Die Erfindung betrifft eine leitfähige Oberflächenstruktur, um suspendierte mikroskopische Partikel und Zellen zu beeinflussen. Sie betrifft auch die Verwendung dieser Struktur zur Steuerung der Adhäsionseigenschaften der Partikel und Zellen.

In der Medizintechnik, der Biokompatibilitätsforschung, insbesondere bei der Herstellung transplantierbarer Materialien, aber auch in der biologisch-pharmakologischen Forschung wird seit langem nach Oberflächen gesucht, die einerseits abstoßend auf in physiologischen und technischen Lösungen befindliche Partikeln und Zellen wirken, andererseits in bestimmten Fällen die Adhäsion fördern (BOGRAND, P. (ed.) , Physicl Basis of Cell- Cell-Adhesion, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1988.

CURTIS, A.S.G., PITTS, J.D. (eds.) , Cell Adhesion and Motility, Cambridge University Press, Cambridge, 1980. GRINELL, F., Int. Rev. Cytol, 53:65-144, 1978. LEE, L.H., Recent Advances in Adhesion, Gordon & Breach, London, 1973. OTTE ILL, R.H., ROCHESTER, C.H., SMITH, A.L. (eds.), Adsorption from Solution, Academic Press, London. PERELSON, A.S., DeLISI, Ch. , WIEGEL, F.W., Cell Surface Dynamics, Concepts and Models, Marcel Dekker, Inc., New York, Basel, 1984) . In der Regel wird diese "Oberflächenmodifizierung" über Hydrophilisierung oder Hydrophobisierung, über die Ankopplung geladener molekularer Gruppen oder durch lokale Ankopplung hochspezifischer Bindungsstellen (z.B. Antikörper) erreicht. Nachteilig an diesen Oberflächenmodifizierungen ist die geringe Reichweite in die Partikelsuspension (in der Regel wenige Ä) , die sehr unterschiedliche Langzeitstabilität, sowie die nicht vorhandene Steuerbarkeit der Effekte.

Daß elektrische Felder über Elektroden in eine Partikel- oder Zellsuspension ausgekoppelt werden können und über Polarisation der Teilchen Moleküle und Zellen zu den Elektroden hin- oder wegdrücken können, wurde ausführlich von POHL 1978 (POHL, H.P., Dielectrophoresis, Cambridge Press, Cambridge 1978) untersucht und in Patenten, wie US 4,390,403, fixiert.

Diese als Dielektrophorese bezeichneten Kräfte können sowohl anziehend (positive Dielektrophorese) als auch abstoßend (negative Dielektrophorese) wirken. Das Phänomen wird sowohl zur Sammlung von Schmutzpartikeln in makroskopischen Filtern als auch zur Sammlung und Separation von Zellen und Mikropartikeln in MikroStrukturen genutzt, allerdings bisher aus folgenden Gründen nur begrenzt nutzbar:

(i) Elektroden wurden im makroskopischen Bereich verwendet und, bis zu einigen Mikrometern miniaturisiert, auch auf planaren Oberflächen erzeugt . Die in die Flüssigkeit entkoppelten elektrischen Hochfrequenzfelder durchdringen dann mit nahezu gleicher Feldstärke die gesamte Zelle, woraus eine hohe Belastung der Objekte (Zellen und Partikel) resultiert und sehr hohe AnregungsSpannungen erforderlich sind (einige V bis zu einigen 100V) .

(ii) Die Elektroden sind immer noch so groß, daß sich Zellen auf ihnen ablagern können, obwohl das Feld angeschaltet ist, da sie auf der breiteren Elektrode keine

Nachbarelektroden mehr spüren, wodurch der angestrebte Effekt zunichte gemacht wird. Dieses Problem entsteht z.B. in der WO 91/11262 (P & B Sciences Limited) , wo zwar ein Elektrodenarray benutzt wird, das kammerförmig (vgl. die dortige Figur 1B) sein kann, nicht aber dessen Größe und

Abmessung an die zu beeinflussenden Partikel anpaßt. Diese WO befaßt sich vielmehr ausschweifend mit den Größen und Formen von "non-uniform-Magnetfeidern" und deren Einfluß auf chemische Reaktionen zwischen den Zellen.

