La présente invention concerne des oligonucléotides et leur utilisation comme amorces universelles pour la détection et l'identification d'espèces de vertébrés, notamment dans des substrats complexes et dégradés.

L'identification taxonomique basée sur l'analyse de l'ADN est une approche couramment utilisée aujourd'hui pour identifier des espèces au sein d'un mélange. Un consortium international nommé Barcode for Life a été créé avec comme objectif de permettre la détection d'espèces animales ou végétales à partir d'une séquence d'ADN. Pour identifier les animaux, l'approche consiste à amplifier puis à séquencer une séquence de 648 paires de base du gène mitochondrial cytochrome c oxidase 1 ("C01 "). C01 s'est montré efficace pour l'identification des oiseaux, papillons, poissons, mouches et autres groupes animaux (Hébert et a/., 2003). Pour les végétaux, la situation est plus complexe et deux autres séquences d'ADN chloroplastiques, matK and nbcL, ont été proposées (Hollingsworth et al. , 2009). Il s'avère néanmoins que les fragments choisis selon cette méthode sont de longueur trop longue (supérieure à 500 nucléotides) pour être utilisés dans des substrats dégradés. Or, dans de très nombreuses situations, les substrats à analyser contiennent de l'ADN dégradé, avec souvent des fragments de moins de 100 nucléotides. C'est le cas notamment des échantillons collectés dans l'environnement (sol, eau, fèces) ou des matrices utilisées dans l'industrie, par exemple les farines animales ou les plats industriels de l'industrie alimentaire.

Une solution pour la détection et l'identification spécifique consiste à analyser des fragments d'ADN informatifs de petite taille (Poinar et al., 1998; Willersley et al. , 2003 ; Willersley et al. , 2007). Des amorces ont ainsi été définies afin d'amplifier des fragments d'ADN végétaux plus courts dans des échantillons de sols gelés. Néanmoins, les amorces permettent d'identifier les familles mais pas les espèces végétales. En outre, les amorces n'ont pas été choisies de manière à amplifier des séquences suffisamment conservées dans le règne végétal pour permettre l'amplification de toute espèce végétale. En d'autres mots, ces amorces ne sont pas véritablement universelles.

WO 2006/024751 décrit un procédé permettant de détecter simultanément dans un échantillon de matière biologique la présence éventuelle de matières biologiques par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) puis hybridation avec des sondes. Les amorces décrites sont très dégénérées (pratiquement chaque codon comporte un nucléotide dégénéré) et manquent par conséquent de spécificité pour l'amplification de l'ADN de vertébrés.

Le brevet EP1797201 propose des oligonucléotides permettant la détection et l'identification de végétaux dans des substrats complexes ou dégradés car la région amplifiée est à la fois courte et très variable. Plus précisément, la région amplifiée correspond à une région variable de l'intron du gène chloroplastique trnL du tabac. A cet égard, référence est faite également à l'article de Taberlet et al. , 2007.

Les amorces décrites dans ce brevet sont spécifiques des espèces végétales et elles ne permettent pas l'identification et la détection des espèces de vertébrés dans des substrats complexes ou dégradés.

La présente invention propose de nouveaux oligonucléotides et leurs utilisations comme amorces universelles pour l'identification et la détection des espèces vertébrés. Ces amorces permettent à la fois d'amplifier une région courte (moins de 120 paires de base), une région très variable entre les espèces vertébrées et une région présentant dans le même temps des régions flanquantes très conservées permettant l'amplification à l'aide une seule et unique paire d'amorces. Ainsi ces amorces peuvent être utilisées dans des mélanges complexes et dégradés, par exemple des échantillons de sols, de fèces et d'eau. De telles amorces trouvent notamment des applications dans l'analyse des plats industriels susceptibles de contenir des mélanges de via ndes ou de poissons, mais également pour l'analyse des régimes alimentaires des carnivores à partir des fèces.

Plus précisément, ces amorces permettent d'amplifier une région 12S de l'ADN mitochondrial. Il est particulièrement intéressant de disposer d 'a morces permettant l ' am pl ification d 'ADN m itochond rial ca r celui-ci représente une cible très accessible dans le cas de substrats dégradés. De plus, l'ADN mitochondrial est présent de manière répétée dans chaque cellule.

Les amorces universelles objet de la présente invention sont particulièrement avantageuses car elles sont extrêmement spécifiques des vertébrés et n'amplifient aucun autre groupe taxonomique. Description de l'invention

La présente concerne une paire d'oligonucléotides, selon laquelle le premier oligonucélotide s'hybride de manière sélective à la séquence SEQ ID NO. 3 et le deuxième nucléotide s'hybride de manière sélective à la séquence SEQ ID NO. 4 dans des conditions de stringences suffisantes pour l'amplification d'une région variable du gène mitochondrial 12S des vertébrés par réaction de polymérisation en chaîne (PCR).

Selon un aspect de l'invention, la région amplifiée du gène mitochondrial 12S comporte m oins d e 1 20 nucléotides (amorces non comprises).

Selon un autre aspect de l'invention, le premier oligonucléotide présente une séquence nucléotidique SEQ ID NO. 1 ou SEQ ID NO. 6-8 et le deuxième oligonucléotide présente une séquence nucléotidique sélectionnés dans le groupe consistant en SEQ ID NO. 2 et SEQ ID NO. 5.

Selon un autre aspect encore de l'invention, la région amplifiée par réaction de polymérisation en chaîne présente une séquence nucléotidique sélectionnée dans le groupe consistant SEQ ID NO. 9-100.

La présente i nventi on concerne ég aleme n t u n procédé d'amplification d'une région du gène mitochondrial 12S, comprenant les étapes suivantes :

a) on dispose d'un échantillon susceptible de contenir de l'ADN d'espèces vertébrés ;

b) on réalise une réaction d'amplification en chaîne en utilisant une paire d'oligonucléotides selon l'invention.

La présente invention propose également un procédé de détection d'une espèce vertébrée dans un échantillon, comprenant les étapes suivantes :

a) on dispose d'un échantillon susceptible de contenir de l'ADN d'espèces vertébrés ;

b) on isole l'ADN total contenu dans l'échantillon ;

c) on réalise une réaction d'amplification en chaîne en utilisant une paire d'oligonucléotides selon l'invention ; et

d) on détecte l'éventuelle présence d'un produit d'amplification.

La présente invention concerne également un procédé de détection et d'identification d'une espèce vertébrée dans un échantillon, comprenant les étapes suivantes : a) on dispose d'un échantillon susceptible de contenir de l'ADN d'espèces vertébrés ;

b) on isole l'ADN total contenu dans l'échantillon ;

c) on réalise une réaction d'amplification en chaîne en utilisant une paire d'oligonucléotides selon l'invention;

d) on détecte la présence d'un produit d'amplification ; et e) on détermine la séquence du produit d'amplification pour identifier l'espèce de vertébré contenue dans l'échantillon.

Un autre objet de la présente invention concerne également un kit pour la détection d'une espèce de vertébré dans un échantillon, comprenant une paire d'oligonucléotides selon l'une ^' quelconque des revendications 1 à 4 et au moins un réactif additionnel.

Selon un aspect de l'invention, le kit comprend une amorce de blocage selon SEQ ID NO.101.

Selon un autre aspect de l'invention, le kit comprend en outre au moins au moins une autre paire d'oligonucléotides choisis parmi les paires d'amorces :

- amorces d'amplification selon SEQ ID NO.102 et SEQ ID NO.103;

- amorces d'amplification selon SEQ ID NO.104 et SEQ ID NO.105; - amorces d'amplification selon SEQ ID NO.106 et SEQ ID NO. 07, éventuellement avec amorce de blocage selon SEQ ID NO.108 ;

- amorces d'amplification selon SEQ ID NO.109 et SEQ ID N0.1 0;

- amorces d'amplification selon SEQ ID NO.111 et SEQ ID N0.112;

- amorces d'amplification selon SEQ ID NO.113 et SEQ ID NO.114; - amorces d'amplification selon SEQ ID NO.115 et SEQ ID NO.116;

- amorces d'amplification selon SEQ ID NO.117 et SEQ ID NO.118;

- amorces d'amplification selon SEQ ID NO.119 et SEQ ID NO. 20;

- amorces d'amplification selon SEQ ID NO.121 et SEQ ID NO.122, éventuellement avec amorce de blocage selon SEQ ID N0.123 ;

- amorces d'amplification selon SEQ ID N0.124 et SEQ ID N0.125, éventuellement avec amorce de blocage selon SEQ ID NO.126 ;

- amorces d'amplification selon SEQ ID N0.127 et SEQ ID N0.128, éventuellement avec amorce de blocage selon SEQ ID NO.129 ;

- amorces d'amplification selon SEQ ID NO.130 et SEQ ID NO.131, éventuellement avec amorce de blocage selon SEQ ID NO.132 ; - amorces d'amplification selon SEQ ID N0.133 et SEQ ID N0.134, éventuellement avec amorce de blocage selon SEQ ID NO.135 et/ou SEQ ID NO.136; et

- amorces d'amplification selon SEQ ID NO.137 et SEQ ID NO.138, éventuellement avec amorce de blocage selon SEQ ID NO.139.

