Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen, bei denen die Hemmung, Regulierung und/oder Modulation der Signaltransduktion von Kinasen, insbesondere der Tyrosinkinasen und/oder Raf-Kinasen eine Rolle spielt, ferner pharmazeutische Zusammensetzungen, die diese Verbindungen enthalten, sowie die Verwendung der Verbindungen zur Behandlung von kinasebedingter Krankheiten.

Im einzelnen betrifft die vorliegende Erfindung Verbindungen, die die Signaltransduktion der Tyrosinkinasen hemmen, regulieren und/oder modulieren, Zusammensetzungen, die diese Verbindungen enthalten, sowie Verfahren zu ihrer Verwendung zur Behandlung von tyrosinkinase- bedingten Krankheiten und Leiden wie Angiogenese, Krebs, Tumor- wachstum, Arteriosklerose, altersbedingte Makula-Degeneration, diabetische Retinopathie, Entzündungserkrankungen und dergleichen bei Säugetieren.

Bei den Tyrosinkinasen handelt es sich um eine Klasse von Enyzmen, die die Übertragung des endständigen Phosphats des Adenosintriphosphats auf Tyrosinreste bei Proteinsubstraten katalysieren. Man nimmt an, dass den Tyrosinkinasen bei verschiedenen Zellfunktionen über die Substrat- phosphorylierung eine wesentliche Rolle bei der Signaltransduktion zukommt. Obwohl die genaue Mechanismen der Signaltransduktion noch unklar sind, wurde gezeigt, dass die Tyrosinkinasen wichtige Faktoren bei

der Zellproliferation, der Karzinogenese und der Zelldifferenzierung darstellen.

Die Tyrosinkinasen lassen sich in Rezeptor-Tyrosinkinasen und zytosolische Tyrosinkinasen einteilen. Die Rezeptor-Tyrosinkinasen weisen einen extrazellulären Teil, einen Transmembranteil und einen intrazellulären Teil auf, während die zytosolischen Tyrosinkinasen ausschließlich intrazellulär vorliegen.

Die Rezeptor-Tyrosinkinasen bestehen aus einer Vielzahl von Trans- membranrezeptoren mit unterschiedlicher biologischer Wirksamkeit. So wurden ungefähr 20 verschiedene Unterfamilien von Rezeptor-Tyrosin- kinasen identifiziert. Eine Tyrosinkinase-Unterfamilie, die die Bezeichnung HER-Unterfamilie trägt, besteht aus EGFR, HER2, HER3 und HER4. Zu den Liganden dieser Rezeptor-Unterfamilie zählen der Epithel-Wachs- tumsfaktor, TGF-a, Amphiregulin, HB-EGF, Betacellulin und Heregulin. Die Insulin-Unterfamilie, zu der INS-R, IGF-IR und IR-R zählen, stellt eine weitere Unterfamilie dieser Rezeptor-Tyrosinkinasen dar. Die PDGF- Unterfamilie beinhaltet den PDGF-a-and-ß-Rezeptor, CSFIR, c-kit und FLK-II. Außerdem gibt es die FLK-Familie, die aus dem Kinaseinsert- domänenrezeptor (KDR), der fötalen Leberkinase-1 (FLK-1), der fötalen Leberkinase-4 (FLK-4) und der fms-Tyrosinkinase-1 (fit-1) besteht. Die PDGF-und FLK-Familie werden üblicherweise aufgrund der zwischen den beiden Gruppen bestehenden Ähnlichkeiten gemeinsam diskutiert. Für eine genaue Diskussion der Rezeptor-Tyrosinkinasen siehe die Arbeit von Plowman et al., DN & P 7 (6) : 334-339,1994, die hiermit durch Bezug- nahme aufgenommen wird.

Die zytosolischen Tyrosinkinasen bestehen ebenfalls aus einer Vielzahl von Unterfamilien, darunter Src, Frk, Btk, Csk, Abl, Zap70, Fes/Fps, Fak, Jak, Ack, and LIMK. Jede dieser Unterfamilien ist weiter in verschiedene Rezeptoren unterteilt. So stellt zum Beispiel die Src-Unterfamilie eine der größten Unterfamilien dar. Sie beinhaltet Src, Yes, Fyn, Lyn, Lck, Blk, Hck, Fgr und Yrk. Die Src-Enzymunterfamilie wurde mit der Onkogenese in Verbindung gebracht. Für eine genauere Diskussion der zytosolischen

Tyrosinkinasen, siehe die Arbeit von Bolen Oncogene, 8 : 2025-2031 (1993), die hiermit durch Bezugnahme aufgenommen wird.

Sowohl die Rezeptor-Tyrosinkinasen als auch die zytosolischen Tyrosin- kinasen sind an Signalübertragungswegen der Zelle, die zu verschiedenen Leidenszuständen führen, darunter Krebs, Schuppenflechte und Hyper- immunreaktionen, beteiligt.

Es wurde vorgeschlagen, dass verschiedene Rezeptor-Tyrosinkinasen sowie die an sie bindenden Wachstumsfaktoren eine Rolle bei den Angiogenese spielen, obwohl einige die Angiogenese indirekt fördern könnten (Mustonen und Alitalo, J. Cell Biol. 129 : 895-898,1995). Eine dieser Rezeptor-Tyrosinkinasen ist die fötale Leberkiriase 1, auch FLK-1 genannt. Das menschliche Analog der FLK-1 ist der kinase-insert- domänenhaltige Rezeptor KDR, der auch unter der Bezeichnung Gefäß- endotheizellenwachstumsfaktorrezeptor 2 bzw. VEGFR-2 bekannt ist, da er VEGF hochaffin bindet. Schließlich wurde die Maus-Version dieses Rezeptors auch ebenfalls NYK genannt (Oelrichs et al., Oncogene 8 (1) : 11- 15,1993). VEGF und KDR stellen ein Ligand-Rezeptor-Paar dar, das eine wesentliche Rolle bei der Proliferation der Gefäßendothelzellen und der Bildung und Sprossung der Blutgefäße, die als Vaskulogenese bzw.

Angiogenese bezeichnet werden, spielt.

Die Angiogenese ist durch eine übermäßig starke Aktivität des Gefäß- endothelwachstumsfaktors (VEGF) gekennzeichnet. Der VEGF besteht eigentlich aus einer Familie von Liganden (Klagsburn und D'Amore, Cytokine & Growth Factor Reviews 7 : 259-270,1996). Der VEGF bindet den hochaffinen transmembranösen Tyrosinkinaserezepzor KDR und die verwandte fms-Tyrosinkinase-1, auch unter der Bezeichnung Flt-1 oder Gefäßendothelzellenwachstumsfaktorrezeptor 1 (VEGFR-1) bekannt. Aus Zellkultur-und Gen-Knockout-Versuchen geht hervor, dass jeder Rezeptor zu unterschiedlichen Aspekten der Angiogenese beiträgt. Der KDR führt die mitogene Funktion des VEGF herbei, während Flt-1 nichtmitogene Funktionen, wie diejenigen, die mit der Zelladhäsion in

Zusammenhang stehen, zu modulieren scheint. Eine Hemmung des KDR moduliert daher das Niveau der mitogenen VEGF-Aktivität. Tatsächlich wurde gezeigt, dass das Tumorwachstum von der antiangiögenen Wirkung der VEGF-Rezeptor-Antagonisten beeinflusst wird (Kim et al., Nature 362, S. 841-844,1993).

Feste Tumore können daher mit Tyrosinkinasehemmern behandelt werden, da diese Tumore für die Bildung der zur Unterstützung ihres Wachstums erforderlichen Blutgefäße auf Angiogenese angewiesen sind.

Zu diesen festen Tumoren zählen die Monozytenleukämie, Hirn-, Urogenital-, Lymphsystem-, Magen-, Kehlkopf-und Lungenkarzinom, darunter Lungenadenokarzinom und kleinzelliges Lungenkarzinom. Zu weiteren Beispielen zählen Karzinome, bei denen eine Überexpression oder Aktivierung von Raf-aktivierenden Onkogenen (z. B. K-ras, erb-B) beobachtet wird. Zu diesen Karzinomen zählen Bauchspeicheldrüsen-und Brustkarzinom. Hemmstoffe dieser Tyrosinkinasen eignen sich daher zur Vorbeugung und Behandlung von proliferativen Krankheiten, die durch diese Enzyme bedingt sind.

Die angiogene Aktivität des VEGF ist nicht auf Tumore beschränkt. Der VEGF ist für die bei diabetischer Retinopathie in bzw. in der Nähe der Retina produzierte angiogene Aktivität verantwortlich. Dieses Gefäßwachs- tum in der Retina führt zu geschwächter Sehkraft und schließlich Erblindung. Die VEGF-mRNA-und-protein-Spiegel im Auge werden durch Leiden wie Netzhautvenenokklusion beim Primaten sowie verringertem p02-Spiegel bei der Maus, die zu Gefäßneubildung führen, erhöht.

Intraokular injizierte monoklonale Anti-VEGF-Antikörper, oder VEGF- Rezeptor-Immunkonjugate, hemmen sowohl im Primaten-als auch im Nagetiermodell die Gefäßneubildung im Auge. Unabhängig vom Grund der Induktion des VEGF bei der diabetischen Retinopathie des Menschen, eignet sich die Hemmung des Augen-VEGF zur Behandlung dieser Krankheit.

Die VEGF-Expression ist auch in hypoxischen Regionen von tierischen und menschlichen Tumoren neben Nekrosezonen stark erhöht. Der VEGF

wird außerdem durch die Expression der Onkogene ras, raf, src und p53- Mutante (die alle bei der Bekämpfung von Krebs von Bedeutung sind) hinaufreguliert. Monoklonale Anti-VEGF-Antikörper hemmen bei der Nacktmaus das Wachstum menschlicher Tumore. Obwohl die gleichen Tumorzellen in Kultur weiterhin VEGF exprimieren, verringern die Anti- körper ihre Zellteilungsrate nicht. So wirkt der aus Tumoren stammende VEGF nicht als autokriner mitogener Faktor. Der VEGF trägt daher in vivo dadurch zum Tumorwachstum bei, dass er durch seine parakrine Gefäß- endothelzellen-Chemotaxis-und-Mitogeneseaktivität die Angiogenese fördert. Diese monoklonalen Antikörper hemmen auch das Wachstum von typischerweise weniger stark vaskularisierten Human-Kolonkarzinomen bei thymuslosen Mäusen und verringern die Anzahl der aus inokulierten Zellen entstehenden Tumore.

Die Expression eines VEGF-bindenden Konstrukts von Flk-1, Flt-1, dem zur Entfernung der zytoplasmatischen Tyrosinkinasedomänen, jedoch unter Beibehaltung eines Membranankers, verkürzten Maus-KDR- Rezeptorhomologs, in Viren stoppt praktisch das Wachstum eines transplantierbaren Glioblastoms bei der Maus, vermutlich aufgrund des dominant-negativen Mechanismus der Heterodimerbildung mit trans- membranösen Endothelzellen-VEGF-Rezeptoren. Embryostammzellen, die in der Nacktmaus üblicherweise in Form von festen Tumoren wachsen, bilden bei Knock-out aller beider VEGF-Allele keine nachweisbaren Tumore. Aus diesen Daten gemeinsam geht die Rolle des VEGF beim Wachstum fester Tumore hervor. Die Hemmung von von KDR bzw. Flt-1 ist an der pathologischen Angiogenese beteiligt, und diese Rezeptoren eignen sich zur Behandlung von Krankheiten, bei denen Angiogenese einen Teil der Gesamtpathologie, z. B. Entzündung, diabetische Retina- Vaskularisierung sowie verschiedene Formen von Krebs, darstellt, da bekannt ist, dass das Tumorwachstum angiogeneseabhängig ist (Weidner et al., N. Engl. J. Med., 324, S. 1-8, 1991).

Bei Angiopoietin 1 (Ang1), einem Liganden für die endothelspezifische Rezeptor-Tyrosinkinase TIE-2, handelt es sich um einen neuen angiogenen Faktor (Davis et al, Cell, 1996,87 : 1161-1169 ; Partanen et al, Moi. Cell Biol., 12 : 1698-1707 (1992) ; US-Patent Nr. 5,521, 073 ; 5,879, 672 ; 5,877, 020 ; und 6,030, 831). Das Akronym TIE steht für"Tyrosinkinase mit Ig-und EGF-Homologiedomänen". TIE wird zur Identifizierung einer Klasse von Rezeptor-Tyrosinkinasen verwendet, die ausschließlich in Gefäßendothelzellen und frühen hämopoietischen Zellen exprimiert werden. TIE-Rezeptorkinasen sind typischerweise durch das Vorhanden- sein einer EGF-ähnlichen Domäne und einer Immunglobulin (IG)-- ähnlichen Domäne charakterisiert, die aus extrazellulären Faltungs- einheiten, die durch Disulfidbrückenbindungen zwischen den Ketten stabilisiert sind, besteht (Partanen et al Curr. Topics Microbiol. Immunol., 1999,237 : 159-172). Im Gegensatz zu VEGF, der seine Funktion während der frühen Stadien in der Gefäßentwicklung ausübt, wirken Ang1 und sein Rezeptor TIE-2 während der späteren Stadien in der Gefäßentwicklung, d. h. während der Gefäßumbildung (Umbildung bezieht sich auf die Bildung eines Gefäßlumens) und Reifung (Yancopoulos et al, Cell, 1998,93 : 661- 664 ; Peters, K. G., Circ. Res., 1998,83 (3) : 342-3 ; Suri et al, Cell 87,1171- 1180 (1996)).

Demzufolge würde man erwarten, daß eine Hemmung von TIE-2 die Umbildung und Reifung eines durch Angiogenese initiierten neuen Gefäßsystems und dadurch den Angiogeneseprozeß unterbrechen sollte.

Weiterhin würde eine Hemmung an der Kinasedomäne-Bindungsstelle von VEGFR-2 die Phosphorylierung von Tyrosinresten blockieren und dazu dienen, die Initiation der Angiogenese zu unterbrechen. Daher darf man annehmen, daß die Hemmung von TIE-2 und/oder VEGFR-2 die Tumorangiogenese verhindern und dazu dienen sollte, das Tumor- wachstum zu verlangsamen oder vollständig zu beseitigen.

