CELLULAIRE ET TISSULAIRE DE LA PEAU

La présente invention concerne l'utilisation d'un activateur de l'autophagie des cellules cutanées pour améliorer la longévité cellulaire et tissulaire de la peau. L'invention vise également spécifiquement un procédé cosmétique de traitement de la peau, pour favoriser la longévité cellulaire et tissulaire cutanée, comprenant l'application sur la peau d'un activateur de l'autophagie des cellules cutanées.

Le vieillissement est un processus complexe dépendant du déterminisme génétique, de mécanismes épigénétiques, et de diverses influences externes telles que le soleil, la pollution atmosphérique, l'alimentation, l'hygiène de vie, etc. La longévité et le déclin des cellules et des tissus de la peau sont donc sous l'influence de nombreux facteurs.

Pour prévenir efficacement le vieillissement cutané, y compris prématuré, et limiter l'apparition des effets néfastes qui en découlent, il est important de retarder les phénomènes de sénescence cellulaire et de limiter la dégénération tissulaire.

C'est pourquoi l'objectif de la présente invention est de trouver une solution cosmétique capable d'agir sur des mécanismes moléculaires fortement impliqués dans la longévité cellulaire et tissulaire et ainsi de limiter et faire reculer l'apparition des signes du vieillissement cutané.

Pour y répondre, la présente invention propose d'utiliser un activateur de l'autophagie des cellules cutanées.

En effet, de façon surprenante, l'application sur la peau d'un activateur de l'autophagie des cellules cutanées, permet d'augmenter la longévité cellulaire et tissulaire de la peau.

L'invention vise donc l'utilisation dans une composition cosmétique d'au moins un activateur de l'autophagie des cellules cutanées, comme principe actif destiné à augmenter la longévité cellulaire et tissulaire de la peau.

Selon l'invention, l'utilisation d'un activateur de l'autophagie permet de retarder les phénomènes de sénescence cellulaire de la peau et de limiter la dégénération tissulaire en agissant sur des mécanismes moléculaires fortement impliqués dans la longévité cellulaire et tissulaire. Il permet de préserver la fonctionnalité des tissus de la peau et l'apparition des signes du vieillissement au niveau de la peau.

Selon un aspect particulier, l'invention vise spécifiquement un procédé cosmétique de traitement de la peau pour augmenter la longévité cellulaire et tissulaire, comprenant l'application topique sur la peau d'un principe actif activateur de l'autophagie des cellules cutanées.

La présente invention est maintenant décrite en détail.

L'autophagie est un mécanisme de recyclage et de détoxification des constituants et des organites cellulaires. L'autophagie permet notamment de réguler, réparer et éliminer les protéines de longue durée de vie dans les cellules, assurant ainsi un contrôle au cours de la différenciation et du vieillissement de la peau humaine.

Sur le plan cellulaire, le mécanisme d'autophagie, comprend quatre étapes : l'initiation, la formation d'une vacuole initiale, nommée autophagosome, qui séquestre le matériel cytoplasmique, la maturation de l'autophagosome en vacuole dégradative et la fusion avec le lysosome, jusqu'à la dégradation du matériel séquestré.

Par activateur ou stimulateur de l'autophagie au sens de l'invention, on entend une molécule ou un principe actif, ou un mélange de molécules ou de principes actifs, capable d'activer le mécanisme de l'autophagie.

La présente invention vise donc un activateur de l'autophagie des cellules cutanées pour son application comme principe actif dans une composition à application topique sur la peau, ledit principe actif et/ou ladite composition étant destinés à augmenter la longévité cellulaire et tissulaire de la peau.

En particulier l'invention vise l'utilisation d'un principe actif activateur de l'autophagie des cellules cutanées comme principe actif dans une composition à application topique, ledit principe actif et/ou ladite composition étant destinés à agir sur les mécanismes moléculaires impliqués dans la longévité cellulaire et tissulaire de la peau, notamment à :

limiter l'accumulation de la lipofuscine dans les cellules de la peau, et limiter la dégradation de la matrice cellulaire induite par les métalloprotéinases 1

(MMP-1).

La lipofuscine, appelée également « âge pigment », est un composé autofluorescent non dégradable qui s'accumule progressivement lors de stress répétés ou avec l'âge et qui entrave le bon fonctionnement de la cellule. Au niveau du tissu cutané, les dépôts de lipofuscine contribuent à l'apparition des tâches de vieillissement qui caractérisent fréquemment les peaux âgées ou trop exposées aux rayons du soleil. Son accumulation est associée à une réduction de la longévité cellulaire.