L'invention concerne aussi l'utilisation de la région variable du gène mitochondrial 12S des vertébrés correspondant aux positions 1094 à 1 193 du gène mitochondrial de l'Homme pour détecter des espèces de vertébrés.

Selon un aspect de l'invention, la région variable est sélectionnée dans le groupe consistant en SEQ ID NO.9-100 en vue de cette utilisation.

Description du listage de séquences

SEQ ID NO.1 : amorce 12S-V05_F

SEQ ID N0.2 : amorce 12S-V05_R

SEQ ID NO.3 : séquence de la région complémentaire de l'amorce 12S-V05_F SEQ ID NO.4 : séquence de la région complémentaire de l'amorce 12S-V05_R SEQ ID NO.5 : variant de l'amorce 2S-V05_R

SEQ ID NOS.6-8 : variants de l'amorce 12S-V05_F

SEQ I D N O S .9-100 : exemples de séquences variables amplifiées de différentes espèces de vertébrés (11 séquences d'amphibiens ; 28 séquences d'oiseaux ; 5 séquences de poissons chondrichtyens ; 27 séquences de mammifères ; 9 séq u e n ces d e re pti l es ; 12 séquences de poissons téléostéens)

SEQ ID NOS.101 , 108, 123, 126, 129, 132, 135, 136, 139-142 : amorces de blocage

SEQ I D NOS. 102-103, 104-105, 106-107, 109-1 10, 1 1 1-1 12, 1 13-1 14, 1 15- 1 16, 1 17-1 18, 1 19-120, 121 -122, 124-125, 127-128, 130-131 , 133-134, 137- 138 : paires d'amorces d'amplification additionnelles pouvant être ajoutées au kit de détection selon l'invention (15 paires d'amorces)

Paire d'oligonucléotides

La présente invention concerne donc des oligonucléotides dérivés de deux régions conservées d'un gène 12S mitochondrial présent chez les vertébrés. Ces oligonucléotides peuvent être utilisés comme amorces pour l'amplification et donc la détection de l'ADN de vertébrés dans un échantillon susceptible de contenir un tel ADN. En effet, les régions conservées dont sont dérivés les polynucléotides de la présente invention flanquent une région à la fois courte et très variable de l'ADN des vertébrés, plus précisément une région courte et variable dans le gène 12S mitochondrial des vertébrés. La variablité de cette région entre espèces de vertébrés peut donc être utilisée pour détecter et identifier les espèces de vertébrés.

Selon la présente invention, on entend par « oligonucléotide » une chaîne nucléotidique simple brin ou son complémentaire pouvant être de type ADN ou ARN, ou une chaîne nucléotidique double brin pouvant être de type ADN complémentaire ou génomique. Selon un mode réalisation, les oligonucléotides de l'invention sont de type ADN, notamment ADN double brin. Le terme « oligonucléotide » désigne également les polynucléotides modifiés. Les oligonucléotides modifiés sont par exemple des oligonucléotides conjugués à des réactifs de liaison (biotine par exemple) ou à des réactifs marqués (marqueurs fluorescents par exemple). Classiquement, les réactifs de liaison ou les réactifs marqués conjugués aux oligonucléotides facilitent la purification ou la détection de ces oligonucléotides.

Les oligonucléotides de la présente invention peuvent être préparés par synthèse chimique ou par des techniques classiques de biologie moléculaire telles que décrites par Sambrook, Fristsch et Maniatis, dans leur ouvrage intitulé "Molecular cloning: a laboratory manual", édition : Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Les oligonucléotides de la présente invention peuvent également être isolés ou purifiés de leur environnement naturel.

Le terme « polynucléotide » peut ici être utilisé en remplacement du terme « oligonucléotide » avec une signification équivalente.

On entend par « amorce » une courte séquence d'oligonucléotides qui, hybridée avec une matrice d'acide nucléique, permet à une polymérase d'entamer la synthèse d'un nouveau brin de l'ADN. Le brin produit à partir de l'amorce est complémentaire au brin utilisé comme matrice. Les amorces sont notamment utilisées dans les réactions de polymérisation en chaîne (PCR).

On entend par « espèce de vertébré » ou « espèce vertébrée » tout organisme faisant partie du sous-embranchement vertébré du règne animal.

La présente invention concerne donc une paire d'oligonucléotides selon laquelle le premier oligonucléotide s'hybride de manière sélective à une région très conservée du gène mitochondrial 12S des vertébrés et le deuxième nucléotide s'hybride de manière sélective à une autre région très conservée du gène mitochondrial 12S des vertébrés dans des conditions de stringences suffisantes pour l'amplification de la région variable du gène mitochondrial 12S des vertébrés par réaction de polymérisation en chaîne (PCR), par exemple dans des conditions de forte stringence. La séquence de la première région conservée correspond à la séquence de l'amorce 12S-V05_F (SEQ ID NO. 1 ) et de sa séquence complémentaire (SEQ ID NO. 3). La séquence de la deuxième région conservée correspond à la séquence de l'amorce 12S-V05_R (SEQ ID NO.2) et de sa séquence complémentaire (SEQ ID NO. 4).

A titre d'exemple, chez l'Homme, le premier oligonucléotide de la présente invention se trouve à la position 1194 de la séquence NC_012920, Homo sapiens mitochondrion et le second oligonucléotide de l'invention se trouve à la position 1093 de cette même séquence.

L'homme du métier connaît les réactions d'amplification d'ADN et les conditions de stringence permettant une amplification sélective d'une séquence. L'homme du métier connaît en particulier les conditions de température d'hybridation et les conditions de composition du tampon d'hybridation.

L'homme du métier pourra donc facilement définir différentes variantes des amorces 12S-V05_F (SEQ ID NO. 1 ) et 12S-V05_R (SEQ ID NO. 2) en utilisant des techniques de routine. Ces variantes s'hybrident aux séquences de référence et permettent l'amplification sélective de la région variable d'intérêt de l'ADN mitochondrial 12S.

Une variante possible de l'amorce 12S-V05_R (SEQ ID NO.2) est représentée à la SEQ ID NO. 5. Certaines variantes possibles de l'amorce 12S-V05_F (S EQ I D N O. 1 ) sont représentées aux SEQ I D Nos. 6-8. Habituellement, les variations de séquence sont plutôt introduites à l'extrémité 5' des oligonucléotides pour ne pas compromettre la réaction d'amplification. Classiquement, on peut par exemple introduire des nucléotides supplémentaires à l'extrémité 5' des oligonucléotides.

Par « séquence capable de s'hybrider de manière sélective » ou « oligonucléotide capable de s'hybrider de manière sélective », on entend selon l'invention les séquences qui s'hybrident avec la séquence de référence à un niveau supérieur au bruit de fond de manière significative. Le niveau du signal généré par l'interaction entre la séquence capable de s'hybrider de manière sélective et les séquences de référence est généralement 10 fois, de préférence 100 fois plus intense que celui de l'interaction des autres séquences d'ADN générant le bruit de fond . Les conditions d'hybridation stringentes permettant une hybridation sélective sont connues de l'homme du métier. En général, la température d'hybridation et de lavage est inférieure d'au moins 5°C, par exemple 10°C, au Tm de la séquence de référence à un pH donné et pour une force ionique donnée. Typiquement, la température d'hybridation est d'au moins 30°C pour un polynucléotide de 15 à 50 nucléotides et d'au moins 60°C pour un polynucléotide de plus de 50 nucléotides. A titre d'exemple, l'hybridation est réalisée dans le tampon suivant : 6X SSC, 50 mM Tris-HCI (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.02% PVP, 0.02% Ficoll, 0.02% BSA, 500 g/ml sperme de saumon dénaturé DNA. Les lavages sont par exemple réalisés successivement à faible stringence dans un tampon 2X SSC, 0, 1 % SDS, à moyenne stringence dans un tampon 0,5X SSC, 01 % SDS et à forte stringence dans un tampon 0.1 X SSC, 0, 1 %SDS. L'hybridation peut bien entendu être effectuée selon d'autres méthodes usuelles connues de l'homme du métier (voir notamment Sambrook, Fristsch et Maniatis, dans leur ouvrage intitulé "Molecular cloning: a laboratory manual", édition : Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

Par « stringence », on entend la rigueur des conditions opératoires (notamment la température et la force ionique) dans lesquelles se déroule une. hybridation moléculaire.

Le paramètre déterminant dans la spécificité et la réversibilité de l'hybridation moléculaire est le Tm ou température de fusion (melting température). C'est la température à laquelle la moitié de l'ADN est sous forme monobrin et l'autre moitié sous forme double brin. Le Tm dépend de nombreux facteurs tels que la longueur du fragment d'ADN considéré, sa richesse en cytosines et guanines et la concentration en sels, notamment en ion Na du milieu réactionnel. En pratique, l'expérimentateur peut créer ou supprimer l'hybridation moléculaire en choisissant une température du milieu réactionnel inférieure, égale ou supérieure au Tm. Les conditions de forte stringence sont celles pour lesquelles la température d'hybridation et de lavage est inférieure d'au moins 5°C et jusqu'à moins 10°C au Tm de la séquence de référence à un pH donné et pour une force ionique donnée.

