La présente invention a pour objet de nouvelles amorces universelles, ainsi que leur utilisation pour la détection et/ou G identification d'espèces végétales du genre Cucumis notamment dans des substrats complexes ou dégradés.

La Famille des Cucurbitacées contient environl5 tribus- 120 genres-900 espèces (Renner et al., (2013) The Cucurbitaceae of India: Accepted names, synonyms, géographie distribution, and information on images and DNA sequences ). De nombreuses espèces du genre Cucumis sont cultivées pour leurs fruits comestibles (courges, courgettes, concombres, cornichons, melons, pastèques, chayotes, etc.) et parfois pour leurs graines (courge à huile, pistache africaine).

Les différentes méthodes permettant l'identification de végétaux basées sur l'analyse du génome sont connues. Par exemple, le «DNA barcoding» est l’une des méthodes de biologie moléculaire permettant de déterminer les espèces présentes dans un échantillon grâce à la présence d’une signature génétique, également appelé marqueur. Ce marqueur est un fragment d’ADN encadré par des régions très conservées et donc universelles, et qui, une fois séquencé, montre des variations de séquences génétiques entre individus d'espèces différentes et des séquences identiques entre individus d'une même espèce (Hebert, Paul DN et al., (2003) Biological identifications through DNA barcodes).

La délimitation des espèces, grâce au «DNA barcoding», est basée sur le ratio « divergence intraspécifique/divergence interspécifique » (Hebert, Paul DN et al., (2004) Identification of birds through DNA barcodes). Ce ratio est appelé le «barcoding gap».

D'un point de vue théorique, le séquençage d'une région homologue suffisamment longue (plusieurs centaines de paires de bases) permet l'identification d’une espèce chez les végétaux. Une telle région doit être encadrée par des zones très conservées autorisant la conception d'amorces universelles pour l'amplification. En ce qui concerne l'ADN nucléaire, les ITS (Internai Transcripted Spacer de l'ADN ribosomique) ont été utilisés pour la détection et l'identification de végétaux. Des amorces universelles ont été décrites chez les champignons et se sont avérées fonctionner également chez les végétaux. De ce fait, cette région de quelques centaines de paires de bases a été utilisée pour effectuer des phylogénies entre espèces proches chez les végétaux (Renaud Lahaye et al. (2008) DNA barcoding the floras of biodiversity hotspots). Cependant, l’ADN nucléaire possède des inconvénients. En effet, les régions identifiées sont trop longues pour être utilisées dans le cas de substrats très dégradés. De plus, les amorces peuvent amplifier plusieurs types de séquence au sein d'une même espèce. Enfin, les amorces ne sont pas réellement universelles et il peut être difficile d'obtenir une amplification chez certaines espèces.

Par ailleurs, les ADN mitochondriaux et chloroplastiques ont également été étudiés, car ils sont présents de manière hautement répétées dans chaque cellule (plusieurs centaines de copies). Il en résulte qu'ils représentent une cible pour l'amplification beaucoup plus accessible dans le cas de substrats dégradés. L'ADN mitochondrial ou chloroplastique est cependant trop peu variable chez les végétaux. Plusieurs articles décrivent des amorces universelles ciblant différentes régions de l'ADN chloroplastique (Bafeel S. O., et al., (2012) DNA barcoding of arid wild plants using rbcL gene sequences ) qui montrent par exemple que le gène rbcL permet l’identification de seulement 17% des espèces de plantes étudiées.

Ainsi, les solutions proposées pour l’identification spécifique d’espèces de plantes ne sont pas complètement satisfaisantes car elles concernent soit des séquences trop longues pour être efficaces dans l'analyse de substrats dégradés, soit des fragments trop courts dont le niveau de variabilité n'est pas assez élevé pour être vraiment utile dans leur identification.

Les marqueurs pouvant être utilisés communément pour la détermination et/ou l’identification d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus restent encore à être identifiés. En effet, il n’existe pas, à ce jour, de marqueur suffisamment variable et possédant des amorces universelles pour permettre une bonne résolution par le «DNA barcoding» chez ces espèces. Ceci est d’autant plus vrai pour l’analyse par le «DNA barcoding» de substrats dégradés.

La détermination et/ou l’identification de plantes à partir d’ADN dégradé est très importante, notamment à des fins de contrôle-qualité de produits alimentaires, de compléments alimentaires ou cosmétiques pour lesquels l’utilisation de plantes connaît un succès croissant. Néanmoins, les régions d’ADN de plante suffisamment courtes (pour pouvoir analyser des échantillons d’ADN dégradé) et suffisamment variables (pour permettre de déterminer et/ou d’identifier les plantes, notamment les espèces de plantes) sont rares et à ce jour aucune n'a été caractérisée. De plus, il n’existe pas d’amorces universelles encadrant un tel fragment d’ADN d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus (de taille comprise de 90 et 120 paires de bases) permettant d’amplifier de l’ADN dégradé.

11 existe donc un réel de besoin de pouvoir déterminer et/ou identifier une plante choisie dans le genre Cucumis à partir d’ADN dégradé.

11 existe également un réel besoin de déterminer des régions d’ADN d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus suffisamment courtes et suffisamment variables pour pouvoir être utilisées dans la détermination et/ou l’identification desdites plantes.

11 existe aussi un réel besoin de déterminer des amorces universelles permettant d’amplifier les régions d’ADN desdites plantes suffisamment courtes et suffisamment variables, notamment de nouvelles amorces universelles permettant d’amplifier de l’ADN dégradé (de taille comprise entre 90 et 120 paires de bases). Il existe aussi un réel besoin de déterminer un marqueur suffisamment variable et possédant des amorces universelles pour permettre une bonne résolution par le «DNA barcoding» d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus.

C’est pourquoi l’un des buts de l’invention est de fournir des régions d’ADN desdites plantes suffisamment courtes et suffisamment variables pour pouvoir être utilisées dans la détermination et/ou l’identification d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus.

L’un des buts de l’invention est également de fournir des amorces universelles permettant d’amplifier lesdites régions d’ADN d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus suffisamment courtes et suffisamment variables.

L’un des buts de l’invention est aussi de fournir un procédé de détermination et/ou d’identification d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus à partir d’ADN dégradé.

DESCRIPTION DE L'INVENTION

Pour remédier aux inconvénients de l'état de la technique, la présente invention propose de nouvelles amorces universelles, ainsi que leur utilisation pour la détection et/ou l’identification d’une plante du genre Cucumis, en particulier choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus.

