本発明は、-30℃保存で少なくとも1週間凍 結しないことを特徴とする、DNAリガーゼ反応 組成物である。ここでいうリガーゼ反応組成 物とは、DNA成分のみを含まない、リガーゼ反 応に必要な成分を含む組成物を指す。

 DNAリガーゼ反応組成物の保存容器として� ��、特に限定されないが、一般的に用いられ� ��プラスチック製のチューブやボトル類が好� ��しく用いられる。更に好ましくは、ポリプ� ��ピレン製のチューブやボトル類が用いられ� ��。実際に、本発明においては、ポリプロピ� ��ン製の1.5mlマイクロチューブを用いて検討� �行った。

 本発明におけるDNAリガーゼ反応組成物は� ��ベタイン及びグリセロールを含有する。グ� ��セロールは、別名グリセリン。ベタインは� ��リメチルグリシンを指す。本発明は、好ま� ��くは、2M以上のベタイン及び5%(V/V)以上のグ� ��セロールをDNAリガーゼ反応組成物である。� ��らに好ましくは、2~2.5Mベタイン、5~10%(V/V)グ リセロールが用いられる。

 ここで言うDNAリガーゼ反応組成物は、連� ��させたいDNA溶液と任意の比率で混合して連� ��反応(ライゲーション反応)を起こさせる組� �物を指し、その組成物は1液から校正される� ��その混合比率は特に限定されないが、DNA:組 成物比が、1:4~1:0.5の間で用いられることが好 ましく、さらに好ましくは、1:2~1:0.5で用いら れる。よって、実際の反応を行う溶液中での ベタインやグリセロールの濃度は混合比率に よって変化する。例えば、2Mベタインを含む� ��応組成物を1:1の混合比率でDNA溶液と混合し� ��場合、反応時のベタイン濃度は1Mとなる。0. 5:1の場合は、0.33Mとなる。

 本発明においてDNAリガーゼの種類は、特に� ��定されるものではないが、好ましくはT4フ� �ージ由来のT4 DNA リガーゼを用いる。この� �素は、ファージを感染させた大腸菌の破砕� �から調製したものや、T4ファージのリガーゼ 遺伝子を大腸菌に組み換えて発現させ、その 破砕物から調製されたものなど様々なものを 用いることができる。特
に、DNA分解酵素などの混入の少ない高純度の 高度を用いることが重要である。

 本発明における-30℃でのDNAリガーゼ反応� ��成物の保存方法は一般的な研究室でしよう� ��れているフリーザーを用いることができる� ��本発明においては、三洋電機社製のフリー� ��ー(BIOMEDICAL FREEZER MDF-U537(商標))を-30℃に設� ��して用いたが、同等の性能を示すフリーザ� ��であれば特に限定されない。凍結試験時に� ��極力温度変化を少なくするために、ドアの� ��閉を極力少なくする必要があり、必要に応� ��て温度を定期的にモニターしても良い。ま� ��、冷気の噴出し口やファンの近くは設定温� ��よりも温度が低下する可能性があり、正確� ��評価ができないので、気をつける。

 本組成物に含まれる成分は、ライゲーシ� ��ン反応の必須成分、バッファー・塩成分に� ��えて、様々な添加剤を加えてよい。必須成� ��としては、DNAリガーゼ、ATP、及びマグネシ� ��ム、バッファー・塩成分としては、バッフ� ��ー、塩化ナトリウムなどの塩、及び還元剤� ��どを挙げることができるが、限定されるも� ��ではない。

 本発明においてDNAリガーゼの種類は、特� ��限定されるものではないが、好ましくはT4� �ァージ由来のT4 DNA リガーゼを用いる。こ� �酵素は、ファージを感染させた大腸菌の破� �物から調製したものや、T4ファージのリガー ゼ遺伝子を大腸菌に組み換えて発現させ、そ の破砕物から調製されたものなど様々なもの を用いることができるが、高度に精製された 高純度のものを用いることが重要である。特 に、DNA分解酵素などの混入の少ないものを用 いることが重要である。

 本発明に用いられるATP(アデノシン5’-三� ��ン酸)は、アデノシンのリボースの5’位の� �酸基にリン酸が3分子連続して結合したヌク� ��オチドのことを指す。ATPの濃度としては、� ��応時の濃度として、0.01~0.2mMが好ましく用い られる。最も好ましくは、0.02~0.1mMが好適に� �いられる。

 本発明に用いられるマグネシウムは、様� ��な塩を用いることができ、特に限定されな� ��。好ましくは、塩化マグネシウムを用いる� ��塩化マグネシウムの濃度は、反応時の濃度� ��して、1~10mMが好ましく用いられる。最も好� ��しくは、2~4mMが好適に用いられる。

