UTILISATION D'UN PRINCIPE ACTIF ISSU

D'EUCHEUMA COTTONII RICHE EN SALACTANES LINEAIRES POUR LUTTER CONTRE LA SENESCENCE CELLULAIRE CUTANEE

La présente invention se rapporte à l'utilisation d'un principe actif issu dEucheuma cottonii riche en molécules spécifiques, pour lutter contre le vieillissement de la peau et améliorer l'âge perçu, ainsi qu'à un principe actif particulier contenant de telles molécules.

L'invention concerne également les compositions cosmétiques incluant ce principe actif, et un procédé de traitement cosmétique destiné à prévenir et/ou lutter contre le vieillissement cutané.

Une des premières conséquences visibles du vieillissement humain, est la modification des paramètres cutanés caractérisés par l'apparition de rides et le relâchement de la peau.

Au niveau cellulaire, le vieillissement, dénommé sénescence, est un état irréversible dans lequel les cellules endommagées ne prolifèrent plus.

La sénescence peut survenir selon deux voies majeures, la sénescence prématurée induite par le stress et la sénescence réplicative. Cette dernière est inhérente à la division cellulaire et signe le déclin du potentiel réplicatif des f ibroblastes. Les cellules sont en effet dotées d'un quota de division qui décide de leur durée de vie. Lorsque ce quota est épuisé, les f ibroblastes cessent leur prolifération et entrent en sénescence, processus physiologique normal qui évite la transformation de la cellule.

La sénescence réplicative est dépendante des télomères, séquences d'ADN non codantes et hautement répétées situées aux extrémités des chromosomes, et pro égée par un complexe protéique spécifique le télosome. Au fil des divisions cellulaires, les télomères raccourcissent progressivement jusqu'à une taille minimum critique qui déclenche l'état de sénescence cellulaire, contribuant à la dégénération du tissu cutané et à son vieillissement.

L'objectif de la présente invention est de proposer un principe actif cosmétique qui favorise la protection du télosome et des télomères des cellules cutanées, pour maintenir le potentiel réplicatif cellulaire et améliorer l'âge perçu.

A cet effet, l'invention vise l'utilisation de molécules particulières obtenues à partir d'Eucheuma coffonii.

Eucheuma cottonii es^ une algue rouge, ramifiée, de couleur vert à jaune oranger, cultivée essentiellement en Asie, notamment dans la zone Pacifique pour la production d'agents gélifiants et épaississants, utilisés dans les secteurs alimentaire, pharmaceutique et cosmétique. On peut citer par exemple la demande FR2480138 qui décrit un extrait sulfaté Eucheuma cottonii comme additif alimentaire visqueux.

Des extraits ont par ailleurs été utilisés en cosmétique pour des propriétés hydratantes, émulsif iantes, émolliantes, lissantes, gélifiantes ou encore amincissantes. On connaît notamment la demande FR2719846 qui mentionne l'utilisation de galactanes sulfatés présentant un taux de sulfatation d'au moins 0,5 sulfate par unité saccharidique pour améliorer l'élasticité de la peau et favoriser la cicatrisation. Ces galactanes sulfatés peuvent être des carragnénanes obtenus à partir d'Eucheuma sp., par un procédé impliquant une fermentation par une bactérie marine. On connaît également la demande JP2002193736 qui décrit des extraits aqueux d'Eucheuma cottonii pour le lissage de la peau et des cheveux.

La présente invention vise spécifiquement l'utilisation d'un principe actif obtenu par hydrolyse d' Eucheuma cottonii contenant des galactanes linéaires, en tant que principe actif cosmétique dans une composition à application cutanée ledit principe actif et/ou ladite composition étant destiné(s) à favoriser la protection du télosome et des télomères dans les cellules de la peau. Le principe actif contient très peu voire pas de galactanes sulfatés.

En effet, de façon surprenante l'utilisation cosmétique d'un principe obtenu par hydrolyse à! Eucheuma cottonii contenant des galactanes linéaires, favorise la protection du télosome et des télomères dans les f ibroblastes, et permet ainsi un maintien du potentiel réplicatif cellulaire pour un effet anti-âge visible.

De façon spécifique, l'invention vise également un principe actif particulier à savoir un hydrolysat Eucheuma cottonii comprenant des galactanes linéaires, destiné à être intégré dans une composition à application cutanée.

Par « composition à application cutanée » on entend toute composition destinée à être appliquée sur la peau, préférentiellement une composition cosmétique.

Par « hydrolysat » on entend tout extrait obtenu à partir Eucheuma cottonii, comprenant au moins une étape d'hydrolyse.

Enfin, l'invention a également pour objet une composition cosmétique contenant un principe actif obtenu à partir Eucheuma cottonii contenant des galactanes linéaires, ainsi qu'un procédé de traitement cosmétique destiné à prévenir et/ou lutter contre les effe s de l'âge sur la peau, comprenant l'application topique sur la peau d'une telle composition.

La présente invention est maintenant décrite en détail.

UTILISATION

Selon un premier aspect, l'invention vise un hydrolysat d'Eucheuma cottonii comprenant des galactanes linéaires, pour son utilisation comme principe actif cosmétique dans une composition à application cutanée, ledit principe actif et/ou ladite composition étant destinés à favoriser la protection du télosome et des télomères des cellules de la peau. Les télomères garantissent l'intégrité des chromosomes. Ils protègent d'une part les extrémités des chromosomes pour éviter qu'ils ne se dégradent, et ils préviennent, d'autre part, la perte de l'information génétique lors de la réplication. Toutefois, ces extrémités chromosomiques sont fragiles et sont elles-mêmes stabilisées par un complexe multi-protéique appelé télosome ou shelterin.

