Zytostatika

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Acylhydrazonen, die die Entwicklung einer Tumorresistenz gegenüber Zytostatika bei einer Krebschemotherapie abschwächen bzw. unterbinden, wobei der Wirkstoff gleichzeitig zu der üblichen Chemotherapie verabreicht wird, um das Enzym Glutathion-Peroxidase der Krebszellen zu inhibieren und die Krebszellen gegen schädlichen oxidativen Stress empfindlich zu machen.

Stand der Technik

Krebserkrankungen, beispielsweise Lymphome, können erfolgreich mit Hilfe von Zytostatika (z. B. Cisplatin, Carboplatin, Oxaliplatin, Etoposid, Methotrexat, 5-Fluoruracil, Bortezomib, Doxorubicin, Bleomycin, Paclitaxel, Vincristin, Cyclophosphamid, Melphalan, Imatinib, Erlotinib) behandelt werden. Häufig sind solche Chemotherapien aber erfolglos, weil die Tumorzellen entweder von vornherein nicht empfindlich auf das Zytostatikum reagieren und nach der Therapie weiter wachsen (intrinsische Resistenz) oder sie reagieren zuerst empfindlich, adaptieren sich aber während der Therapie (angenommene Resistenz) und umgehen die schädlichen Effekte des Zytostatikums. In dem zweiten Fall wird sogar zuerst eine klinische Remission des Tumors beobachtet. Nach einiger Zeit fängt der Tumor wieder an zu wachsen und spricht nicht mehr auf die ursprüngliche Therapie an. In diesem Fall versucht man den Tumor mit anderen Zytostatika zu behandeln, aber oft ohne Erfolg, da der Tumor nun gegenüber einer Vielzahl an Antitumormitteln resistent geworden ist. Es hat sich eine so genannte„Multi-Drug-Resistance" entwickelt.

Verschiedene Mechanismen für Multi-Drug-Resistance sind inzwischen bekannt. Die Krebszellen können häufig das Ausschleusen des Zytostatikums durch eine Überexpression von Wirkstoff-Transporter-Proteinen (z. B. P-Glykoprotein oder Multidrug resistance- associated proteins) beschleunigen, um die intrazelluläre Konzentration des Zytostatikums gering zu halten. ¹ Vor allem fettlösliche (lipophile) Naturstoffe und wasserlösliche (hydrophile) Antimetabolite werden durch diesen Transporter erkannt und aus den Krebszellen heraustransportiert. Krebszellen können auch wichtige intrazelluläre Signalwege für die Zellteilung (Mitose) und den Zelltod (Apoptose) neu regulieren, um die schädlichen Effekte des Zytostakikums zu umgehen. Eine wichtige Mutation in den Signalwegen von Krebszellen findet bei dem Transkriptionsfaktor p53 statt, der sehr häufig in Tumoren vorkommt. ² Solche Tumore, die ein mutiertes p53-Gen besitzen, sind gegenüber einer Vielzahl von Zytostatika resistent. ³

Neue Ergebnisse schreiben dem Wasserstoffperoxid (H ₂ 0 ₂ ) als intrazellulärem Botenmolekül eine wichtige Rolle für die Einleitung des programmierten Zelltodes (Apoptose) zu. ^4,5 Zellen, die einem erhöhten oxidativen Stress in Zusammenhang mit intrazellulären reaktiven Sauerstoffspezies (u. a. H ₂ 0 ₂ ) ausgesetzt sind, sind für Apoptose anfällig. ⁶ Durch die Oxidation von wichtigen Signalproteinen wie z. B. Protein-Tyrosin-Phosphatasen, Kinasen und Transkriptionsfaktoren kann H ₂ 0 ₂ die Signalwege für Apoptose auslösen, die zum Zelltod führen. ^7,8 Es gibt vermehrt Hinweise darauf, dass auch eine Behandlung mit Zytostatika unterschiedlicher Wirkmechanismen zu einer Erhöhung der intrazellulären H ₂ 0 ₂ - Konzentrationen bei Krebszellen führen kann. ⁹