(iii) Mit den Elektroden in Kontakt gekommene oder direkt von ihnen angezogene Zellen oder Partikel verändern sich auf Grund der Metall-Zelloberflächenreaktion irreversibel.

Hochfrequente Wanderwellen, erzeugt über elektrische Signale, wurden von MELCHER zum Pumpen von Ölen genutzt (MELCHER, J.R., The physics of fluids, 9:1548-1555, 1966) . Ende der 80er, Anfang der 90er Jahre konnte dieses Prinzip auch in Mikrokanälen mittels halbleitertechnologisch gefertigter Elektrodenstrukturen umgesetzt werden. Das Prinzip beruhte auf der Stabilisierung eines Temperaturgradienten und der Erzeugung phasenverschobener Raumladungen. Auch hier lag die Elektrodenbreite bei einigen lOμm (FUHR, G. et al . , MEMS 92, Proceedings, 1992) .

Daß auch Partikel und Zellen mittels wandernder elektrischer Felder selektiv bewegt werden können, wurde von MASUDA (MASUDA, S., IEEE Transaction on Industry Applications, 24, 217-222, 1988) gezeigt und 1991 auf hochfrequente Wanderwellen ausgedehnt (FUHR, G. et al . , MEMS 91, Proceedings,

259-264,1991) . Ziel dieser planaren Anordnung war die Bewegung einzelner Zellen in Mikrokanalsystemen mit dem Ziel der Zellseparation, wie sie in WO 91/3850 (Fraunhofer-Gesellschaft) näher erläutert ist.

Gegenüber diesem Stand der Technik liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, eine Oberfläche in ihrem Adhäsionsverhalten insbesondere für suspendierte Zellen und Makromoleküle elektrisch steuerbar zu verändern.

Das wird mit der technischen Lehre des Anspruches 1 erreicht. Die abhängigen Ansprüche konkretisieren und erweitern den abstrakten - vom Anspruch 1 in seinen tragenden Merkmalen umrissenen - Gedanken der elektrisch steuerbaren Adhäsionswirkung eines - insbesondere dielektrisch abgedeckten - Subminiatur-Elektroden-Areals. Das Areal kann als Streifenfläche oder als Punktfläche ausgebildet sein.

Die erfindungsgemäßen Verwendungen der erwähnten Struktur sind von den Ansprüchen 20 bis 22 erfaßt. Anspruch 24 betont die Ausbildung der blanken Elektroden-Areale. Die jeweiligen Spannungsbereiche sind im Anspruch 16 umschrieben.

Mittels einer im Subminiaturbereich (unterhalb von lOμm) strukturierten planaren Oberfläche können die mikroskopischen und submikroskopischen Partikel oder Zellen (im folgenden: "Teilchen") elektrisch gesteuert an der Isolierschicht angelagert oder abgestoßen werden, ohne sie hohen Belastungen auszusetzen, ohne sie chemisch zu verändern und ohne mit dauerhaften nicht ablösbaren Ablagerungen konfrontiert zu werden. Die Elektrodenareale erhalten eine neue Eigenschaft kraft ihrer Dimensionierung. Die Elektroden können dielektrisch bedeckt oder blank sein (Ansprüche 1, 24) . Sind sie blank, werden den streifenförmigen oder punktförmigen Elektroden deutlich geringere Spannungen zugeführt, um die Verluste klein zu halten (Anspruch 16) . Höhere Spannungen (im Voltbereich) erlauben die dielektrisch bedeckten Elektroden. Im Subminiatubereich können so lokal kräftige Felder erzeugt werden, ohne daß die Zellen vollumfänglich mit Kräften beaufschlagt werden. Die Elektrodendimensionierung erlaubt das unsymmetrische (einseitige) Beaufschlagen der Zellen, da Ihre Größe oberhalb des Subminiaturbereichs liegt .

Mit den Elektrodensystemen der Erfindung kann mit physiologischen (leitfähigen) und sogar mit hochleitfähigen Lösungen gearbeitet werden. Dieser Umstand erweitert die medizinisch-biologische Anwendung elektrischer Feldtechniken um einen Anwendungsbereich, der bisher für nicht funktionsfähig erachtet wurde.