Or, selon l'invention, l'utilisation sur la peau d'un activateur de l'autophagie des cellules cutanées permet de limiter l'accumulation de lipofuscine dans les cellules de la peau et par conséquent d'augmenter la longévité cellulaire et tissulaire cutanée.

Par ailleurs, la synthèse de MMP-1, métalloprotéinase matricielle responsable de la dégradation des fibres de collagène I et III, est accrue dans les cellules de la peau au cours du vieillissement cutané. Cette dégradation du réseau matriciel tridimensionnel des cellules cutanées se traduit à la surface de la peau par un relâchement, une perte de fermeté et l'apparition de rides.

Or, selon l'invention, l'utilisation sur la peau d'un activateur de l'autophagie des cellules cutanées permet d'inhiber ou de limiter la synthèse de MMP-1 dans les cellules de la peau, et par conséquent de réduire la dégradation de la matrice extracellulaire et donc d'augmenter la longévité cellulaire et tissulaire cutanée.

Ces actions se traduisent visuellement par une diminution des signes du vieillissement de la peau, notamment une réduction des rides et une amélioration de l'homogénéité du teint. Préférentiellement, le stimulateur de l'activité autophagique des cellules cutanées utile selon l'invention est une molécule de synthèse ou un principe actif issu d'au moins une plante, une algue ou une levure.

L'activateur de l'autophagie peut être par exemple un principe actif capable d'activer l'autophagie des cellules de la peau, issu de Prunus cerasus ou de Metschnikowia hawaïensis.

Selon un aspect de l'invention, l'activateur de l'autophagie des cellules cutanées est susceptible d'être sélectionné par un test réalisé sur des cultures de cellules cutanées tel que décrit dans le brevet FR-2.939.316. L'activateur de l'autophagie est donc susceptible d'être sélectionné par un test réalisé sur des cultures de cellules cutanées comprenant les étapes suivantes :

culture de cellules cutanées, kératinocytes ou fibroblastes, dans un milieu de culture adapté,

retrait du milieu de culture et remplacement par un milieu de culture comprenant un agent stressant induisant un stress nutritif et/ou oxydatif, ajout d'un principe actif issu de plante, d'algue ou de levure ou d'une molécule de synthèse à tester dans le milieu de culture comprenant le principe actif, et

analyse de l'expression de MAP-LC3, d'ATG5-12, de mTOR phosphorylée, de la protéine p53 phosphorylée, de l'expression de la protéine DRAM et/ou de l'AMPK par lesdites cellules, et comparaison des résultats avec ceux obtenus sur des cultures de cellules cutanées non traitées avec le principe actif à tester.

Les activateurs de l'autophagie pour l'utilisation selon l'invention, peuvent être incorporés dans des compositions cosmétiques dans différentes formes galéniques, adaptées à l'administration par voie topique cutanée.

Ces compositions peuvent se présenter notamment sous forme de crèmes, émulsions huile- dans-eau, émulsions eau-dans-huile, émulsions multiples, solutions, suspensions ou poudres. Elles peuvent être plus ou moins fluides et avoir l'aspect d'une crème, d'une lotion, d'un lait, d'un sérum, d'une pommade, d'un gel, d'une pâte ou d'une mousse, ou sous forme solide. Ces compositions contiennent entre 0,01 et 15% en poids d'activateurs de l'autophagie des cellules cutanées selon la présente invention, préférentiellement entre 0,5% et 4%.

Selon un autre aspect, l'invention vise également un procédé cosmétique de traitement de la peau pour augmenter la longévité cellulaire et tissulaire, comprenant l'application topique sur la peau d'un activateur de l'autophagie des cellules cutanées ou d'une composition contenant un activateur de l'autophagie des cellules cutanées. En particulier, l'invention vise un procédé cosmétique de traitement des peaux photoexposées pour retarder le vieillissement, comprenant l'application topique sur la peau d'un activateur de l'autophagie des cellules cutanées ou d'une composition contenant un activateur de l'autophagie des cellules cutanées.

Pour illustrer l'invention, plusieurs activateurs de l'autophagie ont été sélectionnés et testés pour étudier leur capacité à augmenter la longévité cellulaire et tissulaire cutanée.