Die intrazelluläre Konzentration von H ₂ 0 ₂ wird durch verschiedene Enzyme reguliert, die das Molekül abbauen und die Zelle vor der Apoptose schützen. Wchtige Enzyme für den Abbau von H ₂ 0 ₂ sind Katalase, Thioredoxin-Peroxidase und Glutathion- Peroxidase (GPx). Während Katalase die Zellen vor sehr hohen, pathologischen Konzentrationen von H ₂ 0 ₂ schützt, bauen die beiden Peroxidasen H ₂ 0 ₂ bei niedrigeren Konzentrationen ab und dienen deswegen vorwiegend als Regulatoren von Zellsignalübertragungen.

In manchen Krebszellen, die resistent gegenüber verschiedenen Zytostatika geworden sind, findet man eine erhöhte Enzymaktivität bzw. Enzymexpression von GPx. ¹⁰ ' ^{11 ,12,13,14} ES wird vermutet, dass diese erhöhte Enzymaktivität bei der Entstehung von Resistenzen eine wichtige Rolle spielt. Eine mit dem Katalase-Gen transfiztierte MCF-7-Brustkrebszelllinie, die aber 40 % weniger GPx1 exprimierte hat als die native Linie, war im Vergleich zur nativen signifikant empfindlicher gegenüber Paclitaxel, Etoposid und As ₂ 0 ₃ . ¹⁵

Sieben Isoformen der Glutathion-Peroxidase (GPx) sind bekannt. Fünf der humane GPx sind Selenoproteine. Sie benötigen einen Selenocystein-Rest im Aktivzentrum des Enzyms, um H ₂ 0 ₂ bzw. organische Peroxide abzubauen. ¹⁶ Die GPx-lsoform mit der höchsten zellulären Aktivität ist die Isoform 1 (GPx1). Für die Rinder- und humane GPx1 ist die Röntgenkristallstruktur bekannt. ¹⁷ Hemmstoffe der GPx1 könnten therapeutisch nützlich sein, um der vermehrten Expression von GPx während einer Therapie mit Zytostatika entgegenzuwirken und so die Resistenzentwicklung zu unterbinden. Probleme und Mängel des Standes der Technik

Ein GPx-lnhibitor soll chemisch stabil sein, um als Arzneistoff dienen zu können. Er soll selektiv und reversibel die GPx inhibieren und ein günstiges pharmakokinetisches Profil aufweisen.

Es gibt bis jetzt keine geeigneten GPx-lnhibitoren, die als Arzneistoffe für eine therapeutische Anwendung in der Kombination mit Zytostatika in Frage kämen. Die bisher beschriebenen GPx-lnhibitoren, wie z. B. Mercaptosuccinat, ¹⁸ Gold(l)-Thioglucose ¹⁹ und Auranofin, ²⁰ inhibieren das Enzym stark aber hemmen unspezifisch andere Thiol- und Seleno-Enzyme. Darüber hinaus besitzen sie auf Grund ihrer chemisch-reaktiven Eigenschaften eine ungünstige Pharmakokinetik und eine relativ hohe Toxizität, z. B. werden durch die Gold-Verbindungen Nierenschäden und gastrointestinale Störungen verursacht. ²¹ Bisher ist nur von einem chemisch stabilen Inhibitor, Misonidazol, berichtet worden, allerdings zeigte er eine nur sehr schwache GPx-Hemmwirkung ²² und ist neurotoxisch in Menschen. ²³

Das der Erfindung zugrundeliegende technische Problem war somit die Bereitstellung von GPx-lnhibitoren, die als Arzneistoffe für eine therapeutische Anwendung in der Kombination mit Zytostatika eingesetzt werden können und die gegenüber den bekannten GPx-lnhibitoren verbesserte Eigenschaften hinsichtlich Toxizität, Stabilität etc. aufweisen.

