150.03 (O (CO) O), 151, 02 (C-6), 152.30 (C-2), 153.10 (C-4, 4', 4''-trityl), 175.67 ppm (C=O-piv).

MS (TOF, ES+) : 1247,49 [M + H], 1270,48 [M + Na].

MS (TOF, ES-) : 1245,46 [M-H].

C64H63N8O19: 1247, 25 1.19 5'-0- (4, 4', 4"-Tri- (2- [2-nitrophenyl]-propyloxycarbonyloxy)-triphe- nylmethyl)-N2-isobutryl-deoxyguanosin 4,0 g (13,8 mmol) p-Rosolsäure, gelöst in 50 ml Pyridin und 30 ml 2,6-Lutidin, wurden auf 50 °C erwärmt und 18,0 g (73,9 mmol) Nppoc-Cl zugetropft. Nach 16 h wurde überschüssiges Chlorid durch Zugabe von t-Butanol gequencht. Die Umsetzung wurde mittels DC überprüft (Rf-Wert (Ethylacate / n-Hexan 1:1 + 1 % TEA): 0,36). Nach weiteren 30 min Reaktionszeit bei einer Temperatur von 40 °C wurden 4,60 g N2-Isobutryl-deoxyguanosin und 250 mg DMAP, gelöst in 30 ml DMF, zugegeben. Nach 36 h wurde eingeengt, in Methylenchlorid gelöst und 2x mit Natriumhydrogencarbonat- Lösung (1 N) und 1 x mit Natriumchlorid-Lösung (sat.) extrahiert. Die organische Phase wurde getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch an Kieselgel 40-63, um, Eluent Ethylacetat/n-Hexan +1 % TEA (3 : 1), gereinigt. Man erhält das 5'-0- (4, 4', 4''-Tri-(2-[2-nitrophenyl]-propyloxycarbonyloxy)- triphenylmethyl)-N2-isobutryl-deoxyguanosin als weißen festen Schaum.

(Methylenchlorid/Methanol 5% + 1 % TEA) : 0,22

Ausbeute : 1,3 g = 7,0 % d. Th. t3C-NMR : (125.75 MHz, CDCl3, TMS) : d=17. 63 (CH3-nppoc), 18.83 (CH3-ibu), 33.12 (CH-nppoc), 35.90 (CH-ibu), 39.89 (C-2'), 64.19 (C-5'), 70.97 (C-3'), 72.10 (CH2-nppoc), 83.90 (C-4'), 85.66 (C-trityl), 85.82 (C-1'), 120.31 (C-5), 120.34 (C-3, 3', 3'', 5, 5'', 5-trityl), 124. 21 (C-3- phenyl-nppoc), 127.61 (C-6-phenyl-nppoc), 128. 25 (C-4-phenyl-nppoc), 129.57 (C-2, 2', 2'', 6,6',6''-trityl), 132.78 (C-5-phenyl-nppoc), 136.47 (C-1-phenyl-nppoc), 137.74 (C-8), 140.82 (C-1,1',1''-trityl), 147.91 (C-4), 148.37 (C-2), 149.92 (C-2-phenyl-nppoc), 150. 04. (O (CO) O), 153.19 (C-4, 4', 4''-trityl), 155.94 (C-6), 179.84 ppm (C=O-ibu).

C63H60N8020 1249, 22 1.20 5'-O-(4,4',4''-Tri-(2-[2-nitrophenyl]-propyloxycarbonyloxy)- triphe- nylmethyl)-N6-pivaloyl-deoxyadenosin-ß-cyanoethyl-N,N-diiso pro- pylaminophosphoamidit 1, 0 g (0, 80 mmol) des 5'-Triphenylmethyldeoxyadenosin-Derivates wurden in Methylenchlorid und 2,6 eq Ethyldiisopropylamin gelost und unter Schutzgas auf 0 °C abgekühlt. Anschlie#end wurden 1, 2 eq Chlorphosphin zugetropft und 10 min bei 0 °C gerührt. Es wurde 1 h bei RT gerührt und mit Ethanol die Reaktion abgebrochen. Danach wurde eingeengt und in Methylenchlorid gelöst und 2x mit Natriumhydrogencarbonat-Lösung (1 N) und 1x mit Natriumchlorid-Lösung (sat.) extrahiert. Die organische Phase wurde getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch mit Methylenchlorid/Methanol 2 % an Kieselgel 40-63, um gereinigt. Man erhält das 5'-O-(4, 4', 4''-Tri-(2-[2-nitrophenyl]- <BR> <BR> <BR> <BR> propyloxycarbonyloxy)-triphenylmethyl)-N6-pivaloyl-deoxyaden osin-ß-cya- noethyl-N, N-diisopropylaminophosphoamidit als weißen festen Schaum.