Dementsprechend könnte man eine Behandlung von Krebs und anderen

mit unangemessener Angiogenese einhergehenden Erkrankungen bereitstellen.

Die vorliegende Erfindung richtet sich auf Verfahren zur Regulation, Modulation oder Hemmung der TIE-2 zur Vorbeugung und/oder Behandlung von Erkrankungen im Zusammenhang mit unregulierter oder gestörter TIE-2-Aktivität. Insbesondere lassen sich die erfindungsgemäßen Verbindungen auch bei der Behandlung gewisser Krebsformen einsetzen.

Weiterhin können die erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden, um bei gewissen existierenden Krebschemotherapien additive oder synergistische Effekte bereitzustellen, und/oder können dazu verwendet werden, um die Wirksamkeit gewisser existierender Krebschemotherapien und-bestrahlungen wiederherzustellen.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Verbindungen als Inhibitoren von Raf-Kinasen.

Protein-Phosphorylierung ist ein fundamentaler Prozess für die Regulation von Zellfunktionen. Die koordinierte Wirkung von sowohl Proteinkinasen als auch Phosphatasen kontrolliert die Phosphorylierungsgrade und folglich die Aktivität spezifischer Zielproteine. Eine der vorherrschenden Rollen der Protein-Phosphorylierung ist bei der Signaltransduktion, wenn extrazelluläre Signale amplifiziert und durch eine Kaskade von Protein- Phosphorylierungs-und Dephosphorylierungsereignissen, z. B. im p21/raf-Weg propagiert werden.

Das p21 ras-Gen wurde als ein Onkogen der Harvey-und Kirsten-Ratten- Sarkom-Viren (H-Ras bzw. K-Ras) entdeckt. Beim Menschen wurden charakteristische Mutationen im zellulären Ras-Gen (c-Ras) mit vielen verschiedenen Krebstypen in Verbindung gebracht. Von diesen mutanten Allelen, die Ras konstitutiv aktiv machen, wurde gezeigt, dass sie Zellen, wie zum Beispiel die murine Zelilinie NIH 3T3, in Kultur transformieren.

Das p21 ras-Onkogen ist ein wichtiger beitragender Faktor bei der Entwick- lung und Progression humaner solider Karzinome und ist bei 30 % aller humaner Karzinome mutiert (Bolton et al. (1994) Ann. Rep. Med. Chem., 29,165-74 ; Bos. (1989) Cancer Res., 49, 4682-9). In seiner normalen, nicht mutierten Form ist das Ras-Protein ein Schlüsselelement der Signal- transduktionskaskade, die durch Wachstumsfaktor-Rezeptoren in fast allen Geweben gesteuert wird (Avruch et a). (1994) Trends Biochem. Sci., 19, 279-83).

Biochemisch ist Ras ein Guanin-Nukleotid-bindendes Protein, und das Zyklieren zwischen einer GTP-gebundenen aktivierten und einer GDP- gebundenen ruhenden Form wird von Ras-endogener GTPase-Aktivität und anderen Regulatorproteinen strikt kontrolliert. Das Ras-Genprodukt bindet an Guanintriphosphat (GTP) und Guanindiphosphat (GDP) und hydrolysiert GTP zu GDP. Ras ist im GTP-gebundenen Zustand aktiv. In den Ras-Mutanten in Krebszellen ist die endogene GTPase-Aktivität abge- schwächt, und folglich gibt das Protein konstitutive Wachstumssignale an "Downstream"-Effektoren, wie zum Beispiel an das Enzym Raf-Kinase ab.

Dies führt zum krebsartigen Wachstum der Zellen, die diese Mutanten tragen (Magnuson et al. (1994) Semin. Cancer Biol., 5,247-53). Das Ras-Proto-Onkogen benötigt ein funktionell intaktes C-Raf-1-Proto- Onkogen, um in höheren Eukaryoten durch Rezeptor-und Nicht- Rezeptor-Tyrosin-Kinasen initiierte Wachstums-und Differenzierungs- signale zu transduzieren.

Aktiviertes Ras ist für die Aktivierung des C-Raf-1-Proto-Onkogens not- wendig, die biochemischen Schritte, durch die Ras die Raf-1-Protein- (Ser/Thr) -Kinase aktiviert, sind jedoch inzwischen gut charakterisiert. Es wurde gezeigt, dass das Inhibieren des Effekts von aktivem Ras durch Inhibition des Raf-Kinase-Signalwegs mittels Verabreichung von deaktivie- renden Antikörpern gegen Raf-Kinase oder mittels Koexpression domi- nanter negativer Raf-Kinase oder dominanter negativer MEK (MAPKK),

dem Substrat der Raf-Kinase, zur Reversion transformierter Zellen zum normalen Wachstumsphänotyp führt, siehe : Daum et al. (1994) Trends Biochem. Sci., 19,474-80 ; Fridman et al. (1994) J Biol. Chem., 269, 30105-8. Kolch et al. (1991) Nature, 349,426-28) und zur Besprechung Weinstein-Oppenheimer et al. Pharm. & Therap. (2000), 88,229-279.

Auf ähnliche Weise wurde die Inhibition von Raf-Kinase (durch Antisense- Oligodesoxynukleotide) in vitro und in vivo mit der Inhibition des Wachs- tums einer Reihe verschiedener humaner Tumortypen in Beziehung gebracht (Monia et al., Nat. Med. 1996,2, 668-75).

__ _ Raf-Serin-und Threonin-spezifische Protein-Kinasen sind cytosolische Enzyme, die das Zellwachstum in einer Reihe verschiedener Zellsysteme stimulieren (Rapp, U. R., et al. (1988) in The Oncogene Handbook ; T.

Curran, E. P. Reddy und A. Skalka (Hrsg. ) Elsevier Science Publishers ; Niederlande, S. 213-253 ; Rapp, U. R., et al. (1988) Cold Spring Harbor Sym. Quant. Biol. 53 : 173-184 ; Rapp, U. R., et al. (1990) Inv Curr. Top.

Microbiol. Immunol. Potter und Melchers (Hrsg. ), Berlin, Springer-Verlag 166 : 129-139).

Drei Isozyme wurden charakterisiert : C-Raf (Raf-1) (Bonner, T. l., et al. (1986) Nucleic Acids Res. 14 : 1009- 1015). A-Raf (Beck, T. W., et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15 : 595-609), und B-Raf (Qkawa, S., et al. (1998) Mol. Cell. Biol. 8 : 2651-2654 ; Sithanandam, G. et al. (1990) Oncogene : 1775). Diese Enzyme unter- scheiden sich durch ihre Expression in verschiedenen Geweben. Raf-1 wird in allen Organen und in allen Zeillinien, die untersucht wurden, exprimiert, und A-und B-Raf werden in Urogenital-bzw. Hirngeweben exprimiert (Storm, S. M. (1990) Oncogene 5 : 345-351).

Raf-Gene sind Proto-Onkogene : Sie können die maligne Transformation von Zellen initiieren, wenn sie in spezifisch veränderten Formen exprimiert werden. Genetische Veränderungen, die zu onkogener Aktivierung führen, erzeugen eine konstitutiv aktive Proteinkinase durch Entfernung oder Inter- ferenz mit einer N-terminalen negativen Regulatordomäne des Proteins (Heidecker, G., et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10 : 2503-2512 ; Rapp, U. R., et al. (1987) in Oncogenes and Cancer ; S. A. Aaronson, J. Bishop, T.

Sugimura, M. Terada, K. Toyoshima und P. K. Vogt (Hrsg. ) Japan Scientific Press, Tokyo). Mikroinjektion in NIH 3T3-Zellen von onkogen aktivierten, aber nicht wildtyp-Versionen des mit Expressionsvektoren von Escherichia coli präparierten Raf-Proteins führt zu mörphologischer Trans- formation und stimuliert die DNA-Synthese (Rapp, U. R., et al. (1987) in Oncogenes and Cancer ; S. A. Aaronson, J. Bishop, T. Sugimura, M.

Terada, K. Toyoshima, und P. K. Vogt (Hrsg. ) Japan Scientific Press, Tokyo ; Smith, M. R., et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10 : 3828-3833).

Folglich ist aktiviertes Raf-1 ein intrazellulärer Aktivator des Zellwachs- tums. Raf-1-Protein-Serin-Kinase ist ein Kandidat für den"Downstream"- Effektor der Mitogen-Signaltransduktion, da Raf-Onkogene dem Wachs- tumsarrest begegnen, der aus einer Blockade zellulärer Ras-Aktivität aufgrund einer zellulären Mutation (Ras-revertante Zellen) oder Mikro- injektion von Anti-Ras-Antikörpern resultiert (Rapp, U. R., et al. (1988) in The Oncogene Handbook, T. Curran, E. P. Reddy und A. Skalka (Hrsg. ), Elsevier Science Publishers ; Niederlande, S. 213-253 ; Smith, M. R., et al.

(1986) Nature (London) 320 : 540-543).

Die C-Raf-Funktion ist für die Transformation durch eine Reihe verschie- dener Membran-gebundener Onkogene und für die Wachstumsstimulation durch in Sera enthaltene Mitogene erforderlich (Smith, M. R., et a). (1986) Nature (London) 320 : 540-543). Raf-1-Protein-Serin-Kinase-Aktivität wird durch Mitogene über die Phosphorylierung reguliert (Morrison, D. K., et al.

(1989) Cell 58 : 648-657), welche auch die subzelluläre Verteilung bewirkt

(Olah, Z., et al. (1991) Exp. Brain Res. 84 : 403 ; Rapp, U. R., et al. (1988) Cold Spring Harbor Sym. Quant. Biol. 53 : 173-184. Zu Raf-1-aktivierenden Wachstumsfaktoren zählen der aus Thrombozyten stammende Wachs- tumsfaktor (PDGF) (Morrison, D. K., et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 85 : 8855-8859), der Kolonien-stimulierende Faktor (Baccarini, M., et al. (1990) EMBO J. 9 : 3649-3657), Insulin (Blackshear, P. J., et al. (1990) J.

Biol. Chem. 265 : 12115-12118), der epidermale Wachstumsfaktor (EGF) (Morrison, R. K., et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 8855-8859), Interleukin-2 (Turner, B. C., et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 : 1227) und Interleukin-3 und der Granulozyten-Makrophagen-Kolonien- stimulierende Faktor (Carroll, M. P., et al. (1990) J. Biol. Chem. 265 : 19812- 19817).

Nach der Mitogen-Behandlung von Zellen transloziert die transient aktivierte Raf-1-Protein-Serin-Kinase in den perinukleären Bereich und den Nukleus (Olah, Z., et al. (1991) Exp. Brain Res. 84 : 403 ; Rapp, U. R., et al.

(1988) Cold Spring HaborSym. Quant. Biol. 53 : 173-184). Zellen, die aktiviertes Raf enthalten, sind in ihrem Genexpressionsmuster verändert (Heidecker, G., et al. (1989) in Genes and signal transduction in multistage carcinogenesis, N. Colburn (Hrsg. ), Marcel Dekker, Inc., New York, S. 339- 374) und Raf-oncogenes activate transcription from Ap-l/PEA3-dependent promotors in transient transfection assays (Jämal, S., et al. (1990) Science 344 : 463-466 ; Kaibuchi, K., et al. (1989) J. Biol. Chem. 264 : 20855-20858 ; Wasylyk, C., et al. (1989) Mol. Cell. Biol. 9 : 2247-2250).

Es gibt mindestens zwei unabhängige Wege für die Raf-1-Aktivierung durch extrazelluläre Mitogene : Einen, der Proteinkinase C (KC) beinhaltet, und einen zweiten, der durch Protein-Tyrosin-Kinasen initiiert wird (Black- shear, P. J., et al. (1990) J. Biol. Chem. 265 : 12131-12134 ; Kovacina, K. S., et al. (1990) J. Biol. Chem. 265 : 12115-12118 ; Morrison, D. K., et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 8855-8859 ; Siegel, J. N., et al. (1990) J. Biol.

Chem. 265 : 18472-18480 ; Turner, B. C., et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 88 : 1227). In jedem Fall beinhaltet die Aktivierung Raf-1-Protein- Phosphorylierung. Raf-1-Phosphorylierung kann eine Folge einer Kinase- Kaskade sein, die durch Autophosphorylierung amplifiziert wird, oder kann vollkommen durch Autophosphorylierung hervorgerufen werden, die durch Bindung eines vermutlichen Aktivierungsliganden an die Raf-1-Regulator- domäne, analog zur PKC-Aktivierung durch Diacylglycerol initiiert wird (Nishizuka, Y. (1986) Science 233 : 305-312). <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> r',<BR> <BR> <BR> Einer der Hauptmechanismen, durch den die Zellregulation bewirkt wird, ist durch die Transduktion der extrazellulären Signale über die Membran, die wiederum biochemische Wege in der Zelle modulieren. Protein- Phosphorylierung stellt einen Ablauf dar, über den intrazelluläre Signale von Molekül zu Molekül propagiert werden, was schließlich in einer Zellantwort resultiert. Diese Signaltransduktionskaskaden sind hoch reguliert und überlappen häufig, wie aus dem Vorliegen vieler Protein- kinasen wie auch Phosphatasen hervorgeht. Phosphorylierung von Proteinen tritt vorwiegend bei Serin-, Threonin-oder Tyrosinresten auf, und Proteinkinasen wurden deshalb nach ihrer Spezifität des Phosporylie- rungsortes, d. h. der Serin-/Threonin-Kinasen und Tyrosin-Kinasen klassifiziert. Da Phosphorylierung ein derartig weit verbreiteter Prozess in Zellen ist und da Zellphänotypen größtenteils von der Aktivität dieser Wege beeinflusst werden, wird zur Zeit angenommen, dass eine Anzahl von Krankheitszuständen und/oder Erkrankungen auf entweder abweichende Aktivierung oder funktionelle Mutationen in den molekularen Komponenten von Kinasekaskaden zurückzuführen sind. Folglich wurde der Charakterisierung dieser Proteine und Verbindungen, die zur Modulation ihrer Aktivität fähig sind, erhebliche Aufmerksamkeit geschenkt (Übersichtsartikel siehe : Weinstein-Oppenheimer et al. Pharma. &.