La présente invention repose également sur la détermination, par les inventeurs, (i) de régions d’ADN d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus suffisamment courtes et suffisamment variables pour pouvoir être utilisées dans la détermination et/ou l’identification desdites espèces, et (ii) des amorces universelles permettant d’amplifier lesdites régions d’ADN desdites espèces.

Ces régions courtes d’ADN desdites espèces constituent des marqueurs dits «courts» et ont été identifiées dans le gène NdhA (codant la sous-unité 1 de la NADH plastoquinone oxydoreductase) des plantes choisies parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus.

La présente invention concerne ainsi Tutilisation d’une paire d’amorces pour la détection et/ou l’identification d’une plante choisie dans le genre Cucumis et plus particulièrement parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus dans un échantillon susceptible d’en contenir, par l’amplification d’au moins une région variable du gène NdhA, ladite région variable du gène NdhA constituant un marqueur de détection et de préférence d’identification d’au moins une desdites espèces. La présente invention concerne aussi les amorces (ou oligonucléotides), notamment les paires d’amorces, les séquences cibles desdites amorces, et les régions amplifiées per se.

La présente invention concerne aussi rutilisation des régions amplifiées pour la détermination et/ou l’identification d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus.

La présente invention concerne aussi rutilisation d’une paire d’amorces pour la détection et de préférence l’identification d’une plante choisie parmi lesdites espèces, dans laquelle l’espèce est Cucumis melo.

La présente invention concerne aussi rutilisation d’une paire d’amorces pour la détection et de préférence l’identification d’une plante choisie parmi lesdites espèces, dans laquelle la paire d’amorces consiste en une première amorce (un premier oligonucléotide) qui s’hybride à une séquence de 15 à 30 nucléotides contigus, choisie dans la séquence de SEQ ID NO: 1 du gène NdhA et une deuxième amorce (un deuxième oligonucléotide) qui s’hybride a une séquence de 15 à 30 nucléotides contigus, choisie dans la séquence de SEQ ID NO: 2 du gène NdhA.

La présente invention concerne également l’utilisation d’une paire d’amorces dans laquelle:

-la première amorce s’hybride à une séquence de 15 à 30 nucléotides contigus choisie dans la séquence de SEQ ID NO: 1 du gène NdhA , et

-la deuxième amorce s’hybride à une séquence de 15 à 30 nucléotides contigus choisie dans la séquence de SEQ ID NO: 2 du gène NdhA,

pour la détection et/ou l’identification d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus dans un échantillon susceptible d’en contenir, par amplification d’au moins une région variable du gène NdhA, ladite région variable constituant un marqueur de détection et/ou d’identification d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus.

Selon la présente invention, les séquences SEQ ID NO: 1 et SEQ ID NO: 2 sont situées respectivement de la position 122821 à la position 122850 et de la position 122957 à la position 122986 sur le chloroplaste de Cucumis melo (n° Accession Genbank: JF412791.1). Le gène NdhA se situe entre les positions 121617 et 123867 sur le chloroplaste de Cucumis melo.

Selon la présente invention, les termes «amorce» et «oligonucléotide» sont interchangeables. Une amorce ou un oligonucléotide signifie une courte séquence de nucléotides, dont le nombre varie d'une dizaine à environ 100 bases (ou 100 nucléotides en considérant la présence d’un ose et d’un, de deux ou de trois groupes phosphate; la relation base/nucléotides étant bien connue de l’homme du métier). Ainsi, l’expression «paire d’amorces ou paire d’oligonucléotides» fait référence à l’association de deux oligonucléotides. Les deux oligonucléotides formant la paire d’oligonucléotides (amorces) n’ont pas nécessairement la même taille: par exemple le premier oligonucléotide qui s’hybride à la séquence de SEQ ID NO: 1 peut comprendre 21 nucléotides et le deuxième oligonucléotide qui s’hybride à une séquence de 15 à 30 nucléotides contigus choisie dans la séquence de SEQ ID NO: 2 peut comprendre 20 nucléotides, par exemple.

Dans un aspect particulier de l’invention, le premier oligonucléotide correspond à une amorce sens et le deuxième oligonucléotide correspond à une amorce anti-sens.

Le terme «contigus» signifie que les oligonucléotides s’hybrident aux 15 à 30 nucléotides successifs, situés les uns à la suite des autres, sans discontinuité.

Le terme « SEQ ID NO: 1» doit s’entendre comme une séquence de SEQ ID NO : 1 ou une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% avec ladite SEQ ID NO : 1, notamment 95% et plus particulièrement 98% ou 99%.

Le terme «SEQ ID NO: 2» doit s’entendre comme une séquence de SEQ ID NO : 2 ou une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% avec ladite SEQ ID NO : 2, notamment 95% et plus particulièrement 98% ou 99%.

Le terme «détection» signifie que l’utilisation de la paire d’oligonucléotides susmentionnée permet de conclure quant à la présence ou à l’absence de plante dans l’échantillon testé.

Le terme «identification» signifie que l’utilisation de la paire d’oligonucléotides susmentionnée permet d’identifier une plante présente dans l’échantillon testé comme étant une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus, Cucumis sativus et Cucumis melo.

L’expression «la détection et/ou l’identification» signifie «la détection» ou «l’identification» ou «la détection et l’identification», et plus particulièrement «l’identification».

L’expression «échantillon susceptible d’en contenir» signifie que l’échantillon peut comprendre ou peut ne pas comprendre une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus, et notamment peut comprendre ou peut ne pas comprendre d’ADN d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus.

Le terme «hybrider» signifie que les amorces (ou oligonucléotides) formant la paire d’amorces (ou paire d’oligonucléotides) de l’invention s'hybrident avec une séquence «marqueur» de référence du gène NdhA (notamment les séquences de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2) à un niveau supérieur au bruit de fond de manière significative. Le niveau du signal généré par l'interaction entre la séquence capable de s'hybrider de manière sélective (les séquences formant la paire d’amorces d’oligonucléotides) et les séquences de référence (les séquences cibles) est généralement 10 fois, de préférence 100 fois plus intense que celui de l'interaction des autres séquences d'ADN générant le bruit de fond. Les conditions d'hybridation stringentes permettant une hybridation sélective sont bien connues de l'homme du métier.

L’expression «conditions de stringence suffisantes» signifie par exemple une température d’hybridation de 40-65°C, de préférence de 50-60°C, notamment 53-58°C, et plus particulièrement 53°C, 55°C, 58°C dans un tampon d’amplification d’une concentration saline comprise de 0,001 à 0,5M notamment comprenant du MgCfi 2mM.