Der Erfindung liegt dabei die Erkenntnis zugrunde, extrem schmale Elektrodenbänder oder -knöpfe in sich wiederholender Folge auf eine Oberfläche (Substrat) aufzubringen, die so schmal sind, daß im günstigsten Falle mehrere Elektrodenbahnen oder ein Umfeld von eng beieinander liegenden Punkten dem typischen Durchmesser der Teilchen entsprechen.

Unter Subminiaturbereich versteht die Erfindung einen Bereich, der bei etwa lOμm beginnt und nach unten unbegrenzt ist, allerdings derzeit durch zur Verfügung stehende Fertigungstechniken auf Bereiche um lOOnm bis 500nm beschränkt bleibt. Gleichwohl haben Experimente gezeigt, daß die patentgemäßen Wirkungen umso deutlicher zu Tage treten wenn die Abmessungen weiter verringert werden. Besonders relevant ist demnach der Bereich unter lμm.

Ein direkter Kontakt der Partikel mit den Elektroden wird durch eine aufgelagerte, insbesondere biokompatible (Anspruch 17) , dielektrische Schicht verhindert, deren Materialeigenschaften so gewählt werden, daß ein elektrisches Feld mit einer noch ausreichenden Feldstärke in den oberflächennahen Flüssigkeitsraum ausgekoppelt werden kann. Da die Feldstärke mit dem reziproken Abstand der Elektroden und proportional zur angelegten Spannungsdifferenz zunimmt, ergibt sich erst im gewählten Submikrometerbereich (Anspruch 17) die Möglichkeit mit geringen Amplituden (100mV bis IV) die erforderlichen Feldstärkegradienten auf einer Seite der Partikeln und Zellen zu erzeugen.

Die in die Flüssigkeit eingekoppelten Feldstärkegradienten werden mit schmaler werdenden Elektroden auch schneller mit dem Abstand von der Oberfläche abfallen, da sich die Anteile im oberflächenfernen Flüssigkeitsbereich überlagern und kompensieren. Dieser Umstand vermindert die elektrische und thermische Belastung der Partikeln außerordentlich.

Erfindungsgemäß läßt sich dieser Effekt über die Applizierung wandernder elektrischer Oberflächenwellen, vornehmlich im Hochfrequenzbereich (kHz - MHz) verstärken, so daß unter den oben geschilderten Randbedingungen eine elektrische Steuerung der Adhäsionseigenschaften der Oberfläche erfolgen kann und die Teilchen erst dann in den elektrischen Einflußbereich der

Oberfläche gelangen, wenn sie der Oberfläche sehr nahe kommen.

Die aufgebrachten erfindungsgemäßen Schichten koppeln einerseits das wandernde elektrische Feld in geeigneter Weise in den oberflächennahen Flüssigkeitsraum aus und verhindern andererseits elektrolytische Prozesse, so daß sie in physiologischen Lösungen hoher Leitfähigkeit eingesetzt werden können (Anspruch 20) .

Die Isolier-Schichten (Merkmalsgruppe b des Anspruches 1) sind solche Schichten, die die wässrige oder leitfähige Lösung mit den darin suspendierten Teilchen von den Elektroden trennt, demnach "isoliert". Diese Isolierung ist sowohl mechanisch gemeint, sie ist ebenso elektrisch gemeint, es kann auch eine Kombination der beiden vorerwähnten Isoliermöglichkeiten sein. Günstig ist ein hoher Dielektrizitäts-Koeffizient, zwingend erforderlich ist er allerdings nicht.

Bevorzugte Ausführungsbeispiele der Erfindung werden nachfolgend anhand der Figuren näher erläutert .

Figur 1 und Figur 3 sind jeweils perspektivische Ansichten der mikrostrukturierten Oberfläche mit elektrisch leitenden Elektrodenstreifen 22,42,44 und aufgelagerten Isolier- Schichten 23,45,43.

Figur 2 und Figur 4 sind Schnittbilder der in Figur 1 und Figur 3 dargestellten Strukturen.

Figuren la und lb sind jeweils Ansichten einer mikrostrukturierten Oberfläche mit elektrisch leitenden Elektrodenstreifen 11 (11a bis 11k) bzw. 17b, 18b, 19b, ohne aufgelagerte Isolier-Schichten.