Therap., 2000,88, 229-279).

Die Identifikation von kleinen Verbindungen, die die Signaltransduktion der Tyrosinkinasen und/oder Raf-Kinasen spezifisch hemmen, regulieren und/oder modulieren, ist daher wünschenswert und ein Ziel der vorliegenden Erfindung.

Es wurde gefunden, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen und ihre Salze bei guter Verträglichkeit sehr wertvolle pharmakologische Eigenschaften besitzen.

Insbesondere zeigen sie inhibierende Eigenschaften der Tyrosinkinase.

Es wurde weiterhin gefunden, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen Inhibitoren des Enzyms Raf-Kinase sind. Da das Enzym ein "Downstream"-Effektor von p21 ras ist, erweisen sich die Inhibitoren in pharmazeutischen Zusammensetzungen für die human-oder veterinärmedizinische Anwendung als nützlich, wenn Inhibition des Raf-Kinase-Weges, z. B. bei der Behandlung von Tumoren und/oder durch Raf-Kinase vermitteltem krebsartigen Zellwachstum, angezeigt ist. Die Verbindungen sind insbesondere nützlich bei der Behandlung solider Karzinome bei Mensch und Tier, z. B. von murinem Krebs, da die Progression dieser Krebse abhängig ist von der Ras-Protein- Signaltransduktionskaskade und deshalb auf die Behandlung durch Unterbrechung der Kaskade, d. h. durch Inhibition der Raf-Kinase, anspricht. Dementsprechend wird die erfindungsgemäßen Verbindung oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Salz davon für die Behandlung von Krankheiten verabreicht, die durch den Raf-Kinase-Weg vermittelt werden, besonders Krebs, einschließlich solider Karzinome, wie zum Beispiel Karzinome (z. B. der Lungen, des Pankreas, der Schilddrüse, der Harnblase oder des Kolons), myeloische Erkrankungen (z. B. myeloische Leukämie) oder Adenome (z. B. villöses Kolonadenom), pathologische Angiogenese und metastatische Zellmigration. Die Verbindungen sind ferner nützlich bei der Behandlung der Komplementaktivierungs- abhängigen chronischen Entzündung (Niculescu et al. (2002) Immunol.

Res., 24 : 191-199) und durch HIV-1 (Human Immunodeficiency Virus Typ 1) induzierte Immunschwäche (Popik et al. (1998) J Virol, 72 : 6406- 6413).

Es wurde überraschend gefunden, dass erfindungsgemäßen Verbindungen mit Signalwegen, besonders mit den hierin beschriebenen Signalwegen und bevorzugt dem Raf-Kinase-Signalweg interagieren können. Die erfindungsgemäßen Verbindungen zeigen bevorzugt eine vorteilhafte biologische Aktivität, die in auf Enzymen basierenden Assays, zum Beispiel Assays wie hierin beschrieben, leicht nachweisbar ist. In derartigen auf Enzymen basierenden Assays zeigen und bewirken die erfindungsgemäßen Verbindungen bevorzugt einen inhibierenden Effekt, der gewöhnlich durch ICso-Werte in einem geeigneten Bereich, bevorzugt im mikromolaren Bereich und bevorzugter im nanomolaren Bereich dokumentiert wird.

Wie hierin besprochen, sind diese Signalwege für verschiedene Erkrankungen relevant. Dementsprechend sind die erfindungsgemäßen Verbindungen nützlich bei der Prophylaxe und/oder Behandlung von Erkrankungen, die von den genannten Signalwegen durch Interaktion mit einem oder mehreren der genannten Signalwege abhängig sind.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind deshalb erfindungsgemäße Verbindungen als Promotoren oder Inhibitoren, bevorzugt als Inhibitoren der hierin beschriebenen Signalwege. Bevorzugter Gegenstand der Erfindung sind deshalb erfindungsgemäße Verbindungen als Promotoren oder Inhibitoren, bevorzugt als Inhibitoren des Raf-Kinase-Weges. Ein bevorzugter Gegenstand der Erfindung sind deshalb erfindungsgemäße Verbindungen als Promotoren oder Inhibitoren, bevorzugt als Inhibitoren der Raf-Kinase. Ein noch bevorzugterer Gegenstand der Erfindung sind erfindungsgemäße Verbindungen als Promotoren oder Inhibitoren, bevorzugt als Inhibitoren einer oder mehrerer Raf-Kinasen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus A-Raf, B-Raf und C-Raf-1. Ein besonders

bevorzugter Gegenstand der Erfindung sind erfindungsgemäße Verbindungen als Promotoren oder Inhibitoren, bevorzugt als Inhibitoren von C-Raf-1.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer oder mehrerer erfindungsgemäßer Verbindungen bei der Behand- lung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, bevorzugt den hier beschrie- benen Erkrankungen, die durch Raf-Kinasen veruracht, vermittelt und/oder propagiert werden und insbesondere Erkrankungen, die durch Raf-Kinasen ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus A-Raf, B-Raf and C-Raf-1 verursacht, vermittelt und/oder propagiert werden. Gewöhntich werden die hier besprochenen Erkrankungen in zwei Gruppen eingeteilt, in hyperproliferative und nicht hyperproliferative Erkrankungen. In diesem Zusammenhang werden Psoriasis, Arthritis, Entzündungen, Endometriose, Vernarbung, gutartige Prostatahyperplasie, immunologische Krankheiten, Autoimmunkrankheiten und Immunschwächekrankheiten als nicht krebsartige Krankheiten angesehen, von denen Arthritis, Entzündung, immunologische Krankheiten, Autoimmunkrankheiten und Immun- schwächekrankheiten gewöhnlich als nicht hyperproliferative Erkrankungen angesehen werden. In diesem Zusammenhang sind Hirn- krebs, Lungenkrebs, Plattenepithelkrebs, Blasenkrebs, Magenkrebs, Pankreaskrebs, Leberkrebs, Nierenkrebs, Kolorektalkrebs, Brustkrebs, Kopfkrebs, Halskrebs, Ösophaguskrebs,-gynäkologischer Krebs, Schild- drüsenkrebs, Lymphome, chronische Leukämie und akute Leukämie als krebsartige Erkrankungen anzusehen, die alle gewöhnlich als hyper- proliferative Erkrankungen angesehen werden. Insbesondere krebsartiges Zellwachstum und insbesondere durch Raf-Kinase vermitteltes krebs- artiges Zellwachstum ist eine Erkrankung, die ein Ziel der vorliegenden Erfindung darstellt. Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind deshalb erfindungsgemäße Verbindungen als Arzneimittel und/oder Arzneimittel- wirkstoffe bei der Behandlung und/oder Prophylaxe der genannten Erkrankungen und die Verwendung von erfindungsgemäßen

Verbindungen zur Herstellung eines Pharmazeutikums für die Behandlung und/oder Prophylaxe der genannten Erkrankungen wie auch ein Verfahren zur Behandlung der genannten Erkrankungen umfassend die Verabrei- chung eines oder mehrerer erfindungsgemäßer Verbindungen an einen Patienten mit Bedarf an einer derartigen Verabreichung.

Es kann gezeigt werden, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen in einem Xenotransplantat-Tumor-Modell eine in vivo antiproliferative Wirkung aufweisen. Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden an einen Patienten mit einer hyperproliferativen Erkrankung verabreicht, z. B. zur Inhibition des Tumorwachstums, zur Verminderung der mit einer lymphoproliferativen Erkrankung einhergehenden Entzündung, zur Inhibition der Transplantatabstoßung oder neurologischer Schädigung aufgrund von Gewebereparatur usw. Die vorliegenden Verbindungen sind nützlich für prophylaktische oder therapeutische Zwecke. Wie hierin verwendet, wird der Begriff"Behandeln"als Bezugnahme sowohl auf die Verhinderung von Krankheiten als auch die Behandlung vorbestehender Leiden verwendet. Die Verhinderung von Proliferation wird durch Verabreichung der erfindungsgemäßen Verbindungen vor Entwicklung der evidenten Krankheit, z. B. zur Verhinderung des Tumorwachstums, Verhinderung metastatischen Wachstums, der Herabsetzung von mit kardiovaskulärer Chirurgie einhergehenden Restenosen usw. erreicht. Als Alternative werden die Verbindungen zur Behandlung andauernder Krankheiten durch Stabilisation oder Verbesserung der klinischen Symptome des Patienten verwendet.

Der Wirt oder Patient kann jeglicher Säugerspezies angehören, z. B. einer Primatenspezies, besonders Menschen ; Nagetieren, einschließlich Mäusen, Ratten und Hamstern ; Kaninchen ; Pferden, Rindern, Hunden, Katzen usw. Tiermodelle sind für experimentelle Untersuchungen von Interesse, wobei sie ein Modell zur Behandlung einer Krankheit des Menschen zur Verfügung stellen.

Die Suszeptibilität einer bestimmten Zelle gegenüber der Behandlung mit den erfindungsgemäßen Verbindungen kann durch Testen in vitro bestimmt werden. Typischerweise wird eine Kultur der Zelle mit einer erfindungsgemäßen Verbindung bei verschiedenen Konzentrationen für eine Zeitdauer kombiniert, die ausreicht, um den aktiven Mitteln zu ermöglichen, Zelltod zu induzieren oder Migration zu inhibieren, gewöhn- lich zwischen ungefähr einer Stunde und einer Woche. Zum Testen in vitro können kultivierte Zellen aus einer Biopsieprobe verwendet werden. Die nach der Behandlung zurückbleibenden lebensfähigen Zellen werden dann gezählt.

Die Dosis variiert abhängig von der verwendeten spezifischen Verbindung, der spezifischen Erkrankung, dem Patientenstatus usw.. Typischerweise ist eine therapeutische Dosis ausreichend, um die unerwünschte Zellpopulation im Zielgewebe erheblich zu vermindern, während die Lebensfähigkeit des Patienten aufrechterhalten wird. Die Behandlung wird im Allgemeinen fortgesetzt, bis eine erhebliche Reduktion vorliegt, z. B. mindestens ca. 50 % Verminderung der Zelilast und kann fortgesetzt werden, bis im Wesentlichen keine unerwünschten Zellen mehr im Körper nachgewiesen werden.

Zur Identifikation von Kinase-Inhibitoren stehen verschiedene Assay- Systeme zur Verfügung. Beim Scintillation-Proximity-Assay (Sorg et al., J. of. Biomolecular Screening, 2002,7, 11-19) und dem FlashPlate-Assay wird die radioaktive Phosphorylierung eines Proteins oder Peptids als Substrat mit yATP gemessen. Bei Vorliegen einer inhibitorischen Verbin- dung ist kein oder ein vermindertes radioaktives Signal nachweisbar.

Ferner sind die Homogeneous Time-resolved Fluorescence Resonance Energy Transfer- (HTR-FRET-) und Fluoreszenzpolarisations- (FP-) Technologien als Assay-Verfahren nützlich (Sills et al., J. of Biomolecular Screening, 2002,191-214).

Andere nicht radioaktive ELISA-Assay-Verfahren verwenden spezifische Phospho-Antikörper (Phospho-AK). Der Phospho-AK bindet nur das phosphorylierte Substrat. Diese Bindung ist mit einem zweiten Peroxidase- konjugierten Anti-Schaf-Antikörper durch Chemilumineszenz nachweisbar (Ross et al., 2002, Biochem. J., unmittelbar vor der Veröffentlichung, Manuskript BJ20020786).

Es gibt viele mit einer Deregulation der Zellproliferation und des Zelltods (Apoptose) einhergehende Erkrankungen. Die Leiden von Interesse schließen die folgenden Leiden ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind nützlich bei der Behandlung einer Reihe verschiedener Leiden, bei denen Proliferation und/oder Migration glatter Muskelzellen und/oder Entzündungszellen in die Intimaschicht eines Gefäßes vorliegt, resultierend in eingeschränkter Durchblutung dieses Gefäßes, z. B. bei neointimalen okklusiven Läsionen. Zu okklusiven Transplantat-Gefäßerkrankungen von Interesse zählen Atherosklerose, koronare Gefäßerkrankung nach Transplantation, Venentransplantat- stenose, peri-anastomotische Prothesenrestenose, Restenose nach Angioplastie oder Stent-Platzierung und dergleichen.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen eignen sich auch als p38 Kinase- Inhibitoren.

Andere Heteroarylharnstoffe, die p38 Kinase inhibieren sind in der WO 02/85859 beschrieben.

STAND DER TECHNIK In der WO 02/44156 sind andere Benzimidazol-Derivate als TIE-2 und/oder VEGFR2-Inhibitoren beschrieben. In der WO 99/32436 sind substituierte Phenylharnstoffe als Raf-Kinase-Inhibitoren offenbart. Aus der WO 02/062763 und der WO 02/085857 kennt man Chinolyl-,

Isochinolyl-und Pyridylharnstoffderivate als Raf-Kinase-inhibitoren.

Heteroarylharnstoffe als p38-Kinase-Inhibitoren sind in der WO 02/85859 beschrieben. In der WO 00/42012 sind (o-Carboxyaryl-diphenyl-harnstoffe als Raf-Kinase-Inhibitoren und in der WO 00/41698 als p38-Kinase- Inhibitoren beschrieben. Andere Aryl-und Heteroaryl-substituierte heterocyclische Harnstoffe sind in WO 99/32455 als Raf-Kinase- Inhibitoren und in WO 99/32110 als p38-Kinase-Inhibitoren offenbart.

Andere Diphenylharnstoffderivate kennt man aus der WO 99/32463.