Par « amplification », on entend toute amplification enzymatique in vitro d'une séquence définie d'ADN, notamment du type réaction de polymérisation en chaîne (ou Polymerase Chain Reaction, PCR). Les amorces selon l'invention peuvent en outre comporter des étiquettes qui vont permettre d'identifier rapidement l'appartenance de chaque séquence amplifiée à un échantillon de départ. Le terme « queue » peut être utilisée de manière équivalente, à la place du terme « étiquette » (« tags » en anglais). Les étiquettes sont de courtes séquences nucléotidiques, généralement de longueur inférieure à 10 nucléotides. Ces étiquettes sont particulièrement utiles lorsqu'il s'agit d'utiliser des séquenceurs de nouvelle génération qui permettent de séquencer près de 100 000 séquences à la fois. En effet, chaque étiquette correspondant à un échantillon de départ à analyser, on peut ainsi mélanger plusieurs produits d'amplification avant de procéder au séquençage. Ceci est avantageux car mettre en œuvre un séquençage via un séquenceur de nouvelle génération peut s'avérer être une opération coûteuse. Dans la pratique, les amorces selon l'invention peuvent comporter un fragment nucléotidique additionnel du coté 5' spécifique de chaque échantillon. Après amplification de plusieurs échantillons, mélange des différents produits d'amplification ainsi obtenus, et séquençage, chaque séquence amplifiée est ainsi facilement assignée à un échantillon de départ. Les étiquettes constituent donc un outil particulièrement avantageux lorsqu'il s'agit de séquencer à haut débit (Binladen et al. , 2007).

Habituellement, l'amplification comporte des cycles successifs

(généralement de 20 à 40) d'amplification, eux-mêmes composés de trois phases: après une étape de dénaturation (séparation des deux brins de la double hélice) de l'ADN, le positionnement des amorces (courtes séquences d'oligonucléotides spécifiquement choisies) en face de leurs séquences complémentaires, sur les brins d'ADN, et leur fixation sur ces cibles constitue la deuxième phase du procédé (hybridation). La phase d'extension fait intervenir une enzyme, l'ADN polymérase, qui synthétise, à partir des amorces, le brin complémentaire de celui ayant servi de matrice. La répétition de ce cycle conduit à l'amplification exponentielle du fragment d'ADN, également appelé produit d'amplification ou ADN amplifié. Selon un aspect de l'invention, l'hybridation s'effectue à une température comprise entre 45 et 65°C. Notamment, l'hybridation peut s'effectuer à une température comprise entre 45 et 60°C lorsque les amorces ne comportent pas d'étiquette. Alternativement, l'hybridation peut s'effectuer à une température comprise entre 50 et 65°C lorsque les amorces comportent une étiquette. Selon un autre aspect, l'invention concerne une paire d'oligonucléotides, selon laquelle le premier oligonucélotide s'hybride de manière sélective à la séquence SEQ ID NO. 3 et le deuxième nucléotide s'hybride de manière sélective à la séquence SEQ ID NO. 4 dans des conditions de stringences suffisantes pour l'amplification d'une région variable du gène mitochondrial 2S de l'Homme dont la séquence est représentée à la SEQ ID NO.66 et qui peut être utilisée comme séquence de référence.

Selon un aspect de l'invention, la paire d'oligonucléotides permet l'amplification d'une région du gène mitochondrial 12S qui comporte moins de 120 nucléotides, en particulier moins de 1 10 ou moins de 100 nucléotides, amorces non comprises (c'est-à-dire sans compter la longueur des amorces). Disposer d'une paire d'amorce universelle qui permette l'amplification d'une région variable courte est très avantageuse car l'utilisation de telles amorces dans des substrats complexes ou dégradés permet la détection et si besoin l'identification des espèces dans de tels substrats.

Les amorces de la présente invention permettent de détecter et identifier plus de 7700 espèces dans le sous-embranchement du règne animal. Parmi ces espèces figurent notamment les amphibiens, les oiseaux, les poissons chondrichtyens, les mammifères, les reptiles et les poissons téléostéens. Les tableaux 1 à 6 donnés dans la partie expérimentale représentent une partie des séquences susceptibles d'être amplifié avec les amorces de la présente invention. Selon un aspect de la présente invention, la région amplifiée par réaction de polymérisation en chaîne présente une séquence nucléotidique sé lecti o n née d a n s le g ro u pe co ns i sta nt e n l'une quelconque des SEQ ID NOS. 9-100.

La présente invention concerne également un mélange d'amorces pour l'amplification d'une région variable du gène mitochondrial 1 2S des vertébrés par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) comprenant les amorces d'amplification 12S-V05_F, 12S-V05_R et l'amorce de blocage selon SEQ ID 101 . Alternativement, l'invention concerne également un mélange d'amorces pour l'amplification d'une région variable du gène mitochondrial 12S des vertébrés par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) comprenant les amorces d'amplification 12S-V05_F et 12S-V05_R et au moins une autre paire d'oligonucléotides choisies parmi les paires d'amorces :

- amorces d'amplification selon SEQ ID NO.102 et SEQ ID NO.103;

- amorces d'amplification selon SEQ ID NO.104 et SEQ ID NO.105; - amorces d'amplification selon SEQ ID NO.106 et SEQ ID NO.107, éventuellement avec amorce de blocage selon SEQ ID NO.108 ;

- amorces d'amplification selon SEQ ID NO.109 et SEQ ID NO.1 10;

- amorces d'amplification selon SEQ ID NO.1 11 et SEQ ID N0.1 12; - amorces d'amplification selon SEQ ID N0.1 13 et SEQ ID NO.1 14;

- amorces d'amplification selon SEQ ID NO.1 15 et SEQ ID NO.1 16;

- amorces d'amplification selon SEQ ID NO.1 7 et SEQ ID NO. 18;

- amorces d'amplification selon SEQ ID NO.1 19 et SEQ ID NO.120;

- amorces d'amplification selon SEQ ID N0.121 et SEQ ID NO.122, éventuellement avec amorce de blocage selon SEQ ID NO.123 ;

- amorces d'amplification selon SEQ ID N0.124 et SEQ ID N0.125, éventuellement avec amorce de blocage selon SEQ ID NO.126 ;

- amorces d'amplification selon SEQ ID N0.127 et SEQ ID NO. 28, éventuellement avec amorce de blocage selon SEQ ID NO.129 ;

- amorces d'amplification selon SEQ ID NO.130 et SEQ ID NO.131 , éventuellement avec amorce de blocage selon SEQ ID NO.132 ;

- amorces d'amplification selon SEQ ID N0.133 et SEQ ID NO.134, éventuellement avec amorce de blocage selon SEQ ID NO.135 et/ou SEQ ID N0.136; et

- amorces d'amplification selon SEQ ID N0.137 et SEQ ID N0.138, éventuellement avec amorce de blocage selon SEQ ID NO.139.

Procédés mettant en œuyre la paire d'oliqonucléotides

La présente invention concerne également un procédé d'amplification d'une région du gène mitochondrial 1 2S des vertébrés, comprenant les étapes suivantes :

a) on dispose d'un échantillon contenant de l'ADN de vertébrés ; b) on réalise une réaction d'amplification en chaîne en utilisant une paire d'oligonucléotides selon l'invention.

L'échantillon à partir duquel la réaction d'amplification est réalisée peut être collecté dans l'environnement. Dans ce cas, il peut par exemple s'agir d'un échantillon de sol, eau ou fèces. L'échantillon peut également provenir de l'industrie, par exemple des farines animales ou des plats industriels (aliments transformés) de l'industrie alimentaire. L'échantillon en question peut par exemple provenir d'un produit qui a été congelé, lyophilisé ou chauffé. Un avantage du procédé selon l'invention utilisant les amorces ci-dessus décrites est que l'ADN contenu dans l'échantillon peut se trouver sous forme dégradée. Cela est principalement dû au fait que les amorces ont été choisies de manière à ce que la région amplifiée soit courte, par exemple de longueur inférieure à 120 paires de bases.

Selon un aspect de l'invention, l'hybridation s'effectue à une température comprise entre 45 et 65°C. En fonction du fait que les paires d'oligonucléotides de l'invention comporte ou non une étiquette tel que cela est décrit précédemment, les conditions de l'amplification, en particulier la température d'hybridation, peut ou non varier. Notamment, l'hybridation peut s'effectuer à une température comprise entre 45 et 60°C lorsque les amorces ne comportent pas d'étiquette. Par exemple, on peut utiliser une température de 51-53°C. Alternativement, l'hybridation peut s'effectuer à une température comprise entre 50 et 65°C lorsque les amorces comportent une étiquette. Par exemple, on peut utiliser une température de 57-58°C. L'homme du métier sait adapter la température d'hybridation aux amorces utilisées.