Figuren 2a und 2b sind die zugehörigen perspektivischen Schnittbilder der in Figur la und lb dargestellten Strukturen, einmal mit aufliegenden Streifenelektroden 11a, 11b, ... und einmal mit punktförmigen Elektroden 17b, 17b' , 17b" und im Substrat eingebetteten Zuleitungen 17a, 18a, 19a.

Figur 5 dient der Erläuterung der unsymmetrischen Kraftwirkung auf ein zelluläres Objekt 54, dessen Dimension größer ist als die Struktur der Elektroden.

Figur 6 veranschaulicht in zwei Bildern die zeilschonende Wirkung von Oberflächenstrukturen im lμm-Bereich.

Figur 7a und Figur 7b sind Darstellungen, wie mit potentialmäßig gesteuerten Elektroden Säure und Base (auch Anode und Kathode) erzeugbar sind um dem pH-Gradienten von Figur 7b im μm-Bereich zu stabilisieren.

Figur 1 und Figur 2 zeigen eine in ihrem Adhäsionsverhalten (bezüglich Teilchen in Suspension) elektrisch steuerbare planare Oberfläche mit einer Elektrodenstreifenflache 11. Die Elektroden 22 sind über 4 Zuleitungen 12,13,14 und 15 zu Gruppen von jeweils 4 Elektroden zusammengefaßt und periodisch in dieser Gruppenkonfiguration (a,b,c,d ...) ansteuerbar. In gleicher Weise können Gruppen aus jeweils 3 oder auch mehr Elektroden gebildet werden. Auf diese Weise ist es möglich, in ihrer Richtung festlegbare elektrische Wanderwellen zu erzeugen.

Im angegebenen Beispiel wird dies erreicht, indem vier um jeweils ein Viertel in der Phase verschobene periodische Signale an die Zuleitungen 12,13,14 und 15 angelegt werden, so daß sich über der Elektroden-Streifenfläche 11 ein mit einer vorgebbaren Geschwindigkeit ausbildendes Wanderfeld erzeugt wird, das die Teilchen in der Suspension schonend bewegt .

Die den Elektroden aufgelagerte Isolier-Schicht 23 koppelt die wandernden Felder dielektrisch in die darüber befindliche Flüssigkeit 24 aus und kann biokompatibel sein.

Die Oberflächenwellen werden umso kräftiger ausgekoppelt, je höher die relative Dielektrizitätskonstante und je dünner die Isolier-Schicht 23 gewählt werden. Typische Dicken für die beschriebenen Anwendungen sind einige lOnm bis zu einigen

Mikrometern ("Sub-Mikrometerbereich") . Die aufgelagerte Schicht kann jedoch auch durch mono-, bi- und multimolekulare Schichten ersetzt oder ergänzt werden. Mit diesen Schichten können die zellspezifischen biokompatiblen Eigenschaften wesentlich unterstützt werden. Als Materialien kommen beispielsweise Polyuretan, Teflon, Metall- und Halbleiteroxide oder -isolatoren (Si0 ₂ - SiC, Si ₃ N ₄ ) in Frage. Die molekularen Schichten können Lipide, Detergentien, Polymere oder ähnliches sein.

Über diese Isolier-Schichten 23 können die Oberflächen zusätzlich lateral in ihren Adhäsionseigenschaften strukturiert und prädeterminiert werden.

Die Steuerung der Adhäsionseigenschaften erfolgt über das Anlegen der hochfrequenten Signale mit Frequenz, gegeseitigem Phasenbezug und Amplitude. Im Beispiel wandern die elektrischen Oberflächenwellen jeweils in eine Richtung. Durch veränderte Beschaltung der Elektroden über die Zuführungen 12,13,14 und 15 können gegenläufige, stehende und alternierende Wellen erzielt werden. Die so gesteuerte Einheit kann auf feste oder flexible Substrate 21 (mit der Oberfläche 16) makroskopisch flächenbedeckend aufgebracht werden.

Diese Strukturen können auch in aufgerollter Form die Wände von Schläuchen oder Reaktionsräumen (treatment cells) bilden.

