BESCHREIBUNG

Universales Kontrollmaterial für Gerinnungsfaktorinhibitor- Teste

Die vorliegende Erfindung liegt auf dem Gebiet der

Gerinnungsdiagnostik und betrifft ein universales

Kontrollmaterial, dessen Herstellung und dessen Verwendung zur Qualitätskontrolle von Gerinnungsfaktorinhibitor-Testen.

Das Blutgerinnungssystem (Hämostase) erfüllt die Aufgabe, einerseits eine kontinuierliche Strömung des Blutes zu gewährleisten und anderseits im Falle einer Verletzung rasch und lokal einen Wundverschluss herbeizuführen, um einen

Blutverlust zu minimieren. Die Fibrinbildung, die zur Bildung der wundverschließenden Blutgerinnsel beiträgt, steht am Ende einer Kaskade enzymatischer Prozesse, wobei jedes Enzym ein weiteres Enzym durch proteolytische Prozesse aktiviert.

Beispiele für solche prokoagulatorischen Enzyme sind Thrombin (Faktor IIa) und Faktor Xa . Sowohl bei Thrombin als auch bei Faktor Xa handelt es sich um Serinproteasen, die

normalerweise in Form von inaktiven Proenzymen im Blut vorkommen und erst im Zuge der Gerinnungsaktivierung

aktiviert werden.

In der Antikoagulationstherapie werden zunehmend neue

Gerinnungsfaktorinhibitoren, insbesondere spezifische, direkte Thrombin- (Faktor IIa-) und Faktor Xa-Inhibitoren eingesetzt. Diese neuen Gerinnungshemmer haben das Potenzial, die bislang benutzten indirekten Gerinnungshemmer, vor allem Heparin und dessen Derivate, die ihre gerinnungshemmende Wirkung nur im Zusammenspiel mit Kofaktoren wie Antithrombin oder Heparin Cofaktor II entfalten, abzulösen. Für die

Steuerung der Therapie und die Dosierung der Medikamente ist es daher wichtig, die Menge des therapeutischen Inhibitors zu kennen. Es ist daher notwendig, über diagnostische Methoden zu verfügen, die es ermöglichen, die Plasmakonzentrationen der therapeutischen Inhibitoren quantitativ zu bestimmen.

Im Stand der Technik sind verschiedene Testverfahren zum quantitativen Nachweis von direkten Thrombin- bzw. direkten Faktor Xa-Inhibitoren in humanen Plasmaproben bekannt.

Die Bestimmung von Thrombin- bzw. von Faktor Xa-Inhibitoren erfolgt überlicherweise mit Hilfe chromogener oder

koagulometrischer Testverfahren. Bei den chromogenen

Verfahren wird die Patientenprobe, die einen Thrombin- bzw. Faktor Xa-Inhibitor vermutlich enthält, mit einer sich im Überschuss befindlichen, definierten Menge des entsprechenden aktivierten Gerinnungsfaktors und einem chromogenen Substrat für den aktivierten Gerinnungsfaktor vermischt, und die im

Reaktionsansatz verbleibende Aktivität des Gerinnungsfaktors wird photometrisch gemessen. Bei den etablierten, auch kommerziell erhältlichen chromogenen Testen werden

insbesondere die Chromophore para-Nitroanilin (pNA) und 5- Amino-2-Nitro-Benzoesäure (ANBA) , welche ein

Absorptionsmaximum bei 405 nm aufweisen, verwendet. Die entstehende gelbe Farbe wird in der Regel photometrisch bestimmt. Je höher die Konzentration des therapeutischen Inhibitors in der Patientenprobe ist, desto mehr wird die Aktivität des zugegebenen Gerinnungsfaktors gehemmt und desto weniger Substrat wird gespalten. Bei der Bestimmung von

Inhibitoren verhält sich die Farbkonzentration im Testansatz umgekehrt proportional zur Inhibitorkonzentration in der Probe. Beispielsweise in EP-Bl-0034320 oder in EP-A2-0004271 sind derartige Thrombin- bzw. Faktor Xa-basierte, chromogene Testverfahren beschrieben. Mit Hilfe dieser Teste können therapeutische Inhibitoren, die die Aktivität von

Blutgerinnungsfaktoren inhibieren, in Patientenproben

quantitativ bestimmt werden. In der WO-Al-2012069139 ist ein Verfahren zur Bestimmung von Faktor Xa-Inhibitoren und in der WO-Al-2012175183 ein Verfahren zur Bestimmung von

Thrombininhibitoren in Serum- und Urinproben beschrieben. Eine zunehmende Zahl von direkten Thrombin- bzw. von

Faktor Xa-Inhibitoren ist bereits für die therapeutische Anwendung zugelassen oder befindet sich in der Zulassung. Beispiele dafür sind die Substanzen Dabigatran (PRADAXA®) , Argatroban (ARGATROBAN®) , Rivaroxaban (XARELTO®) , Apixaban (ELIQUIS®) und Edoxaban (LIXIANA®) .