I . Exemples d'activateurs de l'autophagie

l.l Activateur de l'autophagie issu de Prunus cerasus

Un exemple d'activateur de l'autophagie utile selon l'invention est un principe actif issu de pédoncule fructifère de Prunus cesarus répondant positivement au test réalisé sur des cultures de cellules cutanées tel que décrit dans le brevet FR-2.939.316. Un tel principe actif peut être obtenu par la mise en œuvre des étapes suivantes :

- solubilisation de poudre de pédoncule fructifère de cerisier dans l'eau,

hydrolyses enzymatiques,

- séparation des phases solubles et insolubles et récupération de la phase soluble, - inactivation enzymatique par traitement thermique,

- filtration et purification des oligosaccharides,

- concentration de la fraction active oligosaccharidique,

- filtration et filtration stérilisante.

Le principe actif contient environ 40% d'oligosaccharides de taille comprise entre 180Da et 1300Da.

I.2 Activateur de l'autophagie issu de Metschnikowia hawaïensis

Un autre exemple d'activateur de l'autophagie utile selon l'invention est un principe actif issu de Metschnikowia hawaïensis répondant positivement au test réalisé sur des cultures de cellules cutanées tel que décrit dans le brevet FR-2.939.316.

Un tel principe actif peut être obtenu par la mise en œuvre des étapes suivantes :

- solubilisation de poudre de Metschnikowia hawaïensis dans l'eau,

hydrolyses,

- filtration,

- filtration et purification pour récupération des peptides,

- filtration et filtration stérilisante.

Le principe actif contient environ 50% de peptides de taille comprise entre 243 Da et 5000 Da.

II. Efficacité des activateurs de l'autophagie sur la formation des Ivsosomes

L'objectif de cette étude est d'évaluer l'effet des principes actifs sur le production des lysosomes, organelles impliquées dans le mécanisme autophagique de la cellule.

Cette étude a été réalisée par cytométrie en flux sur des fibroblastes humains normaux soumis à des traitements modérés et répétés avec du peroxyde d'hydrogène (H ₂ 0 ₂ ) permettant d'induire la sénescence cellulaire.

Le protocole opératoire est décrit en suivant.

A J0, les fibroblastes humains normaux sont ensemencés dans du milieu adapté.

Pendant plusieurs jours, les fibroblastes sont traités : - fibroblastes non stressés : les fibroblastes humains sont ensemencés dans le milieu de culture en présence ou non d'un des principes actifs.

- fibroblastes stressés témoins : les fibroblastes humains sont ensemencés dans le milieu de culture puis traités avec la solution H ₂ 0 ₂ . Ce traitement répété H ₂ 0 ₂ permet d'induire l'état de sénescence cellulaire caractérisé par un ratio de croissance et une activité β-galactosidase.

- fibroblastes stressés traités avec les principe actifs des exemples 1.1 et 1.2 : les fibroblastes humains sont ensemencés dans le milieu de culture en présence des principes actifs puis traités avec la solution H ₂ 0 ₂ .

Un marquage spécifique des lysosomes est réalisé par fluorescence.

L'analyse du marquage fluorescent est réalisé par cytométrie en flux. L'intensité de fluorescence verte est proportionnelle à la quantité de lysosomes. Plus l'intensité de fluorescente est importante, plus la formation de lysosomes est élevée.

Les résultats sont présentés dans le tableau suivant :

Testés à 1% sur fibroblastes humains stressés, les principes actifs extrait de cerisier et extrait de Metschnikowia hawaïensis boostent significativement la production des lysosomes de 45% et de 99% en comparaison aux fibroblastes stressés témoins.

En augmentant la production de lysosomes dans les cultures de cellules, ces principes actifs activent le mécanisme d'autophagie. III. Exemples de compositions incluant ces activateurs de l'autophagie

lll.l Crème de Nuit

A. Eau QSP 100%

Propylène glycol 10%

Carbopol 2050 (Noveon) 0,2 % B. DUB MCT 5545 (Stéarinerie Dubois) 10%

DUB Liquide 85 (Stéarinerie Dubois) 6%

DUB Cire A (Stéarinerie Dubois) 2%

DUB G1218A (Stéarinerie Dubois) 3%

DUB 1632 (Stéarinerie Dubois) 2%

DC 200 (Dow Corning) 2%

C. Conservateur 1%

Principe actif de l'exemple 1.2 3%

D. NaOH 0,5%

Cette composition est un gel émulsionné, avec pH 5.

Elle est obtenue par la mise en œuvre des étapes suivantes :

- mélanger A, chauffer à 60°C et bien disperser le carbopol sous agitation mécanique

- chauffer A et B à 80°C, sous agitation mécanique

- émulsionner B dans A sous émulseur

- à 40°C ajouter C dans l'ordre, homogénéiser

- puis à 30°C, ajuster le pH avec C

- continuer l'homogénéisation jusqu'à ce que l'émulsion soit uniforme.