Substituierte heterocyclische Harnstoffderivate als p38-Kinase-Inhibitoren sind in der WO 99/32111 offenbart.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG Die Erfindung betrifft Harnstoffderivate ausgewählt aus der Gruppe <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> 4- {4- [3- (Fluor-trifluormethyl-phenyl)-ureido]-phenoxy}-pyridin-2-< ;BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> carbonsäure-N-methylamid, 1- [4- (Benzo [1,2, 5] thiadiazol-5-yloxy)-phenyl]-3- (2-fluor-5- <BR> <BR> <BR> <BR> trifluormethyl-phenyl)-harnstoff,<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> 1- (2-Fluor-5-trifluormethyl-phenyl)-3- [4- (pyridin-4-ylsulfanyl)-phenyl]- harnstoff, 1- [4- (2, 3-Dihydro-benzo [1,4] doxin-6-yloxy)-phenyl]-3-(2-fluoro-5- trifluormethyl-phenyl)-harnstoff, 7-{4-[3-(2-Fluoro-5-trifluoromethyl-phenyl)-ureido]-phenoxy} -benzofuran- 2-carbonsäure-amid, 1- [4- (Benzo [1,3] dioxol-5-yloxy)-phenyl]-3- (2-fluor-5-trifluormethyl- phenyl)-harnstoff, 1- (2-Fluor-5-trifluormethyl-phenyl)-3- [4- (6-methoxy-pyridin-3-yloxy)- phenyl]-harnstoff, (5-{4-[3-(4-Fluoro-3-trifluoromethyl-phenyl)-ureido]-phenoxy }-1H- benzimidazol-2-yl)-carbaminsäure-methylester,

1- [4- (Benzo [1,2, 5] thiadiazol-5-yloxy)-phenyl]-3- (4-chlor-3- trifluormethyl-phenyl)-harnstoff, 1- (2-Fluor-5-trifluormethyl-phenyl)-3- [4- (imidazo [1,2-a] pyridin-8- yloxy)-phenyl]-harnstoff, <BR> <BR> <BR> <BR> 1- (2-Fluor-5-trifluormethyl-phenyl)-3- [4- (2-methyl-benzothiazol-5-<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> yloxy)-phenyl]-harnstoff, 1-(2-Fluoro-5-trifluoromethyl-phenyl)-3-[4-(1H-indol-6-yloxy )-phenyl]- harnstoff, 1-(4-Chlor-3-trifluormethyl-phenyl)-3-[4-(imidazo [1,2-a] chinolin-9- yloxy)-phenyl]-harnstoff, 1-(2-Fluoro-5-trifluoromethyl-phenyl)-3-[4-(imidazo [1, 2-a] chinolin-9- yloxy)-phenyl]-harnstoff, 1-(2-Fluor-5-trifluoromethyl-phenyl)-3-[4-(1H-indol-5-yloxy) -phenyl]- harnstoff, 7-{4-[3-(2-Fluor-5-trifluoromethyl-phenyl)-ureido]-phenoxy}- benzofuran- 2-carbonsäure-methylester, 1-[4-(Benzo [1,3] dioxol-5-yloxy)-phenyl]-3- (4-chlor-3-trifluormethyl- phenyl)-harnstoff, 1- [4- (Benzo [1,2, 5] thiadiazol-4-yloxy)-phenyl]-3-(2-fluor-5- trifluormethyl-phenyl)-harnstoff, 1-(4-Chlor-3-trifluoromethyl-phenyl)-3-[4-(6-methoxy-pyridin -3-yloxy)- phenyl]-harnstoff, 1- [4- (Imidazo [1,2-a] chinolin-9-yloxy)-phenyl]-3- (4-trifluormethoxy- phenyl)-harnstoff, 1- [4- (Benzo [1,2, 5] thiadiazol-5-yloxy)-3-methyl-phenyl]-3- (2-fluor-5- trifluormethyl-phenyl)-harnstoff, 1- [4- (Benzo [1,2, 5] thiadiazol-5-yloxy)-3-methyl-phenyi]-3- (4-chlor-3- trifluormethyl-phenyl)-harnstoff, 1- [4- (Benzo [1,2, 5] thiadiazol-5-yloxy)-2-methyl-phenyl]-3- (2-fluor-5- trifluormethyl-phenyl)-harnstoff,

1- [4- (Benzo [1, 2, 5] thiadiazol-5-yloxy)-2-methyl-phenyl]-3- (4-chlor-3-<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> trifluormethyl-phenyl)-harnstoff, 1- [4- (Benzo [1,2, 5] thiadiazol-5-yloxy)-3-fluor-phenyl]-3-(2-fluor-5- <BR> <BR> <BR> trifluormethyl-phenyl)-harnstoff,<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> 1- [4- (2-Amino-benzothiadiazol-6-yloxy)-phenyl]-3- (2-fluor-5-<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> trifluormethyl-phenyl)-harnstoff,<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> 1- [4- (2-Amino-4, 7-dimethyl-benzothiadiazol-6-yloxy)-phenyl]-3- (2-<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> fluor-5-trifluormethyl-phenyl)-harnstoff,<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> 4- {4- [3- (2-Fluor-4-trifluormethyl-phenyl)-ureido]-phenylsulfanyll- pyridin-2-carbonsäure-methylamid, sowie ihre pharmazeutisch verwendbaren Derivate, Salze, Solvate und Stereoisomere, einschließlich deren Mischungen in allen Verhältnissen.

Gegenstand der Erfindung sind auch die optisch aktiven Formen (Stereoisomeren), die Enantiomeren, die Racemate, die Diastereomeren -sowie die Hydrate und Solvate dieser Verbindungen. Unter Solvate der Verbindungen werden Anlagerungen von inerten Lösungsmittelmolekülen an die Verbindungen verstanden, die sich aufgrund ihrer gegenseitigen Anziehungskraft ausbilden. Solvate sind z. B. Mono-oder Dihydrate oder Alkoholate.

Unter pharmazeutisch verwendbaren Derivaten versteht man z. B. die Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen als auch sogenannte Prodrug-Verbindungen.

Unter Prodrug-Derivaten versteht man mit z. B. Alkyl-oder Acylgruppen, Zuckern oder Oligopeptiden abgewandelte Verbindungen der Formel I, die im Organismus rasch zu den wirksamen erfindungsgemäßen Verbindungen gespalten werden.

Hierzu gehören auch bioabbaubare Polymerderivate der erfindungs- gemäßen Verbindungen, wie dies z. B. in Int. J. Pharm. 115,61-67 (1995) beschrieben ist.

Der Ausdruck"wirksame Menge"bedeutet die Menge eines Arzneimittels oder eines pharmazeutischen Wirkstoffes, die eine biologische oder medizinische Antwort in einem Gewebe, System, Tier oder Menschen hervorruft, die z. B. von einem Forscher oder Mediziner gesucht oder erstrebt wird.

Darüberhinaus bedeutet der Ausdruck"therapeutisch wirksame Menge" eine Menge, die, verglichen zu einem entsprechenden Subjekt, das diese Menge nicht erhalten hat, folgendes zur Folge hat : verbesserte Heilbehandlung, Heilung, Prävention oder Beseitigung einer Krankheit, eines Krankheitsbildes, eines Krankheitszustandes, eines Leidens, einer Störung oder von Nebenwirkungen oder auch die Verminderung des Fortschreitens einer Krankheit, eines Leidens oder einer Störung.

Die Bezeichnung"therapeutisch wirksame Menge"umfaßt auch die Mengen, die wirkungsvoll sind, die normale physiologische Funktion zu erhöhen.

Gegenstand der Erfindung sind auch Mischungen der erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel I, z. B. Gemische zweier Diastereomerer z. B. im Verhältnis 1 : 1,1 : 2,1 : 3,1 : 4,1 : 5,1 : 10,1 : 100 oder 1 : 1000.

Besonders bevorzugt handelt es sich dabei um Mischungen stereo- isomerer Verbindungen.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen und auch die Ausgangsstoffe zu ihrer Herstellung werden im übrigen nach an sich bekannten Methoden hergestellt, wie sie in der Literatur (z. B. in den Standardwerken wie Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, Georg-Thieme-Verlag, Stuttgart) beschrieben sind, und zwar unter Reaktionsbedingungen, die für

die genannten Umsetzungen bekannt und geeignet sind. Dabei kann man auch von an sich bekannten, hier nicht näher erwähnten Varianten Gebrauch machen.

Die Ausgangsstoffe können, falls erwünscht, auch in situ gebildet werden, so daß man sie aus dem Reaktionsgemisch nicht isoliert, sondern sofort weiter zu den erfindungsgemäßen Verbindungen umsetzt.

I ! Die Ausgangsverbindungen sind in der Regel bekannt. Sind sie neu, so I { können sie aber nach an sich bekannten Methoden hergestellt werden. lue Verbindungen der Formel I können vorzugsweise erhalten werden, indem man Anilinderivate mit Isocyanaten umsetzt.

Die Umsetzung erfolgt nach Methoden, die dem Fachmann bekannt sind.

Zunächst erfolgt Reaktion in einem geeigneten Lösungsmittel, gegebenenfalls in Gegenwart einer organischen Base, wie z. B.

Triethylamin oder einer anorganischen Base, wie z. B. eines Alkali-oder Erdalkalicarbonats.

Als inerte Lösungsmittel eignen sich z. B. Kohlenwasserstoffe wie Hexan, Petrolether, Benzol, Toluol oder Xylol ; chlorierte Kohlenwasserstoffe wie Trichlorethylen, 1, 2-Dichlorethan, Tetrachlorkohlenstoff, Chloroform oder Dichlormethan ; Alkohole wie Methanol, Ethanol, Isopropanol, n-Propanol, n-Butanol oder tert.-Butanol ; Ether wie Diethylether, Diisopropylether, Tetrahydrofuran (THF) oder Dioxan ; Glykolether wie Ethylenglykol- monomethyl-oder-monoethylether (Methylglykol oder Ethylglykol), Ethylenglykoldimethylether (Diglyme) ; Ketone wie Aceton oder Butanon ; Amide wie Acetamid, Dimethylacetamid oder Dimethylformamid (DMF) ; Nitrile wie Acetonitril ; Sulfoxide wie Dimethylsulfoxid (DMSO) ; Schwefel- kohlenstoff ; Carbonsäuren wie Ameisensäure oder Essigsäure ; Nitrover-

bindungen wie Nitromethan oder Nitrobenzol ; Ester wie Ethylacetat oder Gemische der genannten Lösungsmittel.

Die Reaktionszeit liegt je nach den angewendeten Bedingungen zwischen einigen Minuten und 14 Tagen, die Reaktionstemperatur zwischen etwa - 30° und 140°, normalerweise zwischen-10° und 90°, insbesondere zwischen etwa 0° und etwa 70°.

Eine Base der erfindungsgemäßen Verbindungen kann mit einer Säure in das zugehörige Säureadditionssalz übergeführt werden, beispielsweise durch Umsetzung äquivalenter Mengen der Base und der Säure in einem inerten'Lösungsmittel wie Ethanol und anschließendes Eindampfen. Für diese Umsetzung kommen insbesondere Säuren in Frage, die physio- logisch unbedenkliche Salze liefern. So können anorganische Säuren verwendet werden, z. B. Schwefelsäure, Salpetersäure, Halogenwasse- rstoffsäuren wie Chlorwasserstoffsäure oder Bromwasserstoffsäure, Phosphorsäuren wie Orthophosphorsäure, Sulfaminsäure, ferner organische Säuren, insbesondere aliphatische, alicyclische, araliphatische, aromatische oder heterocyclische ein-oder mehrbasige Carbon-, Sulfon- oder Schwefelsäuren, z. B. Ameisensäure, Essigsäure, Trifluoressigsäure, Propionsäure, Pivalinsäure, Diethylessigsäure, Malonsäure, Bernstein- säure, Pimelinsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Milchsäure, Weinsäure, Äpfelsäure, Citronensäure, Gluconsäure, Ascorbinsäure, Nicotinsäure, Isonicotinsäure, Methan-oder Ethansulfonsäure, Ethandisulfonsäure, 2- Hydroxyethansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure, Naphthalin-mono-und-disulfonsäuren, Laurylschwefelsäure. Salze mit physiologisch nicht unbedenklichen Säuren, z. B. Pikrate, können zur Isolierung und/oder Aufreinigung der erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden.

Gegenstand der Erfindung ist ferner die Verwendung der Verbindungen und/oder ihrer physiologisch unbedenklichen Salze zur Herstellung eines

Arzneimittels (pharmazeutische Zubereitung), insbesondere auf nicht- chemischem Wege. Hierbei können sie zusammen mit mindestens einem festen, flüssigen und/oder halbflüssigen Träger-oder Hilfsstoff und gege- benenfalls in Kombination mit einem oder mehreren weiteren Wirkstoffen in eine geeignete Dosierungsform gebracht werden.

Gegenstand der Erfindung sind ferner Arzneimittel, enthaltend mindestens eine erfindungsgemäße Verbindung und/oder ihre pharmazeutisch verwendbären Derivate, Salze, Solvate und Stereoisomere, einschließlich deren Mischungen in allen Verhältnissen, sowie gegebenenfalls Träger- und/oder Hilfsstoffe.

Pharmazeutische Formulierungen können in Form von Dosiseinheiten, die eine vorbestimmte Menge an Wirkstoff pro Dosiseinheit enthalten, dargereicht werden. Eine solche Einheit kann beispielsweise 0,5 mg bis 1 g, vorzugsweise 1 mg bis 700 mg, besonders bevorzugt 5 mg bis 100 mg einer erfindungsgemäßen Verbindung enthalten, je nach dem behandelten Krankheitszustand, dem Verabreichungsweg und dem Alter, Gewicht und Zustand des Patienten, oder pharmazeutische Formulierungen können in Form von Dosiseinheiten, die eine vorbestimmte Menge an Wirkstoff pro Dosiseinheit enthalten, dargereicht werden. Bevorzugte Dosierungs- einheitsformulierungen sind solche, die eine Tagesdosis oder Teildosis ; wie oben angegeben, oder einen entsprechenden Bruchteil davon eines Wirkstoffs enthalten. Weiterhin lassen sich solche pharmazeutischen Formulierungen mit einem der im pharmazeutischen Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren herstellen.

Pharmazeutische Formulierungen lassen sich zur Verabreichung über einen beliebigen geeigneten Weg, beispielsweise auf oralem (einschließlich buccalem bzw. sublingualem), rektalem, nasalem, topischem (einschließlich buccalem, sublingualem oder transdermalem), vaginalem oder parenteralem (einschließlich subkutanem,

intramuskulärem, intravenösem oder intradermalem) Wege, anpassen.