Le télosome joue un rôle très important de protection en permettant aux télomères d'adopter une conformation particulière en lasso, appelée boucle télomérique. Il masque les télomères et les préserve ainsi des dégradations en autorisant toutefois leur accès à intervalles réguliers pour permettre leur réplication.

Le télosome est composé de 6 protéines centrales, dont POT1 (« Protection Of Telomeres » protection des télomères) et TPP1 (« POT1 and TTN2-interacting protein » protéines interagissant avec POT1 et TTN2). Ces protéines du télosome participent activement à la protection des télomères et la demanderesse a notamment démontré que leurs expressions sont signif icativement réduites dans des fibroblastes sénescen^s en comparaison à des fibroblastes normaux.

Lorsque les télosomes sont altérés ou en absence de télosome, les télomères fragilisés raccourcissent plus vite à chaque division. Le stress (UV, espèces réactives à l'oxygène, etc.) accentue également leur usure.

L'altération des télomères, résultant à la fois de leur érosion progressive et/ou de leur démasquage via une défaillance du télosome, commande l'arrêt de la prolifération et conduit à la sénescence cellulaire, appelée sénescence réplicative ou télomérique. Ce processus entraine, via différents mécanismes, un déclin graduel de la fonctionnalité du tissu cutané et son vieillissement.

Selon l'invention, l'utilisation sur la peau d'un principe actif obtenu à partir d!Eucheuma cottonii comprenant des galactanes linéaires permet de limiter les pertes au niveau des télomères des fibroblastes. En particulier un principe actif obtenu à partir d'Eucheuma cottonii comprenant des galactanes linéaires peut être utilisé pour :

- préserver la capacité des fibroblastes à exprimer POT1 et TPP1, protéines du télosome dont les expressions sont réduites dans des fibroblastes sénescerûs, et

- limiter le raccourcissement des télomères dans les fibroblastes, notamment d'empêcher l'érosion accélérée des télomères induite par un stress. En limitant les pertes au niveau des télomères, à chaque division cellulaire, le principe actif selon l'invention permet de préserver le capital réplicatif des fibroblastes et retarder les phénomènes de sénescence et de dégénération.

La longévité cellulaire est favorisée, le passage des fibroblastes humains en sénescence cellulaire limitée, et l'apparition des signes du vieillissement ralentie. Un principe actif obtenu à partir d'Eucheuma cottonii comprenant des galactanes linéaires peut donc être utilisé pour prévenir et/ou lutter contre l'apparition des marques du vieillissement au niveau de la peau et améliorer l'âge perçu. Il permet en particulier :

- de favoriser la restructuration de la matrice dermique, et

- de lisser le microrelief cutané en réduisant la rugosité de la peau et en atténuant les rides.

Il peut notamment être utilisé spécifiquement pour prévenir et/ou lutter contre l'apparition des rides.

Selon un mode de réalisation particulièrement adapté, l'invention vise l'utilisation dans une composition, d'un principe actif obtenu à partir d'Eucheuma cottonii, tel que décrit en suivant. PRINCIPE ACTIF

L'invention concerne également un principe actif cosmétique particulier, à savoir un hydrolysat à! Eucheuma cottonii comprenant des galactanes linéaires. Le degré de polymérisation des galactanes linéaires est préférentiellement compris entre 6 et 18. Les galactanes linéaires utiles selon l'invention ne sont pas des galactanes linéaires sulfatés : moins de 1% des galactanes linéaires présents dans l'hydrolysat selon l'invention sont sulfatés.

Le principe actif présente préférentiellement une couleur jaune claire.

Il se présente sous forme d'un produit liquide non visqueux. Il peut être défini par au moins une des caractéristiques exposées ci-après, préférentiellement toutes.

Matières sèches :

Le taux de matières sèches d'un principe actif selon l'invention (mesuré par passage à l 'étuve à 105°C en présence de sable d' un échantillon de poids initial donné jusqu'à obtention d' un poids constant) peut être compris entre 30 et 100 g/1, préférentiellement entre 47 et 65 g/1.

Mesure du pH :

Le pH (mesuré par la méthode potentiométrique à température ambiante) peut être compris entre 3 et 5, préférentiellement entre 3 et 4.

Carbohydrates :

Détermination de la teneur en sucres totaux

Le dosage de la teneur en sucres totaux peut être réalisé par la méthode de DUBOIS (DUBOIS M. et al., (1956), Analytical chemistry, 28, n° 3 p. 350- 356). En présence d'acide sulfurique concentré et de phénol, les sucres réducteurs donnent un composé jaune orangé. A partir d'une gamme étalon, on peut déterminer le taux de sucres totaux d'un échantillon.

La teneur en sucres totaux peut être supérieure à 45% en poids de matière sèche, préférentiellement supérieure à 60%. Préférentiel lemen† la teneur en sucres totaux est comprise entre 19 et 71 g/1, en particulier entre 31 et 46 g/1.

Caractérisation de la fraction carbohydrate :

La détermination de la taille des carbohydrates d'un principe actif selon l'invention est réalisée par chromatographie liquide haute performance.