II I.2. Crème de Jour Anti-Age

A. Eau QSP 100%

Carbopol Ultrez 20 (Noveon) 0,3%

Glycérol 3%

EDTA 0,2%

B. Sophim MC30 (Sophim) 6%

DUB MCT 5545 (Stéarinerie Dubois) 5%

Beurre de Karité (Sictia) 3%

Stérol CC/595 (Cesalpina) 3%

Ritapro 165 (Rita) 3%

DC 345 (Dow Corning) 1%

DUB Zenoat (Stéarinerie Dubois) 2%

C. Conservateur 1%

Principe actif de l'exemple 1.1 3%

D. TEA QSP pH 5,3 Cette composition est gel émulsionné, avec pH 5,3.

Elle est obtenue par la mise en œuvre des étapes suivantes :

- Mélanger A, mélanger B,

- chauffer A et B sous agitation mécanique à 80°C,

- émulsionner B dans A sous agitation,

- à 40°C, additionner C dans l'ordre, homogénéiser,

- continuer l'homogénéisation en ajoutant D jusqu'à ce que le mélange soit uniforme et laisser refroidir sous agitation jusqu'à 30°C.

III.3. Sérum

A. Eau QSP 100%

Glycérol 3%

Carbopol ETD 2050 (Noveon) 0,3%

Butylène Glycol 5%

B. DUB ININ (Stéarinerie Dubois) 3%

Arlamol E (Noveon) 3%

DUB PTIS (Stéarinerie Dubois) 2%

DUB PTCC (Stéarinerie Dubois) 3,3%

C. Conservateur 1%

Principe actif de l'exemple I.2 3%

D. NaOH qsp pH 6,5

Cette composition se présente sous forme d'un sérum avec un pH 6,2.

Elle est obtenue par la mise en œuvre des étapes suivantes :

- mélanger A, bien disperser le gel sous agitation mécanique,

- mélanger B. Chauffer A et B à 80°C,

- émulsionner B dans A sous émulseur,

- à 40°C ajouter C dans l'ordre, homogénéiser,

- ajuster le pH avec D, sous agitation mécanique,

- continuer l'homogénéisation jusqu'à ce que le sérum soit uniform

- laisser sous agitation jusqu'à refroidissement, 30°C. IV. Evaluation de l'effet d'activateurs de l'autophagie sur la longévité cellulaire et tissulaire IV.l Etudes in vitro sur les marqueurs moléculaires de la longévité cellulaire et tissulaire de la peau

1.1. Etude de l'accumulation d'agrégats de lipofuscine

L'objectif de cette étude est d'évaluer la capacité d'activateurs de l'autophagie à limiter la formation d'agrégats de lipofuscine qui altèrent le fonctionnement cellulaire et qui sont corrélés à la réduction de la longévité cellulaire.

Cette étude a été réalisée par microscopie confocale sur des fibroblastes humains normaux soumis à des traitements modérés et répétés avec du peroxyde d'hydrogène (H ₂ 0 ₂ ) permettant d'induire la sénescence cellulaire.

Le protocole opératoire est décrit en suivant.

A JO, les fibroblastes humains normaux sont ensemencés dans un milieu de culture. Les cellules sont ensuite incubées à 37°C.

Pendant plusieurs jours, les fibroblastes sont traités et stressés :

- témoins : les fibroblastes humains sont ensemencés dans un milieu de culture puis traités avec une solution H ₂ 0 ₂ ; ce traitement répété permet d'induire l'état de sénescence cellulaire caractérisé par un ratio de croissance et une activité β- galactosidase,

- traités : les fibroblastes humains sont ensemencés dans un milieu de culture en présence des activateurs de l'autophagie des cellules cutanées des exemples l.l et I.2 à 1% (V/V) puis traités avec une solution H ₂ 0 ₂ .

La visualisation de la lipofuscine est réalisée à l'aide d'un microscope couplé à un logiciel d'analyse d'images. La liposfuscine se matérialise par l'apparition de grains autofluorescents dans le cytoplasme des cellules. La quantité de lipofuscine est proportionnelle à l'intensité d'autofluorescence des cellules.

Les résultats obtenus sont exprimés en intensité de fluorescence / nombre de cellules (UA), et présentés dans le tableau ci-dessous : Efficacité / Fibroblastes

stressés témoins (%)

Témoin stressé 0

Extrait de Prunus cerasus à 1% -35%

Extrait de Metschnikowia

-45%

hawaïensis à 1 %

L'accumulation cytoplasmique des agrégats de lipofuscine est significativement augmentée lorsque des fibroblastes humains normaux sont soumis à un stress H ₂ 0 ₂ modéré et répété. En outre, on constate que les activateurs de l'autophagie, permettent de réduire l'accumulation de lipofuscine en comparaison aux fibroblastes stressés témoins.