Zur Findung von selektiven und kompetitiven Inhibitoren des GPx1-Enzyms wurde eine struktur-basierte Wirkstoff-Design-Strategie angewendet. Es wurde die Röntgenkristallstruktur der Rinder-GPX1 herangezogen ¹⁷ , um mit Hilfe von Molecular- Modeling Substanzen zu identifizieren, die theoretisch in dem Aktivzentrum des Enzyms binden können. Aus mehreren hunderttausend Substanzen, die in das Enzymaktivzentrum gedockt wurden, wurde etwa 20 Verbindungen identifiziert, die an das Enyzmaktivzentrum theoretisch gut binden konnten, chemisch stabil sind und Arzneistoffeigenschaften (lead-like) aufweisen. Die Substanzen wurden kommerziell bezogen oder selbst hergestellt und in einem Enzymtest an der Rindererythrozyten-GPX1 auf Hemmwirkung getestet.

Die auf diese Art und Weise gefundenen GPx-lnhibitoren wurden zusammen mit den exemplarischen Zytostatika Cisplatin, Methotrexat, Etoposid bzw. Bortezomib getestet, um zu prüfen, ob die Resistenz gegen diese Antitumormittel in humanen Krebszelllinien aufgehoben werden kann. Auf diesem Weg wurde die eingangs genannte Aufgabe gelöst durch die Verwendung von Acylhydrazonen und ihren pharmazeutisch verträglichen Salzen gemäß Anspruch 1. Bevorzugte Ausführungsformen sind in den abhängigen Ansprüchen wiedergegeben.

In anderen Worten wurde die Aufgabe gelöst durch die Verwendung von Acylhydrazonen und ihren pharmazeutisch verträglichen Salzen der allgemeinen Formel I,

Formel I worin

X , Y jeweils Stickstoff oder Kohlenstoff bedeuten, wobei wenn ein Rest X oder Y

Stickstoff ist, der jeweils andere Rest X oder Y Kohlenstoff ist;

R1 , R2 jeweils eine Hydroxylgruppe oder Wasserstoff bedeuten, wobei wenn ein

Rest R1 oder R2 eine Hydroxylgruppe ist, der jeweils andere Rest R1 , R2 Wasserstoff ist;

R3 Wasserstoff oder eine Methoxygruppe ist und

R4 eine Methylgruppe (wenn X Kohlenstoff ist) oder kein weiterer Substituent

(freies Elektronenpaar wenn X Stickstoff ist) ist,

zur Vermeidung der Ausbildung oder zur Aufhebung von Resistenzen von Tumoren gegen Zytostatika.

Eine Kombination mit X=Kohlenstoff und R4=kein weiterer Substituent, was in diesem Fall R4=Wasserstoff bedeuten würde, ist ausgeschlossen. Ebenfalls ausgeschlossen ist eine Kombination mit X=Stickstoff und R4=Methylgruppe.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden Acylhydrazone verwendet, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie der allgemeinen Formel II entsprechen, wobei X Kohlenstoff und

Y Stickstoff ist,

R1 , R2 jeweils eine Hydroxylgruppe oder Wasserstoff bedeuten, wobei wenn ein Rest

R1 oder R2 eine Hydroxylgruppe ist, der jeweils andere Rest R1 , R2 Wasserstoff ist;

R3 Wasserstoff ist und eine Met

Formel II

Ein bevorzugtes Acylhydrazon der allgemeinen Formel II ist dadurch gekennzeichnet, dass X Kohlenstoff und Y Stickstoff ist, R1 Wasserstoff und R2 eine Hydroxylgruppe ist, R3 Wasserstoff ist und R4 dung 5):

Formel III

Gleichfalls ist als Acylhydrazon der allgemeinen Formel II ein Acylhydrazon bevorzugt, das dadurch gekennzeichnet ist, dass X Kohlenstoff und Y Stickstoff ist, R1 eine Hydroxylgruppe und R2 Wasserstoff ist, R3 Wasserstoff ist und R4 eine Methylgruppe ist (Formel IV / Verbindung 6):

Formel IV

Ein weiteres bevorzugtes Acylhydrazon der allgemeinen Formel I ist dadurch gekennzeichnet, dass X Stickstoff und Y Kohlenstoff ist, R1 Wasserstoff und R2 eine Hydroxylgruppe ist, sowie R3 eine Methoxygruppe ist und kein weiterer Substituent R4 am Stickstoff vorhanden ist, d.h. dass am Stickstoff ein freies Elektronenpaar vorliegt (Formel V / Verbindung 7):