Die beschriebenen Strukturen werden mit bekannten Herstellungstechniken der Halbleitertechnologie, z.B. in Elektronenstrahl-Lithogra >phie und bekannten Abscheide- und

Ätzverfahren erzeugt.

Figur 3 und Figur 4 zeigen eine Oberflächenstruktur bei der zwei zueinander dielektrisch isolierte Elektroden- Streifenflächen 42,44 um 90° gedreht angeordnet sind. Die gesamten Elektrodenstreifen sind mit Isolier- Deckschichten 31,32,45 passiviert, über die die wandernden Oberflächenwellen beider Elektrodenebenen in die Flüssigkeit ausgekoppelt werden können. Je nach Anwendungszweck können die Einzelelektroden entweder in Gruppen zusammengefaßt und miteinander verknüpft bzw. einzeln angeschlossen sein. Der Anschluß erfolgt über Zuführungen 33,34, die zu den Elektrodenstreifen oder -gruppen führen.

Der Verlauf der Streifen-Elektroden (Figuren 1, la, lb) muß nicht gerade sein, sondern kann in gebogenen, gezackten, mäanderförmigen oder spiraligen Formen auf der Oberfläche 41 verlaufen. Damit lassen sich zusätzlich zu den Adhäsions- Eigenschaften über dem Elektrodenareal befindliche Teilchen sammeln und an bestimmten Orten des Oberflächenarrays ablegen bzw. von diesem entfernen. Muster können gesteuert erzeugt werden.

Figur la und 2a zeigen eine im Adhäsionsverhalten (bezüglich Teilchen in Suspension) elektrisch steuerbare Oberfläche mit einer Elektrodenstreifenflache 11a, 11b, 11c, (kurz: 11) , der keine dielektrische Schicht überlagert ist. Es handelt sich also um blanke Elektroden. Die an sie anlegbare Spannung liegt im unteren Voltbereich - je kleiner die Streifenbreite und der Streifenabstand, desto kleiner auch die Spannung.

Figur lb und Figur 2b zeigen eine im Adhäsionsverhalten (bezüglich Teilchen in Suspension) elektrisch steuerbare

Oberfläche mit Elektroden-Punkten 17b, 17b', 17b", 18b, 18b', 18b" und 19b, 19b' und 19b". Die "Elektroden-Buttons" sind von keiner dielektrischen Schicht bedeckt. Ihr gegenseitiger Abstand liegt im Bereich von lOOnm bis lμm. Die an sie angelegten Spannungen liegen im Bereich der vorgenannten zu Figur la. Die Zuleitungen zu den Elektroden-Punkten sind im Substrat 21 verlegt. Damit sind die Zuleitungen 17a, 17a', 17a", 18a... und 19a, ... isoliert von der Suspension; elektrische Verluste können vermieden werden.

Figur 5 zeigt die schematischen Größenverhältnisse, wie sie bei der Verwendung tierischer Zellsuspensionen 56 mit Zellgrößen 54 von einigen Mikrometern auftreten und stellt den günstigsten Fall für physiologisch stark leitfähige Zellsuspensionen dar. Es ist ersichtlich, daß die submikrometerbreiten Elektroden 52 den Einfluß der beschriebenen Oberflächenstrukturen auf den oberflächennahen Raum 55 beschränken. Dadurch ist die belastungsarme Beeinflussung des Zeil- und Partikel- Adhäsionsverhaltens gegeben.

Es ist davon auszugehen, daß der Oberflächen-Wanderwelleneinfluß in Lösung nur 2 bis 5 Elektrodenbreiten reicht. Damit ist ein nach der Partikelgröße unterschiedlicher Strukturierungsgrad definiert .

Jedes der gezeigten Ausführungsbeispiele kann geometrisch variiert und in Hybridstrukturen eingeordnet werden.Ebenfalls kann die erfindungsgemäße Oberflächenstruktur auch zur

Freihaltung von Mikroelementen genutzt werden, die als Sensor eingesetzt werden.