1.2. Etude de la protection de la matrice extracellulaire

L'objectif de cette étude est d'évaluer l'effet d'activateurs de l'autophagie des cellules cutanées sur la synthèse de M MP-1 dont la synthèse est accrue au cours du vieillissement. L'étude a été réalisée par dosage ELISA sur des fibroblastes humains normaux ayant subi des traitements modérés et répétés avec du peroxyde d'hydrogène (H ₂ 0 ₂ ) permettant d'induire la sénescence cellulaire.

Le protocole opératoire est décrit en suivant.

A JO, les fibroblastes humains normaux sont ensemencés dans un milieu de culture. Les cellules sont ensuite incubées à 37°C.

Pendant plusieurs jours, les fibroblastes sont traités et stressés :

- témoins : les fibroblastes humains sont ensemencés dans un milieu de culture puis traités avec une solution H ₂ 0 ₂ ; ce traitement répété permet d'induire l'état de sénescence cellulaire caractérisé par un ratio de croissance et une activité β- galactosidase,

- traités : les fibroblastes humains sont ensemencés dans un milieu de culture en présence des activateurs de l'autophagie des cellules cutanées de l'exemple l.l à

1% (V/V) puis traités avec une solution H ₂ 0 ₂ .

Les surnageants cellulaires sont récupérés. Le dosage de M M P-1 est réalisé à l'aide d'un kit de dosage ELISA.

Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau ci-après : Efficacité / Fibroblastes

stressés témoins (%)

Témoin 0

Extrait de Prunus cerasus à 1% -48%

La synthèse de M MP-1 est significativement augmentée lorsque les fibroblastes humains normaux sont soumis à un stress H ₂ 0 ₂ modéré et répété.

En outre on constate que les activateurs de l'autophagie permettent de réduire de 35% la synthèse de M M P-1 en comparaison aux fibroblastes stressés témoins. Cet effet est significatif et dose-dépendant. L'intégrité de l'environnement matriciel est ainsi préservé. IV.2 Etudes in vivo : évaluation de l'effet sur les signes du vieillissement des peaux photoexposées

2.1.Etude de l'effet anti-rides sur des peaux photo-exposées

Avec l'âge, le vieillissement tissulaire se traduit au niveau cutané par l'apparition de rides et de tâches de sénescence.

L'objectif de cette étude est d'évaluer, in vivo, l'effet anti-rides sur des peaux photovieillies d'un activateur des cellules cutanées (exemple l.l) formulé à 3% contre placebo au niveau de la patte d'oie et par projection de franges.

L'étude a été menée sur 20 volontaires sains d'âge compris entre 52 et 70 ans et sélectionnés comme présentant une peau photoexposée.

Les acquisitions ont été réalisées à l'aide d'un appareil de projection de franges dédié à la mesure 3D du relief cutané (Eotech, France). Les acquisitions en 3D ont été réalisées au niveau de la patte d'oie avant et après 28 jours de traitement biquotidien.

Les paramètres les plus pertinents retenus pour cette étude sont :

- Des paramètres de rugosité en 3D

* Sq : moyenne quadratique de rugosité de surface,

* Sa : moyenne arithmétique de rugosité de surface.

- Des paramètres de volume

* volume négatif : volume inférieur à la surface de la peau.

Une diminution de ces différents paramètres est caractéristique d'une amélioration du relief de la surface étudiée et d'une diminution des rides.

Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau ci-après : Variation / Placebo (%)

-6,1%

Paramètre Sa

-5,9%

Paramètre Sq

-14,2%

Volume négative

Dans les conditions de cette étude, après 28 jours d'applications biquotidiennes et en comparaison au placebo, le principe actif de l'exemple 1.1 formulé à 3% en émulsion :

- lisse le relief cutané au niveau des pattes d'oie. En effet, l'activateur de l'autophagie testé, diminue significativement les paramètres de rugosité 3D :

- le paramètre Sa de 6,1% (p=0,0040),

- le paramètre Sq de 5,9% (p=0,0042),

- réduit les rides en permettant une diminution significative du paramètre

volume négatif (-14,2%, p=0,0079).

Cette étude montre donc bien qu'un activateur de l'autophagie permet de ralentir le vieillissement cutané et qu'il augmente donc la longévité cellulaire de la peau.