In der Labordiagnostik spielt die Qualitätssicherung, die sicherstellen soll, dass ein Analyseergebnis, das mit einem gegebenen Testsystem für eine Patientenprobe ermittelt wurde, präzise und richtig ist, eine wichtige Rolle. Ein allgemein praktiziertes Vorgehen besteht darin, dass man zwischen den Messungen von Patientenproben stichprobenartig und mit demselben Testsystem (Reagenzien, Analysegerät, etc.)

sogenannte Kontrollproben misst, denen vom Hersteller

Zielwerte für den zu bestimmenden Analyten zugewiesen sind. Entspricht das Ergebnis einer solchen Kontrollmessung dem Zielwert beziehungsweise liegt es innerhalb eines

vorgegebenen Toleranzbereichs um den Zielwert, kann davon ausgegangen werden, dass auch die mit dem angewandten

Testsystem für die Patientenproben ermittelten Ergebnisse frei sind von systematischen Fehlern und damit richtig und präzise sind. Es sind verschiedene Teste für therapeutische

Gerinnungsfaktor-Inhibitoren, insbesondere für Thrombin- und Faktor Xa-Inhibitoren auf dem Markt erhältlich. Derartige Teste umfassen die notwendigen Reagenzien zur quantitativen Messung der Inhibitoraktivität in einer Probe, also

üblicherweise ein Thrombin- oder Faktor Xa-Reagenz und ein entsprechendes Peptidsubstrat-Reagenz sowie für den zu bestimmenden Inhibitor spezifische Kaiibrator- und

Kontrollmaterialien, wobei die Kaiibrator- und

Kontrollmaterialien definierte Mengen des zu bestimmenden Inhibitors enthalten. Beispielsweise umfasst ein Testsystem für den Thrombininhibitor Dabigatran ein Thrombin-Reagenz, ein für Thrombin spezifisches Peptidsubstrat-Reagenz und Kaiibrator- und Kontrollmaterialien, die definierte Mengen Dabigatran enthalten. Während das Thrombin-Reagenz und das für Thrombin spezifische Peptidsubstrat-Reagenz auch in einem Test zur Bestimmung eines anderen Thrombininhibitors

verwendet werden können, müssen die Kaiibrator- und

Kontrollmaterialien jedoch jeweils den spezifischen Inhibitor enthalten .

Problematisch ist die große und weiter zunehmende Anzahl therapeutischer Gerinnungsfaktor-Inhibitoren, für deren

Bestimmung jeweils spezifische Kaiibrator- und

Kontrollmaterialien zur Verfügung gestellt werden müssen. Üblicherweise wird als Kontroll- bzw. Kaiibratormaterial normales Humanplasma verwendet, dem eine definierte Menge des jeweiligen Inhibitors hinzugefügt ist. Die Herstellung spezifischer Kaiibrator- und Kontrollmaterialien für jeden einzelnen therapeutischen Inhibitor bedeutet für die

Hersteller der Teste einen hohen Entwicklungsaufwand.

Auch für den Anwender ist die Vielzahl der benötigten

Kontroll- und Kaiibratormaterialien problematisch, da er die vielen verschiedenen Kontroll- und Kaiibratormaterialien anschaffen, vorrätig halten und handhaben muss. Insbesondere bei der Verwendung von automatischen Analysegeräten, die nur eine beschränkte Kapazität für die Aufnahme verschiedener Kontroll- und Kaiibratormaterialien aufweisen, ist es

praktisch nicht möglich, die für alle therapeutisch

angewendeten Thrombin- und Faktor Xa-Inhibitoren spezifischen Kontroll- und Kaiibratormaterialien im Gerät parallel zu platzieren. Ein weiterer Nachteil ist, dass die Haltbarkeit von Plasmakontrollen und -kalibratoren beschränkt ist, sodass Kontrollen und Kalibratoren für Teste, die weniger häufig durchgeführt werden, nicht vollständig aufgebraucht werden können, bevor sie wegen Ablaufs des maximalen Haltbarkeit unverbraucht entsorgt werden müssen.

Es ist daher wünschenswert, die Anzahl der notwendigen

Kontroll- und Kaiibratormaterialien zu reduzieren, um die vorgenannten Nachteile zu beseitigen und um die automatische Abarbeitung der verschiedenen spezifischen Teste auf einem Analysegerät sicherzustellen.

Der vorliegenden Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, die geschilderten Probleme im Zusammenhang mit der Vielzahl der erforderlichen Plasmakontrollen und -kalibratoren zu beheben .

In der EP-Al-2843416 werden Kontroll-und Kalibratorplasmen beschrieben, die zur Verwendung in einem ersten Test zur

Bestimmung eines ersten spezifischen Thrombininhibitors und zur Verwendung in einem zweiten Test zur Bestimmung eines ersten spezifischen Faktor Xa-Inhibitors vorgesehen sind und die den jeweiligen ersten spezifischen Thrombininhibitor und den jeweiligen ersten spezifischen Faktor Xa-Inhibitor enthalten, z.B. Dabigatran und Rivaroxaban. Auf diese Weise kann die Anzahl der notwendigen Kaiibrator- und

Kontrollmaterialien um 50 % verringert werden. Die vorliegende Erfindung löst die oben geschilderten

Probleme durch die Bereitstellung eines Kontrollmaterials, das anstelle eines oder mehrerer therapeutischer Inhibitoren eine definierte Menge mindestens eines unspezifischen

Serinproteaseinhibitors in einer wässrigen Pufferlösung enthält und dem mindestens ein Zielwert für die Konzentration mindestens eines therapeutischen Gerinnungsfaktorinhibitors zugewiesen ist. Dies hat den Vorteil, dass für alle Teste zur quantitativen Bestimmung von therapeutischen Inhibitoren von Gerinnungsfaktoren aus der Gruppe der Serinproteasen ein einziges (universales) Kontrollmaterial verwendet werden kann .

Unter dem Begriff „Gerinnungsfaktor" ist jede plasmatische Serinprotease zu verstehen, die eine prokoagulatorische

(gerinnungsfordernde) Funktion im Blutgerinnungssystem eines Säugetiers, bevorzugt des Menschen, hat. Prokoagulatorische Gerinnungsfaktoren sind in der aktivierten Form

beispielsweise Faktor IIa (Thrombin) , Faktor Vlla, Faktor IXa, Faktor Xa, Faktor XIa und Faktor Xlla. Im

Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist, sofern nichts anderes erwähnt ist, mit einem „Gerinnungsfaktor" dessen aktive Form und nicht dessen inaktive Vorläuferform gemeint.