Le chromatogramme obtenu montre la présence de monosaccharides de masse moléculaire nférieure à 180Da et d'oligosaccharides et de polysaccharides de masse molaire comprise entre 180 et 8100Da (degré de polymérisation au maximum 45). Les monosaccharides représen en moins de 35%, préférentiellement entre 18 et 25%, et les oligosaccharides et polysaccharides de masse molaire comprise entre 180 et 8100Da représentent au moins 65%, préférentiellement entre 72 et 85%.

La fraction glucidique du principe actif selon l'invention est donc composée essentiellement de monosaccharides, d'oligosaccharides et de polysaccharides de degré de polymérisation inférieur à 45.

La majorité des carbohydrates présents dans le principe actif sont des galactanes linéaires.

Taux de carbohydrates sulfatés :

Le taux de carbohydrates sulfatés dans des matrices aqueuses est déterminé à l'aide d'une méthode spectrophotométrie.

Les carbohydrates sulfatés donnent une coloration bleue en présence d'azure A.

Le taux de carbohydrates sulfatés dans les échantillons est déterminé par rapport à une gamme étalon réalisée avec une solution dextran sulfaté de concentration connue.

Moins de 1% des carbohydrates du principe actif selon l'invention sont des carbohydrates sulfatés. Teneur en cendres brutes :

La teneur en cendres brutes est dé erminée par la pesée des résidus issus de l'incinération à 550°C dans un four à moufle électrique (VULCAN™). Le poids du résidu est calculé en déduisant la tare.

La teneur en minéraux est exprimée en pourcentage par rapport au poids total de la matière sèche du principe actif.

La teneur en cendres brutes d'un principe actif selon l'invention est préférentiellement nférieure à 30%.

Teneur en acides uroniques :

Le produit de l'acide galacturonique avec le tétraborate de sodium, donne en présence du méta-hydroxydiphényl, une coloration rose permettant le dosage au spectrophotomètre à 520 nm.

L'intensité de coloration est proportionnelle à la quantité d'acides uroniques. Les lectures sont réalisées à partir d'une gamme étalon d'acide galacturonique allant de 10 à 100 mg/l.

Les échantillons du principe actif selon l'invention doivent être préalablement dilués avec de l'eau distillée.

Les résultats obtenus pour les étalons permettent de tracer une droite DO=f (concentration).

Le taux d'acides uroniques des produits est alors directement lu sur cette droite.

La teneur en acides uroniques d'un principe actif selon l'invention est préférentiellement inférieure à 25%.

PROCEDE D'OBTENTION

Le principe actif selon l'invention tel que décrit précédemment peut être préférentiellement par un procédé comprenant une hydrolyse. Un procédé particulièrement adapté comprend au moins la succession des étapes suivantes :

- solubilisation de poudre d'Eucheuma co††oniien solution aqueuse,

- hydrolyse des carbohydrates,

- séparation des phases soluble et insoluble, pour récupérer la phase soluble,

- f iltration et récupération du filtrat,

- concentration de la fraction active contenant des galactanes linéaires, Préférentiellement, le procédé comprend au moins la succession des étapes suivantes :

- solubilisation de poudre d'Eucheuma co††oniien solution aqueuse,

- hydrolyse des carbohydrates,

- séparation des phases soluble et insoluble, pour récupérer la phase soluble,

- f iltration et récupération du filtrat,

- concentration de la fraction active contenant des galactanes linéaires,

- f iltration,

- f iltration stérilisante.

Des étapes de désodorisation et de décoloration peuvent être ajoutées.

Les paramètres des différentes étapes doivent être ajustés afin d'obtenir des principes actifs comprenant des galactanes linéaires, préférentiellement des galactanes linéaires de degré de polymérisation principalement compris entre 6 et 18.

Le procédé d'obtention selon l'invention, notamment l'hydrolyse des carbohydrates réalisée, est réalisé pour permettre d'éliminer les carbohydrates sulfatés présents naturellement dans l'algue. COMPOSITIONS COSMÉTIQUES ET PROCÈDE COSMÉTIQUE DE SOIN DE LA PEAU

La présente invention couvre aussi les compositions cosmétiques incluant des galactanes linéaires obtenus à partir d'Eucheuma cottonii ou un hydrolysat d'Eucheuma cottonii comprenant des galactanes linéaires, dans différentes formes galéniques, adaptées à l'administration par voie topique cutanée.

Ces compositions peuvent se présenter notamment sous forme d'émulsions huile- dans-eau, émulsions eau-dans-huile, émulsions multiples (Eau/Huile/Eau ou Huile/Eau/Huile) qui peuvent être éventuellement des microémulsions ou des nanoémulsions, ou sous forme de solutions, suspensions, hydrodispersions, gels aqueux ou poudres. Elles peuvent être plus ou moins fluides et avoir l'aspect d'une crème, d'une lotion, d'un lait, d'un sérum, d'une pommade, d'un gel, d'une pâte ou d'une mousse, ou sous forme solide.

Il peut s'agir de compositions comprenant entre 0,01 et 3% de principe(s) obtenu(s) à partir d'Eucheuma cottonii comprenan des galactanes linéaires selon la présente invention.

Ces compositions comprennent, outre l'actif, un milieu physiologiquement acceptable et de préférence cosmétiquement acceptable, c'est-à-dire qui ne provoque pas de sensations d'inconfort inacceptables pour l'utilisateur tels que des rougeurs, tiraillements ou picotements.