La présente invention a pour autre objet, l’utilisation d’une paire d’amorces, dans laquelle ledit premier oligonucléotide ou ledit deuxième oligonucléotide de la paire d’amorces s’hybride à sa séquence cible respective choisie parmi les séquences SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO:2 du gène NdhA, à une température comprise de 40 à 65°C, et plus particulièrement de 50-60°C et une concentration saline comprise de 0,001 à 0,5 M, et plus particulièrement de 0,05 à 0,1 M, et encore plus particulièrement de à 0,001 à 0,005M.

L’expression «amplification d’au moins une région variable du gène NdhA» fait référence à toute amplification enzymatique in vitro d'une séquence définie d'ADN du gène NdhA, par exemple par une réaction d'amplification en chaîne par polymérase (PCR).

L’expression «ladite région variable constituant un marqueur de détection et/ou d’identification d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus» signifie que la région variable du gène NdhA qui est amplifiée constitue une région d’ADN de plante suffisamment courte et suffisamment variable pour pouvoir détecter et/ou identifier une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus.

Dans un autre aspect particulier, l’invention concerne l’utilisation d’une paire d’amorces dans laquelle :

- la première amorce a une séquence de 15 à 30 nucléotides contigus choisie dans la séquence de SEQ ID NO: 3 ou une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% avec ladite SEQ ID NO : 3, et

- la deuxième amorce a une séquence de 15 à 30 nucléotides contigus choisie dans la séquence de SEQ ID NO: 4 ou une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% avec ladite SEQ ID NO : 4.

Plus particulièrement, l’invention concerne l’utilisation d’une paire d’amorces dans laquelle :

- la première amorce a une séquence de 15 à 30 nucléotides contigus choisie dans la séquence de SEQ ID NO: 3, et

- la deuxième amorce a une séquence de 15 à 30 nucléotides contigus choisie dans la séquence de SEQ ID NO: 4,

pour la détection et/ou l’identification d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus dans un échantillon susceptible d’en contenir, par amplification d’au moins une région variable du gène NdhA, ladite région variable constituant un marqueur de détection et/ou d’identification d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus.

Dans un autre aspect préféré, ladite première amorce s’hybride à une séquence d’au moins 20 nucléotides contigus choisie dans la séquence de SEQ ID NO: 1 du gène NdhA et a une séquence d’au moins 20 nucléotides contigus choisie dans la séquence de SEQ ID NO: 3.

Dans un autre aspect préféré, ladite deuxième amorce s’hybride à une séquence d’au moins 20 nucléotides contigus choisie dans la séquence de SEQ ID NO: 2 du gène NdhA et a une séquence d’au moins 20 nucléotides contigus choisie dans la séquence de SEQ ID NO: 4.

L’expression «d’au moins 15 nucléotides contigus » signifie par exemple 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucléotides contigus.

Le terme « SEQ ID NO : 3 » doit s’entendre comme une séquence de SEQ ID NO : 3 ou une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% avec ladite SEQ ID NO : 3, notamment 95% et plus particulièrement 98% ou 99%.

Le terme « SEQ ID NO : 4 » doit s’entendre comme une séquence de SEQ ID NO : 4 ou une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% avec ladite SEQ ID NO : 4, notamment 95% et plus particulièrement 98% ou 99%.

Dans un aspect particulier, l’invention concerne l’utilisation d’une paire d’amorces dans laquelle la première amorce a une séquence de 15 à 30 nucléotides contigus choisie dans le groupe constitué par l’une des séquences suivantes: SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO : 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO : 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, ou SEQ ID NO: 47. Bien entendu, lesdites séquences constituent des exemples non limitatifs de séquences de 15 à 30 nucléotides choisies dans la séquence de SEQ ID NO:3 pouvant être utilisées dans le cadre de la présente invention.

Dans un aspect particulier, l’invention concerne l’utilisation d’une paire d’amorces susmentionnée, dans laquelle la deuxième amorce a une séquence de 15 à 30 nucléotides contigus choisie dans le groupe constitué par l’une des séquences suivantes: SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO : 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO : 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72,

SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO : 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO:

78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, ou SEQ ID NO: 83. Bien entendu, lesdites séquences constituent des exemples non limitatifs de séquences de 15 à 30 nucléotides choisies dans la séquence de SEQ ID NO: 4 pouvant être utilisées dans le cadre de la présente invention.

Dans un aspect particulier, l’invention concerne rutilisation d’une paire d’amorces susmentionnée, dans laquelle ladite région variable du gène NdhA qui est amplifiée a une taille comprise de 90 à 120 paires de bases

L’expression « une taille comprise de 90 à 120 paires de bases » signifie notamment 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 116, 117, 118, 119 ou 120 paires de bases.

Dans un aspect particulier, l’invention concerne rutilisation d’une paire d’amorces susmentionnée, dans laquelle ladite région variable du gène NdhA comprend ou consiste en une séquence choisie dans le groupe constitué par: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, ou SEQ ID NO: 11, ou une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 90% avec ladite séquence et notamment 95% et plus particulièrement 98% ou 99%.

Selon la présente invention, la séquence SEQ ID NO: 5 représente une séquence consensus pour laquelle les letres «K», «M» et «W» représentent un nucléotide choisi parmi A, T, C ou G. De préférence «K» représente un «T ou G», «M» représente un «A ou C», et «W» représente un «A ou T».

Dans un aspect particulier, l’invention concerne rutilisation d’une paire d’amorces susmentionnée, dans laquelle ledit échantillon est un produit qui est susceptible de contenir au moins une molécule d’ADN d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus.

Dans un aspect particulier, l’invention concerne rutilisation d’une paire d’amorces susmentionnée, dans laquelle ledit échantillon est un produit qui comprend ou consiste en au moins une molécule d’ADN d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus.

Dans un aspect particulier, l’invention concerne l’utilisation d’une paire d’amorces susmentionnée, dans laquelle ledit échantillon est un produit qui ne comprend pas au moins une molécule d’ADN d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus.

Dans un aspect encore plus particulier, lorsque ladite molécule d’ADN d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus correspond au gène NdhA (ou un fragment dudit gène NdhA), alors la molécule d’ADN, correspondant à la partie amplifiée, possède au maximum 120 paires de bases, selon la détermination ci-après: la séquence de l’amorce sens (20 paires de bases par exemple) + les fragments correspondant à la région amplifiée (90 à 120 paires de bases) + la séquence de l’amorce anti-sens (20 paires de bases par exemple).