Le procédé d'amplification selon l'invention peut nécessiter une étape d'extraction de l'ADN avant d'effectuer l'amplification. On utilise alors par exemple pour cela un kit d'extraction disponible dans le commerce.

La présente invention propose également un procédé de détection d'une espèce de vertébrés dans un échantillon. Ce procédé de détection selon l'invention comprend les étapes suivantes :

a) on dispose d'un échantillon susceptible de contenir de l'ADN d'espèces vertébrés ;

b) on isole l'ADN total contenu dans l'échantillon ;

c) on réalise une réaction d'amplification en chaîne en utilisant une paire d'oligonucléotides selon l'invention ; et

d) on détecte l'éventuelle présence d'un produit d'amplification. L'invention se rapporte aussi à un procédé de détection et d'identification d'une espèce de vertébré dans un échantillon, comprenant les étapes suivantes :

a) on dispose d'un échantillon susceptible de contenir de l'ADN d'espèces vertébrés ;

b) on isole l'ADN total contenu dans l'échantillon ;

c) on réalise une réaction d'amplification en chaîne en utilisant une paire d'oligonucléotides selon l'invention ; d) on détecte la présence d'un produit d'amplification ; et e) on détermine la séquence du produit d'amplification pour identifier l'espèce de vertébré contenue dans l'échantillon.

L'étape de détermination de la séquence correspond au séquençage de celle- ci. Les méthodes et outils de séquençage sont connus de l'homme du métier et un exemple de ce qui peut être utilisé dans la présente invention est donné dans la partie expérimentale.

Kit de détection

L'invention a également trait à un kit pour la détection d'une espèce d e ve rté b ré d a n s u n é cha nti l l o n , led i t kit co m p re n a nt une pa i re d'oligonucléotides selon l'invention.

Selon un aspect de l'invention, le kit comprend en outre une amorce de blocage selon l'une quelconque des séquences SEQ ID NOS.101 , 108, 123, 126, 129, 132, 135, 136, 139-142. Utiliser une amorce de blocage est utile lorsqu'il s'agit d'éviter l'amplification d'une espèce déterminée, par exemple l'homme ou la vache. Ces amorces sont choisies à partir de l'extrémité la plus variable du fragment amplifié, et de manière à ce que l'amorce de blocage se chevauche avec l'amorce d'amplification sur au moins 6 nucléotides, par exemple sur 8 nucléotides. Enfin, il est nécessaire que le Tm de l'amorce de bloquage soit nettement supérieur à celui des amorces d'amplification (au moins 5°C, par exemple 10°C).

Selon un autre aspect encore de l'invention, le kit comprend au moins une autre paire d'oligonucléotides. Cette au moins une autre paire d'oligonucléotides peut être alors utilisée à titre de vérification du contenu de l'échantillon ou à titre d'alternatives, par exemple si la paire d'oligonucléotides 12S-V05_F (SEQ ID NO. 1 ) et 12S-V05_R (SEQ ID NO. 2) ne permettait pas l'amplification.

Selon un autre aspect encore de l'invention, le kit comprend en outre une étiquette de moins de 1 0 nucléotides pour l'identification de l'échantillon de départ après séquençage du produit PCR.

Le kit selon l'invention peut également en outre contenir de manière non limitative des réactifs additionnels, par exemple une enzyme DNA polymerase, des dNTP, du Tris-HCI, du KCI, du MgCI ₂ ou du Bovine Sérum Albumin (BSA). Utilisations

La présente invention concerne également l'utilisation de la région variable du gène mitochondrial 12S des vertébrés correspondant aux positions 1094 à 1193 du gène mitochondrial de l'Homme pour détecter et/ou identifier des espèces de vertébrés. Par exemple, cette région variable est sélectionnée dans le groupe consistant en SEQ ID NO.9-100. A partir de la séquence du gène 12S de l'Homme et des positions indiquées, l'homme du métier sait comment identifier les séquences correspondantes dans d'autres espèces vertébrés.

Exemple 1

Matériels et méthodes

PCR

Les amorces 12S-V05 ont été testées pour l'analyse du régime alimentaire de trois espèces de félidés :

i) le léopard commun, Panthera pardus : un échantillon;

ii) le léopard des neiges, Uncia uncia : un échantillon;

iii) le chat-léopard, Prionailurus bengalensis : deux échantillons, en utilisant des fèces comme source d'ADN.

Les extractions d'ADN ont été effectuées à partir de 1 5 mg de matière, en utilisant un kit d'extraction classique et en suivant les instructions du fabricant (DNeasy Blood and Tissue Kit, QIAgen GmbH, Hilden, Germany).

Les extraits d'ADN ont été récupérés dans un volume de 250 [il.

Les amplifications d'ADN ont été faites dans un volume de 25 pL, en utilisant 2 pL d'extrait par réaction.

Le mélange d'amplification contenait 1 U d'AmpliTaq ® Gold DNA Polymerase (Applied Biosystems, Foster City, CA), 10 mM Tris-HCI, 50 mM KCI, 2 mM MgCI ₂ , 0,2 mM de chaque dNTP, 0, 1 μΜ de chaque amorce ( 2SV05F/R + une étiquette ou fragment additionnel de 9 nucléotides du côté 5' spécifique de chaque échantillons), et 5 g de "bovine sérum albumin" (BSA, Roche Diagnostic, Basel, Switzerland).

Le mélange PCR a été dénaturé pendant 10 min à 95°C, suivi de 45 cycles de 30 s à 95°C (dénaturation) et 30 s à 60°C (hybridation).

Comme les séquences cibles sont plus courtes que 120 paires de bases, l'étape d'élongation a été supprimée de manière à réduire la production de l'artefact +A (Brownstein et al., 1996; Magnuson et al., 1996) qui réduit l'efficacité de la première étape de séquençage (ligation à bouts francs).

Séquençage

Le séquençage a été effectué sur un séquenceur lllumina/Solexa Génome Analyzer llx (Illumina Inc., San Diego, CA 92121 USA), en utilisant le Paired- End Cluster Génération Kit V4 et le Sequencing Kit V4 (Illumina Inc., San Diego, CA 92121 USA), en suivant les instructions du fabriquant.

08 nucléotides ont été séquencés à chaque extrémité des fragments d'ADN. Les lectures ont été analysées avec les OBITools (http://www.grenoble .prabi.fr/trac/OBITools):

(i) les deux lectures (dans les deux sens) d'un même fragment ont été alignées et fusionnées avec le programme solexaPairEnd, prenant en compte les données de qualité;

(ii) les amorces et les fragments additionnels pour identifier les échantillons ont été identifiés avec le programme ngsfilter;

(iii) seules les régions amplifiées, sans les amorces, ont été conservées pour les analyses ultérieures;

(iv) les séquences strictement identiques ont été regroupées avec le programme obiuniq;

(v) les séquences plus courtes que 10 paires de bases, ou contenant des ambiguïtés, ou présentes moins de 10 fois ont été retirées avec le programme obigrep;

(vi) l'assignation à un taxon a été réalisée avec le programme ecoTag (Pégard et al., 2009); ce programme est basé sur FASTA35 (Pearson et Lipman, 1988) pour trouver des séquences hautement similaires dans une base de référence qui a été construite à partir des données E BL en utilisant le programme ecoPCR (Ficetola et al. , 2010).

Résultats

Lors de cette expérimentation, les séquences suivantes ont pu être identifiées:

Léopard commun (Panthera pardus) : numéro d'accession EF551002

Léopard des neiges (Uncia uncia)

Chat-léopard (Prionailurus bengalensis)

Chèyre (Caora hircus) : numéro d'accession AF533441 (SEQ ID NO.56)

Bouquetin de Sibérie (Capra sibirica)

Musaraigne (Crocidura pullata)

Perdrix chukar (Alectoris chukar)

Grenouille (Nanorana vicina)

Le tableau ci-dessous présente les nombre de chaque séquence obtenue pour les quatre échantillons. fèces

Léopard Léopard Chat-léopard commun des

Léopard commun (Panthera

2460

pardus)

prédateur Léopard des neiges (Uncia uncia)

Chat-léopard (Prionailurus

1982 9765 bengalensis)

Chèvre (Capra hircus)

Bouquetin de Sibérie {Capra

1256

sibirica)

Musaraigne {Crocidura pullata)

Perdrix chukar (Alectoris οηίΐΐοή

Grenouille (Nanorana vicina)

PCR réalisée dans les mêmes conditions avec en outre des amorces de blocage

Les mêmes échantillons sont soumis au même protocole pour l'amplification, mais avec l'amorce de blocage à une concentration de 2 μΜ; toutes les autres concentrations restent identiques.