Les compositions selon l'invention peuvent contenir comme adjuvant au moins un composé choisi parmi :

- les huiles, qui peuvent être choisies notamment parmi les huiles de silicone, linéaires ou cycliques, volatiles ou non volatiles ;

- les cires, telles que l'ozokérite, la cire de polyéthylène, la cire d'abeille ou la cire de carnauba ;

- les élastomères de silicone,

- les tensioactifs, de préférence émulsionnants, qu'ils soient non ioniques, anioniques, cationiques ou amphotères ; - les co-†ensioac†ifs, tels que les alcools gras linéaires ;

- les épaississants et/ou gélifiants,

- les humectants, tels que les polyols comme la glycérine ;

- les filtres organiques,

- les filtres inorganiques,

- les colorants, les conservateurs, les charges,

- les tenseurs,

- les séquestrants,

- les parfums,

- et leurs mélanges, sans que cette liste soit limitative.

Des exemples de tels adjuvants sont cités notamment dans le Dictionnaire CTFA (International Cosmetic Ingrédient Dictionary and Handbook publié par le Personal Care Product Council).

Bien entendu, l'homme du métier veillera à choisir les éventuels composés complémentaires, actifs ou non-actifs, et leur quantité, de telle sorte que les propriétés avantageuses du mélange ne soient pas, ou sensiblement pas, altérées par l'adjonction envisagée.

Ces compositions sont notamment destinées à favoriser la protection du télosome et des télomères, en particulier à prévenir et/ou lutter contre les effets de l'âge sur la peau.

L'invention vise à cet effet un procédé cosmétique de soin de la peau humaine, destiné à prévenir et/ou lutter contre les effets de l'âge sur la peau, en particulier en favorisant la protection du télosome et des télomères, comprenant l'application topique d'une composition renfermant des galactanes linéaires non sulfatés obtenus à partir d'Eucheuma cottonii ou un hydrolysat d'Eucheuma cottonii comprenant galactanes linéaires selon la présente invention. EXEMPLES

Un exemple non limitatif de procédé d'obtention, de principe actif obtenu à partir d'Eucheuma cottonii contenant des galactanes linéaires, est présenté en suivant, ainsi que des exemples de composition incluant un tel principe actif.

Exemple 1 : procédé d'obtention du principe actif selon l'invention

Un exemple de procédé d'obtention d'un principe actif selon l'invention, comprend la mise en oeuvre des étapes suivantes :

- solubilisation de 50 g/1 de poudre d'Eucheuma cottonii en solution aqueuse, - hydrolyse des carbohydrates en milieu acide,

- séparation des phases soluble et insoluble, et récupération de la phase soluble,

- filtration de la phase soluble et récupération du filtrat contenant les galactanes linéaires de degré de polymérisation moyen inférieur à 45, - concentration de cette fraction active,

- filtration,

- filtration stérilisante.

Le principe actif obtenu présente les caractéristiques suivantes :

- aspect : liquide limpide

- couleur : jaune clair

- teneur en matières sèches :52,7g/l

- pH : 3,6

- teneur en sucres totaux : 38,7g/l, soit 73,5% en poids par rapport à la matière sèche, dont 78% sous forme de galactanes linéaires

- teneur en carbohydrates sulfatés : 0,22g/l, soit moins de 1% des carbohydrates du principe actif

- teneur en cendres : 17,1%

- teneur en acides uroniques : 9,4% Exemple 2 : utilisation d'un principe actif selon l'invention dans une crème de nuit

Phase A. Eau QSP 100%

Glycérol 4,9%

Phase B. Cire de Lanol CTO (Seppic) 6%

DUB k& AE (Stéarinerie DUBOIS) 4,2%

Montanov 202 (Seppic) 4%

Montanov 68 (Seppic) 4%

DUB Vinyl (Stéarinerie DUBOIS) 1,4%

DUB PTIS (Stéarinerie DUBOIS) 2%

Lanol 2681 (Seppic) 2%

Phase C. DC 73 101 (Dow Corning) 5,4%

Silicone Microcare M1600 (Thor) 4%

Phase D. Principe actif selon l'invention (exemple 1 ) 3%

Conservateur 0,7% Les quantités indiquées sont données en pourcentage de poids.

Cette émulsion siliconée épaisse, fondante, blanche présente un pH de 6,8. En application topique sur la peau, elle présente une pénétration rapide avec un fini doux.

Elle peut être obtenue par la mise en oeuvre des étapes suivantes :

- mélanger A, chauffer au bain-marie à 80°C sous agitation mécanique,

- mélanger B, chauffer au bain-marie à 80°C sous agitation mécanique,

- émulsionner B dans A sous rotor sator à 1100 tours/min,

- mélanger C, chauffer au bain-marie à 50°C, et ajouter C à l'émulsion lorsqu'elle atteint 60°C, sous rotor sator à 1200 tours/min,

- A 30°C, ajouter D, dans l'ordre indiqué, sous rotor stator à 1500 tours/minute, et

- laisser refroidir en abaissant régulièrement la vitesse d'agitation du rotor sator et ce, jusqu'à complète homogénéisation de l'émulsion. Exemple 3 : utilisation d'un principe actif selon l'invention dans une crème de jour

Phase A. Eau QSP 100%

Carbopol Ultrez 20 (Novéon) 0,2%

Phase B. itaphyl ICS (Rita) 2%

DUB Vinyl (Stéarinerie DUBOIS) 1,4%

Alcool Cetearyl 2%

DUB BA (Stéarinerie DUBOIS) 1,4%

Pelemol 2014 (Phoenix chemical) 2%

Phase C. Conservateur 0,7 %

Principe actif selon l'invention (exemple 1) 3%

Phase D. NaOH qsp pH 6

Les quantités indiquées sont données en pourcentage de poids.