Dans un aspect particulier, l’invention concerne l’utilisation d’une paire d’amorces susmentionnée, dans laquelle ledit échantillon est choisi parmi : un produit à base d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus, un produit qui contient au moins une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus processée, un extrait d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus, un mélange de plantes choisies parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus, un produit à base d’une plante pure choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus, un produit qui ne contient pas de plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus.

L’expression «produit à base d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus » signifie un produit contenant au moins une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus dont l’intégrité de l’ADN n’a pas été altérée.

L’expression « un produit qui contient au moins une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus processée» signifie un produit contenant au moins une desdites plantes dont l’intégrité de l’ADN a été altérée.

L’expression « un extrait de plantes » signifie un échantillon obtenu par extraction d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus, c’est-à-dire un échantillon/extrait comprenant au moins de l’ADN d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus, l’intégrité dudit ADN étant altérée ou non altérée.

L’expression « un mélange de plantes » signifie un mélange contenant de l’ADN de plantes d’au moins deux plantes choisies parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus, notamment des plantes dont l’ADN a été processé. L’expression «un produit qui ne contient pas de plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus» signifie un produit contenant 0% d’ADN d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus.

L’expression « plante pure » signifie un produit contenant 100% d’ADN d’une seule desdites espèces.

Dans un aspect particulier, l’invention concerne l’utilisation d’une paire d’amorces susmentionnée, dans laquelle ladite détection et/ou identification d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus est effectuée par hybridation dans des conditions de stringence suffisantes pour l’amplification de ladite région variable du gène NdhA.

L’expression « conditions de stringence suffisantes » signifie par exemple une température d’hybridation de 50-60°C, notamment 53-58°C, et plus particulièrement 53°C, 55°C, 58°C dans un tampon d’amplification d’une concentration saline comprise de 0,001 à 0,5M notamment comprenant du MgCfi 2mM.

Dans un aspect particulier, l’invention concerne l’utilisation d’une paire d’amorces susmentionnée, dans laquelle ladite hybridation dans des conditions de stringence suffisantes comprend ou consiste en une hybridation desdites première et deuxième amorces avec:

-des séquences de 15 à 30 nucléotides contigus choisies dans les séquences de SEQ ID NO:l, ou SEQ ID NO: 2 du gène NdhA, à une température de 50-60°C, notamment 53- 58°C et plus particulièrement 53°C, 55°C ou 58°C dans un tampon d’amplification d’une concentration saline comprise de 0,001 à 0,5M notamment comprenant du MgCfi 2mM.

Dans un aspect particulier, l’invention concerne l’utilisation d’une paire d’amorces susmentionnée, dans laquelle ladite hybridation dans des conditions de stringence suffisantes comprend ou consistent en:

-des séquences de 15 à 30 nucléotides contigus choisies dans les séquences de SEQ ID NO: 3 et SEQ ID NO: 4 du gène NdhA, qui s’hybrident à une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO:l, ou SEQ ID NO: 2 du gène NdhA à une température de 50-60°C, notamment 55°C dans un tampon d’amplification d’une concentration saline comprise de 0,001 à 0,5M notamment comprenant du MgCfi 2mM.

Dans un aspect particulier, l’invention concerne l’utilisation d’une paire d’amorces susmentionnée, dans laquelle ladite amplification d’au moins une région variable du gène NdhA comprend ou consiste en la répétition du cycle comprenant ou constitué de :

- une étape d’hybridation d’au moins une molécule d’ADN simple brin d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus, issue de la dénaturation d’une molécule d’ADN double brin d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus provenant d’un échantillon susceptible de contenir au moins une desdites plantes, avec au moins une amorce constituée par un des deux oligonucléotides formant la susdite paire d’amorces.

Dans un aspect particulier, l’invention concerne l’utilisation d’une paire d’amorces susmentionnée, dans laquelle ladite amplification d’au moins une région variable du gène NdhA comprend ou consiste en la répétition du cycle comprenant ou constitué de :

- une étape d’hybridation d’au moins une molécule d’ADN simple brin d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus, issue de la dénaturation d’une molécule d’ADN double brin de plante provenant d’un échantillon susceptible de contenir au moins une plante, avec au moins une amorce constituée par un des deux oligonucléotides formant la susdite paire d’amorces,

- une étape d’élongation du brin complémentaire d’au moins une des deux susdites molécules d’ADN simple brin desdites plantes, par l’ADN polymérase, à partir de la susdite amorce, afin d’obtenir un produit d’amplification constituant un marqueur de détection et/ou d’identification d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus.

Le produit d’amplification correspond ici à la région variable amplifiée du gène NdhA qui constitue un marqueur dit « court » au sens de la présente invention.

Dans un aspect particulier de l’invention, l’utilisation d’une paire d’amorces susmentionnée, comprenant ou consistant en la répétition dudit cycle comprenant ou étant constitué d’une étape d’hybridation et d’une étape d’élongation, doit également s’entendre comme un procédé d’amplification.

Dans un aspect particulier, l’invention concerne l’utilisation d’une paire d’amorces susmentionnée, dans laquelle ladite amplification d’au moins une région variable du gène NdhA comprend ou consiste en la répétition du cycle comprenant ou constitué de:

- une étape de dénaturation d’une molécule d’ADN double brin d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus provenant d’un échantillon susceptible de contenir au moins une desdites plantes afin d’obtenir deux molécules d’ADN simple brin de plante,

- une étape d’hybridation d’au moins une des deux susdites molécules d’ADN simple brin de plante avec au moins une amorce constituée par un des deux oligonucléotides formant la susdite paire d’amorces,

- une étape d’élongation du brin complémentaire d’au moins une des deux susdites molécules d’ADN simple brin de plante par l’ADN polymérase, à partir de la susdite amorce, afin d’obtenir un produit d’amplification constituant un marqueur de détection et/ou d’identification d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus.

Dans un aspect particulier, l’invention concerne l’utilisation d’une paire d’amorces susmentionnée, dans laquelle ladite amplification d’au moins une région variable du gène NdhA comprend ou consiste en la répétition du cycle comprenant ou constitué de:

- une étape d’hybridation de deux molécules d’ADN simple brin de plante, issues de la dénaturation d’une molécule d’ADN double brin de plante provenant d’un échantillon susceptible de contenir au moins une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus, avec deux amorces constituées par les deux oligonucléotides formant la susdite paire d’amorces.