Les amorces de blocage suivantes ont été utilisées :

Léopard commun :

SEQ ID NO.140

Léopard des neiges :

SEQ ID NO.14

Chat-léopard :

SEQ ID N0.142

Le tableau ci-dessous présente les nombre de chaque séquence obtenue pour les quatre échantillons, mais en utilisant les amorces de blocage pour l'amplification. fèces

Léopard Chat-léopard

Léopard

des

commun 1 2 neiges

Léopard commun (Panthera

10

pardus)

prédateur Léopard des neiges {Uncia uncia) 318

Chat-léopard {Prionailurus

0 0 bengalensis)

Chèvre (Capra hircus) 5951

proie

Bouquetin de Sibérie (Capra 6225 sibirica)

Musaraigne (Crocidura pullata) 1522 Perdrix chukar (Alectoris οΐΊίΐΙοή 741

Grenouille (Nanorana vicina) 1141 Rat noir (Rattus rattus) 784

Il est à noter que les amorces étant universelles, les proportions obtenues après séquençage reflètent relativement bien les proportions initiales dans les extraits. Il s'agit d'un autre avantage des amorces utilisées.

Discussion

Ces résultats démontrent clairement que le système fonctionne, même pour l'analyse d'ADN très dégradé comme celui issu de fèces de carnivores. Dans cet exemple, des séquences de mammifères, d'oiseaux, et de batraciens ont été amplifiées. L'utilisation d'amorces de blocage permet de limiter l'amplification des séquences du prédateur dans le cas présenté ci-dessus, et permet également de bloquer l'amplification de contaminants potentiels.

Variabilité de la séquence amplifiée

Les tableaux 1 à 6 ci-dessous montrent les variations de la zone amplifiée par les amorces 12S-V05_F et 12S-V05_R de la présente invention pour la détection et l'identification d'espèces de vertébrés. Ces tableaux ont été élaborés à partir de la version 103 de la base de données EMBL.

Il est à noter que ces tableaux ne représentent qu'une partie des espèces pouvant être identifiées en utilisant les amorces de la présente invention. En effet, 24759 séquences sont susceptibles d'être amplifiées en utilisant ces amorces (amplification électronique avec le logiciel ecoPCR, Filetola ef al. , 2010), en tolérant trois mismatches (mais aucun mismatch sur le deux derniers nucléotides du côté 3' des amorces). Ces 24759 séquences sont toutes relatives à des vertébrés dans la mesure où les amorces sont très spécifiques des vertébrés. Plus précisément ces 24759 séquences correspondent à 7726 espèces différentes et à 8264 séquences uniques (deux espèces proches peuvent avoir la même séquence, et une même espèce peut avoir plusieurs variants).

Les tableaux ci-dessous mettent en évidence le fait que deux régions très conservées encadrent une partie variable d'une longueur d'environ 100 nucléotides (voir listage de séquences). Une telle région représente donc une très bonne cible en vue de la détection et de l'identification des espèces de vertébrés à partir d'extraits d'ADN complexes et dégradés.

Exemple 2

Comparaison des amorces de la présente invention (12S-V05_F selon SEQ ID N0.1 et 12S-V05_R selon SEQ ID NO.2) avec les amorces décrites dans WO 2006/024751 La comparaison a été effectuée sur l'ensemble des ADN mitochondriaux d'animaux téléchargés le 15 Mars 201 1 à partir d'EMBL. Cette base contient un total de 2424 séquences, dont 1496 vertébrés et 928 non-vertébrés.

Les amplifications ont été simulées à l'aide du logiciel ecoPCR (Ficetola et al. 2010; Bellemain et al. 2010), en tolérant un maximum de trois mésappariement par amorce, mais en fixant les deux derniers nucléotides du côté 3' (pas de mésappariement possible sur les deux derniers nucléotides du côté 3').

Les amorces suivantes ont été testées:

(i) L15162/H15392 (amplifiant un fragment de 129 nucléotides)

(ii) L1541 1 /H15497 (amplifiant un fragment de 85 nucléotides)

(iii) 1 2S_V5_F/12_V5_R (amplifiant un fragment d'environ 100 nucléotides) Les résultats obtenus sont les suivants (nombre d'amplification positives):

Séquences de vertébrés Séquences de non-vertébrés

Amorces utilisées amplifiées amplifiées

nombre % nombre %

L15 162/H15392 1488 99,47 396 42,67

L 1541 1/H15497 1354 90,51 331 35,67

12S-V05 F/12-V05 R 1388 92,78 0 0

Nous avons observé que les amorces L 5162/H15392 amplifient deux séquences cibles pour les ADN mitochondriaux avec les numéros d'accession NC_010292 et NC_008290. De même les amorces L1541 1/H15497 amplifient sept séq uences cibles pour NC_006331 , et deux séquences cibles pour NC_015087, NC_015085, NC_014681 , NC_014679, NC_014280, NC_01 1598, NC_01 1597, NC_008360, NC_008290, NC_007782 et NC_006992.

Les amorces de la présente invention n'amplifient jamais deux séquences cibles sur le même ADN mitochondrial.

D'autre part, en testant les amorces sur la version 107 d'EMBL comprenant l'ensemble des séquences déposées dans les bases de données publiques, nous avons constaté que L15162/H15392 et L1541 1 /H15497 amplifient également quelques bactéries, et quelques végétaux, ce qui n'est jamais le cas pour les amorces la présente invention. Les émorces de la présente invention sont beaucoup plus spécifiques.

L'extrême dégénérescence des amorces L15162/H15392 et L1541 1/H15497 explique qu'elles amplifient une bonne proportion de l'ensemble des vertébrés. En revanche, cette dégénérescence explique aussi les artéfacts produits (plusieurs séquences cibles amplifiées sur un même ADN mitochondrial) et le manque de spécificité pour les vertébrés (L15162/H 15392 amplifient plus de 40% de non-vertébrés, et L1541 1 /H 15497 plus de 35%).

Tableau 1 - Amphibiens

Nom Numéro Séquence Séquence amplifiée Séquence

scientifique d'accession correspondant à correspondant à

12S-V05 F 12S-V05 F

Alytes CTAGCCTTAAACATTGACAACTTACATTATTTCATCCGCCCGGGAACTACGAGC

AJ440759 TTAGATACCCCACTATGC CGCAGCTTAAAACCCAAAGGACTTGGCGGTGCCCCAAACCCAC TAGAACAGGCTCCTCTAG obstetricans

(SEQ ID NO. )

Bombina CTAACCTCAAACTATGACTCAATACAAAACACCATCCGCCCGGGAACTACGAGC

AJ440764 TTAGATACCCCACTATGC CCTAGCTTAAAACCCAAAGGACTTGGCGGTGCCCCACCCAC TAGAACAGGCTCCTCTAG variegata

(SEQ ID NO.10)

CCAGCCGTAAACTTTTACTTACATCAAATCGCCAGGGAACTACGAGCCAAGCTT

Bufo bufo AY325988 TTAGATACCCCACTATGC AAAACCCAAAGGACTTGACGGTACCCCACATCCCC TAGGACAGGCTCCTCTAG

(SEQ ID NO.11)

CCAGCCGTAAACTTTTATTTACATCCAAATCGCCCGGGAACTACGAGCTAAGCT

Bufo viridis AY680267 TTAGATACCCCACTATGC TAAAACCCAAAGGACTTGACGGTACCCCATATCCCC TAGGACAGGCTCCTCTAG

(SEQ ID NO.12)

TCAGTCGTAAACTTTAAATTACTTCCTACTCGCCCGGGAACTACGAGCTATGCT

Dendrobates

DQ502123 TTAGATACCCCACTATGC TAAAACCCAAAGGACTTGACGGTACCCCATATCCCC TAGGACAGGCTCCTCTAG tinctorius

(SEQ ID NO.13)

TCAGCCGTAAACTTTAAATTACATTCGTATCGCCTGGGAACTACGAGCCAAGCT

Hyla arborea AY843601 TTAGATACCCCACTATGC TAAAACCCAAAGGACTTGACGGTACCCCACATCCAC CAGGACAGGCTCCTCTAG

(SEQ ID NO.14)

TCAGCCGTAAACTTTAAATTACACCAATATCGCCAGGGAACTACGAGCTAAGCT

Hyla meridionalis AY819370 TTAGATACCCCACTATGC TAAAACCCAAAGGACTTGACGGTACCCCATATCCAC TAGGACAGGCTCCTCTAG

(SEQ ID NO.15)

CTAGCCGTAAACAATTAATTTACACCCATCAGCGCCAGGGAACTACGAGCAATG

Rana pipiens DQ283123 TTAGATACCCCACTATGC CTTAAAACCCAAAGGATTTGACGGTGTCCCACCCAG AAGAACAGGCTCCTCTAG

(SEQ ID NO.16)

CTAGCCGTAAACAATTAACTCACATCCACACCGCCAGGGAATTACGAGCAATGC

Rana temporaria AY326063 TTAGATACCCCACTATGC TTAAAACCCAAAGGATTTGACGGTGTCCCACCCCA TAGAACAGGCTCCTCTAG

(SEQ ID NO.17)

CTAGACATAAACTTTGATTATCCGCCAGAGTACTACGAGCTACAGCTTAAAACT

Salamandra atra AY928616 TTAGATACCCCACTATGC CAAAGGACTTGGCGGTGCTTTACACCCCC TAGAACAGGCTCCTCTAG

(SEQ ID N0.18)