Ce gel émulsionné onctueux blanc présente un pH de 6. En application topique, il présente une application veloutée avec un fini doux et un effet poudré.

II peut être obtenu par la mise en oeuvre des étapes suivantes :

- mélanger A, chauffer au bain-marie à 80°C sous agitation mécanique en veillant à bien disperser le gel,

- mélanger B, chauffer au bain-marie à 80°C sous agitation mécanique,

- émulsionner B dans A sous rotor sator à 3600 tours/min,

- A 40°C, ajouter C, dans l'ordre indiqué, sous rotor stator à 3000 tours/minute,

- laisser refroidir,

- A 30°C, ajuster le pH avec D, sous agitation mécanique à 1800 tours/minute et laisser agiter jusqu'à complète homogénéisation du gel émulsionné.

Exemple 4 : utilisation d'un principe actif selon l'invention dans un fluide nettoyant Phase A. Eau QSP 100%

Glycérol 3,7% Satialgine US551 (Degussa) 0,7% Phase B. Montanov 68 (Seppic) 2,5%

Pelemol BB (Phoenix Chemical) 2,7%

Pelemol 2014 (Phoenix Chemical) 3,7%

Montanov S (Seppic) 3%

Sophiderm (Sophim) 3,4%

DUB MCT 5545 (Stéarinerie Dubois) 3,2%

DUB OK 18 (Stéarinerie Dubois) 4%

DUB IPP (Stéarinerie Dubois) 4%

Phase C. Conservateur 0,7%

Principe actif selon l'invention (exemple 1) 3%

Les quantités indiquées sont données en pourcentage de poids.

Cette émulsion fluide, blanche présente un pH de 6,8. Elle s'émulsionne facilement à l'eau, sous forme de mousse douce et fine, avec un fini sec.

Il peut être obtenu par la mise en oeuvre des étapes suivantes :

- mélanger A, disperser le gel au bain-marie à 80°C, sous agitation mécanique à 1000 tours/minute,

- mélanger B, chauffer au bain-marie à 80°C, sous agitation magnétique,

- émulsionner B dans A, sous rotor-sator à 1800 tours/minute,

- chauffer A à 60°C sous agitation mécanique à 1000 tours/minute, - laisser sous agitation jusqu'à complet refroidissement.

Exemple 5 : utilisation d'un principe actif selon l'invention dans un sérum anti-rides

Phase A. Eau QSP 100%

Glycérol 3%

Blanose 7M31CF (Hercules) 1% Phase B. DUB 1632 (Stéarinerie Dubois) 6,9%

DUB PTCC (Stéarinerie Dubois) 3%

Huile de palme raffinée (Sictia) 2,7%

DUB 340 (Stéarinerie Dubois) 2,7% DC 9040 (Dow Corning) 3,7% i†a 6MS (Ri†a) 2%

Montanov 14 (Seppic) 1,7%

Phase C. Conservateur 0,7%

Principe actif selon l'invention (exemple 1) 3%

Les quantités indiquées sont données en pourcentage de poids.

Cette émulsion gel fluide blanche présente un pH de 5,5. En application topique, elle présente un étalement confortable avec un fini cotonneux légèrement f ilmogene. Elle peut être obtenue par la mise en oeuvre des étapes suivantes :

- mélanger A, chauffer au bain marie à 80°C, sous agitation mécanique en veillant à bien disperser le gel (environ 800 tours/minute),

- mélanger B, chauffer au bain-marie à 80°C sous agitation magnétique,

- émulsionner B dans A sous rotor stator à 1100 tours/min,

- ajouter C, aussitôt dans l'ordre indiqué sous rotor stator à 3000 tours/min,

- laisser refroidir sous agitation jusqu'à complète homogénéisation.

Exemple 6 : utilisation d'un principe actif selon l'invention dans une émulsion antirides

Phase A. Eau QSP 100%

Phase B. Lanol 99 (SEPPIC) 5%

Montanov 202 (SEPPIC) 3%

Montanov 68 (SEPPIC) 2%

Phase C. Conservateur 0,7%

Phase D Sepigel 305 (SEPPIC) 0,3%

Phase E Principe actif selon l'invention (exemple 1) 3%

Les quantités indiquées sont données en pourcentage de poids.

Cette émulsion fluide blanche présente un pH de 6,8.

Elle peut être obtenue par la mise en oeuvre des étapes suivantes : - mélanger A, chauffer au bain marie à 80°C, sous agitation mécanique en veillant à bien disperser I emulsion (environ 800 tours/minute),

- mélanger B, chauffer au bain-marie à 80°C sous agitation magnétique,

- émulsionner A dans B sous rotor stator entre 2000 et 5000 tours/min, - à 50°C, ajouter C, puis D toujours sous rotor sator,

- à 30°C, ajouter E, homogénéiser jusqu'à refroidissement complet

EVALUATION Ε L'EFFICACITE COSMETIQUE C>'UN PRINCIPE ACTIF SELON L'INVENTION A. Tests in vitro

I. Etude de l'effet sur la protection des télomères - Etude de l'expression des molécules du télosome POT1 et TPPl

Le premier but de l'étude est d'évaluer l'expression des deux protéines majeures du télosome responsables de la protection des télomères POT1 (« Protection Of telomeres » Protection des Télomères) et TPPl (« PTOl and TIN2-interacting protein » protéine interagissant avec PTOl et TTN2) dans des f ibroblastes humains sénescents obtenus à la suite d'une agression modérée et répétée avec du peroxyde d'hydrogène (H ₂ O ₂ ) en comparaison avec des f ibroblastes humains normaux.