(7)

Formel V Das Acylhydrazon A/'-(4-Hydroxybenzyliden)-2-(2-methyl-1 /-/-imidazol-1-yl)essig-säure- hydrazid (5) sowie die Derivate 6 und 7 wurden mit Hilfe des Molecular-Modelings (AutoDock 4) als mögliche GPx1-lnhibitoren identifiziert. Die synthetisierten Substanzen zeigten bei 50 μΜ in dem GPx-Hemmassay mit Rindererythrozythen-GPx1 signifikante Inhibition. In Zellkultur hoben die Substanzen bei einer Konzentration von 25 μΜ die Resistenz gegen Cisplatin, Methotrexat, Etoposid bzw. Bortezomib in zwei humanen B-Zelllymphomen fast vollständig auf.

Vorzugsweise werden die Acylhydrazone zur Vermeidung der Ausbildung oder zur Aufhebung von Resistenzen von Tumoren gegen Zytostatika derart verwendet, dass sie in Kombination mit Zytostatika eingesetzt werden.

Besonders bevorzugt werden die Acylhydrazone vor und/oder während einer Zytostatika- Behandlung eingesetzt. Dies bedeutet, dass sie während einer Chemotherapie, aber auch ggf. zusätzlich vorbeugend vorab, verabreicht werden können.

Die Zytostatika, bei denen sie zur Vermeidung der Ausbildung oder zur Aufhebung von Resistenzen von Tumoren gegen Zytostatika eingesetzt werden, sind vorzugsweise ausgewählt aus Cisplatin, Carboplatin, Oxaliplatin, Etoposid, Methotrexat, 5-Fluoruracil, Bortezomib, Doxorubicin, Bleomycin, Paclitaxel, Vincristin, Cyclophosphamid, Melphalan, Imatinib, Erlotinib besonders bevorzugt aus Cisplatin, Etoposid, Methotrexat, Bortezomib.

Die Tumore, bei denen die Acylhydrazone mit den Zytostatika Verwendung finden, sind vorzugsweise ausgewählt aus Lymphom, Leukämie, multiplem Myelom, Glioblastom, Bronchialkarzinom, Ovarialkarzinom, Ösophaguskarzinom, Sarkom, besonders bevorzugt Lymphom.

Biologische Testung

Bestimmung der Hemmwirkung mit dem GPx-Assay

Mit dem Glutathion-Peroxidase-Assay (GPx-Assay) wurde die inhibitorische Aktivität der Substanzen auf die Glutathion-Peroxidase nachgewiesen, wobei als Blindwert (0 % Enzymaktivität) der Absorptionsverlauf ohne GPx-Zugabe gemessen wurde. Mercaptosuccinat diente als Referenzinhibitor. ¹⁹ Fig. 1 zeigt repräsentative Ergebnisse für die Hemmung von Rinder-GPx mit Mercaptosuccinat und verschiedenen Konzentrationen der Verb. 5. Kontrollversuche haben gezeigt, das durch Verb. 5-7 die Glutathion-Reduktase bis zu einer Konzentration von 250 μΜ nicht gehemmt wird. Es konnte gezeigt werden, dass die Glutathion-Peroxidase, die durch Mercaptosuccinat vollständig gehemmt wird, auch durch die Verbindung 5 gut bis sehr gut (konzentrationsabhängig) gehemmt werden kann. Graphisch ist die konzentrationsabhängige Hemmung von Rinder-GPx durch 5 in Fig. 2 gezeigt. Näheres hierzu ist im experimentellen Teil unter den Punkten 2 (Biologische Testung) und 3 (Biologische Testergebnisse) zu finden. Vergleichbar gute Ergebnisse wurden für die Verbindungen 6 und 7 erzielt.