Die Haupttargets einer Antikoagulationsstherapie sind derzeit die Gerinnungsfaktoren Thrombin und Faktor Xa . Deshalb werden diese beiden Gerinnungsfaktoren und ihre Inhibitoren im

Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung immer wieder beispielhaft erwähnt. Es ist jedoch durchaus möglich, dass in Zukunft alternative Therapieansätze entwickelt werden, die auf der Hemmung anderer prokoagulatorischer

Gerinnungsfaktoren, wie beispielsweise Faktor Vlla,

Faktor IXa, Faktor XIa oder Faktor Xlla, beruhen. Auch in diesen Fällen ist das erfindungsgemäße Vorgehen anwendbar.

Der Begriff „therapeutischer Inhibitor eines

Gerinnungsfaktors" bezeichnet eine therapeutisch wirksame Substanz, die natürlicherweise nicht im menschlichen Körper vorkommt und die die proteolytische Aktivität eines einzigen Gerinnungsfaktors, also spezifisch, entweder durch direkte Bindung an den Gerinnungsfaktor oder durch die Interaktion mit physiologischen Kofaktoren, wie z.B. Antithrombin oder Heparin Cofaktor II, indirekt reduziert. Der Begriff

„therapeutischer Inhibitor" umfasst explizit nicht

gerinnungshemmende Proteine oder Proteinkomplexe, die

natürlicherweise im menschlichen Körper vorkommen, wie z.B. Antithrombin oder Heparin Cofaktor II.

Therapeutische Inhibitoren inhibieren einen einzigen

spezifischen Gerinnungsfaktor, im Allgemeinen entweder

Thrombin oder Faktor Xa . Therapeutische Gerinnungsfaktorinhibitoren aus der Gruppe der spezifischen Thrombininhibitoren sind beispielsweise Hirudin, Orgaran, Argatroban, Dabigatran, Melagatran, Ximelagatran, Bivalirudin, Lepirudin, MCC-977, SSR-182289, TGN-255, TGN- 167, ARC-183 und Odiparcil.

Therapeutische Gerinnungsfaktorinhibitoren aus der Gruppe der spezifischen Faktor Xa-Inhibitoren sind beispielsweise

Apixaban, Rivaroxaban, Edoxaban, Fondaparinux, Otamixaban, LY 517717, YM 153, DU-176b, DX-9065a und KFA-1982.

Unter dem Begriff „unspezifischer Serinproteaseinhibitor" ist ein Inhibitor zu verstehen, der -im Gegensatz zu den

spezifischen therapeutischen Gerinnungsfaktorinhibitoren- eine Vielzahl (mindestens zwei) von Gerinnungsfaktoren aus der Gruppe der Serinproteasen zu binden vermag und der durch diese Bindung die proteolytische Aktivität mehrerer

Gerinnungsfaktoren reduziert. Typischerweise inhibieren diese unspezifischen Serinproteaseinhibitoren nicht nur

Gerinnungsfaktoren aus der Gruppe der Serinproteasen, sondern weitere Vertreter dieser Unterfamilie der Peptidasen. In Bezug auf die vorliegende Erfindung ist jeder

Serinproteaseinhibitor geeignet, der mindestens die

Gerinnungsfaktoren zu inhibieren vermag, welche von den therapeutischen Inhibitoren inhibiert werden, die quantitativ bestimmt werden sollen. Bekannte unspezifische

Serinproteaseinhibitoren, die eine Vielzahl von

Serinproteasen, darunter auch Thrombin und Faktor Xa, zu inhibieren vermögen, sind z.B. Benzamidin,

Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) , und 4- (2- Aminoethyl ) benzensulfonylfluorid (AEBSF, auch bekannt unter dem Handelsnamen Pefabloc SC®) .

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist also ein Verfahren zur Herstellung eines Kontrollmaterials, das frei ist von therapeutischen Inhibitoren von Gerinnungsfaktoren aus der Gruppe der Serinproteasen und das zur Verwendung in einem Verfahren zur Kontrolle der Richtigkeit von Verfahren zur quantitativen Bestimmung von therapeutischen Inhibitoren von Gerinnungsfaktoren aus der Gruppe der Serinproteasen geeignet ist, das Verfahren zur Herstellung des Kontrollmaterials umfassend die Schritte:

(a) Lösen einer definierten Menge mindestens eines

unspezifischen Serinproteaseinhibitors in einer wässrigen

Pufferlösung, und

(b) Zuweisen eines ersten Zielwertes für die Konzentration eines ersten therapeutischen Gerinnungsfaktorinhibitors, wobei das Zuweisen des ersten Zielwertes für die

Konzentration des ersten therapeutischen

Gerinnungsfaktorinhibitors wie folgt durchgeführt wird: i) Vermischen einer ersten Teilmenge der in Schritt a)

hergestellten Lösung mit einer definierten Menge eines ersten Gerinnungsfaktors und mit einem Substrat mit

Spezifität für diesen Gerinnungsfaktor zu einem ersten Reaktionsansatz, ii) Messen der Menge eines Spaltprodukts des Substrats in dem ersten Reaktionsansatz, iii) Vergleichen der in dem ersten Reaktionsansatz gemessenen Menge des Spaltprodukts mit vorbestimmten

Kalibrationswerten, die die in dem ersten Reaktionsansatz gemessene Menge des Spaltprodukts einer bekannten

Konzentration des ersten therapeutischen

Gerinnungsfaktorinhibitors zuordnen, und Ermitteln der zu der gemessenen Menge des Spaltprodukts dazugehörigen

Konzentration des ersten therapeutischen

Gerinnungsfaktorinhibitors, und iv) Festlegen der so ermittelten Konzentration des ersten therapeutischen Gerinnungsfaktorinhibitors als ersten

Zielwert des Kontrollmaterials, wobei der erste therapeutische Gerinnungsfaktorinhibitor spezifisch den ersten Gerinnungsfaktor inhibiert und wobei der unspezifische Serinproteaseinhibitor den ersten

Gerinnungsfaktor und mindestens einen weiteren

Gerinnungsfaktor inhibiert.