Le second but de l'étude est d'évaluer la capacité d'un principe actif obtenu à partir d'Eucheuma cottonii comprenant des galactanes linéaires, à limiter l'expression de PTOl et TPPl de f ibroblastes humains normaux agressés par le même traitement au peroxyde d'hydrogène.

L'étude a été réalisée par PC quantitative sur des f ibroblastes humains.

Le protocole opératoire décrit en suivant.

A JO les f ibroblastes humains normaux sont ensemencés dans du milieu complet. Les cellules sont ensuite incubées à 37°C.

A Jl, J2, J3 et J4, les f ibroblastes sont traités :

- Témoins non agressés : les f ibroblastes normaux sont traités dans du milieu complet pendant 2 heures, en présence ou absence du principe actif de l'exemple 1 à 0,25% (V/V), et à la fin de l'incubation, le milieu de culture est éliminé et remplacé par du milieu contenant ou non le principe actif de l'exemple 1 à 0,25% (V/V),

- Témoin agressé : les f ibroblastes normaux sont agressés dans du milieu complet avec une solution H2O2 pendant 2 heures. L'agression répé ée 4 fois (Jl, J2, J3 et J4) permet d'induire l'état sénescent cellulaire. Ce sont donc des f ibroblastes sénescerûs.

- Fibroblastes agressés et traités : les f ibroblastes humains normaux sont agressés et traités dans du milieu de culture complet avec une solution de H ₂ O ₂ pendant 2 heures en présence ou absence du principe actif selon l'exemple 1 à 0,25% et 0,50%. A la fin de l'incubation, le milieu de culture est éliminé et remplacé par du milieu contenant ou non le principe actif de l'exemple 1 à 0,25% et 0,50% (V/V).

A J4, les cellules sont récupérées et les ARN totaux extraits. Les ARN sont reverse-transcripts et les ADN complémentaires obtenus analysés par PCR quantitative (Réaction en Chaîne par Polymérase quantitative).

La quantification de l'incorporation de fluorescence est mesurée en continu à l'aide d'un thermocycleur et la quantification relative est réalisée à l'aide d'un logiciel. Les résultats obtenus pour la protéine POTl sont présentés dans le tableau ci-après

Capacité à limiter la

Expression de

perte d'expression POTl (%)

de POTl (%)

Témoin non agressé non traité -

100 /

Fibroblastes normaux

Témoin non agressé et traité - Fibroblastes normaux traités avec le 96 /

principe actif selon l'invention 0,25%

Témoin agressé non traité -

68 0

Fibroblastes sénescents

Fibroblastes agressés et traités

90 +69

Principe actif selon l'invention 0,25%

Fibroblastes agressés et traités

100 +100 Principe actif selon l'invention 0,50% Les résultats obtenus pour la protéine TPP1 sont présentés dans le tableau ci- après :

Ces résultats montrent que les expressions des protéines du télosome POTl et TPP1 sont signif icativement réduites sur les fibroblastes humains sénescents par rapport à celles de fibroblastes humains normaux.

On constate par ailleurs qu'un principe actif obtenu à partir d'Eucheuma coffonii comprenant des galactanes linéaires permet de limiter l'altération des expressions de POTl et TPP1, protéines essentielles du télosome.

Il empêche l'érosion accélérée des télomères, induite par le stress, et freine le passage prématuré des fibroblastes en sénescence.

En particulier testé à 0,5%, le principe actif de l'exemple 1 permet de limiter de 100% l'altération de l'expression de POTl et de 89% l'altération de l'expression de TPPl.

II. Etude de l'effet sur la longueur des télomères

Cette deuxième étude a pour but d'évaluer la capacité d'un principe actif contenant des galactanes linéaires obtenus à partir d'Eucheuma cottonii a limiter l'accélération de l'érosion des télomères induite par un stress répété. L'étude a été réalisée par cytométrie de flux sur des fibroblastes humains pré- sénescents obtenus à la suite d'un traitement modéré et répété avec du peroxyde d'hydrogène (H2O2), selon le protocole opératoire décrit en suivant. A JO les fibroblastes humains normaux sont ensemencés dans du milieu complet. Les cellules sont ensuite incubées à 37°C.

A Jl, J2, J3 et J4, les fibroblastes sont traités :

- Témoins non agressés : les fibroblastes normaux sont traités dans du milieu complet pendant 2 heures, en présence ou absence du principe actif de l'exemple 1 à 0,25% (V/V), et à la fin de l'incubation, le milieu de culture est éliminé et remplacé par du milieu contenant ou non le principe actif de l'exemple 1 à 0,25% (V/V),

- Témoin agressé : les fibroblastes normaux sont agressés dans du milieu complet avec une solution H2O2 pendant 2 heures. L'agression répétée 4 fois (Jl, J2, J3 et J4) permet d'induire l'état sénescent cellulaire. Ce sont donc des fibroblastes sénescents.

- Fibroblastes agressés et traités : les fibroblastes humains normaux sont agressés et traités dans du milieu de culture complet avec une solution de H2O2 pendant 2 heures en présence ou absence du principe actif selon l'exemple 1 à 0,25% et 0,50%. A la fin de l'incubation, le milieu de culture est éliminé et remplacé par du milieu contenant ou non le principe actif de l'exemple 1 à 0,25% et 0,50% (V/V).