Bestimmung der Resistenz in B-Lymphom-Zeiien, behandelt mit verschiedenen Zytostatika und Testsubstanz

Zwei Nicht-Hodgkin B-Zell-Lymphom-Zelllinien (DOGUM und GUMBUS ²⁴ ) wurden durch Vorbehandlung mit den vier Zytostatika Methotrexat, Etopisid, Cisplatin oder Bortezomib resistent gemacht. Die Zellen sollen als resistent gelten, wenn der Quotient (Resistenzfaktor) aus dem IC ₅ o-Wert der behandelten Zellen und dem IC ₅ o-Wert der nativen Ausgangszellen mindestens 3 beträgt.

Zellen wurden entweder mit der jeweiligen Testsubstanz behandelt oder als unbehandelte Kontrolle nur mit dem Lösungsmittel DMSO. Des Weiteren wurden die mit Testsubstanz behandelten und nicht behandelten Zellen mit fünf steigenden Konzentrationen der Zytostatika Methotrexat, Etoposid, Cisplatin oder Bortezomib versetzt.

Fig. 3 zeigt eine repräsentative Dosis-Wrkungskurven für die native GUMBUS- und resistente GUMBUS-BOR-Linien, behandelt mit steigenden Konzentrationen an Bortezomib, mit und ohne eine Kombinationsbehandlung mit 25 μΜ 5. Die Kombination Bortezomib und 5 führt zu einem deutlichen Zuwachs der Wrkungsstärke gegenüber den Versuchen mit nur Bortezomib.

Die Ergebnisse zeigen eine deutliche Aufhebung der Zytostatika-Resistenz durch den GPx- Inhibtor 5 in den acht resistenten B-Lymphom-Zelllinien. Näheres hierzu ist im experimentellen Teil unter den Punkten 2 (Biologische Testung) und 3 (Biologische Testergebnisse) zu finden. Vergleichbar gute Ergebnisse wurden für die Verbindungen 6 und 7 erzielt. Beschreibung derAbbildungen

Fig. 1. zeigt repräsentative Ergebnisse des Hemmassays mit Rinder-GPx, behandelt mit

Mercaptosuccinat bzw. Verb. 5;

Fig. 2 zeigt die GPx-Hemmwirkung von 5 in Abhängigkeit von der Konzentration;

Fig. 3. zeigt die wachstumshemmende Wirkung von Bortezomib in nativen und

Bortezomib-resistenten GUMBUS-Zellen, mit und ohne Zugabe von 25 μΜ 5.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen näher beschrieben, ohne sie auf diese Beispiele zu beschränken.

Beispiele

1. Herstellung der GPx-lnhibitoren

1.1 2-(2-Methyl-1H-imidazol-1-yl)essigsäureethylester (1 )

Es werden erst 20.0 g 2-Methyl-1/-/-imidazol in 400 mL THF gelöst, dann 66.0 g Kalium- carbonat hinzugefügt und suspendiert. Anschließend werden 27.0 mL 2- Bromessigsäureethylester zugetropft und das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur 3 h lang gerührt. Anschließend filtriert man alle festen Bestandteile ab, wäscht den Rückstand mit 3 x 50 mL Dichlormethan und engt die erhaltene Lösung im Teilvakuum weitestgehend ein. Es bleibt ein schwach gelb gefärbtes Öl zurück, welches nach längerem Stehenlassen allmählich kristallisiert. Dieses wird mit Diethylether verrieben und anschließend filtriert. Der Rückstand wird mit 2 ^χ 50 mL kaltem Ether gewaschen, die vereinigten Etherphasen über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und dann am Rotationsverdampfer erst bei 800 mbar, sowie final an der Drehschieberpumpe bei < 10 ^"2 mbar vom Lösungsmittel befreit. Man erhält 17.2 g (42 %) der Titelverbindung als farbloses Öl.

DC-Kontrolle (mobile Phase: Dichlormethan/Methanol/konz. NH ₃ 93 : 7 : 0.5 (VA/); Detektion mit 1 % Co(NÖ ₃ ) ₂ in Methanol): R _f 0.29 (violett, 2-Methylimidazol), 0.55 (violett, Titelverbindung).