Ausbeute : 0,7 g == 60 % d. Th.

3qP-NMR (202,45 MHz, Ceci3) : #=149, 37 ppm.

1.21 5'-0-(4, 4', 4''-Tri-(2-[2-nitrophenyl]-propyloxywarbonyloxy)-triphe- nylmethyl)-thymidin-ß-cyanoethyl-N, N-diisopropylaminophospho- amidit 2,0 g (1,73 mmol) des 5'-Triphenylmethylthymidin-Derivates wurden in Methylenchlorid und 2,6 eq Ethyldiisopropylamin gelöst und unter Schutzgas auf 0'C abgekühlt. Anschließend wurden 1,2 eq Chlorphosphin zugetropft und 10 Minuten bei 0 °C gerührt. Es wurde 1 h bei RT gerührt und mit Ethanol die Reaktion abgebrochen. Danach wurde eingeengt, in Methylenchlorid gelöst und 2x mit Natriumhydrogencarbonat-Lösung (1 N) und 1x mit Natriumchlorid-Lösung (sat.) extrahiert. Die organische Phase wurde getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch mit Essigsäureethylester/Hexan 1 : 1 an Kieselgel 40-63, um gereinigt. Man erhält das 5'-0- (4, 4-Tri-(2-[2-nitrophenyl]- propyloxycarbonyloxy)-triphenylmethyl)-thymidin-ß-cyanoethy l-N, N- diisopropylaminophosphoamidit als weißen festen Schaum.

Ausbeute : 2,1 g = 89 % d. Th.

31P-NMR (202,45 MHz, CDC13) : d=149, 77 ppm.

Beispiel 2 : Abspaltung von Schutzgruppen Die Säurebeständigkeit der nicht aktivierten Schutzgruppen wurde mit 80 % iger Essigsäure bzw. 1 % iger Trichloressigsäure (Standardbedingungen für die Oligonukleotidsynthese) durchgeführt. Tabelle 2 gibt das Ergebnis dieser Studie wieder.

Alle Proben werden zunächst für 300 s bzw. 900 s in 80 % iger Essigsäure gelöst und auf der HPLC analysiert. Diejenigen, die diese Behandlung ohne Etherspaltung überstehen, werden für 300 s bzw. 900 s mit 1 % iger Trichloressigsäure behandelt und anschließend analysiert.

Tabelle 2 :

Verbindung Symbol 80 % ige 1 % ige Tri- Essigsäure chloressigsäure 5'-O-(4-Nppoc-trityl)- S1 stabil labil thymidin 5'-0- (4-Methoxy-4'-Nppoc- S2 stabil labil trityl)-thymidin 5'-0- (4, 4'-Dimethoxy-4"- S3 labil labil Nppoc-trityl)-thymidin 5'-0- (4, 4'-DiNppoc-trityl)- S4 stabil labil thymidin 5'-0- (4-Methoxy-4, 4"- S5 stabil labil diNppoc-trityl)-thymidin 5'-O-(4, 4', 4"-TriNppoc-S6 stabil stabil trityl)-thymidin Es zeigt sich, dass die 4, 4', 4"-TriNppoc-trityl-Schutzgruppe (S6) in Trichloressigsäure stabil ist.

Beispiel 3 : Optimierung der Synthese Eine erste Optimierung wird durch Verwendung von Diphenylmethylchlorsilan anstelle von tert. Butoxydiphenylchlorsilan erzielt.

Beispiel 4 : 2 Experimente an der festen Phase

Die zweistufigen Schutzgruppen werden auf einer festen Phase getestet. Der prinzipielle Funktionalitätstest wird auf einem DNA-Prozessor D der febit ag in einem Geniom one-Gerät durchgeführt.

An eine silanisierte DNA-Prozessoroberfläche wird 5'-0- (4, 4', 4"-TriNppoc- trityl)-thymidin-phosphoamidit ankondensiert. Es erfolgt eine punktuelle Belichtung, eine anschließende Säurebehandlung (max. 2 min) und die Kopplung eines Spacers. Abschließend erfolgt nochmals eine Detektion.

Als Kontrolle erfolgt das analoge Experiment. Es wird jedoch statt des Amidits mit der Tandem-Schutzgruppe ein NPPOC-dT-Amidit gekoppelt.

Durch dieses Experiment konnte die Funktionalität der zweistufigen Schutzgruppe gezeigt werden.