CTAAACATAAACTTTGATTATCCGCCAGAGTACTACGAGCCACAGCTTAAAACT

Salamandra

AY928617 TTAGATACCCCACTATGC CAAAGGACTTGGCGGTGCTTTACACCCCC TAGAACAGGCTCCTCTAG lanzai

(SEQ ID NO.19)

Tableau 2 - Oiseaux

CTGGCCCTAAATCCTGATACTTATCTTACCAAAGTATCCGCCCGAGAACTACGA

Buteo buteo AF380305 TTAGATACCCCACTATGC GCACAAACGCTTAAAACTCTAAGGACTTGGCGGTGCCCCAAACCCAC TAGAACAGGCTCCTCTAG

(SEQ ID NO.29)

Cardinalis CTGGCCCTAAATCTTGATGCTTACACCTACTAAAGCATCCGCCCGAGAACTACG

AF447215 TTAGATACCCCACTATGC AGCACTAACGCTTAAAACTCTAAGGACTTGGCGGTGCTCCAAACCCAC

cardinalis CAGAACAGGCTCCTCTAG

(SEQ ID NO.30)

TTAGCCCTAAATCTTGGTACTTACCCTACTAAAGTACCCGCCCGAGAACTACGA

Ciconia ciconia AB026818 TTAGATACCCCACTATGC GCACAAACGCTTAAAACTCTAAGGACTTGGCGGTGCCCCAAACCCAC CAGAACAGGCTCCTCTAG

(SEQ ID NO.31)

CTGGCCCTAAATCTAGATGCTTATGTTACTAAAGCATCCGCCCGAGGACTACGA

Colnmba livia AF 173585 TTAGATACCCCACTATGC GCACAAACGCTTAAAACTCTAAGGACTTGGCGGTGCCCTAAACCCAC TAGAACAGGCTCCTCTAG

(SEQ ID NO.32)

CTGGCCCTAAATCTTGATGCTCTATGCTACCTGAGCATCCGCCCGAGAACTACG

Corvus corone AF386463 TTAGATACCCCACTATGC AGCACAAACGCTTAAAACTCTAAGGACTTGGCGGTGTCCCAAACCCAC CAGAACAGGCTCCTCTAG

(SEQ ID NO.33)

CTGGCCCTAAATCTTGATACTTACTTTACCGAAGTATCCGCCAGAGAACTACGA

Cygnus cygnus AY164523 TTAGATACCCCACTATGC GCACAAACGCTTAAAACTCTAAGGACTTGGCGGTGCCCCAAACCCAC TAGAACAGGCTCCTCTAG

(SEQ ID NO.34)

CTAGCCCTAAATCCTGATGTTTATTGTACCATAGCACATCCGCCCGAGAATTAC

Falco peregrinus AB219556 TTAGATACCCCACTATGC GAGCACAAACGCTTGAAACTCTAAGGACTTGGCGGTGCCCCAAACCCAC CAGAACAGGCTCCTCTAG

(SEQ ID NO.35)

CTGGCCCTAAATCTTGATGCTTACCCCTACTAAAGCATCCGCCCGAGAACTACG

Fringilla coelebs AF407088 TTAGATACCCCACTATGC AGCACCAACGCTTAAAACTCTAAGGACCTGGCGGTGCCCCAAACCCAC CAGAACAGGCTCCTCTAG

(SEQ ID NO.36)

CTAGCCCTAAATCTAGATACCTCCCATCACACATGTATCCGCCTGAGAACTACG

Gallus gallus AB086102 TTAGATACCCCACTATGC AGCACAAACGCTTAAAACTCTAAGGACTTGGCGGTGCCCCAAACCCAC TAGAACAGGCTCCTCTAG

(SEQ ID NO.37)

CTGGCCCTTAATCCAGATACCCATATACCCCTGTATCCGCCCGAGAACTACGAG

Lagopus muta AF222585 TTAGATACCCCACTATGC CACAAACGCTTAAAACTCTAAGGACTTGGCGGTGCCCTAAACCCAC TAGAACAGGCTCCTCTAG

(SEQ ID NO.38)

CTGGCCCTAAATCTTGATGCTTACCCCTACTAAAGCATCCGCCCGAGAACTACG

Motacilla alba AF407083 TTAGATACCCCACTATGC AGCACCAACGCTTAAAACTCTAAGGACTTGGCGGTGCCCCAAACCCAC CAGAACAGGCTCCTCTAG

(SEQ ID NO.39)

CTGGCCCTAAATCTTGATGCTCGATATTACCTGAGCATCCGCCTGAGAACTACG

Parus major A Y 136557 TTAGATACCCCACTATGC AGCACAAACGCTTAAAACTCTAAGGACTTGGCGGTGCCCCAAACCCAC TAGAACAGGCTCCTCTAG

(SEQ ID NO.40)

CTGGCCCTAAATCTTGATGCTTAAACCTACTAAAGCATCCGCCCGAGAACTACG

Passer

AF407085 TTAGATACCCCACTATGC AGCACTAACGCTTAAAACTCTAAGGACTTGGCGGTGCCCCAAACCCAC CAGAACAGGCTCCTCTAG domesticus

(SEQ ID NO.41)

CTGGCCCTAAATCTAGACACCCGCACACCCGAGTGTCCGCCTGAGAACTACGAG

Perdix perdix AF222590 TTAGATACCCCACTATGC CACAAACGCTTAAAACTCTAAGGACTTGGCGGTGCCCTAAACCCAC CAGAACAGGCTCCTCTAG

(SEQ ID NO. 2)

CTGGCCCTAAATCTAGATGCCTACATACCCATGCATCCGCCCGAGAACTACGAG

Phasianus

AM9025 15 TTAGATACCCCACTATGC CACAAACGCTTAAAACTCTAAGGACTTGGCGGTGCCCCAAACCCAC TAGAACAGGCTCCTCTAG colc icus

(SEQ ID NO.43)

CTGGCCCTAAATCTTGATGCTCGATCTTACTGGAGCATCCGCCCGAGAACTACG

Sylvia atricapilla AM889140 TTAGATACCCCACTATGC AGCACCAACGCTTAAAACTCTAAGGACTTGGCGGTGCCCCACATCCAC CAGAACAGGCTCCTCTAG

(SEQ ID NO.44)

CTGGCCCTTAATCTAGATACCTATATACCCTTGTATCCGCCTGAGAACTACGAG

Telrao urogallus AF222594 TTAGATACCCCACTATGC CACAAACGCTTAAAACTCTAAGGACTTGGCGGTGCCCTAAACCCAC TAGAACAGGCTCCTCTAG

(SEQ ID NO.45)

CTGGCCCTAAATCTTGATGCTCGATATTACCTGAGCATCCGCCCGAGAACTACG

Turdus

AF484935 TTAGATACCCCACTATGC AGCACAAACGCTTAAAACTCTAAGGACTTGGCGGTGCCCCAAACCCAC CAGAACAGGCTCCTNTAG p ilomelos

(SEQ ID NO.46)

CTGGCCCTAAATCTTGATGCTCGATCTAACCGGAGCATCCGCCCGAGAACTACG

Zosterops

AY136570 TTAGATACCCCACTATGC AGCACAAACGCTTAAAACTCTAAGGACTTGGCGGTGCTCCAAATCCAC CAGAACAGGCTCCTCTAG pallidus

(SEQ ID NO.47)

Tableau 3 - Poissons chondrichtyens

Nom Numéro Séquence Séquence amplifiée Séquence

scientifique d'accession correspondant à correspondant à

12S-V05 F 12S-V05 F

Chimaera TTAGCCCTAAACCTAGGTGCTTAATTACCTAAACACCCGCCAGAGAACTACAAG

AJ3 10140 TTAGATACCCCACTATGT CGCCAGCTTGAAACCCAAAGGACTTGGCGGTGCTTAGATCCCC

monstrosa TAGAACAGGCTCCTCTAG

(SEQ ID NO .48)

TTAACCATAAACATTGTTATTAATGATATACCTTAATAACCGCCTGAGTACTAC

Manta birostris AF448000 TTAGATACCCTACTATGC AAGCGCTAGCTTAAAACCCAAAGGACTTGGCGGTGCTCCAAATCCAC TAGAACAGGCTCCTCTAG

(SEQ ID NO. 9)

TTAACCATAAATAGACCTTTACTACCACTTACTTTGTTTAAGTCCGCCTGAGTA

Raja brachyura EF081263 TTAGATACCCTACTATGC CTACAAGCGCTAGCTTAAAACCCAAAGGACTTGGCGGTGCCCCAGACCCCC TAGAACAGGCTCCTCTAG

(SEQ ID NO.50)

CCATCTACAAACTTAGACAATAATCTACCATATTGTCCGCCAGAGTACTACAAG

Squatina

AF448031 TTAGATACCCTACTATGC CGCTAGCTTAAAACCCAAAGGACTTGGCGGTGCCTCAGACCCTC CAGAACAGGCTCCTCTAG nebulosa

(SEQ ID NO.51)