Ein erfindungsgemäßes Kontrollmaterial ist immer frei von therapeutischen Gerinnungsfaktorinhibitoren. Es ist weiterhin vorzugsweise frei von Plasma, enthält also kein humanes und/oder tierisches Plasma. Vorzugsweise besteht ein

erfindungsgemäßes Kontrollmaterial aus einer wässrigen

Pufferlösung und dem darin gelösten unspezifischen

Serinproteaseinhibitor. Anstelle eines unspezifischen

Serinproteaseinhibitors kann auch eine Kombination von zwei oder mehr unspezifischen Serinproteaseinhibitoren in dem Kontrollmaterial enthalten sein. Geeignete wässrige

Pufferlösungen sind beispielsweise phosphatgepufferte

isotonische Kochsalzlösung (z.B. 0,05 M Natriumdihydrogen- phosphat, 0,9 % NaCl, pH-Wert 6,9 bis 7,3), imidazol- gepufferte isotonische Kochsalzlösung (z.B. 0,1 M Imidazol, 0,9 % NaCl, pH-Wert 6,9 bis 7,3), glycingepufferte

isotonische Kochsalzlösung (z.B. 0,1 M Glycin, 0,9 % NaCl, pH-Wert 8,0 bis 8,2), trisgepufferte isotonische

Kochsalzlösung (z.B. 0,1 M TRIS, 0,9 % NaCl, pH-Wert 6,9 bis 7,3) oder HEPES-Pufferlösung (z.B. 50 mM HEPES, pH-Wert 6,9 bis 7,4).

Gegebenenfalls kann ein Kontrollmaterial zusätzlich

Antioxidanzien, Konservierungsmittel und/oder bovines

Serumalbumin (BSA) enthalten.

Vorzugsweise enthält ein erfindungsgemäßes Kontrollmaterial nach dem Lösen eines unspezifischen Serinproteaseinhibitors in der Puffermatrix Benzamidin in einer Konzentration von 0.1 mM - 500 mM oder Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) in einer Konzentration von 0.1 mM - 500 mM oder 4- (2- Aminoethyl ) benzensulfonylfluorid (AEBSF) in einer

Konzentration von 0.1 mM - 500 mM. Im Zusammenhang mit der Herstellung eines erfindungsgemäßen Kontrollmaterials wird der durch Lösen einer definierten Menge des unspezifischen Serinproteaseinhibitors in einer wässrigen Pufferlösung bereitgestellten Lösung (die

Kontrolllösung) mindestens ein erster Zielwert für die

Konzentration eines ersten therapeutischen

Gerinnungsfaktorinhibitors zugewiesen . Dazu wird die Kontrolllösung mit einem solchen Testsystem analysiert wie eine später zu analysierende Patientenprobe, d.h. eine Teilmenge der Kontrolllösung wird mit

entsprechenden Reagenzien vermischt, die einen ersten

Gerinnungsfaktor und ein Substrat mit Spezifität für diesen Gerinnungsfaktor enthalten, und es wird die Menge eines

Spaltprodukts in dem so erhaltenen Reaktionsansatz gemessen. Die gemessene Menge des Spaltprodukts wird dann mit

vorbestimmten Kalibrationswerten verglichen. Die Kalibrationswerte werden in herkömmlicher Weise vorab bestimmt, d.h. es werden mindestens zwei

Kalibratormaterialien, üblicherweise humanes Normalplasma, das definierte Mengen des therapeutischen

Gerinnungsfaktorinhibitors enthält, in dem zu kalibrierenden Testsystem analysiert, die erhaltenen Messwerte werden den bekannten Konzentrationen des therapeutischen

Gerinnungsfaktorinhibitors zugeordnet, und es wird eine

Kalibrationskurve erstellt, an der anhand der Messwerte unbekannter Proben deren Konzentration abgelesen werden kann.

Die sich anhand eines solchen Vergleichs ergebende

Konzentration des therapeutischen Gerinnungsfaktorinhibitors der Kontrolllösung wird dieser dann als Zielwert zugewiesen. Unter dem Begriff „Zielwert" ist eine Konzentrationsangabe für einen therapeutischen Gerinnungsfaktorinhibitor zu verstehen (z.B. U/mL, mg/mL etc.), die -wenn dieser

therapeutische Gerinnungsfaktorinhibitor in diesem Kontrollmaterial in einem kalibrierten Testsystem quantitativ bestimmt wird- wiedergefunden werden soll. Der Begriff „Zielwert" umfasst explizit auch einen Zielwertbereich, der geringfügige, tolerable Abweichungen oberhalb und/oder unterhalb eines einzelnen Wertes umfasst.