Dans un aspect particulier, l’invention concerne l’utilisation d’une paire d’amorces susmentionnée, dans laquelle ladite amplification d’au moins une région variable du gène NdhA comprend ou consiste en la répétition du cycle comprenant ou constitué de:

- une étape d’hybridation de deux molécules d’ADN simple brin de plante, issues de la dénaturation d’une molécule d’ADN double brin de plante provenant d’un échantillon susceptible de contenir au moins une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus, avec deux amorces constituées par les deux oligonucléotides formant la susdite paire d’amorces,

- une étape d’élongation des brins complémentaires des deux susdites molécules d’ADN simple brin de plante, par l’ADN polymérase, à partir des susdites amorces, afin d’obtenir un produit d’amplification constituant un marqueur de détection et/ou d’identification d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus.

Dans un aspect particulier, l’invention concerne l’utilisation d’une paire d’amorces susmentionnée, dans laquelle ladite amplification d’au moins une région variable du gène NdhA comprend ou consiste en la répétition du cycle comprenant ou constitué de:

- une étape de dénaturation d’une molécule d’ADN double brin de plante provenant d’un échantillon susceptible de contenir au moins une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus afin d’obtenir deux molécules d’ADN simple brin de plante,

- une étape d’hybridation de deux susdites molécules d’ADN simple brin de plante avec deux amorces constituées par les deux oligonucléotides formant la susdite paire d’amorces,

- une étape d’élongation des brins complémentaires des deux susdites molécules d’ADN simple brin de plante, par l’ADN polymérase, à partir des susdites amorces, afin d’obtenir un produit d’amplification constituant un marqueur de détection et/ou d’identification d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus.

Dans un aspect particulier, l’invention concerne rutilisation d’une paire d’amorces susmentionnée, dans laquelle ladite répétition du cycle est une répétition d’au moins 25 cycles, notamment 40 cycles et plus particulièrement 49, 50 ou 51 cycles.

L’expression «au moins 25 cycles» signifie par exemple 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 ou 51 cycles.

Dans un aspect particulier, l’invention concerne rutilisation d’une paire d’amorces susmentionnée, pour la détection et/ou l’identification d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus.

La présente invention a pour autre objet une paire d’amorces dans laquelle

- une première amorce comprend ou est constituée d’une séquence de 15 à 30 nucléotides contigus, complémentaire de la séquence SEQ ID NO: 1, ou d’une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% avec ladite séquence de SEQ ID NO: 1, et

- une deuxième amorce comprend ou est constituée d’une séquence de 15 à 30 nucléotides contigus, complémentaire de la séquence SEQ ID NO: 2, ou d’une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% avec ladite séquence de SEQ ID NO: 2.

L’expression «une taille de 15 à 30 nucléotides» signifie une taille de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ou 30 nucléotides.

La présente invention a pour autre objet une paire d’amorces qui consiste en:

-une première amorce d’une taille comprise de 15 à 30 nucléotides contigus, et comprend ou est constituée par une séquence choisie parmi: SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO : 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO : 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO : 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, ou SEQ ID NO: 47, et

-une seconde amorce d’une taille comprise de 15 à 30 nucléotides contigus, et comprend ou est constituée par une séquence choisie parmi: SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO : 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO : 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO : 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, ou SEQ ID NO: 83, ou une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% avec lesdites séquences.

Ces oligonucléotides correspondent aux séquences des paires d’amorces NdhA de la présente invention.

La présente invention a pour autre objet un marqueur de détection et/ou d’identification d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus ayant une taille comprise entre 90 et 120 nucléotides, ledit marqueur comprenant ou étant constitué par une séquence amplifiée ayant un pourcentage d’identité d’au moins 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% avec une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11.

Ces marqueurs correspondent aux séquences nucléotidiques des régions amplifiées selon la présente invention.

La présente invention a pour autre objet un marqueur de détection et/ou d’identification d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus qui comprend ou est constitué par une séquence amplifiée ayant un pourcentage d’identité d’au moins 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% avec une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 5 à 11 pour détecter ou de préférence identifier respectivement une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus.

La présente invention concerne aussi un procédé d’amplification d’au moins une région variable constituant un marqueur de détection et/ou d’identification d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus, Cucumis sativus et Cucumis melo.

La présente invention a pour autre objet un procédé d’amplification et d’identification d’au moins une région variable du gène NdhA, ladite région variable constituant un marqueur de détection et de préférence d’identification d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus, comprenant ou étant constitué des étapes suivantes:

a) une étape d’amplification de ladite région variable du gène NdhA susceptible d’être contenue dans un produit ou un échantillon, en utilisant

-la paire d’amorces consistant en une première amorce qui s’hybride à une séquence de 15 à 30 nucléotides contigus choisie dans la séquence de SEQ ID NO: 1 du gène NdhA et une deuxième amorce qui s’hybride à une séquence de 15 à 30 nucléotides contigus choisie dans la séquence de SEQ ID NO: 2 du gène NdhA , b) une étape de détermination ou d’identification de la présence d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus dans ledit produit ou échantillon par la détection d’au moins une région variable amplifiée du gène NdhA.

Le procédé d’amplification et d’identification d’au moins une région variable du gène NdhA selon la présente invention comprend en outre avant l’étape a) une étape d’extraction du matériel nucléique d’un produit ou échantillon susceptible de contenir ladite région variable du gène NdhA.

Le procédé d’amplification et d’identification d’au moins une région variable du gène NdhA selon la présente invention comprend en outre une étape c) d’identification d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus par séquençage de ladite région variable amplifiée et détectée du gène NdhA.

Dans un aspect particulier, la présente invention concerne un procédé d’amplification et d’identification d’au moins une région variable du gène NdhA, ladite région variable constituant un marqueur de détection et de préférence d’identification d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus, étant constitué des étapes suivantes:

a) une étape d’extraction du matériel nucléique d’un produit ou échantillon susceptible de contenir ladite région variable du gène NdhA

b) une étape d’amplification de ladite région variable du gène NdhA susceptible d’être contenue dans un produit ou un échantillon, en utilisant

-la paire d’amorces consistant en une première amorce qui s’hybride à une séquence de 15 à 30 nucléotides contigus choisie dans la séquence de SEQ ID NO: 1 du gène NdhA et une deuxième amorce qui s’hybride à une séquence de 15 à 30 nucléotides contigus choisie dans la séquence de SEQ ID NO: 2 du gène NdhA ,

c) une étape de détermination ou d’identification de la présence d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus dans ledit produit ou échantillon par la détection d’au moins une région variable amplifiée du gène NdhA,

d) une étape d’identification d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus par séquençage de ladite région variable amplifiée et détectée du gène NdhA.