TTAATTATAAATAGATAAATATTCACTAACTCATTCGCCCGAGAACTACAAGCG

Torpédo tokionis AF448026 TTAGATACCCTACTATGT CTAGCTTAAAACCCAAAGGACTTGGCGGCACTTCAGATCTAC CAGAACAGGCTCCTCTAG

(SEQ ID NO.52)

Tableau 4 - Mammifères

Nom Numéro Séquence Séquence amplifiée Séquence

scientifique d'accession correspondant à correspondant à

12S-V05 F 12S-V05 F

TTAGCCCTAAACACAGATAATTACATAAACAAAATTATTTGCCAGAGTACTACC

Bison bison AF091687 TTAGATACCCCACTATGC AGCAACAGCTTAAAACTCAAAGGACTTGGCGGTGCTTTATATCCTT TAGAACAGGCTCCTCTAG

(SEQ ID NO.53)

TTAGCCCTAAACACAGATAATTACATAAACAAAATTATTCGCCAGAGTACTACT

Bos taurus AB074962 TTAGATACCCCACTATGC AGCAACAGCTTAAAACTCAAAGGACTTGGCGGTGCTTTATATCCTT TAGAACAGGCTCCTCTAG

( SEQ ID NO.54)

TTAGCCCTAAACATAAACCATTCTATAACAAAATAATTCGCCAGAGAACTACTA

Canis lupus AB048585 TTAGATACCCCACTATGC GCAACAGCTTAAAACTCAAAGGACTTGGCGGTGCTTTATATCCCT TAGAACAGGCTCCTCTAG

(SEQ ID NO.55)

TTAGCCCTAAACACAAATAATTACAGAAACAAAATTATTCGCCAGAGTACTACC

Capt a hircus AF533441 TTAGATACCCCACTATGC GGCAACAGCCCGAAACTCAAAGGACTTGGCGGTGCTTTATACCCTT TAGAACAGGCTCCTCTAG

(SEQ ID NO.56)

TTAGCCCTAAACACAAGTAGTCACAAAAACAAGATTATTCGCCAGAGTACTACC

Capra ibex AY8468 15 TTAGATACCCCACTATGC GGCAACAGCCCGAAACTCAAAGGACTTGGCGGTGCTTTATACCCTT TAGAACAGGCTCCTCTAG

(SEQ ID NO.57)

TTAGCCCTAAACACAAGTAATTAATATAACAAAATTATTCGCCAGAGTACTACC

Câpre olus

AJ885202 TTAGATACCCCACTATGC GGCAATAGCTTAAAACTCAAAGGACTTGGCGGTGCTTTATACCCTT TAGAACAGGCTCCTCTAG capreolus

(SEQ ID NO.58)

TTAGCCGTAAACCCAAATATGTAAACCAACAAACATATTCGCCAGAGAACTACT

Castor fiber A J389542 TTAGATACCCCACTATGC AGCAACAGCTTAAAACTCAAAGGACTTGGCGGTGCTTTATATCCGT TAGAACAGGCTCCTCTAG

(SEQ ID NO.59)

CTAGCCTTAAACACAAATAGTTATGCAAACAAAACTATTCGCCAGAGTACTACC

Cervus elaphus AB245427 TTAGATACCCCACTATGC GGCAATAGCTTAAAACTCAAAGGACTTGGCGGTGCTTTATACCCTT TAGAACAGGCTCCTCTAG

(SEQ ID NO.60)

TCAGCCCTAAACACAAAAAATTCACAACAAAATTGTTCGCCAGAGAACTACGAG

Eliomys

Y16896 TTAGATACCCCACTATGC CCACAGCTCAAAACTCAAAGGACTTGGCGGTGCTTTATATCCCT TAGAACAGGCTCCTCTAG quercinus

(SEQ ID NO.61)

Eptesicus TTAGCCCTAAACATGGAAAATTATAAACAAAATTATTCGCCAGAGTACTACCAG

AY495467 TTAGATACCCCACTATGC

serotinus CAAGAGCTAGAAACTCAAAGGACTTGGCGGTGCCTTAAGTCCTT TAGAACAGGCTCCTCTAG

(SEQ ID NO.62)

Erinaceus TTAGCCCTAAACTTAGACAGTTACTTAACAAAACTGTACGCCAGAGAACTACGA

X88898 TTAGATACCCTATTATGC GCTACAGCTTAAAACTCAAAGGACTTGGCGGTGCTTTATACCCC

e ropaeus CAGAACAGGCTCCTCTAG

(SEQ ID NO.63)

TTAGCCCTAAACTTAGATAGTTATCCTAAACAAAACTATCCGCCAGAGAACTAC

Felis c tus AY012149 TTAGATACCCCACTATGC TAGCAATAGCTTAAAACTCAAAGGACTTGGCGGTGCTTTACATCCCT TAGAACAGGCTCCTCTAG

(SEQ ID NO.64)

TTAGCCCTAAACATAAACCCTTACTAACGCAACCGTTCGCCAGAGTACTACAAG

G lis glis AJ001562 TTAGATACCCCACTATGC CCACAGCTCAAAACTCAAAGGACTTGGCGGTGCTTTATATCCCT TAGAACAGGCTCCTCTAG

(SEQ ID NO.65)

TTAGCCCTAAACCTCAACAGTTAAATCAACAAAACTGCTCGCCAGAACACTACG

Homo sapiens AB055387 TTAGATACCCCACTATGC AGCCACAGCTTAAAACTCAAAGGACCTGGCGGTGCTTCATATCCCT CAGAACAGGCTCCTCTAG

(SEQ ID NO.66)

TTAGCCTTAAACCTAAATAATTTCCTAACAAAATTATTCGCCAGAGAACTACAA

Lepus europaeus AJ421471 TTAGATACCCCATTATGC GCCAGAGCTTAAAACTCAAAGGACTTGGCGGTGCTTTATACCCGC TAGAACAGGCTCCTCTAG

(SEQ ID NO.67)

TCAGCCCTAAACATAGATAGCTTACATAACAAAACTATCTGCCAGAGAACTACT

Lutra luira FJ236015 TTAGATACCCCACTATGC AGCAACAGCTTAAAACTCAAAGGACTTGGCGGTGCTTTACATCCCT TAGAACAGGCTCCTCTAG

(SEQ ID NO.68)

TCAGCCCTAAACATAGATAATTCATAGAACAAAATTATCTGCCAGAGAACTACT

Mêles mêles AB U 9077 TTAGATACCCCACTATGC AGCAACAGCTTAAAACTCAAAGGACTTGGCGGTGCTTTACATCCCT TAGAACAGGCTCCTCTAG

(SEQ ID NO.69)

TTAGCCATAAACCTAAATAATTAAATTTAACAAAACTATTTGCCAGAGAACTAC

Mus musculus AB042432 TTAGATACCCCACTATGC TAGCCATAGCTTAAAACTCAAAGGACTTGGCGGTACTTTATATCCAT TAGAACAGGCTCCTCTAG

(SEQ ID NO.70)

TCAGCCCTAAACATAAATAGTTCTAACAACAAAACTATCTGCCAGAGAACTACT

Mustela erminea AB U 9066 TTAGATACCCCACTATGC AGCAACAGCTTAAAACTCAAAGGACTTGGCGGTGCTTTACATCCCT TAGAACAGGCTCCTCTAG

(SEQ ID NO.71)

TTAGCCCTAAACTTCATCATTATAAAACAAAAGTATTTGCCTGAGAACTACTAG

Myodes glareolus AJ005781 TTAGATACCCCACTATGC CCACAGCTTAAAACTCAAAGGACTTGGCGGTACTTTATATCCAT TAGAACAGGCTCCTCTAG

(SEQ ID NO.72)

TTAGCCCTAAACTTTGATAATTTCATAACAAAATTATTCGCCAGAGAACTACAA

Oryctolagus

AJ001588 TTAGATACCCCACTATGC GCCAAAGCTTAAAACTCAAAGGACTTGGCGGTGCTTTATACCCAC CGGAACAGGCTCCTCTAG cuniculus

(SEQ ID NO.73)

TTAGCCCTAAACACAAATAATTATAAAAACAAAATTATTCGCCAGAGTACTACC

Ovis aries AFO 10406 TTAGATACCCCACTATGC GCAACAGCCCGAAACTCAAAGGACTTGGCGGTGCTTTATACCCTT TAGAACAGGCTCCTCTAG

(SEQ ID NO.74)

TTAGCCCTAAACCTTAATAATTAAACCTACAAAATTATTTGCCAGAGAACTACT

Rattus norvégiens AB 183258 TTAGATACCCCACTATGC AGCTACAGCTTAAAACTCAAAGGACTTGGCGGTACTTTATATCCAT TAGAACAGGCTCCTCTAG

(SEQ ID NO.75)

TTAGCCCTAAACATAGACACTCAATTAACAAGACTGTTCGCCAGAGGACTACTA

S iurus vulgaris AJ238588 TTAGATACCCCACTATGC GCTACTGCTTAAAACTCAAAGGACTTGGCGGTGCTTTACATCCCT TAGAACAGGCTCCTCTAG

(SEQ ID NO.76)