A J7, la longueur des télomères est quantifiée à l'aide d'un kit dédié.

Les résultats obtenus sont présentés en suivant : Longueur des Capacité à limiter le télomères relative raccourcissement (%) des télomères (%)

Témoin non agressé non traité -

17,3 /

Fibroblastes normaux

Témoin non agressé et traité - Fibroblastes normaux traités avec le 16,3 /

principe actif selon l'invention 0,25%

Témoin agressé non traité -

15 0

Fibroblastes sénescerûs

Fibroblastes agressés et traités

15,6 +26

Principe actif selon l'invention 0,25%

Fibroblastes agressés et traités

16,5 +65

Principe actif selon l'invention 0,50%

Ces résultats permettent dans un premier temps de montrer que le raccourcissement des télomères est accéléré sur fibroblastes sénescerûs par rapport à des fibroblastes normaux.

De plus, ils montrent qu'un principe actif obtenu à partir d'Eucheuma coffonii comprenant des galactanes linéaires permet de limiter l'accélération du raccourcissement des télomères induit par un s\ress. En particulier testé à 0,5%, le principe actif de l'exemple 1 permet de réduire de 65% l'accélération du raccourcissement des télomères induit par le s\ress.

III. Etude de l'effet sur le maintien du potentiel réplicatif cellulaire L'objectif de cette étude est d'évaluer l'augmentation de l'activité de la β- galactosidase, marqueur du passage prématuré des cellules en sénescence, dans les fibroblastes humains sénescen^s par rapport aux fibroblastes humains normaux.

Elle permet aussi d'évaluer la capacité d'un principe actif obtenu à partir d'Eucheuma cottonii contenant des galactanes linéaires à préserver le potentiel réplicatif des cellules en limitant leur passage en sénescence. L'étude a été réalisée par coloration de la β-galactosidase sur des fibroblastes humains.

Le protocole opératoire de l'étude est décrit en suivant.

A JO les fibroblastes humains normaux sont ensemencés dans du milieu complet. Les cellules sont ensuite incubées à 37°C.

A Jl, J2, J3 et J4, les fibroblastes sont traités :

- Témoins non agressés : les fibroblastes normaux sont traités dans du milieu complet pendant 2 heures, en présence ou absence du principe actif de l'exemple 1 à 0,25% (V/V), et à la fin de l'incubation, le milieu de culture est éliminé et remplacé par du milieu contenant ou non le principe actif de l'exemple 1 à 0,25% (V/V),

- Témoin agressé : les fibroblastes normaux sont agressés dans du milieu complet avec une solution H2O2 pendant 2 heures. L'agression répé ée 4 fois (Jl, J2, J3 et J4) permet d'induire l'état sénescent cellulaire. Ce sont donc des fibroblastes sénescents.

- Fibroblastes agressés et traités : les fibroblastes humains normaux sont agressés et traités dans du milieu de culture complet avec une solution de H2O2 pendant 2 heures en présence ou absence du principe actif selon l'exemple 1 à 0,25% et 0,50%. A la fin de l'incubation, le milieu de culture est éliminé et remplacé par du milieu contenant ou non le principe actif de l'exemple 1 à 0,25% et 0,50% (V/V).

A J7, l'activité β-galactosidase est visualisée à l'aide d'un kit dédié. La visualisation de l'activité de la β-galactosidase est réalisée sur microscope couplé à un système d'analyse d'images. L'activité de la β-galactosidase est proportionnelle à la coloration bleu foncé. Une analyse quantitative des images est également réalisée à l'aide d'un logiciel.

Les résultats obtenus sont présentés en suivant : Activité Capacité à limiter le β-galactosidase passage en

(10 ³ x UA) sénescence (%)

Témoin non agressé non traité - 40 /

Fibroblastes normaux

Témoin non agressé et traité - Fibroblastes normaux traités avec le 49 /

principe actif selon l'invention 0,25%

Témoin agressé non traité - 317 0

Fibroblastes sénescerûs

Fibroblastes agressés et traités 180 +49

Principe actif selon l'invention 0,25%

Fibroblastes agressés et traités 144 +62

Principe actif selon l'invention 0,50%

Ces résultats montrent que l'activité de la β-galactosidase est augmentée sur fibroblastes humains passant en sénescence.

On constate également qu'un principe actif obtenu à partir d'Eucheuma cottonii contenant des galactanes linéaires testé à 0,5% permet de limiter le passage prématuré des fibroblastes en sénescence de 62% et préserver ainsi leur potentiel réplicatif .

B. Tests in vivo

IV. Etude de l'effet sur la matrice dermique

On sait qu'avec l'âge, des changements fondamentaux de la matrice extracellulaire se produisent conduisant à une détérioration du réseau de collagène, qui se traduit par une désorganisation des fibres, une structure plus grossière et une réduction de la densité de collagène.

Cette étude a pour but d'évaluer in vivo la capacité d'un principe actif obtenu à partir d'Eucheuma cottonii contenant des galactanes linéaires, formulé à 3% en émulsion, à favoriser la restructuration de la matrice dermique désorganisée avec l'âge. L'étude a été réalisée contre placebo, au niveau des joues, sur deux groupes de volontaires sains de sexe féminin : - un groupe traité avec une émulsion placebo : 21 volontaires d age moyen 59 ans

- un groupe traité avec la composition de l'exemple 6 comprenant le principe actif de l'exemple 1 en émulsion à 3% : 24 volontaires d'âge moyen 59 ans. Les mesures d'acquisition du réseau de fibres au niveau des joues ont été réalisées à partir de coupes, à l'aide d'un microscope confocal, équipé de 3 diodes laser. Pour l'observation du derme papillaire et l'évaluation des fibres de collagène, la longueur d'onde de 785 nm a été choisie.