 緩衝液成分はpHを至適条件に保つのに重� �である。T4 DNA リガーゼの反応は、pH7.5前後 が最も至適とされており、pH7.5前後のpHを保� �ことのできるバッファー成分を含むことが� �ましい。バッファーとしては特に限定され� �ものではないが、トリス緩衝液やHEPES緩衝液 が好適に用いられる。特に、トリス-塩酸緩� �液が最も好ましい。緩衝液の濃度は、反応� �の濃度として、10~100mMが好適に用いられるが 、20~50mMが用いられる。

 塩成分としては、塩化ナトリウムや塩化� ��リウムなどの一般的なアルカリ土類金属の� ��を用いることができる。特に、塩化ナトリ� ��ムが好適に用いることができる。塩化ナト� ��ウムの濃度は、反応時の濃度として、10~100m Mが好適に用いられ、特に、好ましくは20~50mM� ��用いられる。

 還元剤成分としては、2-メルカプトエタ� �ールやジチオスレイトール(DTT)など、一般的 に生化学実験で用いられている還元成分を用 いることができ、特に限定されない。特に好 ましくは、還元維持能力の高いDTTが用いられ る。DTTの濃度は、反応時の濃度として、0.5~10 mMが好適に用いられる。特に好ましくは、1~5m Mが用いられる。

 本発明における添加剤としては、ポリエ� ��レングリコール、スペルミジン、ベタイン� ��及びグリセロールなどを挙げることができ� ��が、限定されるものではない。上で述べた� ��うにポリエチレングリコール、スペルミジ� ��、ベタインは、ライゲーション反応の効率� ��向上させることのできる成分である。

 本発明におけるポリエチレングリコール� ��、様々な分子量のものを使用することがで� ��るが、好ましくは分子量が200-20,000、好まし くは5,000-10,000、最も好ましくは6,000を用いる� ��ポリエチレングリコールの濃度は、反応時� ��濃度として、0.5~3%(W/V)が好ましく用いられ� �。最も好ましくは0.75~1.5%の濃度で使用する� �が良い。

 本発明におけるスペルミジンは、ポリア� ��ンの一種であり、様々な由来のものが販売� ��れているが起源は特に限定されない。スペ� ��ミジンの濃度は、反応時の濃度として、0.1~ 10mMが好ましく用いられる。最も好ましくは� �0.5~2mMで使用するのが良い。

 本発明におけるベタインは、具体的には� ��リメチルグリシンを指す。この分子は、グ� ��シンのアミノ基にメチル基が3つ結合した構 造を持つ。ベタインの濃度としては、反応時 の濃度として、0.1~1.5Mが好ましく用いられる� ��最も好ましくは、0.5~1.25Mが好適に用いられ� ��。さらにベタインは、ライゲーション反応� ��成物の凍結を妨げる成分であり、反応組成� ��中で2.5~3Mの濃度で用いることが好ましい。

 また本特許は、上記組成物を用いてリガ� ��ゼ反応を行うことを特徴とする、ライゲー� ��ョン反応方法をも含むものである。

 具体的には、上記組成物に連結させたいD NA断片を混合し、反応させる。DNA断片は、基� ��的には2本鎖であり、末端が相補的である必 要がある。様々なパターンの連結反応が予想 されるが、大きく分けると、突出末端を有す るDNA同士、及び平滑末端を有するDNA同士の連 結が考えられる。突出末端には、5’側のDNA� �の突出したものと、3’側のDNA鎖の突出した� ��のの2種類が考えられる。それらの多くは、 制限酵素によって作り出される末端である。 一方、平滑末端を有する断片は、末端の配列 に関わらず連結することが可能である。

 また、DNAポリメラーゼの作用により作り� ��される、3’末端にアデニンが一塩基基突出 したDNA断片を、3’側にチミンが一塩基基突� �したベクター(Tベクター)に連結するクロー� �ング方法(TAクローニング)が近年盛んに行わ� ��るようになっている。この方法にも本発明� ��用いることができる。

 上でも述べたが、リガーゼによる連結反� ��が生じるには、DNAの5’側の末端がリン酸化 されている必要がある。2本鎖の連結が連結� �れるには、最低片方の鎖が連結される必要� �ある(片方のみが連結された場合は、もう片� ��は連結されないが、DNA断片としては連結さ� ��たことになる)。少なくとも片方のDNA断片の 5’末端がリン酸化されていることが、2本鎖D NAの連結反応には必要である。多くの場合、� ��方だけが連結されたDNAは、大腸菌などへ導� ��すると、大腸菌の修復機構で連結されるこ� ��が知られている。

 本発明は、上記組成物を含有する試薬・� ��ットにも関する。

 また、本発明の実施の一態様としては、D NA以外のライゲーション反応に必要な上述の� ��分を含む1液のライゲーション試薬を挙げる ことができる。