TTAGCCCTAAACTCAGGTATTTAACCTAACAAAAATACCCGCCAGAGAACTACT

Sorex araneus AY012102 TTAGATACCCCACTATGC AGCAATAGCTTAAAACTCAAAGGACTTGGCGGTGCTTTATATCCCT CAGAACAGGCTCCTCTAG

(SEQ ID NO.77)

CTAGCCCTAAACCCAAATAGTTACATAACAAAACTATTCGCCAGAGTACTACTC

Sus scrofa AB292606 TTAGATACCCCACTATGC GCAACTGCCTAAAACTCAAAGGACTTGGCGGTGCTTCACATCCAC TAGAACAGGCTCCTCTAG

(SEQ ID NO.78)

TTAGCCTTAAACATAAATAATTTATTAAACAAAATTATTCGCCAGAGAACTACT

Ursus arctos AF303110 TTAGATACCCCACTATGC AGCAACAGCTTAAAACTCAAAGGACTTGGCGGTGCTTTAACCCCC TAGAACAGGCTCCTCTAG

(SEQ ID NO.79)

Tableau 5 - Reptiles

Nom Numéro Séquence Séquence amplifiée Séquence

scientifique d'accession correspondant à correspondant à

12S-V05 F 12S-V05 F

CTAACCATAACACAACAATTAAATCACTTATTGTTCGCCAAATAACTACGAGTA

Coronella

AY122836 TTAGATACCTTACTATGC AAAACTTAAAATTTAAAAGACTTGACGGTACCTCAAA CAAC

austriaca TTAGACAGGCTCCTCTAG

(SEQ ID NO.80)

CTAACCATAACACAACAATCAAATAACCCATTGTTCGCCAAATAACTACGAGTA

Coronella

AY122835 TTAGATACCTTACTATGC AAAACTTAAAATTTAAAAGACTTGACGGTACCTCAAAACAAC TTAGACAGGCTCCTCTAG girondica

(SEQ ID NO.81)

CCAGACGTAAACTTTGATAGAACCACATCACAAATCTATCCGCCAGGGGACTAC

Gekko gecko AY282753 TTAGATACCCTACTATGC TAGTAACTAACTTAAAACTCCAAGGACTTGACGGTGTTCCATATCATC TAGGACAGGCTCCTCTAG

(SEQ ID NO.82)

TAAGCCATAAACATTGATTAGCCACTATACAACTTCTCCGCCAGAGAATTACAA

Lacerta

AF206591 TTAGATACCCTATTATGC GTGAAAAACTTAAAACTCAAAGGACTTGACGGTGTCCCATATCGAC TAGGACAGGCTCCTCTAG schreiberi

(SEQ ID- NO.83)

CTAGCCGTAACAAAACAATTAAATAACTAATTGTTCGCCAAATAACTACGAGTG

Naja naja AF236683 TTAGATACCTTACTATGC AAAACTTAAAATTTAAAAGACTTGACGGTGCTTCACATCAAC TTAGACAGGCTCCTCTAG

(SEQ ID NO.84)

CTAACCTAACACACAATAAATTACCAATTGTTCGCCAAACAACTACGAGTAAAA

Natrix maura AF402623 TTAGATACCTTACTATGC ACTTAAAACTTAAAAGACTTGACGGTACTTCACACCACC TTAGACAGGCTCCTCTAG

(SEQ ID NO.85)

CTAACCTAACACACAATAAACTACCAATTGTTCGCCAAACAACTACGAGTAAAA

Natrix natrix AY 122682 TTAGATACCTTACTATGC ACTTAAAACTTAAAAGACTTGACGGTACTTCACACCACC TTAGACAGGCTCCTCTAG

(SEQ ID NO.86)

TAAGCCCTGAACATTGATAGTTACTAATACAATACTTTCCGCCAGAGAACTACA

Podarcis muralis AF206600 TTAGATACCCTACTATGC AGTGAAAAACTTAAAACTCAAAGGACTTGACGGTGTCCCATATCGGC TAGGACAGGCTCCTCTAG

(SEQ ID NO.87)

CCAACCACAACCCACAATTAAAATACTAATTGTTCGCCAAACAACTACGAGTAG

Vipera rsinii AF236687 TTAGATACCTTACTATAC TAACTTAAAACTTAAAAGACTTGACGGTACTTTATCACAAC TTAGACAGGCTCCTCTAG

(SEQ ID NO.88)

Tableau 6 - Poissons téléostéens

Nom Numéro Séquence Séquence amplifiée Séquence

scientifique d'accession correspondant à correspondant à

12S-V05 F 12S-V05 F

TCAGTCATAAACTTTGGTGATAAATTACACATATTGCCCGCCAGGGTACTACGA

Acipenser

AY544139 TTAGATACCCCACTATGC GCGCTAGCTTAAAACCCAAAGGACTTGGCGGTGCCCCAGACCCAC TAGAACAGGCTCCTCTAG persicus

(SEQ ID NO.89)

TCAACCTTAAACAACGATGACAACATACAAATATCATCCGCCAGGGGACTACGA

Anguilla anguilla AB021887 TTAGATACCCCACTATGC GCGTTAGCTTAAAACCCAAAGGACTTGGCGGTGCCTCAAACCCAC TAGAACAGGCTCCTCTAG

(SEQ ID NO.90)

TCAGCCGTAAACTTAGACATCCAAATACAATTAGATGTCCGCCAGGGTACTACG

Barbus barbus AB238965 TTAGATACCCCACTATGC AGCACCAGCTTAAAACCCAAAGGACCTGACGGTGTCTCAGACCCCC TAGAACAGGCTCCTCTAG

(SEQ ID NO.91)

CTAGCCGTAAACTTTGATGGAAACATACAACTAACATCCGCCAGGGAACTACAA

Coregonus

AB034824 TTAGATACCCCACTATGC GCGCCAGCTTAAAACCCAAAGGACTTGGCGGTGCCTCAGACCCAC TAGAACAGGCTCCTCTAG lavaretus

(SEQ ID NO.92)

CTAGCCCTAAACATTGATAGTACAATACACCCACTATCCGCCCGGGTACTACGA

Cottus gobio AB188189 TTAGATACCCCACTATGC GCAATAGCTTAAAACCCAAAGGACTTGGCGGTGCTTTAGATCCAC TAGAACAGGCTCCTCTAG

(SEQ ID NO.93)

ATGGTCGTTAACATTGATGGTTTTATACCCAAACCGTCCGCCTGGGAACTACGA

Gadus morhua AM489716 TTAGATACCCCACTATGT GCAATAGCTTAAAACCCAAAGGACTTGGCGGTGCTTTAGACCCCC TAGAACAGGCTCCTCTAG

(SEQ ID NO.94)

CTAGCCCTAAACATTGATAGAATTTTACAACCACTATCCGCCCGGGGACTACAA

Gasterosteus

AP002944 TTAGATACCCCACTATGC GCATCAGCTTGAAACCCAAAGGACTTGGCGGTGCTTTAGATCCAC TAGAACAGGCTCCTCTAG aculeatus ( SEQ ID NO.95)

TTAGCCGTAAACATTGATAGTACAGTACATCTACTATCCGCCCGGGTACTACGA

Labrus merula AJ810141 TTAGATACCCCACTATGC GCACCAGCTTAAAACCCAAAGGACTTGGCGGTGCTTTAGATCCAC TAGAACAGGCTCCTCTAG

(SEQ ID NO.96)

ATGGTTGTTAACATTGATGGTTTTATACTTAAACCATCCGCCTGGGTACTACGA

Lota Iota AP004412 TTAGATACCCCACTATGT GCATTAGCTTAAAACCCAAAGGACTTGGCGGTGCTTTAGACCCCC TAGAACAGGCTCCTCTAG

(SEQ ID NO.97)

CTAGCCGTAAACCTTGATAGAAATATACAATTGATATCCGCCAGGGAACTACAA

Oncorhynchus

DQ288268 TTAGATACCCCACTATGC GCGCCAGCTTAAAACCCAAAGGACTTGGCGGTGCCTCAGACCCAC TAGAACAGGCTCCTCTAG mykiss

(SEQ ID NO.98)

CTAGCCGTAAACTTTGATAGAAAAATACAACTGATATCCGCCAGGGAACTACAA

Salvelinus

AF 154850 TTAGATACCCCACTATGC GCGCCAGCTTAAAACCCAAAGGACTTGGCGGTGCCTCAGACCCAC TAGAACAGGCTCCTCTAG fontinalis

(SEQ ID NO.99)

TTAGCCATAAACATCGATCTTTACACAAAAATCCGCCCGGGAACTACAAACACG

Solea solea AF488492 TTAGATACCCCACTATGC AGTTTAAAACCCAAAGGACTTGGCGGTGCTTAACATCCAC TAGAACAGGCTCCTCTAG

(SEQ ID NO.100)