Solche Formulierungen können mit allen im pharmazeutischen Fachgebiet bekannten Verfahren hergestellt werden, indem beispielsweise der Wirkstoff mit dem bzw. den Trägerstoff (en) oder Hilfsstoff (en) zusammengebracht wird.

An die orale Verabreichung angepaßte pharmazeutische Formulierungen können als separate Einheiten, wie z. B. Kapseln oder Tabletten ; Pulver oder Granulate ; Lösungen oder Suspensionen in wäßrigen oder nichtwäßrigen Flüssigkeiten ; eßbare Schäume oder Schaumspeisen ; oder Öl-in-Wasser-Flüssigemulsionen oder Wasser-in-ÖI-Flüssigemulsionen dargereicht werden.

So läßt sich beispielsweise bei der oralen Verabreichung in Form einer Tablette oder Kapsel die Wirkstoffkomponente mit einem oralen, nicht- toxischen und pharmazeutisch unbedenklichen inerten Trägerstoff, wie z. B. Ethanol, Glyzerin, Wasser u. ä. kombinieren. Pulver werden herge- stellt, indem die Verbindung auf eine geeignete feine Größe zerkleinert und mit einem in ähnlicher Weise zerkleinerten pharmazeutischen Trägerstoff, wie z. B. einem eßbaren Kohlenhydrat wie beispielsweise Stärke oder Mannit vermischt wird. Ein Geschmacksstoff, Konservierungs- mittel, Dispersionsmittel und Farbstoff können ebenfalls vorhanden sein.

Kapseln werden hergestellt, indem ein Pulvergemisch wie oben beschrieben hergestellt und geformte Gelatinehüllen damit gefüllt werden.

Gleit-und Schmiermittel wie z. B. hochdisperse Kieselsäure, Talkum, Mägnesiumstearat, Kalziumstearat oder Polyethylenglykol in Festform können dem Pulvergemisch vor dem Füllvorgang zugesetzt werden. Ein Sprengmittel oder Lösungsvermittler, wie z. B. Agar-Agar, Kalziumcarbonat oder Natriumcarbonat, kann ebenfalls zugesetzt werden, um die Verfügbarkeit des Medikaments nach Einnahme der Kapsel zu verbessern.

Außerdem können, falls gewünscht oder notwendig, geeignete Bindungs-, Schmier-und Sprengmittel sowie Farbstoffe ebenfalls in das Gemisch eingearbeitet werden. Zu den geeigneten Bindemitteln gehören Stärke, Gelatine, natürliche Zucker, wie z. B. Glukose oder Beta-Lactose, Süß- stoffe aus Mais, natürliche und synthetische Gummi, wie z. B. Akazia, Traganth oder Natriumalginat, Carboxymethylzellulose, Polyethylenglykol, Wachse, u. ä. Zu den in diesen Dosierungsformen verwendeten Schmier- mitteln gehören Natriumoleat, Natriumstearat, Magnesiumstearat, Nätrium- benzoat, Natriumacetat, Natriumchlorid u. ä. Zu den Sprengmitteln gehören, ohne darauf beschränkt zu sein, Stärke, Methylzellulose, Agar, Bentonit, Xanthangummi u. ä. Die Tabletten werden formuliert, indem beispielsweise ein Pulvergemisch hergestellt, granuliert oder trocken- verpreßt wird, ein Schmiermittel und ein Sprengmittel zugegeben werden und das Ganze zu Tabletten verpreßt wird. Ein Pulvergemisch wird hergestellt, indem die in geeigneter Weise zerkleinerte Verbindung mit einem Verdünnungsmittel oder einer Base, wie oben beschrieben, und gegebenenfalls mit einem Bindemittel, wie z. B. Carboxymethylzellulose, einem Alginat, Gelatine oder Polyvinylpyrrolidon, einem Lösungsverlang- samer, wie z. B. Paraffin, einem Resorptionsbeschleuniger, wie z. B. einem quaternären Salz und/oder einem Absorptionsmittel, wie z. B. Bentonit, Kaolin oder Dikalziumphosphat, vermischt wird. Das Pulvergemisch läßt sich granulieren, indem es mit einem Bindemittel, wie z. B. Sirup, Stärke- paste, Acadia-Schleim oder Lösungen aus Zellulose-oder Polymer- materialen benetzt und durch ein Sieb gepreßt wird. Als Alternative zur Granulierung kann man das Pulvergemisch durch eine Tablettiermaschine laufen lassen, wobei ungleichmäßig geformte Klumpen entstehen, die in Granulate aufgebrochen werden. Die Granulate können mittels Zugabe von Stearinsäure, einem Stearatsalz, Talkum oder Mineralöl gefettet werden, um ein Kleben an den Tablettengußformen zu verhindern. Das gefettete Gemisch wird dann zu Tabletten verpreßt. Die erfindungs- gemäßen Verbindungen können auch mit einem freifließenden inerten

Trägerstoff kombiniert und dann ohne Durchführung der Granulierungs- oder Trockenverpressungsschritte direkt zu Tabletten verpreßt werden.

Eine durchsichtige oder undurchsichtige Schutzschicht, bestehend aus einer Versiegelung aus Schellack, einer Schicht aus Zucker oder Polymer- material und einer Glanzschicht aus Wachs, kann vorhanden sein. Diesen Beschichtungen können Farbstoffe zugesetzt werden, um zwischen unter- schiedlichen Dosierungseinheiten unterscheiden zu können.

Orale Flüssigkeiten, wie z. B. Lösung, Sirupe und Elixiere, können in Form von Dosierungseinheiten hergestellt werden, so daß eine gegebene Quantität eine vorgegebene Menge der Verbindung enthält. Sirupe lassen sich herstellen, indem die Verbindung in einer wäßrigen Lösung mit geeignetem Geschmack gelöst wird, während Elixiere unter Verwendung eines nichttoxischen alkoholischen Vehikels hergestellt werden.

Suspensionen können durch Dispersion der Verbindung in einem nicht- toxischen Vehikel formuliert werden. Lösungsvermittler und Emulgiermittel, wie z. B. ethoxylierte Isostearylalkohole und Polyoxyethylensorbitolether, Konservierungsmittel, Geschmackszusätze, wie z. B. Pfefferminzöl oder natürliche Süßstoffe oder Saccharin oder andere künstliche Süßstoffe, u. ä. können ebenfalls zugegeben werden.

Die Dosierungseinheitsformulierungen für die orale Verabreichung können gegebenenfalls in Mikrokapseln eingeschlossen werden. Die Formulierung läßt sich auch so herstellen, daß die Freisetzung verlängert oder retardiert wird, wie beispielsweise durch Beschichtung oder Einbettung von partikulärem Material in Polymere, Wachs u. ä.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sowie Salze, Solvate und physiologisch funktionelle Derivate davon lassen sich auch in Form von Liposomenzuführsystemen, wie z. B. kleinen unilamellaren Vesikeln, großen unilamellaren Vesikeln und multilamellaren Vesikeln, verabreichen.

Liposomen können aus verschiedenen Phospholipiden, wie z. B.

Cholesterin, Stearylamin oder Phosphatidylcholinen, gebildet werden.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sowie die Salze, Solvate und physiologisch funktionellen Derivate davon können auch unter Verwendung monoklonaler Antikörper als individuelle Träger, an die die Verbindungsmoleküle gekoppelt werden, zugeführt werden. Die Verbindungen können auch mit löslichen Polymeren als zielgerichtete Arzneistoffträger gekoppelt werden. Solche Polymere können Polyvinyl- pyrrolidon, Pyran-Copolymer, Polyhydroxypropylmethacrylamidphenol, Polyhydroxyethylaspartamidphenol oder Pofyethyienoxidpöiytysin, substituiert mit Palmitoylresten, umfassen. Weiterhin können die Verbindungen an eine Klasse von biologisch abbaubaren Polymeren, die zur Erzielung einer kontrollierten Freisetzung eines Arzneistoffs geeignet sind, z. B. Polymilchsäure, Polyepsilon-Caprolacton, Polyhydroxybutter- säure, Polyorthoester, Polyacetale, Polydihydroxypyrane, Polycyano- acrylate und quervernetzte oder amphipatische Blockcopolymere von Hydrogelen, gekoppelt sein.

An die transdermale Verabreichung angepaßte pharmazeutische Formulierungen können als eigenständige Pflaster für längeren, engen Kontakt mit der Epidermis des Empfängers dargereicht werden. So kann beispielsweise der Wirkstoff aus dem Pflaster mittels lontophorese zugeführt werden, wie in Pharmaceutical Research, 3 (6), 318 (1986) allgemein beschrieben.

An die topische Verabreichung angepaßte pharmazeutische Verbindungen können als Salben, Cremes, Suspensionen, Lotionen, Pulver, Lösungen, Pasten, Gele, Sprays, Aerosole oder Öle formuliert sein.

Für Behandlungen des Auges oder anderer äußerer Gewebe, z. B. Mund und Haut, werden die Formulierungen vorzugsweise als topische Salbe

oder Creme appliziert. Bei Formulierung zu einer Salbe kann der Wirkstoff entweder mit einer paraffinischen oder einer mit Wasser mischbaren Cremebasis eingesetzt werden. Alternativ kann der Wirkstoff zu einer Creme mit einer Öl-in-Wasser-Cremebasis oder einer Wasser-in-ÖI-Basis formuliert werden.

Zu den an die topische Applikation am Auge angepaßten pharma- zeutischen Formulierungen gehören Augentropfen, wobei der Wirkstoff in einem geeigneten Träger, insbesondere einem wäßrigen Lösungsmittel, gelöst oder suspendiert ist.

;' An die topische Applikation im Mund angepaßte pharmazeutische Formulierungen umfassen Lutschtabletten, Pastillen und Mundspülmittel.

An die rektale Verabreichung angepaßte pharmazeutische Formulierungen können in Form von Zäpfchen oder Einläufen dargereicht werden.

An die nasale Verabreichung angepaßte pharmazeutische Formulierungen, in denen die Trägersubstanz ein Feststoff ist, enthalten ein grobes Pulver mit einer Teilchengröße beispielsweise im Bereich von 20-500 Mikrometern, das in der Art und Weise, wie Schnupftabak aufgenommen wird, verabreicht wird, d. h. durch Schnellinhalation über die Nasenwege aus einem dicht an die Nase gehaltenen Behälter mit dem Pulver. Geeignete Formulierungen zur Verabreichung als Nasenspray oder Nasentropfen mit einer Flüssigkeit als Trägersubstanz umfassen Wirkstofflösungen in Wasser oder Öl.

An die Verabreichung durch Inhalation angepaßte pharmazeutische Formulierungen umfassen feinpartikuläre Stäube oder Nebel, die mittels verschiedener Arten von unter Druck stehenden Dosierspendern mit Aerosolen, Vernebler oder Insufflatoren erzeugt werden können.

An die vaginale Verabreichung angepaßte pharmazeutische Formulierungen können als Pessare, Tampons, Cremes, Gele, Pasten, Schäume oder Sprayformulierungen dargereicht werden.

Zu den an die parenterale Verabreichung angepaßten pharmazeutischen Formulierungen gehören wäßrige und nichtwäßrige sterile Injektions- lösungen, die Antioxidantien, Puffer, Bakteriostatika und Solute, durch die die Formulierung isotonisch mit dem Blut des zu behandelnden Empfängers gemacht wird, enthalten ; sowie wäßrige und nichtwäßrige sterile Suspensionen, die Suspensionsmittel und Verdicker enthalten können. Die Formulierungen können in Einzeldosis-oder Mehrfach- dosisbehältern, z. B. versiegelten Ampullen und Fläschchen, dargereicht und in gefriergetrocknetem (lyophilisiertem) Zustand gelagert werden, so daß nur die Zugabe der sterilen Trägerflüssigkeit, z. B. Wasser für Injektionszwecke, unmittelbar vor Gebrauch erforderlich ist.

Rezepturmäßig hergestellte Injektionslösungen und Suspensionen können aus sterilen Pulvern, Granulaten'und Tabletten hergestellt werden.

Es versteht sich, daß die Formulierungen neben den obigen besonders erwähnten Bestandteilen andere im Fachgebiet übliche Mittel mit Bezug auf die jeweilige Art der Formulierung enthalten können ; so können beispielsweise für die orale Verabreichung geeignete Formulierungen Geschmacksstoffe enthalten.

Eine therapeutisch wirksame Menge einer Verbindung der vorliegenden Erfindung hängt von einer Reihe von Faktoren ab, einschließlich z. B.. dem Alter und Gewicht des Tiers, dem exakten Krankheitszustand, der der Behandlung bedarf, sowie seines Schweregrads, der Beschaffenheit der Formulierung sowie dem Verabreichungsweg, und wird letztendlich von dem behandelnden Arzt bzw. Tierarzt festgelegt. Jedoch liegt eine wirk- same Menge einer erfindungsgemäßen Verbindung für die Behandlung von neoplastischem Wachstum, z. B. Dickdarm-oder Brustkarzinom, im

allgemeinen im Bereich von 0,1 bis 100 mg/kg Körpergewicht des Empfängers (Säugers) pro Tag und besonders typisch im Bereich von 1 bis 10 mg/kg Körpergewicht pro Tag. Somit läge für einen 70 kg schweren erwachsenen Säuger die tatsächliche Menge pro Tag für gewöhnlich zwischen 70 und 700 mg, wobei diese Menge als Einzeldosis pro Tag oder üblicher in einer Reihe von Teildosen (wie z. B. zwei, drei, vier, fünf oder sechs) pro Tag gegeben werden kann, so daß die Gesamttagesdosis die gleiche ist. Eine wirksame Menge eines Salzes oder Solvats oder eines physiologisch funktionellen Derivats davon kann als Anteil der wirksamen Menge der erfindungsgemäßen Verbindung perse bestimmt werden. Es läßt sich annehmen, daß ähnliche Dosierungen für die Behandlung der anderen, obenerwähnten Krankheitszustände geeignet sind.