L’expression «afin d’obtenir éventuellement au moins une région variable amplifiée du gène NdhA » signifie que le procédé d’amplification peut permettre d’obtenir au moins une région variable amplifiée du gène NdhA, ou peut ne pas permettre d’obtenir au moins une région variable amplifiée du gène NdhA. Dans ce dernier cas, la non-obtention d’au moins une région variable amplifiée du gène NdhA signifie qu’il n’y a pas d’ADN d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus dans l’échantillon testé.

Dans un aspect particulier, la présente invention concerne un procédé d’amplification susmentionné, dans lequel ledit procédé comprend après ladite étape d’hybridation une étape d’élongation du brin complémentaire d’au moins une des deux susdites molécules d’ADN simple brin de plante, par l’ADN polymérase, à partir de la susdite amorce, afin d’obtenir au moins une région variable amplifiée du gène NdhA.

Dans un aspect particulier, la présente invention concerne un procédé d’amplification susmentionné, dans lequel ledit procédé comprend après ladite étape d’hybridation une étape d’élongation de chacun des brins complémentaires des deux susdites molécules d’ADN simple brin de plante, par l’ADN polymérase, à partir des susdites amorces, afin d’obtenir deux régions variables amplifiées du gène NdhA.

Dans un aspect particulier, la présente invention concerne un procédé d’amplification susmentionné, dans lequel ledit procédé comprend avant ladite étape d’hybridation une étape de dénaturation d’une molécule d’ADN double brin de plante provenant d’un échantillon susceptible de contenir au moins une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus, afin d’obtenir deux molécules d’ADN simple brin de plante.

Dans un aspect particulier, la présente invention concerne un procédé d’amplification susmentionné, dans lequel ladite étape de dénaturation d’une molécule d’ADN double brin de plante est effectuée à une température d’environ 95°C pendant environ 30 secondes.

Dans un aspect particulier, la présente invention concerne un procédé d’amplification susmentionné, dans lequel ladite étape d’hybridation est effectuée à une température d’environ 50- 60°C, notamment d’environ 53-55°C pendant environ 30 secondes.

Le terme «50-60°C» signifie 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60°C.

L’expression «environ 50-60°C» signifie que des valeurs proches de 50°C ou 60°C, telles que 49°C ou 6l°C sont également comprises dans la portée de l’invention.

L’expression « environ 30 secondes » signifie 30 secondes ou des valeurs proches de 30 secondes, telles que 29 secondes ou 31 secondes.

Dans un aspect particulier, la présente invention concerne un procédé d’amplification susmentionné, dans lequel ladite étape d’hybridation est effectuée à une température d’environ 50- 60°C, notamment environ 55°C pendant environ 30 secondes. Dans cet aspect particulier, ce sont les amorces NdhA qui sont utilisées.

Dans un aspect particulier, la présente invention concerne un procédé d’amplification susmentionné, dans lequel ladite étape d’élongation est effectuée à une température d’environ 72°C pendant environ 1 minute. Bien entendu la durée d’hybridation, la durée d’élongation et les températures d’hybridation et d’élongation dépendent de la longueur du fragment à amplifier et de la vitesse de l’enzyme, et peuvent être adaptées en fonction de la polymérase utilisée. Dans le cas de la présente invention les durées et températures sont données en référence à la Taq polymérase utilisée (Hot FlREPol DNA polymérase ; Solis).

L’expression « environ 72°C» signifie 72°C ou des valeurs proches de 72°C, telles que 71 °C ou 73°C.

L’expression «environ 1 minute» signifie 60 secondes ou des valeurs proches de 60 secondes, telles que 59 secondes ou 61 secondes.

Dans un aspect particulier, la présente invention concerne un procédé d’amplification susmentionné, dans lequel ladite étape de dénaturation est précédée d’une étape de dénaturation initiale d’une molécule d’ADN double brin de plante afin d’obtenir deux molécules d’ADN simple brin de plante, à une température d’environ 95°C pendant environ 10 minutes.

Cete étape de dénaturation a pour objectif d’activer l’enzyme et de dénaturer la molécule d’ADN. Cette étape peut être optionnelle, en ce sens que certaines enzymes peuvent se passer de cette étape de dénaturation initiale.

La durée et température de cete étape de dénaturation dépendent de la polymérase utilisée (Taq polymérase - Hot FlREPol DNA polymérase ; Solis dans le cas de la présente invention).

L’expression «environ 95°C» signifie 95°C ou des valeurs proches de 95°C, telles que 94°C ou 96°C.

L’expression « environ 10 minutes » signifie 10 minutes (ou 600 secondes) ou des valeurs proches de 600 secondes, telles que 550 secondes, 559 secondes, 610 secondes ou 601 secondes.

Dans un aspect particulier, la présente invention concerne un procédé d’amplification susmentionné, dans lequel ladite étape d’élongation est suivie d’une étape d’élongation finale du brin complémentaire d’au moins une des susdites molécules d’ADN simple brin de plante, à une température d’environ 72°C pendant environ 7 minutes.

L’expression «environ 7 minutes» signifie 7 minutes (ou 420 secondes) ou des valeurs proches de 420 secondes, telles que 410 secondes, 419 secondes, 430 secondes ou 429 secondes.

La durée et température de cete étape d’élongation finale dépendent de la polymérase utilisée (Taq polymérase - Hot FlREPol DNA polymerase; Solis dans le cas de la présente invention).

Dans un aspect particulier, la présente invention concerne un procédé d’amplification susmentionné, dans lequel ladite étape d’élongation finale est suivie d’une étape de diminution de la température au cours de laquelle la température est diminuée à une température d’environ 10°C.

L’expression « environ 10°C » signifie 10°C ou des valeurs proches de 10°C, telles que 9°C ou i PC. Cete diminution de température a pour objectif de stopper la réaction enzymatique, ramener l’échantillon à une température convenable pour travailler (sans se brûler) et conserver l’échantillon si jamais nécessaire.

Dans un aspect particulier, la présente invention concerne un procédé d’amplification susmentionné, dans lequel ledit procédé d’amplification d’au moins une région variable du gène NdhA comprend ou est constitué des étapes suivantes :

- ladite étape de dénaturation d’une molécule d’ADN double brin de plante, à une température d’environ 95°C pendant environ 30 secondes, afin d’obtenir deux molécules d’ADN simple brin de plante,

- ladite étape d’hybridation d’au moins une des deux susdites molécules d’ADN simple brin, à une température d’environ 50-60°C, notamment environ 53-55°C pendant environ 30 secondes,

- ladite étape d’élongation du brin complémentaire d’au moins une des deux susdites molécules d’ADN simple brin de plante, à une température d’environ 72°C pendant environ 1 minute, afin d’obtenir au moins une région variable amplifiée du gène NdhA.