Die Figur 6 veranschaulicht die Wirkung, die mit den zuvor erläuterten Subminiatur-Strukturen gegenüber einer Zelle in der Größenordnung von einigen lOμm erhalten wird. Während große Elektroden, die einen Abstand von Mitte zu Mitte in der Größenordnung von 30μm haben, die Zelle stark großflächig mit positiven und negativen Influenzladungen belasten, so daß in der Zelle ein erhebliches Potentialgefälle entsteht, wird dies mit den im rechten Halbbild gezeigten Subminiatur-Elektroden nicht mehr geschehen, da sich hier die unterschiedlichen Ladungen an der Oberfläche der Zelle mit einer Periode wiederholen, die der Periode der Subminiatur-Elektrodenstreifen etwa entspricht, so daß nur geringes Potentialgefälle entsteht und sich ein gleichförmig alternierendes Spannungsgefälle an der Oberfläche der Zelle aufbaut. Dieses ist für die Zelle besonders schonend und belastet sie nur wenig, während die von den schmalen Elektrodenstreifen auf die Zelle aufgebrachte Kraft gleichwohl erheblich ist.

Mit dieser Wirkung und den Strukturen gemäß den Figuren 1, 3 und 5 werden also schonende Feldkraft-Abschirmungen, sogenannte "Field Force Shields" in begrenztem Bereich oberhalb der Subminiatur-Elektrodenstruktur erreicht.

Ein Beispiel für Dimensionierung und Werkstoffe, mit dem beispielsweise die Figur 5 implementiert wurde, ist folgendermaßen:

Gold-Elektrodenstreifen 52 haben eine Breite von 500nm. Die Lücke zwischen den Elektrodenstreifen 52a, 52b, 52c, 52d ... beträgt jeweils 500nm. Die Elektrodenhöhe ist - abweichend von der rechteckigen Struktur der Figur 5 - etwa auch 500nm. Die Elektrodenstreifen-Struktur wurde mit Elektronenstrahl- Lithographie erzeugt. Das Substrat 51 ist Silizium. Die Abdeckschicht 53 ist aus Glas . Ebenfalls aus Glas ist der Zwischenraum zwischen jeweils zwei Elektroden-Streifen. Das

eingesetzte Feld (die eingesetzte Spannung) hat eine Frequenz von 1MHz und eine Spannung von 1.5V . Die

∑r∑r verwendete Erythrozyten-Suspension hat eine Leitfähigkeit von 1.2S/m. Auch nach mehr als einer Stunde blieb die Oberflächenstruktur des beschriebenen Beispiels ohne jede Ablagerung von Erythrozyten.

Das Beispiel und die Darstellung der verschiedenen Subminiatur- Strukturen zeigt die Möglichkeit auf, daß biokompatible Oberflächen geschaffen werden können, bei denen verhindert werden kann, daß sich die Teilchen ablagern, so daß Trombosen vermieden werden können. Daneben bietet sich die Anwendungsmöglichkeit der Sensorik, bei der verhindert werden kann, daß sich Partikel auf den Sensorflächen ablagern, womit Sensoren entstehen, die eine hohe Lebensdauer haben.

Weitere Anwendungen der beschriebenen Strukturen sind die Implanatationstechnik und der Aufbau von Optiken.

Nicht unerwähnt bleiben soll die anhand der Figuren 7a und 7b erläuterte Anwendungsmöglichkeit des im μm-Bereich stabilisierten pH-Gradienten. Mit ihm bietet sich die Möglichkeit der Sichtbarmachung von Elektrodendefekten, mit ihm können chemische Mikro-Reaktionssysteme aufgebaut werden, mit ihm können pharmakologische Testsysteme entstehen, schließlich können biologische/medizinische Zellkulturen erforscht werden.

Die Elektrodenstruktur gemäß der Figur 7a erlaubt die potentialmäßige Steuerung und die Erzeugung von Säure und Base auch Kathode und Anode. Dies gelingt allein mit der elektrischen Ansteuerung der im μm-Bereich geschaffenen Elektroden-Struktur. Die Einzelelektroden werden asymmetrisch mit geringen Spannungen im Bereich zwischen IV bis 2V gepulst . Abhängig von dem Elektrodenabstand (Figur 7b) entstehen unterschiedliche pH-Werte, mit denen ein Gradient oberhalb der Elektroden- Struktur geschaffen werden kann. Der pH-Gradient kann über einen pH-abhängigen Fluoreszenzmarker sichtbar gemacht werden.