Gegenstand der Erfindung sind ferner Arzneimittel enthaltend mindestens eine erfindungsgemäße Verbindung und/oder ihre pharmazeutisch verwendbaren Derivate, Salze, Solvate und Stereoisomere, einschließlich deren Mischungen in allen Verhältnissen, und mindestens einen weiteren Arzneimittelwirkstoff.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Set (Kit), bestehend aus getrennten Packungen von (a) einer wirksamen Menge an einer erfindungsgemäßen Verbindung und/oder ihrer pharmazeutisch verwendbaren Derivate, Salze, Solvate und Stereoisomere, einschließlich deren Mischungen in allen Verhältnissen, und (b) einer wirksamen Menge eines weiteren Arzneimittelwirkstoffs.

Das Set enthält geeignete Behälter, wie Schachteln oder Kartons, individuelle Flaschen, Beutel oder Ampullen. Das Set kann z. B. separate Ampullen enthalten, in denen jeweils eine wirksame Menge an einer erfindungsgemäßen Verbindung und/oder ihrer pharmazeutisch

verwendbaren Derivate, Salze, Solvate und Stereoisomere, einschließlich deren Mischungen in allen Verhältnissen, und einer wirksamen Menge eines weiteren Arzneimittelwirkstoffs gelöst oder in lyophylisierter Form vorliegt.

VERWENDUNG Die vorliegenden Verbindungen eignen sich als pharmazeutische Wirkstoffe für Säugetiere, insbesondere für den Menschen, bei der Behandlung von tyrosinkinasebedingten Krankheiten. Zu diesen Krankheiten zählen die Proliferation von Tumorzellen, die pathologische Gefäßneubildung (oder Angiogenese), die das Wachstum fester Tumoren fördert, die Gefäßneubildung im Auge (diabetische Retinopathie, alters- bedingte Makula-Degeneration und dergleichen) sowie Entzündung (Schuppenflechte, rheumatoide Arthritis und dergleichen).

Die vorliegende Erfindung umfasst die Verwendung der erfindungs- gemäßen Verbindungen nach Anspruch 1 und/oder ihre physiologisch unbedenklichen Salze und Solvate zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Vorbeugung von Krebs. Bevorzugte Karzinome für die Behandlung stammen aus der Gruppe Hirnkarzinom, Urogenital- traktkarzinom, Karzinom des lymphatischen Systems, Magenkarzinom, Kehlkopfkarzinom und Lungenkarzinom. Eine weitere Gruppe bevorzugter Krebsformen sind Monozytenleukämie, Lungenadenokarzinom, kleinzellige Lungenkarzinome, Bauchspeichefdrüsenkrebs, Glioblastome und Brust- karzinom.

Ebenfalls umfasst ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen nach Anspruch 1 und/oder ihre physiologisch unbedenklichen Salze und Solvate zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Vorbeugung einer Krankheit, an der Angiogenese beteiligt ist.

Eine derartige Krankheit, an der Angiogenese beteiligt ist, ist eine Augenkrankheit, wie Retina-Vaskularisierung, diabetische Retinopathie, altersbedingte Makula-Degeneration und dergleichen.

Die Verwendung von erfindungsgemäßen Verbindungen nach Anspruch 1 und/oder ihre physiologisch unbedenklichen Salze und Solvate zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Vorbeugung von Entzündungskrankheiten, fällt ebenfalls unter den Umfang der vorliegen- den Erfindung. Zu solchen Entzündungskrankheiten zählen zum Beispiel rheumatoide Arthritis, Schuppenflechte, Kontaktdermatitis, Spät-Typ der Überempfindlichkeitsreaktion und dergleichen.

Ebenfalls umfasst ist die Verwendung derverfindungsgemäßeh Verbindungen nach Anspruch 1 und/oder ihre physiologisch unbedenk- lichen Salze und Solvate zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behand- lung oder Vorbeugung einer tyrosinkinasebedingten Krankheit bzw. eines tyrosinkinasebedingten Leidens bei einem Säugetier, wobei man diesem Verfahren einem kranken Säugetier, das einer derartigen Behandlung bedarf, eine therapeutisch wirksame Menge einer erfindungsgemäßen Verbindung verabreicht. Die therapeutische Menge hängt von der jeweiligen Krankheit ab und kann vom Fachmann ohne allen großen Aufwand bestimmt werden.

Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung der erfindungs- gemäßen Verbindungen nach Anspruch 1 und/oder ihre physiologisch unbedenklichen Salze und Solvate zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Vorbeugung von Retina-Vaskularisierung.

Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung von Augenkrankheiten wie diabetischer Retinopathie und altersbedingter Makula-Degeneration sind ebenfalls ein Bestandteil der Erfindung. Die Verwendung zur Behandlung oder Vorbeugung von Entzündungskrankheiten wie rheumatoider Arthritis, Schuppenflechte, Kontaktdermatitis und Spät-Typen der Überempfindlich- keitsreaktion, sowie die Behandlung oder Vorbeugung von Knochen- Pathologien aus der Gruppe Osteosarkom, Osteoarthritis und Rachitis, fällt ebenfalls unter den Umfang der vorliegenden Erfindung.

Der Ausdruck"tyrosinkinasebedingte Krankheiten oder Leiden"bezieht sich auf pathologische Zustände, die von der Aktivität einer oder mehrerer Tyrosinkinasen abhängig sind. Die Tyrosinkinasen sind entweder direkt oder indirekt an den Signaltransduktionswegen verschiedener Zellaktivi- täten, darunter Proliferation, Adhäsion und Migration sowie Differenzierung beteiligt. Zu den Krankheiten, die mit Tyrosinkinaseaktivität assoziiert sind, zählen die Proliferation von Tumorzellen, die pathologische Gefäßneu- bildung, die das Wachstum fester Tumore fördert, Gefäßneubildung im Auge (diabetische Retinopathie, altersbedingte Makula-Degeneration und dergleichen) sowie Entzündung (Schuppenflechte, rheumatoide Arthritis und dergleichen).

Die erfindungsgemäßen Verbindungen nach Anspruch 1 können an Patienten zur Behandlung von Krebs verabreicht werden. Die vorliegenden Verbindungen hemmen die Tumorangiogenese und beeinflussen so das Wachstum von Tumoren (J. Rak et al. Cancer Research, 55 : 4575-4580, 1995). Die angiogenesehemmenden Eigenschaften der vorliegenden Ver- bindungen nach Anspruch 1 eignen sich auch zur Behandlung bestimmter Formen von Blindheit, die mit Retina-Gefäßneubildung in Zusammenhang stehen.

Die Verbindungen nach Anspruch 1 eignen sich auch zur Behandlung bestimmter Knochen-Pathologien wie Osteosarkom, Osteoarthritis und Rachitis, die auch unter der Bezeichnung onkogene Osteomalazie bekannt ist (Hasegawa et al., Skeletal Radiol. 28, S. 41-45, 1999 ; Gerber et al., Nature Medicine, Bd. 5, Nr. 6, S. 623-628, Juni 1999). Da der VEGF durch den in reifen Osteoklasten exprimierten KDR/Flk-1 direkt die osteoklastische Knochenresorption fördert (FEBS Let. 473 : 161-164 (2000) ; Endocrinology, 141 : 1667 (2000)), eignen sich die vorliegenden Verbindungen auch zur Behandlung und Vorbeugung von Leiden, die mit Knochenresorption in Zusammenhang stehen, wie Osteoporose und Morbus Paget.

Die Verbindungen können dadurch, dass sie zerebrale Ödeme, Gewebeschädigung und ischämiebedingte Reperfusionsverletzungen reduzieren, auch zur Verringerung oder Vorbeugung von Gewebeschäden, die nach zerebralen ischämischen Ereignissen wie Gehirnschlag auftreten, verwendet werden (Drug News Perspect 11 : 265-270 (1998) ; J. Clin.

Invest. 104 : 1613-1620 (1999)).

Gegenstand der Erfindung ist somit die Verwendung von Verbindungen nach Anspruch 1, sowie ihrer pharmazeutisch verwendbaren Derivate, Solvate und Stereoisomere, einschließlich deren Mischungen in allen Verhältnissen, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krankheiten, bei denen die Hemmung, Regulierung und/oder Modulation der Signaltransduktion von Kinasen eine Rolle spielt.

Bevorzugt sind hierbei Kinasen ausgewählt aus der Gruppe der Tyrosinkinasen und Raf-Kinasen.

Vorzugsweise handelt es sich bei den Tyrosinkinasen um TIE-2.

Bevorzugt ist die Verwendung von Verbindungen gemäß Anspruch 1, sowie ihrer pharmazeutisch verwendbaren Derivate, Solvate und Stereo- isomere, einschließlich deren Mischungen in allen Verhältnissen, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krankheiten, die durch Inhibierung der Tyrosinkinasen durch die Verbindungen nach Anspruch 1 beeinflußt werden.

Besonders bevorzugt ist die Verwendung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krankheiten, die durch Inhibierung von TIE-2 durch die Verbindungen nach Anspruch 1 beeinflußt werden.

Insbesondere bevorzugt ist die Verwendung zur Behandlung einer Krankheit, wobei die Krankheit ein fester Tumor ist.

Der feste Tumor ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe Gehirntumor, Tumor des Urogenitaltrakts, Tumor des lymphatischen Systems, Magentumor, Kehlkopftumor und Lungentumor.

Der feste Tumor ist weiterhin vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe Monozytenleukämie, Lungenadenokarzinom, kleinzellige Lungenkarzinome, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Glioblastome und Brustkarzinom.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin die Verwendung der erfindungs- gemäßen Verbindungen zur Behandlung einer Krankheit, an der Angiogenese beteiligt ist.

Vorzugsweise handelt es sich bei der Krankheit um eine Augenkrankheit.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin die Verwendung zur Behandlung von Retina-Vaskularisierung, diabetischer Retinopathie, altersbedingter Makula-Degeneration und/oder Entzündungskrankheiten.

Die Entzündungskrankheit ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe rheumatoide Arthritis, Schuppenflechte, Kontaktdermatitis und Spät-Typ der Überempfindlichkeitsreaktion stammt.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin die Verwendung der erfindungs- gemäßen Verbindungen zur Behandlung von Knochen-Pathologien, wobei die Knochenpathologie aus der Gruppe Osteosarkom, Osteoarthritis und Rachitis stammt.

Die Verbindungen nach Anspruch 1 eignen sich zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krankheiten, die durch Raf-Kinasen verursacht, vermittelt und/oder propagiert werden, wobei die Raf-Kinase aus der Gruppe bestehend aus A-Raf, B-Raf und Raf-1 ausgewählt wird.

Bevorzugt ist die Verwendung zur Behandlung von Erkrankungen, vorzugsweise aus der Gruppe der hyperproliferativen und nicht hyperproliferativen Erkrankungen.

Hierbei handelt es sich um Krebserkrankungen oder nicht krebsartige Erkrankungen.

Die nicht krebsartigen Erkrankungen sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Psoriasis, Arthritis, Entzündungen, Endometriose, Vernarbung, gutartiger Prostatahyperplasie, immunologischer Krankheiten, Autoimmunkrankheiten und Immunschwächekrankheiten.

Die krebsartigen Erkrankungen sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Hirnkrebs, Lungenkrebs, Plattenepithelkrebs, Blasenkrebs, Magenkrebs, Pankreaskrebs, Leberkrebs, Nierenkrebs, Kolorektalkrebs, Brustkrebs, Kopfkrebs, Halskrebs, Ösophaguskrebs, gynäkologischem Krebs, Schilddrüsenkrebs, Lymphom, chronischer Leukämie und akuter Leukämie.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch gemeinsam mit anderen gut bekannten Therapeutika, die aufgrund ihrer jeweiligen Eignung für das behandelte Leiden ausgewählt werden, verabreicht werden. So wären zum Beispiel bei Knochenleiden Kombinationen günstig, die äntiresorptiv wirkende Bisphosphonate, wie Alendronat und Risedronat, Integrinblocker (wie sie weiter unten definiert werden), wie avß3-Antagonisten, bei der Hormontherapie verwendetete konjugierte Östrogene wie Prempro0, Premarin0 und Endometrion0 ; selektive Östrogenrezeptormodulatoren (SERMs) wie Raloxifen, Droloxifen, CP- 336,156 (Pfizer) und Lasofoxifen, Kathepsin-K-Hemmer und ATP- Protonenpumpenhemmer enthalten.

Die vorliegenden Verbindungen eignen sich auch zur Kombination mit bekannten Antikrebsmitteln. Zu diesen bekannten Antikrebsmitteln zählen die folgenden : Östrogenrezeptormodulatoren, Androgenrezeptor- modulatoren, Retinoidrezeptormodulatoren, Zytotoxika, antiproliferative

Mittel, Prenyl-Proteintransferasehemmer, HMG-CoA-Reduktase-Hemmer, HIV-Protease-Hemmer, Reverse-Transkriptase-Hemmer sowie weitere Angiogenesehemmer. Die vorliegenden Verbindungen eignen sich insbesondere zur gemeinsamen Anwendung mit Radiotherapie. Die synergistischen Wirkungen der Hemmung des VEGF in Kombination mit Radiotherapie sind in der Fachwelt beschrieben worden (siehe WO 00/61186).

"Ostrogenrezeptormodulatoren"bezieht sich auf Verbindungen, die die Bindung von Östrogen an den Rezeptor stören oder diese hemmen, und zwar unabhängig davon, wie dies geschieht. Zu den Östrogenrezeptormodulatoren zählen zum Beispiel Tamoxifen, Raloxifen, Idoxifen, LY353381, LY 117081, Toremifen, Fulvestrant, 4- [7- (2, 2- <BR> <BR> <BR> <BR> Dimethyl-1-oxopropoxy-4-methyl-2- [4- [2- (1- piperidinyl) ethoxy] phenyl]-2H- 1-benzopyran-3-yl] phenyl-2, 2-dimethylpropanoat, 4,4'- Dihydroxybenzophenon-2, 4-dinitrophenylhydrazon und SH646, was jedoch keine Einschränkung darstellen soll.