Dans un aspect particulier, la présente invention concerne un procédé d’amplification susmentionné, dans lequel ledit procédé d’amplification d’au moins une région variable du gène NdhA comprend ou est constitué des étapes suivantes :

- ladite étape de dénaturation initiale d’une molécule d’ADN double brin, à une température de 95°C pendant 10 minutes, suivie de ladite étape de dénaturation d’une molécule d’ADN double brin de plante, à une température d’environ 95°C pendant environ 30 secondes, afin d’obtenir deux molécules d’ADN simple brin de plante,

- ladite étape d’hybridation d’au moins une des deux susdites molécules d’ADN simple brin, à une température d’environ 50-60°C, notamment environ 53-55°C pendant environ 30 secondes,

- ladite étape d’élongation du brin complémentaire d’au moins une des deux susdites molécules d’ADN simple brin de plante, à une température d’environ 72°C pendant environ 1 minute, suivie de ladite étape d’élongation finale du brin complémentaire d’au moins une des deux susdites molécules d’ADN simple brin de plante, à une température d’environ 72°C pendant environ 7 minutes, afin d’obtenir au moins une région variable amplifiée du gène NdhA,

- ladite étape de diminution de la température à une température d’environ l0°C.

Dans un aspect particulier, la présente invention concerne un procédé d’amplification susmentionné, dans lequel ledit procédé d’amplification d’au moins une région variable du gène NdhA comprend ou est constitué des étapes suivantes :

- ladite étape de dénaturation d’une molécule d’ADN double brin de plante, à une température d’environ 95°C pendant environ 30 secondes, afin d’obtenir deux molécules d’ADN simple brin de plante,

- ladite étape d’hybridation d’au moins une des deux susdites molécules d’ADN simple brin, à une température d’environ 50-60°C, notamment environ 55°C pendant environ 30 secondes, - ladite étape d’élongation du brin complémentaire d’au moins une des deux susdites molécules d’ADN simple brin de plante, à une température d’environ 72°C pendant environ 1 minute, afin d’obtenir au moins une région variable amplifiée du gène NdhA.

Dans un aspect particulier, la présente invention concerne un procédé d’amplification susmentionné, dans lequel ledit procédé d’amplification d’au moins une région variable du gène NdhA comprend ou est constitué des étapes suivantes :

- ladite étape de dénaturation initiale d’une molécule d’ADN double brin, à une température d’environ 95°C pendant environ 10 minutes, suivie de ladite étape de dénaturation d’une molécule d’ADN double brin de plante, à une température d’environ 95°C pendant environ 30 secondes, afin d’obtenir deux molécules d’ADN simple brin de plante,

- ladite étape d’hybridation d’au moins une des deux susdites molécules d’ADN simple brin, à une température d’environ 50-60°C, notamment environ 55°C pendant environ 30 secondes,

- ladite étape d’élongation du brin complémentaire d’au moins une des deux susdites molécules d’ADN simple brin de plante, à une température d’environ 72°C pendant environ 1 minute, suivie de ladite étape d’élongation finale du brin complémentaire d’au moins une des deux susdites molécules d’ADN simple brin de plante, à une température d’environ 72°C pendant environ 7 minutes, afin d’obtenir au moins une région variable amplifiée du gène NdhA,

- ladite étape de diminution de la température à une température d’environ l0°C.

Dans un aspect particulier, la présente invention concerne un procédé d’amplification susmentionné, dans lequel ledit procédé comprend l’obtention d’au moins une région variable amplifiée du gène NdhA.

Dans un aspect particulier, la présente invention concerne un procédé d’amplification susmentionné, dans lequel ledit procédé ne permet pas l’obtention d’au moins une région variable amplifiée du gène NdhA.

Dans un aspect encore plus particulier, la présente invention concerne un procédé d’amplification susmentionné, dans lequel ledit procédé comprend une étape de détection de ladite obtention d’au moins une région variable amplifiée du gène NdhA afin d’obtenir une région variable amplifiée et détectée du gène NdhA.

Ladite étape de détection d’au moins une région variable amplifiée du gène NdhA peut se faire par diverses techniques, notamment par électrophorèse.

Dans un aspect particulier, la présente invention concerne un procédé d’amplification susmentionné, dans lequel ledit procédé comprend une étape d’identification d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus par séquençage de ladite région variable amplifiée et détectée du gène NdhA afin d’obtenir une région variable amplifiée séquencée. Dans un aspect particulier, la présente invention concerne un procédé d’amplification susmentionné, dans lequel ledit séquençage est un séquençage capillaire ou un séquençage NGS (Next Génération- Sequencing) .

Dans un aspect particulier, la présente invention concerne un procédé d’amplification susmentionné, dans lequel ledit séquençage permet d’identifier l’espèce à laquelle appartient la plante par comparaison entre ladite région variable amplifiée séquencée et une séquence de référence.

Dans un aspect particulier, ladite séquence de référence est choisie parmi les séquences suivantes SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, et SEQ ID NO: 11.

Dans un aspect particulier, la présente invention concerne un procédé d’amplification susmentionné, dans lequel la nature de l’échantillon est connue ou non.

Dans un aspect particulier, la présente invention concerne un procédé d’amplification susmentionné, dans lequel l’échantillon est un mélange de plantes, un produit à base de plante, un produit qui contient au moins une plante processée, un extrait de plante, un produit qui ne contient pas de plante, un échantillon de plante sans plante, un mélange sans plante, une plante pure ou un fragment de plante pure ayant une molécule d’ADN dont la taille est comprise entre 90 et 120 nucléotides.

Dans un aspect particulier, les marqueurs dits courts selon la présente invention sont notamment utilisés pour analyser des échantillons d’ADN contenant une molécule d’ADN dont la taille est comprise entre 90 et 120 nucléotides.

23

Tableau _ 1 : Tableau récapitulatif des séquences selon la présente invention

L’invention sera mieux illustrée par les exemples suivants. Les exemples ci-après visent à éclaircir l’objet de l’invention et illustrer des modes de réalisation avantageux, mais en aucun cas visent à restreindre la portée de l’invention.

Exemple 1 : Méthode avec des produits à base de Cucumis

Extraction d’ADN :

Sur produits à base de Cucumis :

L’ADN a été extrait des produits à base de Cucumis en utilisant un protocole adapté du kit NucleoMag Trace (Machery-Nagel).