Das Besondere an der vorliegenden Erfindung ist, dass einem erfindungsgemäß hergestellten Kontrollmaterial auch eine Vielzahl von Zielwerten (zwei, drei, vier, fünf, sechs oder mehr) für eine Vielzahl verschiedener therapeutischer

Gerinnungsfaktorinhibitoren (zwei, drei, vier fünf, sechs oder mehr) zugewiesen werden kann. Die verschiedenen

therapeutischen Gerinnungsfaktorinhibitoren können entweder für denselben Gerinnungsfaktor spezifisch sein (zum Beispiel mehrere unterschiedliche Thrombininhibitoren) , oder sie können für verschiedene Gerinnungsfaktoren spezifisch sein (zum Beispiel ein oder mehrere Thrombininhibitoren und ein oder mehrere Faktor Xa-Inhibitoren) . Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen

Verfahrens zur Herstellung eines Kontrollmaterials umfasst daher zusätzlich folgende Schritte:

(c) Zuweisen eines zweiten Zielwertes für die Konzentration eines zweiten therapeutischen Gerinnungsfaktorinhibitors, wobei das Zuweisen des zweiten Zielwertes für die

Konzentration des zweiten therapeutischen

Gerinnungsfaktorinhibitors wie folgt durchgeführt wird: i) Vermischen einer zweiten Teilmenge der in Schritt a)

hergestellten Lösung mit einer definierten Menge eines zweiten Gerinnungsfaktors und mit einem Substrat mit

Spezifität für diesen Gerinnungsfaktor zu einem zweiten Reaktionsansatz, ii) Messen der Menge eines Spaltprodukts des Substrats in dem zweiten Reaktionsansatz, iii) Vergleichen der in dem zweiten Reaktionsansatz

gemessenen Menge des Spaltprodukts mit vorbestimmten

Kalibrationswerten, die die in dem zweiten Reaktionsansatz gemessene Menge des Spaltprodukts einer bekannten

Konzentration des zweiten therapeutischen

Gerinnungsfaktorinhibitors zuordnen, und Ermitteln der zu der gemessenen Menge des Spaltprodukts dazugehörigen

Konzentration des zweiten therapeutischen

Gerinnungsfaktorinhibitors, und iv) Festlegen der so ermittelten Konzentration des zweiten therapeutischen Gerinnungsfaktorinhibitors als zweiten Zielwert des Kontrollmaterials, wobei der zweite therapeutische Gerinnungsfaktorinhibitor spezifisch den zweiten Gerinnungsfaktor inhibiert.

Das Zuweisen weiterer Zielwerte für die Konzentrationen weiterer (dritter, vierter, fünfter, sechster etc.)

therapeutischer Gerinnungsfaktorinhibitoren kann in analoger Weise erfolgen.

Auf diese Weise ist ein universales Kontrollmaterial für eine Vielzahl von Gerinnungsfaktorinhibitor-Testen (zwei, drei, vier fünf, sechs oder mehr) erhältlich.

Besonders bevorzugt ist die Herstellung eines

Kontrollmaterials, das zur Verwendung in einem Verfahren zur Kontrolle von einem ersten Verfahren zur quantitativen

Bestimmung eines ersten Thrombininhibitors und von einem zweiten Verfahren zur quantitativen Bestimmung eines ersten Faktor Xa-Inhibitors und ggf. von weiterer Verfahren zur quantitativen Bestimmung weiterer Gerinnungsfaktorinhibitoren geeignet ist. Dazu werden dem Kontrollmaterial, wie oben beschrieben, ein erster Zielwert für die Konzentration des ersten Thrombininhibitors, z.B. Dabigatran, und ein zweiter Zielwert für die Konzentration des ersten Faktor Xa- Inhibitors, z.B. Rivaroxaban, und ggf. weitere Zielwerte zugewiesen .

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung eines erfindungsgemäß hergestellten

Kontrollmaterials in einem Verfahren zur Kontrolle der

Richtigkeit eines Verfahrens zur quantitativen Bestimmung eines ersten therapeutischen Inhibitors eines

Gerinnungsfaktors aus der Gruppe der Serinproteasen in einer Probe, wobei der erste therapeutische

Gerinnungsfaktorinhibitor spezifisch einen ersten

Gerinnungsfaktor inhibiert.

Eine bevorzugte Verwendung eines erfindungsgemäß

hergestellten Kontrollmaterials bezieht sich auf die

Verwendung in einem ersten Verfahren zur Kontrolle der

Richtigkeit eines Verfahrens zur quantitativen Bestimmung des ersten therapeutischen Inhibitors eines Gerinnungsfaktors aus der Gruppe der Serinproteasen in einer Probe und/oder in einem zweiten Verfahren zur Kontrolle der Richtigkeit eines Verfahrens zur quantitativen Bestimmung des zweiten

therapeutischen Inhibitors eines Gerinnungsfaktors aus der Gruppe der Serinproteasen in einer Probe. Dies setzt voraus, dass dem Kontrollmaterial sowohl ein erster Zielwert für die Konzentration eines ersten therapeutischen

Gerinnungsfaktorinhibitors und ein zweiter Zielwert für die Konzentration eines zweiten therapeutischen

Gerinnungsfaktorinhibitors zugewiesen sind. Wie bereits oben erläutert, kann ein erfindungsgemäß hergestelltes

Kontrollmaterial, dem noch weitere Zielwerte für die

Konzentrationen weiterer (dritter, vierter, fünfter, sechster etc.) therapeutischer Gerinnungsfaktorinhibitoren zugewiesen sind, auch in weiteren Verfahren zur Kontrolle der

Richtigkeit von Verfahren zur quantitativen Bestimmung der weiteren therapeutischen Inhibitoren (dritter, vierter, fünfter, sechster etc.) von Gerinnungsfaktoren aus der Gruppe der Serinproteasen in einer Probe verwendet werden. Ein Verfahren zur Kontrolle der Richtigkeit eines Verfahrens zur quantitativen Bestimmung eines therapeutischen Inhibitors eines Gerinnungsfaktors aus der Gruppe der Serinproteasen umfasst die Analyse des Kontrollmaterials in demselben

Testsystem (hinsichtlich der Analysemethode und Messsystem) , mit dem auch Patientenproben analysiert werden.