L'analyse visuelle des images a été réalisée à l'aide d'une échelle de score comprenant 4 stades par un jury entraîné. Lors de son évaluation, le jury prend en compte à la fois l'aspect de la matrice dermique en général et celui des fibres. Lorsque la matrice dermique n'est pas altérée, les fibres apparaissent sous forme de structures f ibrillaires brillantes et allongées disposées à la façon d'une toile d'araignée. L'observation d'une peau âgée ou de zones photoexposées montrent à l'inverse, une matrice composée de fibres épaisses, grossièrement disposées, recroquevillées et fragmentées, présentant un aspect spongieux.

L'échelle suivante illustre la classification utilisée par le jury :

Le protocole opératoire de l'étude est décrit en suivant.

Entre J-14 et JO, les volontaires s'appliquent deux fois par jour une crème placebo sur le visage.

A JO, les volontaires n'appliquent aucune crème ou maquillage sur le visage, et on réalise des acquisitions par microscopie confocale au niveau des joues. Entre JO et J41, on applique deux fois par jour le placebo ou I emulsion contenant le principe actif de l'exemple 1 à 3%.

A J42, les volontaires n'appliquent aucune crème ou maquillage sur le visage, et on réalise à nouveau des acquisitions par microscopie confocale au niveau des joues.

La moyenne des résultats obtenus est présentée dans le tableau ci-dessous :

On constate que dans les conditions de cette étude, après 42 jours d'applications biquotidiennes d'un principe actif obtenu à partir d'Eucheuma cottonii comprenant des galactanes linéaires et en comparaison au groupe placebo, l'évaluation réalisée sur échelle de grade par un jury d'expert a montré une amélioration significative de l'aspect de la matrice dermique de 30,6%.

V. Etude de l'effet anti-rides

L'apparition des rides est un des premiers signes visibles du vieillissement cutané qui peut être, au moins en partie, dû au raccourcissement de la longueur des télomères lié à l'âge. En effet, la longueur des télomères peut être utilisée comme indicateur du potentiel réplicatif des cellules et ainsi être associée au vieillissement.

L'objectif de l'étude est d'évaluer in vivo l'effet anti-rides d'un principe actif obtenu à partir d'Eucheuma cottonii comprenant des galactanes linéaires formulé à 3% en émulsion contre placebo au niveau des pattes d'oie par projection de franges.

L'étude a été réalisée contre placebo, au niveau des joues, sur deux groupes de volontaires sains de sexe féminin : - un groupe traité avec une émulsion placebo : 21 volontaires d age moyen 59 ans

- un groupe traité avec le principe actif de l'exemple 1 en émulsion à 3% (composition de l'exemple 6): 24 volontaires d'âge moyen 59 ans.

Les acquisitions au niveau des pattes d'oie ont été réalisées à l'aide d'un appareil à projection de franges dédié à la mesure 3D du relief cutané. Ce système comprend un capteur de mesure associant un projecteur de franges lumineuses et une caméra CCD haute résolution reliée à un logiciel d'acquisition.

Les paramètres pertinents retenus pour l'étude sont :

- des paramètres de rugosité en 3D :

o Sq : moyenne quadratique de rugosité de surface

o Sa : moyenne arithmétique de rugosité de surface

- Un paramètre de volume :

o Volume négatif : volume inférieur à la surface de la peau

Une diminution de ces différents paramètres est caractéristique d'une amélioration du relief de la surface étudiée et d'une diminution des rides.

Le protocole opératoire de l'étude est décrit en suivant.

Entre J-14 et JO, les volontaires s'appliquent deux fois par jour une crème placebo sur le visage.

A JO, les volontaires n'appliquent aucune crème ou maquillage sur le visage, et on réalise des acquisitions en 3D de la patte d'oie par projection de franges.

Entre JO et J41, on applique deux fois par jour le placebo ou l 'émulsion contenant 3% du principe actif de l'exemple 1.

A J42, les volontaires n'appliquent aucune crème ou maquillage sur le visage, et on réalise à nouveau des acquisitions en 3D de la patte d'oie par projection de franges. La moyenne des résultats obtenus avec le principe actif selon l'invention est présentée dans le tableau ci-dessous en pourcentage de variation en comparaison aux résultats obtenus avec le placebo :

On constate que, dans les conditions de cette étude, après 42 jours d'applications biquotidiennes et en comparaison au placebo, un principe actif obtenu à partir d'Eucheuma cottonii comprenant des galactanes linéaires permet :

- de lisser le relief cutané au niveau des pattes d'oie (réduction des paramètres Sa et Sq), et

- de réduire les rides (réduction du paramètre volume négatif).

En particulier, le principe actif de l'exemple 1 formulé à 3% en émulsion, en comparaison au placebo, permet de diminuer de 8,9% le paramètre Sa, de 11,0% le paramètre Sq et de 27,9% le paramètre volume négatif.

Ces différentes études montrent bien que l'utilisation sur la peau d'un principe actif obtenus à partir d'Eucheuma cottonii comprenant des galactanes linéaires, est capable de favoriser la protection du télosome et des télomères des cellules de la peau et permet ainsi de prévenir et/ou lutter contre les signes du vieillissement de la peau, tels que l'apparition des rides.