Amplification PCR :

Sur produits à base de Cucumis :

Les ADNs extraits des produits à base de Cucumis ont été amplifiés pour un marqueur génétique à l’aide des amorces correspondantes (Tableau 2). Une étiquette de 8 bases est ajoutée du côté 5’ de l’amorce afin de créer un système de « multiplexage » et de permettre l’assignation des séquences à leurs échantillons respectifs.

Le mélange réactionnel utilisé pour l’amplification a été préparé comme suit : tampon : IX ; MgC12 : 2 mM ; dNTP : 0,2 mM chacun; amorces: 0,2 mM chacune; BSA: 0,16 mg.pL ¹ ; Taq Polymérase (Hot FIREPol DNA polymérase; Solis) : 2 unités ; 3 pL d’ADN ; pour un volume final de 25 pL. Il a ensuite été amplifié sur un thermocycleur (Tl 00, Biorad) en utilisant le programme défini en Tableau

3.

Tableau 3: Programme d’amplification des marqueurs génétiques sur produits à base de Cucumis Séquençage :

Sur produits à base de Cucumis :

Les produits d’amplification ont été analysés par électrophorèse capillaire (QIAxcel DNA Screening kit, Qiagen). Les marqueurs ayant été correctement amplifiés ont ensuite été purifiés avec le kit NucleoSpin Gel and PCR Clean-up (Macherey-Nagel) et dosés au spectrophotomètre SimpliNano 4285 v2.0.0 (GE Healthcare). Les échantillons ont ensuite été poolés et normalisés. La librairie à séquencer est préparée à partir du Truseq PCR-free library préparation Kit (Illumina). Le séquençage en paired-end 2x150 bp a été réalisé sur séquenceur nouvelle génération MiSeq (Illumina).

Exemple 2

Échantillonnage:

Quatre types d’échantillons ont été sélectionnés pour cette étude (énumérés et décrits dans le tableau 6). Les matières premières ont été choisies pour confirmer l’efficacité des amorces étudiées. Les compléments alimentaires (gélules), les produits pour l’alimentation animale et les cosmétiques (crèmes) ont été choisis pour mettre en avant l’outil génétique dans les différents domaines concernés par l’utilisation dedites matières premières.

Traitement à l’alpha-amylase des échantillons enrobés d’amidon:

Les échantillons enrobés dans des microsphères d’amidon (échantillons n°6, 10, 11 et 12, voir tableau 6) nécessitent un traitement préalable pour ouvrir les microsphères et libérer l’ADN qu’elles contiennent. L’alpha-amylase est une enzyme utilisée pour dégrader la molécule d’amidon.

Extraction d’ADN:

L’ADN des 9 produits à base d’espèces du genre Cucumis a été extrait en utilisant un protocole adapté du kit NucleoMag Trace (Machery-Nagel).

Amplification PCR:

Les ADNs extraits des produits à base d’espèces du genre Cucumis ont été amplifiés pour un marqueur génétique NdhA à l’aide des amorces correspondantes (tableau 4). Une étiquette de 8 bases nucléotidiques est ajoutée du coté 5’ de l’amorce afin de créer un système de « multiplexage » et de permettre l’assignation des séquences à leurs échantillons respectifs (COISSAC, Eric, RIAZ, Tiayyba et PUILLANDRE, Nicolas. Bioinformatic Challenges for DNA metabarcoding of plantes and animais. Molecular Ecology, 2012, vol. 21, pp. 1834-1847).

Tableau 4 : Liste des amorces utilisées au cours de l’étude sur les produits à base de Cucumis

Le mélange réactionnel utilisé pour l’amplification à été préparé comme suit : tampon : IX ; MgC12 : 2 mM ; dNTP : 0,2 mM chacun ; amorces : 0,2 mM chacune ; BSA : 0,16 mg.pL ¹ ; Taq Polymérase : 2 unités ; 3 pL d’ADN ; pour un volume final de 25 pL. L'amplification est ensuite réalisée sur un thermocycleur en utilisant le programme défini en tableau 5.

Tableau 5 : Programme d’amplification des marqueurs génétiques sur produits à base de Cucumis

Séquençage sur produits à base de Cucumis :

Les produits d’amplification ont été analysés par électrophorèse capillaire (QIAxcel, Qiagen ^® ). Les marqueurs amplifiés ont ensuite été purifiés avec le kit NucleoSpin Gel and PCR Clean-up (Macherey- Nagel ^® ). Les échantillons ont ensuite été mélangés et normalisés. La librairie à séquencer est préparée à partir du Truseq PCR-free library préparation Kit (Illumina ^® ). Le séquençage des amplicons a été réalisé à l’aide d’un séquenceur MiSeq (Illumina ^® ).

Analyse bio informatique sur produits à base de Cucumis :

L’analyse bio informatique des séquences obtenues a été réalisée avec le package Obitools (BOYER, Frédéric, MERCIER, Céline, BONIN, Aurélie, LE BRAS, Yvan, TABERLET, Pierre et COIS SAC, Eric, OBITOOLS : a UNIX-inspired software package for DNA metabarcoding. Molecular Ecology Resources, 2016, vol. 16, no. 1, pp. 176-182) : l’assemblage des séquences sens et antisens a été réalisé par le programme Illumina-pairend. Le programme NGSFliter identifie les amorces et les étiquetes et assigne chaque séquence à son échantillon ; Obiuniq rassemble les séquences identiques entre elles et les compte ; Obigrep élimine les séquences plus courtes que 10 paires de bases ou comptées moins de 10 fois ; Obiclean trie les séquences en repérant les erreurs de séquençage : Ecotag propose une assignation taxonomique à chaque séquence, avec un seuil de 95% identité, en les comparant avec une base de données sur les algues générée par PCR virtuelle par le programme EcoPCR ; enfin les séquences avec une occurrence de moins de 0,003 (0,3%) par taxon et par run sont éliminées pour éviter les mauvaises assignations. Résultats du séquençage :

Les résultats du séquençage nouvelle génération (NGS) sont constitués des différentes séquences génétiques amplifiées dans le produit d’extraction de l’échantillon analysé (tableau 6). Ces séquences d’ADN proviennent des plantes entrant dans la composition initiale du produit et/ou de tissus ou pollens de plantes qui arrivent pendant ou à la fin du processus de fabrication du produit ou lors des transferts et des échantillonnages.

Tableau 6 : Résultats du séquençage des 9 produits à base de melon pour le marqueur NdhA