Bei der Kontrolle der Richtigkeit eines analytischen

Verfahrens handelt es sich um ein Verfahren zur

Qualitätssicherung, das sicherstellen soll, dass die

Ergebnisse eines in einem Labor angewandten analytischen Verfahrens zuverlässig sind und nicht etwa aufgrund eines systematischen Fehlers zu Fehlbeurteilungen führen könnten. Dazu wird geprüft, ob das mit einer Kontrollprobe ermittelte Analyseergebnis dem der Kontrollprobe zugewiesenen Zielwert (oder Zielwertebereich) entspricht. Stellt sich heraus, dass das mit einer Kontrollprobe ermittelte Analyseergebnis dem Zielwert der Kontrollprobe entspricht, wird festgestellt, dass das analytische Verfahren zuverlässig funktioniert und richtige Ergebnisse liefert. Stellt sich heraus, dass das mit einer Kontrollprobe ermittelte Analyseergebnis dem Zielwert der Kontrollprobe nicht entspricht, wird festgestellt, dass das analytische Verfahren nicht zuverlässig funktioniert und dass die Ergebnisse dieses analytischen Verfahrens wegen des Risikos von Fehlbeurteilungen nicht zur Beurteilung von

Patientenproben verwendet werden sollten.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist also ein Verfahren zur Kontrolle der Richtigkeit eines Verfahrens zur quantitativen Bestimmung eines therapeutischen Inhibitors eines ersten Gerinnungsfaktors aus der Gruppe der

Serinproteasen in einer Patientenprobe, wobei der erste therapeutische Gerinnungsfaktorinhibitor spezifisch den ersten Gerinnungsfaktor inhibiert. Das Verfahren zur

quantitativen Bestimmung des therapeutischen

Gerinnungsfaktorinhibitors umfasst folgende Schritte: a. Vermischen der Patientenprobe mit einer definierten Menge des ersten Gerinnungsfaktors und mit einem Substrat mit Spezifität für diesen Gerinnungsfaktor zu einem Reaktionsansatz,

b. Messen der Menge eines Spaltprodukts des Substrates in dem Reaktionsansatz,

c. Vermischen von mindestens zwei Kaiibratorproben, die jeweils eine definierte Menge des therapeutischen Gerinnungsfaktorinhibitors enthalten, mit derselben definierten Menge des ersten Gerinnungsfaktors und mit demselben Substrat mit Spezifität für diesen Gerinnungsfaktor zu jeweils einem

Kalibratorreaktionsansatz,

d. Messen der Menge desselben Spaltprodukts des

Substrates in den Kalibratorreaktionsansätzen und Erstellen von Kalibrationswerten, die die in den Kalibratorreaktionsansätzen gemessene Menge des Spaltprodukts einer bekannten Konzentration des ersten therapeutischen Gerinnungsfaktorinhibitors zuordnen, und Ermitteln der zu der gemessenen Menge des Spaltprodukts dazugehörigen Konzentration des ersten therapeutischen Gerinnungsfaktorinhibitors in der Patientenprobe, und

e. Bestimmen der Menge des in der Patientenprobe

enthaltenen therapeutischen

Gerinnungsfaktorinhibitors durch Vergleichen der in dem Reaktionsansatz gemessenen Menge des

Spaltprodukts mit den Kalibrationswerten.

Zur Kontrolle der Richtigkeit des Verfahrens zur

quantitativen Bestimmung des therapeutischen

Gerinnungsfaktorinhibitors werden zusätzliche folgende

Schritte durchgeführt: i) Vermischen einer Kontrollprobe bestehend aus einer Teilmenge eines erfindungsgemäß hergestellten Kontrollmaterials mit derselben definierten Menge des ersten Gerinnungsfaktors und mit demselben Substrat mit Spezifität für diesen Gerinnungsfaktor zu einem Kontrollreaktionsansatz,

ii) Messen der Menge desselben Spaltprodukts des

Substrates in dem Kontrollreaktionsansatz ,

iii) Vergleichen der in dem Kontrollreaktionsansatz

gemessenen Menge des Spaltprodukts mit den

Kalibrationswerten und Ermitteln der Konzentration des ersten therapeutischen Gerinnungsfaktorinhibitors in der Kontrollprobe, und

A. Feststellen, dass die Richtigkeit des Verfahrens zur quantitativen Bestimmung des therapeutischen Gerinnungsfaktorinhibitors in der Patientenprobe gegeben ist, wenn die in Schritt iii) in der Kontrollprobe ermittelte Konzentration des ersten therapeutischen

Gerinnungsfaktorinhibitors dem ersten Zielwert für die Konzentration eines ersten therapeutischen Gerinnungsfaktorinhibitors der Kontrollprobe entspricht oder

B. Feststellen, dass die Richtigkeit des Verfahrens zur quantitativen Bestimmung des therapeutischen Gerinnungsfaktorinhibitors nicht gegeben ist, wenn die in Schritt iii) in der Kontrollprobe ermittelte Konzentration des ersten therapeutischen Gerinnungsfaktorinhibitors von dem ersten Zielwert für die Konzentration eines ersten therapeutischen

Gerinnungsfaktorinhibitors der Kontrollprobe abweicht .

Wenn im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung die Rede ist von einem Verfahren zur quantitativen Bestimmung eines therapeutischen Gerinnungsfaktorinhibitors umfassend die Schritte :

a. Vermischen einer Probe mit einer definierten Menge eines Gerinnungsfaktors und mit einem Substrat mit Spezifität für diesen Gerinnungsfaktor zu einem Reaktionsansatz, und b. Messen der Menge eines Spaltprodukts des Substrates in dem Reaktionsansatz, handelt es sich im Wesentlichen um aus dem Stand der Technik bekannte Gerinnungsfaktoraktivitätsteste, die die Messung der Hemmung der Gerinnungsfaktoraktivität ermöglichen.