"Androgenrezeptormodulatoren"bezieht sich auf Verbindungen, die die Bindung von Androgenen an den Rezeptor stören oder diese hemmen, und zwar unabhängig davon, wie dies geschieht. Zu den Androgenrezeptormodulatoren zählen zum Beispiel Finasterid und andere 5a-Reduktase-Hemmer, Nilutamid, Flutamid, Bicalutamid, Liarozol und Abirateron-acetat.

"Retinoidrezeptormodulatoren"bezieht sich auf Verbindungen, die die Bin- dung von Retinoiden an den Rezeptor stören oder diese hemmen, und zwar unabhängig davon, wie dies geschieht. Zu solchen Retinoidrezeptor- modulatoren zählen zum Beispiel Bexaroten, Tretinoin, 13-cis-Retinsäure, 9-cis-Retinsäure, a-Difluormethylornithin, ILX23-7553, trans-N- (4'-Hydroxy- phenyl) retinamid und N-4-Carboxyphenylretinamid.

"Zytotoxika"bezieht sich auf Verbindungen, die in erster Linie durch direkte Einwirkung auf die Zellfunktion zum Zelltod führen oder die die Zellmyose hemmen oder diese stören, darunter Alkylierungsmittel, Tumornekrose-

faktoren, interkaliernde Mittel, Mikrotubulin-Hemmer und Topoisomerase- Hemmer.

Zu den Zytotoxika zählen zum Beispiel Tirapazimin, Sertenef, Cachectin, Ifosfamid, Tasonermin, Lonidamin, Carboplatin, Altretamin, Prednimustin, Dibromdulcit, Ranimustin, Fotemustin, Nedaplatin, Oxaliplatin, Temozolomid, Heptaplatin, Estramustin, Improsulfan-tosylat, Trofosfamid, Nimustin, Dibrospidium-chlorid, Pumitepa, Lobaplatin, Satraplatin, Profiromycin, Cisplatin, lrofulven, Dexifosfamid, cis-Amindichlor (2- methylpyridin) platin, Benzylguanin, Glufosfamid, GPX100, (trans, trans, trans)-bis-mu- (hexan-1, 6-diamin)-mu- [diamin- platin ( ! t)] bis [diamin (chlor) platin (II)]-tetrachlorid, Diarizidinylspermin, Arsentrioxid, 1- (11-Dodecylamino-10-hydroxyundecyl)-3, 7-dimethylxanthin, Zorubicin, Idarubicin, Daunorubicin, Bisantren, Mitoxantron, Pirarubicin, Pinafid, Valrubicin, Amrubicin, Antineoplaston, 3'-Desamino-3'-morpholino- 13-desoxo-10-hydroxycarminomycin, Annamycin, Galarubicin, Elinafid, MEN10755 und 4-Desmethoxy-3-desamino-3-aziridinyl-4-methylsulfonyl- daunorubicin (siehe WO 00/50032), was jedoch keine Einschränkung darstellen soll.

Zu den Mikrotubulin-Hemmern zählen zum Beispiel Paclitaxel, Vindesin- sulfat, 3', 4'-Dideshydro-4'-desoxy-8'-norvincaleukoblastin, Docetaxol, Rhizoxin, Dolastatin, Mivobufin-isethionat, Auristatin, Cemadotin, RPR109881, BMS184476, Vinflunin, Cryptophycin, 2,3, 4,5, 6-pentafluor-N- (3-fluor-4-methoxyphenyl) benzolsulfonamid, Anhydrovinblastin, N, N- dimethyl-L-valyl-L-valyl-N-methyl-L-valyl-L-prolyl-L-prolin- t-butylamid, TDX258 und BMS188797.

Topoisomerase-Hemmer sind zum Beispiel Topotecan, Hycaptamin, Irinotecan, Rubitecan, 6-Ethoxypropionyl-3', 4'-O-exo-benzyliden- chartreusin, 9-Methoxy-N, N-dimethyl-5-nitropyrazolo [3,4, 5-kl] acridin-2- (6H) propanamin, 1-Amino-9-ethyl-5-fluor-2, 3-dihydro-9-hydroxy-4-methyl- 1 H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4' : b, 7] indolizino [1,2b] chinolin-10, 13 (9H, 15H)- dion, Lurtotecan, 7- [2- (N-Isopropylamino) ethyl]- (20S) camptothecin, BNP1350, BNPI 1100, BN80915, BN80942, Etoposid-phosphat, Teniposid,

Sobuzoxan, 2'-Dimethylamino-2'-desoxy-etoposid, GL331, N-[2- (Dimethylamino) ethyl]-9-hydroxy-5, 6-dimethyl-6H-pyrido [4,3-b] carbazol-1- carboxamid, Asulacrin, (5a, 5aB, 8aa, 9b)-9- [2- [N- [2- (Dimethylamino) ethyl]- N-methylamino] ethyl]-5- [4-hydroxy-3, 5-dimethoxyphenyl]-5, 5a, 6,8, 8a, 9- hexohydrofuro (3', 4' : 6,7) naphtho (2,3-d)-1, 3-dioxol-6-on, 2,3- (Methylendioxy)-5-methyl-7-hydroxy-8-methoxybenzo [c] phenanthridinium, 6,9-Bis [(2-aminoethyl) amino] benzo [g] isochinolin-5, 10-dion, 5- (3-Amino- propylamino)-7,10-dihydroxy-2-(2-hydroxethylaminomethyl)-6H- pyrazol [4,5, 1-de] acridin-6-on, N-[1-[2(Diehtylamino)ethylamino]-7- methoxy-9-oxo-9H-thioxanthen-4-ylmethyl] formamid, N- (2- (Dimethyl- amino)-ethyl) acridin-4-carboxamid, 6-[[2-(Dimethylamino)-ethyl] amino]-3- hydroxy-7H-indeno [2,1-c] chinolin-7-on und Dimesna.

Zu den"antiproliferativen Mitteln"zählen Antisense-RNA-und-DNA- Oligonucleotide wie G3139, ODN698, RVASKRAS, GEM231 und INX3001, sowie Antimetaboliten wie Enocitabin, Carmofur, Tegafur, Pentostatin, Doxifluridin, Trimetrexat, Fludarabin, Capecitabin, Galocitabin, Cytarabin-ocfosfat, Fosteabin-Natriumhydrat, Raltitrexed, Paltitrexid, Emitefur, Tiazofurin, Decitabin, Nolatrexed, Pemetrexed, Nelzarabin, 2'- Desoxy-2'-methylidencytidin, 2'-Fluormethylen-2'-desoxycytidin, N- [5- (2, 3- Dihydrobenzofuryl) sulfonyl]-N'- (3, 4-dichlorphenyl) harnstoff, N6- [4-Desoxy- 4- [N2- [2 (E), 4 (E)-tetradecadienoyl] glycylamino]-L-glycero-B-L-manno- heptopyranosyl] adenin, Aplidin, Ecteinascidin, Troxacitabine, 4- [2-Amino- 4-oxo-4,6, 7,8-tetrahydro-3H-pyrimidino [5,4-b] [1,4] thiazin-6-yl- (S)-ethyl]- 2, 5-thienoyl-L-glutaminsäure, Aminopterin, 5-Flurouracil, Alanosin, 11- Acetyl-8- (carbamoyloxymethyl)-4-formyl-6-methoxy-14-oxa-1, 11-diaza- tetracyclo (7.4. 1.0. 0) -tetradeca-2,4, 6-trien-9-ylessigsäureester, Swainsonin, Lometrexol, Dexrazoxan, Methioninase, 2'-cyan-2'-desoxy-N4-palmitoyl-1- B-D-Arabinofuranosylcytosin und 3-Aminopyridin-2-carboxaldehyd- thiosemicarbazon. Die"antiproliferativen Mittel"beinhalten auch andere monoklonale Antikörper gegen Wachstumsfaktoren als bereits unter den angeführt wurden, wie Trastuzumab, sowie Tumorsuppressorgene, wie p53, die über rekombinanten virusvermittelten

Gentransfer abgegeben werden können (siehe z. B. US-Patent Nr.

6,069, 134).

ASSAYS Die in den Beispielen beschriebenen erfindungsgemäßen Verbindungen wurden in den unten beschriebenen Assays geprüft, und es wurde gefunden, dass sie eine kinasehemmende Wirkung aufweisen. Weitere Assays sind aus der Literatur bekannt und könnten vom Fachmann leicht durchgeführt werden (siehe z. B. Dhanabal et al., Cancer Res. 59 : 189-197 ; Xin et al., J. Bíol. Chem. 274 : 9116-9121 ; Sheu et al.,-Anticancer Res.

18 : 4435-4441 ; Ausprunk et al., Dev. Biol. 38 : 237-248 ; Gimbrone et al., J.

Natl. Cancer Inst. 52 : 413-427 ; Nicosia et al., In Vitro 18 : 538- 549).

VEGF-Rezeptorkinase-Assay Die VEGF-Rezeptorkinaseaktivität wird durch Einbau von radioaktiv mar- kiertem Phosphat in 4 : 1 Polyglutaminsäure/Tyrosin-Substrat (pEY) be- stimmt. Das phosphorylierte pEY-Produkt wird auf einer Filtermembran festgehalten, und der Einbau des radioaktiv markierten Phosphats wird durch Szintillationszählung quantitativ bestimmt.

MATERIALIEN VEGF-Rezeptorkinase Die intrazelluläre-Tyrosinkinase-Domänen des menschlichen KDR (Terman, B. I. et al. Oncogene (1991) Bd. 6, S. 1677-1683. ) und Flt-1 (Shibuya, M. et al. Oncogene (1990) Bd. 5, S. 519-524) wurden als <BR> <BR> <BR> Glutathion-S-. transferase (GST) -Genfusionsproteine kloniert. Dies geschah durch Klonieren der Zytoplasma-Domäne der KDR-Kinase als leserastergerechte Fusion am Carboxy-Terminus des GST-Gens. Die löslichen rekombinanten GST-Kinasedomäne-Fusionsproteine wurden in Spodoptera frugiperda (Sf21) Insektenzellen (Invitrogen) unter

Verwendung eines Baculovirus-Expressionsvektors (pAcG2T, Pharmingen) exprimiert.

Lysepuffer 50 mM Tris pH 7,4, 0,5 M NaCI, 5 mM DTT, 1 mM EDTA, 0, 5% Triton X- 100,10% Glycerin, je 10 mg/mi Leupeptin, Pepstatin und Aprotinin sowie 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (alle von Sigma).

Waschpuffer 50 mM Tris pH 7,4, 0,5 M NaCl, 5 mM DTT, 1 mM EDTA, 0. 05% Triton X- 100,10% Glycerin, je 10 mg/ml Leupeptin, Pepstatin und Aprotinin sowie 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid.

Dialysepuffer 50 mM Tris pH 7,4, 0,5 M NaCI, 5 mM DTT, 1 mM EDTA, 0.05% Triton X- 100,50% Glycerin, je 10 mg/mf Leupeptin, Pepstatin und Aprotinin sowie 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid.

10x Reaktionspuffer 200 mM Tris, pH 7,4, 1,0 M NaCI, 50 mM MnCI2, 10 mM DTT und 5 mg/ml Rinderserumalbumin [bovine serum albumin = BSA] (Sigma).

Enzymverdünnungspuffer 50 mM Tris, pH 7,4, 0,1 M NaCI, 1 mM DTT, 10% Glycerin, 100 mg/ml BSA.

10x Substrat 750 pg/ml Poly (glutaminsäure/Tyrosin ; 4 : 1) (Sigma).

Stopp-Lösung 30% Trichloressigsäure, 0,2 M Natriumpyrophosphat (beide von Fisher).

Waschlösung 15% Trichloressigsäure, 0,2 M Natriumpyrophosphat.

Filterplatten Millipore #MAFC NOB, GF/C 96-Well-Glasfaserplatte.

Verfahren A-Proteinaufreinigung 1. Die Sf21-Zellen wurden mit dem rekombinanten Virus bei einer m. o. i.

(Multiplizität der Infektion) von 5 Viruspartikeln/Zelle infiziert und 48 Stunden lang bei 27°C gezüchtet.

2. Alle Schritte wurden bei 4°C durchgeführt. Die infizierten Zellen wurden durch Zentrifugieren bei 1000xg geerntet und 30 Minuten bei 4°C mit 1/10 Volumen Lysepuffer lysiert und anschließend 1 Stunde lang bei 100. 000xg zentrifugiert. Der Überstand wurde dann über eine mit Lysepuffer äquilibrierte Glutathion-Sepharose-Säure (Pharmacia) gegeben und mit 5 Volumina des gleichen Puffers und anschließend 5 Volumina Waschpuffer gewaschen. Das rekombinante GST-KDR-Protein wurde mit Waschpuffer/10 mM reduziertem Glutathion (Sigma) eluiert und gegen Dialysepuffer dialysiert.

Verfahren B-VEGF-Rezeptorkinase-Assay 1. Assay mit 5 ul Hemmstoff oder Kontrolle in 50% DMSÖ versetzen.

2. Mit 35 pI Reaktionsmischung, die 5 p1'10x Reaktionspuffer, 5 ul 25 mM ATP/10 luCi [33 P] ATP (Amersham) und 5 lul 10x Substrat enthält, versetzen.

3. Reaktion durch Zugabe von 10 pI KDR (25 nM) in Enzymver- dünnungspuffer starten.

4. Mischen und 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren.

5. Reaktion durch Zugabe von 50 ul Stopp-Lösung stoppen.

6.15 Minuten lang bei 4°C inkubieren.

7. 90-pl-Aliquot auf Filterplatte überführen.

8. Absaugen und 3 Mal mit Waschlösung waschen.

9.30 pI Szintillations-Cocktail zugeben, Platte verschließen und in einem Szintillations-Zähler Typ Wallac Microbeta zählen.