Unter einer „Probe" ist im Sinne der Erfindung das Material zu verstehen, das den zu bestimmenden direkten

Gerinnungsinhibitor vermutlich enthält. Der Begriff Probe umfasst insbesondere menschliche oder tierische

Körperflüssigkeiten, vornehmlich Blut, Plasma, Serum und Urin. Sofern die Probe von einem einzigen Individuum stammt wird sie auch als Patientenprobe bezeichnet.

Die Probe kann beispielsweise einem konventionellen

Gerinnungsfaktoraktivitätstest unterworfen werden, wobei der Probe eine definierte Menge desjenigen aktivierten

Gerinnungsfaktors zugegeben wird, für welchen der zu

bestimmende direkte Gerinnungsinhibitor spezifisch ist. Bei einem Verfahren zur Bestimmung eines Thrombininhibitors wird konsequenterweise eine definierte Menge Thrombin zugegeben; bei einem Verfahren zur Bestimmung eines Faktor Xa-Inhibitors wird eine definierte Menge Faktor Xa zugegeben, und die

Inhibitor-abhängige Inaktivierung der Aktivität des

zugegebenen Gerinnungsfaktors wird gemessen. Grundsätzlich können rekombinante, gentechnisch hergestellte oder aus natürlichem oder in vitro-kultiviertem Rohmaterial isolierte Gerinnungsfaktoren verwendet werden. Rohmaterialien für die Gewinnung eines Gerinnungsfaktors können z.B. tierische, beispielsweise bovine, oder humane Gewebe oder

Körperflüssigkeiten (z.B. Blut, Plasma, Lymphflüssigkeit) sein, Überstände oder Lysate tierischer oder humaner

Zellkulturen oder Kulturen eukaryontischer Zellen oder von Mikroorganismen, wie Bakterien oder Pilzen, die einen

rekombinante Gerinnungsfaktor exprimieren. Die notwendigen Schritte zur Aktivierung inaktiver Gerinnungsfaktoren sind dem Fachmann hinlänglich bekannt. Bevorzugterweise wird die Inhibitor-abhängige Inaktivierung der amidolytischen Aktivität des zugegebenen

Gerinnungsfaktors mit Hilfe eines chromogenen, fluorogenen, amperogenen oder anderweitig markierten Substrats ermittelt, das spezifisch von dem aktivierten Gerinnungsfaktor gespalten wird. Unter einem „Substrat mit Spezifität für einen

Gerinnungsfaktor" ist ein Substrat zu verstehen, das

hinreichend spezifisch von einem proteolytischen

Gerinnungsfaktor umgesetzt wird, wobei bei der spezifischen Substratumsetzung ein nachweisbares Spaltprodukt freigesetzt wird. Insbesondere spaltbare Substrate, welche mindestens eine Spaltstelle für einen aktivierten Gerinnungsfaktor aufweisen, sind dem Fachmann hinlänglich bekannt. Ein

spaltbares Substrat kann ein synthetisch, rekombinant oder biotechnologisch hergestelltes Molekül oder ein natürliches Molekül sein, das durch Einwirken des aktivierten

proteolytischen Gerinnungsfaktors in zwei Spaltprodukte zerlegt wird. Ein spaltbares Substrat kann ganz oder

teilweise aus einem Peptid bestehen. Bevorzugterweise umfasst es zumindest im Bereich der Spaltstelle einen Peptidanteil.

Bei der abspaltbaren Signalgruppe („Label") eines Substrats kann es sich z.B. um einen im sichtbaren Bereich des

Spektrums bestimmbaren Farbstoff, einen Fluoreszenzfarbstoff oder einen im UV-Bereich bestimmbaren Farbstoff handeln.

Beispielsweise werden Peptide verwendet, die an der

Carboxygruppe eines Argininrests einen durch Amidbindung gebundenen Farbstoffrest aufweisen. Besonders geeignet sind hierfür p-Nitroanilidgruppen (pNA) und 5-Amino-2-Nitro- Benzoesäurederivate (ANBA) , sowie von diesen durch

Substitution abgeleitete Farbstoffe, welche nach Abspaltung vom Peptidanteil durch eine photometrische Messung bei 405 nm Wellenlänge quantifiziert werden können. Bevorzugterweise besteht der Peptidanteil eines spaltbaren Substrats aus 3 bis etwa 150 Aminosäureresten. In den Patentdokumenten EP-AI - 0034122 und US 4,508,644 sind eine Vielzahl von geeigneten chromogenen Peptidsubstraten, deren Herstellung und deren Verwendung in gerinnungsdiagnostischen Tests beschrieben, z.B. zur Bestimmung der Gerinnungsfaktoren Thrombin und Xa .

Die Menge des freigesetzten signalbildenden Spaltprodukts, z.B. der chromogenen, fluorogenen oder amperogenen Gruppe, verhält sich umgekehrt proportional zur Inhibitoraktivität bzw. -konzentration in der Probe. Mit Hilfe einer

Kalibrationskurve, erstellt aus der Messung von

Kalibratorlösungen mit bekannten Aktivitäten eines

therapeutischen Inhibitors, lässt sich die Menge des

Inhibitors in einer Patientenprobe korrekt quantifizieren.

Die amidolytische Aktivität kann kinetisch oder als

Endpunktbestimmung ausgewertet werden. Bei der kinetischen Methode wird die Reaktion, d.h. die verbliebene

Gerinnungsfaktoraktivität als Maß für die vorhandene

Inhibitoraktivität, anhand der Umsatzrate des spaltbaren Substrats quantifiziert. Bei der Endpunktbestimmung wird nach einer vorbestimmten Messzeit die Spaltreaktion gestoppt und die Menge des freigesetzten Spaltprodukts gemessen.

Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung und sind nicht als Einschränkung zu verstehen.

BEISPIELE

BEISPIEL 1: Herstellung universaler Kontrollmaterialien für die Bestimmung eines Thrombin- und eines Faktor Xa-Inhibitors

Es sollten universale Kontrollmaterialien bereitgestellt werden, die gleichermaßen zur Qualitätskontrolle eines Tests zur quantitativen Bestimmung von Dabigatran (therapeutischer Thrombininhibitor) und eines Tests zur quantitativen

Bestimmung von Rivaroxaban (therapeutischer Faktor Xa- Inhibitor) verwendbar sind.

Bei dem Test zur quantitativen Bestimmung von Dabigatran wird in einem automatischen Analysegerät die Probe mit einem

Reagenz I enthaltend eine definierte Thrombinmenge und mit einem Reagenz II enthaltend eine definierte Menge eines durch Thrombin hydrolysierbaren Substrates (Tos-Gly-Pro-Arg-ANBA- Isopropylamid) vermischt, und es wird die Geschwindigkeit des Anstiegs der Absorption des Reaktionsansatzes bei 405 nm gemessen, welche ein Maß für die Substratspaltung durch

Thrombin darstellt. Die absoluten Messwerte werden mit einer zuvor in demselben Messsystem (Reagenzien und Analysegerät) bestimmten Kalibrationskurve verglichen und so die

Dabigatran-Konzentration (ng/mL) bestimmt. Die

Kalibrationskurve war zuvor mit Kaiibratorplasmen mit

bekannter Dabigatran-Konzentration erstellt worden.

Bei dem Test zur quantitativen Bestimmung von Rivaroxaban wird in einem automatischen Analysegerät die Probe mit einem Reagenz I enthaltend eine definierte Faktor Xa-Menge und mit einem Reagenz II enthaltend eine definierte Menge eines durch Faktor Xa hydrolysierbaren Substrates (Suc-Ile-Glu (piperidin- 1-yl ) -Gly-Arg-pNA) vermischt, und es wird die Geschwindigkeit des Anstiegs der Absorption des Reaktionsansatzes bei 405 nm gemessen, welche ein Maß für die Substratspaltung durch

Faktor Xa darstellt. Die absoluten Messwerte werden mit einer zuvor in demselben Messsystem (Reagenzien und Analysegerät) bestimmten Kalibrationskurve verglichen und so die Rivaroxaban-Konzentration (ng/mL) bestimmt. Die

Kalibrationskurve war zuvor mit Kaiibratorplasmen mit

bekannter Rivaroxaban-Konzentration erstellt worden.

Durch Lösen des unspezifischen Serinproteaseinhibitors

Benzamidin oder alternativ des unspezifischen

Serinproteaseinhibitors 4- (2-Aminoethyl) benzensulfonylfluorid (AEBSF, Pefabloc SC®, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim,

Deutschland) in HEPES/BSA-Puffer-Lösung (0,05 M HEPES, 10 g/L BSA, pH-Wert 7,4) wurden Kontrolllösungen mit

unterschiedlicher Benzamidinkonzentration (im Bereich

zwischen 3 mM und 100 mM) oder alternativ mit

unterschiedlicher AEBSF-Konzentration (im Bereich zwischen 5 mg/mL und 50 mg/mL) hergestellt.

Einzelnen Kontrolllösungen wurden jeweils Zielwerte für die Konzentration von Dabigatran und Rivaroxaban zugewiesen, indem jeweils mehrfach ein Aliquot jeder Kontrolllösung als Probe in den oben beschriebenen Dabigatran- und Rivaroxaban- Testen analysiert wurde und die Messergebnisse mit zuvor mit Kaiibratorplasmen mit bekannter Dabigatran- bzw. Rivaroxaban- Konzentration erstellten Kalibrationskurven verglichen wurden .

Die so ermittelte Dabigatran- bzw. Rivaroxaban-Konzentration, die dann der jeweiligen Kontrolllösung als Zielwerte

zugeordnet wurden und die davon abgeleiteten Zielwertbereiche (in Klammern) für die ausgewählten Kontrolllösungen sind in Tabelle 1 (Benzamidin-Kontrolllösungen) und Tabelle 2 (AEBSF- Kontrolllösungen) zusammengestellt . Zielwerte ausgewählter erfindungsgemä Benzamidin-Kontrolllösungen

Zielwerte ausgewählter erfindungsgemäß AEBSF-Kontrolllösungen

Wird in einem Messsystem in den Kontrolllösungen eine

Dabigatran- bzw. Rivaroxaban-Konzentration bestimmt, die dem deklarierten Zielwert entspricht bzw. innerhalb des

Zielwertbereiches liegt, zeigt dies die Richtigkeit des in dem Messsystem durchgeführten Verfahrens zur quantitativen Bestimmung des therapeutischen Gerinnungsfaktorinhibitors an. Wird hingegen in den Kontrolllösungen eine Dabigatran- bzw. Rivaroxaban-Konzentration bestimmt, die von dem deklarierten Zielwert abweicht bzw. außerhalb des Zielwertbereiches liegt, zeigt dies an, dass die Richtigkeit des in dem Messsystem durchgeführten Verfahrens zur quantitativen Bestimmung des therapeutischen Gerinnungsfaktorinhibitors nicht gegeben ist. Im letzteren Fall sollten Ergebnisse, die für Patientenproben ermittelt wurden, nicht für diagnostische Zwecke verwendet werden .