Mitogenese-Assay an menschlichen Nabelschnurvenenendothelzellen Die Expression von VEGF-Rezeptoren, die mitogene Reaktionen auf den Wachstumsfaktor vermitteln, ist größtenteils auf Gefäßendotheizellen be- schränkt. Kultivierte menschliche Nabelschnurvenenendothelzellen (HUVECs) proliferieren als Reaktion auf Behandlung mit VEGF und können als Assaysystem zur quantitativen Bestimmung der Auswirkungen von KDR-Kinasehemmern auf die Stimulation des VEGF verwendet werden. In dem beschriebenen Assay werden Einzelzellschichten von HUVECs im Ruhezustand 2 Stunden vor der Zugabe von VEGF oder

"basic fibroblast growth factor" (bFGF) mit dem Konstituens oder der Testverbindung behandelt. Die mitogene Reaktion auf VEGF oder bFGF wird durch Messung des Einbaus von [3H] Thymidin in die Zell-DNA bestimmt.

Materialien HUVECs Als Primärkulturisolate tiefgefrorene HUVECs werden von Clonetics Corp bezogen. Die Zellen werden im Endothel-Wachstumsmedium (Endothelial Growth Medium = EGM ; Clonetics) erhalten und in der 3.-7. Passage für die Mitogenitätsassays verwendet.

Kulturplatten NUNCLON 96-Well-Polystyrol-Gewebekulturplattten (NUNC #167008).

Assay-Medium Nach Dulbecco modifiziertes Eagle-Medium mit 1 g/ml Glucose (DMEM mit niedrigem Glucosegehalt ; Mediatech) plus 10% (v/v) fötales Rinderserum (Clonetics).

Testverbindungen Mit den Arbeitsstammlösungen der Testverbindungen wird mit 100% Dimethylsulfoxid (DMSO) solange eine Reihenverdünnung durchgeführt, bis ihre Konzentrationen um das 400-fache höher als die gewünschte End- konzentration sind. Die letzten Verdünnungen (Konzentration 1x) werden unmittelbar vor Zugabe zu den Zellen mit Assay-Medium hergestellt.

10x Wachstumsfaktoren Lösungen des menschlichen VEGF 165 (500 ng/ml ; R&D Systems) und bFGF (10 ng/ml ; R&D Systems) werden mit Assay-Medium hergestellt.

10x [3H]-Thymidin [Methyl-3H]-Thymidin (20 Ci/mmol ; Dupont-NEN) wird mit DMEM-Medium mit niedrigem Glucosegehalt auf 80 uCVml verdünnt.

Zellwaschmedium Hank's balanced salt solution (Mediatech) mit 1 mg/ml Rinderserumalbumin (Boehringer-Mannheim).

Zell-Lyse-Lösung 1 N NaOH, 2% (w/v) Na2C03.

Verfahren 1 In EGM gehaltene HUVEC-Einzelzeilschichten werden durch Trypsinbe- handlung geerntet und in einer Dichte von 4000 Zellen pro 100 ul Assay- Medium pro Näpfchen in 96-Well-Platten überimpft. Das Wachstum der Zellen wird 24 Stunden bei 37°C in einer 5% C02 enthaltenden feuchten Atmosphäre gestoppt.

Verfahren 2 t Das Wachstumsstoppmedium wird durch 100 gul Assay-Medium ersetzt, das entweder das Konstituens (0,25% [v/v] DMSO) oder die erwünschte Endkonzentration der Testverbindung enthält. Alle Bestimmungen werden in dreifacher Wiederholung durchgeführt. Die Zellen werden dann 2 Stunden bei 37°C/5% COs inkubiert, so dass die Testverbindungen in die Zellen eindringen können.

Verfahren 3 Nach 2-stündiger Vorbehandlung werden die Zellen durch Zugabe von 10, ut Assay-Medium, 10x VEGF-Lösung oder 10x bFGF-Lösung pro Näpfchen stimuliert. Die Zellen werden dann bei 37°C/5% CO2 inkubiert.

Verfahren 4 Nach 24 Stunden in Anwesenheit der Wachstumsfaktoren wird mit 10x [3H]-Thymidin (10 ul/well) versetzt.

Verfahren 5 Drei Tage nach dem Versetzen mit [3H]-Thymidin wird das Medium abgesaugt und die Zellen werden zweimal mit Zellwaschmedium gewaschen (400 ul/well, anschließend 200 ul/well). Die gewaschenen, adhärenten Zellen werden dann durch Zugabe von Zell-Lyse-Lösung (100 pl/well) und 30-minutiges Erwärmen auf 37°C solubilisiert. Die Zell-Lysate werden in 7-ml-Szintillationsrährchen aus Glas, die 150 ul Wasser enthalten, überführt. Man versetzt mit dem Szintillations-Cocktail (5 ml/Röhrchen), und die mit den Zellen assoziierte Radioaktivität wird flüssigkeitsszintillationsspektroskopisch bestimmt.

Gemäß diesen Assays stellen die Verbindungen der Formel I VEGF- Hemmer dar und eignen sich daher zur Hemmung der Angiogenese, wie bei der Behandlung von Augenkrankheiten, z. B. diabetischer Retinopathie, und zur Behandlung von Karzinomen, z. B. festen Tumoren. Die vorliegenden Verbindungen hemmen die VEGF-stimulierte Mitogenese von kultivierten menschlichen Gefäßendothelzellen mit HK50-Werten von 0,01-5, 0 guM. Diese Verbindungen sind im Vergleich zu verwandten Tyrosinkinasen (z. B. FGFR1 sowie Src-Familie ; zur Beziehung zwischen , _ Src-Kinasen und VEGFR-Kinasen siehe Eliceiri et al., Molecular Cell, Bd.

4, S. 915-924, Dezember 1999) auch selektiv.

Die TIE 2-Tests können z. B. analog der in WO 02/44156 angegebenen Methoden durchgeführt werden.

Der Assay bestimmt die inhibierende Aktivität der zu testenden Substanzen bei der Phosphorylierung des Substrats Poly (Glu, Tyr) durch Tie-2-Kinase in Gegenwart von radioaktivem 33P-ATP. Das phosphorylierte Substrat bindet während der Inkubationszeit an die Oberfläche einer "flashplate"-Mikrotiterplatte. Nach Entfernen der Reaktionsmischung wird mehrmals gewaschen und anschließend die Radioaktivität an der Oberfläche der Mikrotiterplatte gemessen. Ein inhibierender Effekt der zu messenden Substanzen hat eine geringere Radioaktivität, verglichen mit einer ungestörten enzymatischen Reaktion, zur Folge.

Vor-und nachstehend sind alle Temperaturen in °C angegeben. In den nachfolgenden Beispielen bedeutet"übliche Aufarbeitung" : Man gibt, falls erforderlich, Wasser hinzu, stellt, falls erforderlich, je nach Konstitution des Endprodukts auf pH-Werte zwischen 2 und 10 ein, extrahiert mit Ethylacetat oder Dichlormethan, trennt ab, trocknet die organische Phase über Natriumsulfat, dampft ein und reinigt durch Chromatographie an Kieselgel und/oder durch Kristallisation. Rf-Werte an Kieselgel ; Laufmittel : Ethylacetat/Methanol 9 : 1.

Massenspektrometrie (MS) : EI (Elektronenstoß-lonisation) M+ FAB (Fast Atom Bombardment) (M+H) + ESI (Electrospray lonization) (M+H) + (wenn nichts anderes angegeben) Beispiel 1 1-[4-(Benzo[1,2,5]thiadiazol-5-yloxy)-phenyl]-3-(2-fluoro-5- trifluormethyl- phenyl)-hamstoff ("A 1"),-~ Die Herstellung erfolgt analog nachstehendem Schema 1.1 Herstellung von 4- (Benzo [1,2, 5] thiadiazol-5-yloxy)-phenylamin ("A2") : 1.8 g Benzo [1,2, 5] thiadiazol-5-ol und 1.3 ml 4-Fluornitrobenzol werden in 25 ml DMF gelöst und 3.9 g Cäsiumcarbonat hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht bei 85° gerührt.

Zur Aufarbeitung wird das Gemisch mit Wasser versetzt und mit Essigester extrahiert. Die gesammelten organischen Phasen werden mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und einrotiert. Der Rückstand wird mit Diethylether verrieben. Man erhält 2.8 g von 5- (4-Nitro- phenoxy) -benzo [1,2, 5] thiadiazol ; Rf (CH2C12) 0.65 ; EI-MS (M+H) + 274.

Die Nitro-Verbindung wird mit Raney-Nickel zur gewünschten Verbindung hydriert. Nach Chromatographie mit Petrolether/Essigester erhält man 1.3 g einer gelben Festsubstanz ("A2") ; Rf (Petrolether/Essigester 1/1) 0,75, El-MS (M+H)+ 244.

1.2 100 mg"A2"und 0.1 ml 2-Fluor-5- (trifluormethyl) phenyl isocyanat werden in 5 ml Dichlormethan gelöst und 0.12 mi Triethylamin hinzugegeben : Die Mischung wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt.

Zur Aufarbeitung wird das Lösungsmittel am Rotavapor abgezogen und der Rückstand mit Hilfe der präparative HPLC gereinigt.

Säule : RP 18 (7 Zm) Lichrosorb 250x25 Fließmittel : A : 98H2O, 2CH3CN, 0, 1% TFA B : 10H2O, 90CH3CN, 0,1 % TFA UV : 225NM Fluß : 10ml/min Man erhält 69 mg einer weißen Festsubstanz ("A1, Trifluoracetat") ; Rf (Petrolether/Essigester 1/1) 0,63 ; El-MS (M+H)+ 449.

Analog erhält man nachstehende Verbindungen Nr. MW EI-MS (M+H) + oder HPLC-MS F F 2 448 449 F 0 0 nu-", I H H F

3 407 408 i I I \N F H H F F 0 4 448 449 0 // v-N v N H F Trifluoracetat 5 473 474* F F » ° l F O/ N/\ \ \ H H F 6 434435 F F t'N H H F Trifluoracetat F F 7 421 422 F \ nu i H Trifluoracetat F 8 503 504 F F F I \ O/I O I \ N 0 H H - O Trifluoracetat

F 9 464 465 IF \ \ \ cri N nus F F 10 430 431 NEZ . _. 0 NI _N H H i,' F I i Bistrifluoracetat 11 461 462 s N F O F/II/ H H F 12 429 430 F F I \ F O i O F W H H F Trifluoracetat 13 496 497 a F I O/O. /N I H F

_ 14 480 481 F0 N F F F I H H F 15 429 430 F /16 488489 FUZZ Ho F 16 488 489 0 F I \ F/I I/ o H H F F 17 450 451 F H H \ \ o H H Ig18 448449 F N F H H HO 19 437 438 t ; NH F OH

fi 20 478 479 0 0 N zur Ho F F 21 v H H N N IF I \Fp/I / H H ci F 22, __ i' Ho Zens JEW H H F 23 F C 3) vON N lN VN/ H H F pF-23" r-F F F 24 F ci N\ /NJN. \ \ wN S H H F F 25 H H j FF25 N N OV'N/S F5FF 25 F F 25 H H ) F F __-26 IF O S ! H H . H H F

FF 27 IF 0 0 S ! H H N N N H H F F F 28 f H H L N H H F H X H * HPLC-APCl-MSn Pharmakologische Testergebnisse

Nr. Inhibierung Inhibierung von TIE-2 von RAF IC50 (nMol) IC50 (nMol) 2 32 227 A1 57 220 FF280264 F ci 0 N H H /NJ'N \ H H Vergleichsverbindung aus WO 02/62763 ; Beispiel 42 ; Trifluoracetat F F 29 695 PIF O I Q I -N PO H H 0 F Vergleichsverbindung aus WO 02/44156 ; Beispiel 10 ;

Die nachfolgenden Beispiele betreffen pharmazeutische Zubereitungen : Beispiel A : Injektionsgläser Eine Lösung von 100 g eines erfindungsgemäßen Wirkstoffes und 5 g Dinatriumhydrogenphosphat wird in 3 I zweifach destilliertem Wasser mit 2 n Salzsäure auf pH 6,5 eingestellt, steril filtriert, in Injektionsgläser abge- füllt, unter sterilen Bedingungen lyophilisiert und steril verschlossen. Jedes Injektionsglas enthält 5 mg Wirkstoff.

Beispiel B : Suppositorien Man schmilzt ein Gemisch von 20 g eines erfindungsgemäßen Wirkstoffes mit 100 g Sojalecithin und 1400 g Kakaobutter, gießt in Formen und läßt erkalten. Jedes Suppositorium enthält 20 mg Wirkstoff.

Beispiel C : Lösung Man bereitet eine Lösung aus 1 g eines erfindungsgemäßen Wirkstoffes, 9,38 g NaH2PO4 2 H2O, 28,48 g Na2HP04. 12 HzO und 0,1 g Benzalkoniumchlorid in 940 ml zweifach destilliertem Wasser. Man stellt auf pH 6,8 ein, füllt auf 1 1 auf und sterilisiert durch Bestrahlung. Diese Lösung kann in Form von Augentropfen verwendet werden.

Beispiel D : Salbe Man mischt 500 mg eines erfindungsgemäßen Wirkstoffes mit 99,5 g Vaseline unter aseptischen Bedingungen.

Beispiel E : Tabletten Ein Gemisch von 1 kg Wirkstoff, 4 kg Lactose, 1,2 kg Kartoffelstärke, 0,2 kg Talk und 0,1 kg Magnesiumstearat wird in üblicher Weise zu Tabletten verpreßt, derart, daß jede Tablette 10 mg Wirkstoff enthält.

Beispiel F : Dragees Analog Beispiel E werden Tabletten gepreßt, die anschließend in üblicher Weise mit einem Überzug aus Saccharose, Kartoffelstärke, Talk, Tragant und Farbstoff überzogen werden.

Beispiel G : Kapseln 2 kg Wirkstoff werden in üblicher Weise in Hartgelatinekapseln gefüllt, so daß jede Kapsel 20 mg des Wirkstoffs enthält.

Beispiel H : Ampullen Eine Lösung von 1 kg eines erfindungsgemäßen Wirkstoffes in 60 I zweifach destilliertem Wasser wird steril filtriert, in Ampullen abgefüllt, unter sterilen Bedingungen lyophilisiert und steril verschlossen. Jede Ampulle enthält 10 mg Wirkstoff.