¹ H-NMR (DMSO-de, <5): 7.01 , 6.71 (2 d, 2 1 H, C(4)H und C(5)H, ³ J = 1.2 Hz), 4.87 (s, 2H, C(2)H ₂ ), 4.16 (q, 2H, C(7)H ₂ , ³ J = 7.2 Hz), 2.19 (s, 3H, C(6)H ₃ ), 1.21 ppm (t, 3H, C(8)H ₃ , ³ J = 7.2 Hz).

¹³ C-NMR (DMSO-de, <5): 168.4, 144.6, 126.2, 120.9, 61.1 , 46.7, 14.0, 12.4 ppm.

HRMS (ESI, m/z), berechnet für [CsH^IN^ + H] ⁺ : 169.0972; gefunden: 169.0984. 1.2 2-(2-Methyl-1H-imidazol-1-yl)essigsäurehydrazid (2)

Es werden 10.0 g 2-(2-Methyl-1H-imidazol-1-yl)essigsäureethylester (1) in 100 mL Methanol gelöst, 11.5 mL 80%iges Hydrazinhydrat hinzugegeben und die klare Lösung für 16 h unter Rückfluss erhitzt. Anschließend lässt man auf Raumtemperatur abkühlen und entfernt das Lösungsmittel sowie überschüssiges Hydrazin im Teilvakuum an der Drehschieberpumpe bei < 10 ^~2 mbar. Das langsam erstarrende Öl wird mit 3 ^χ 10 mL Toluen an der Drehschieberpumpe azeotrop getrocknet, woraufhin man die Titelverbindung in hoher Reinheit als farblosen bis schwach rosa gefärbten Feststoff in einer Rohausbeute von 9.3 g (quantitativ) erhält.

DC-Kontrolle (mobile Phase: Dichlormethan/Methanol/konz. NH ₃ 93 : 7 : 0.5 (VA/); Detektion mit 1 % Co(N0 ₃ ) ₂ in Methanol): R, 0.14 (rot-violett).

¹ H-NMR (DMSO-de, <5): 9.35 (s br, 1 H, NH), 6.97, 6.69 (2 d, 2 1 H, C(4)H und C(5)H, ³ J = 1.2 Hz), 4.49 (s, 2H, C(2)H ₂ ), 4.29 (s br, 2H, NH ₂ ), 2.22 ppm (s, 3H, C(6)H ₃ ).

1 ³ C-NMR (DMSO-de, <5): 166.2, 144.5, 125.9, 120.7, 46.8, 12.6 ppm.

HRMS (ESI, m/z), berechnet für [C ₆ H ₁₀ N ₄ O + H] ⁺ : 155.0927; gefunden: 155.0920.

Schmelzbereich: 123-125 °C.

1.3 2-(1 H-Pyrazol-1 -yl)essigsäurethylester (3)

In 50 mL THF werden 1.0 g 1 H-Pyrazol gelöst und 6.3 g Kaliumcarbonat unter Rühren suspendiert. Man gibt 1.8 mL 2-Bromessigsäureethylester hinzu und erhitzt auf dem Ölbad zum Rückfluss. Nach 6 h werden weitere 0.3 molare Äquivalente 2- Bromessigsäureethylester hinzugegeben. Die Reaktion ist beendet, wenn auf dünnschicht- chromatographisch kein Startmaterial mehr detektierbar ist (2.5-3 d). Anschließend wird die blass gelb gefärbte Suspension filtriert, der Rückstand mit Dichlormethan gewaschen und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer im Teilvakuum entfernt. Zurück bleibt ein intensiv rot gefärbtes Öl, welches durch Vakuumdestillation gereinigt wird. Die produkthaltige Fraktion siedet bei 94-96 °C und 12 mbar. Man erhält 816 mg (36 %) der Titelverbindung als schwach gelb gefärbtes Öl.

DC-Kontrolle (mobile Phase: Dichlormethan/Methanol/konz. NH ₃ 93 : 7 : 0.5 (VA/); Detektion mit 1 % Co(N0 ₃ ) ₂ in Methanol): R _f 0.62 (violett bis weinrot, Pyrazol); 0.90 (violett, Titelverbindung).

¹ H-NMR (DMSO-de, <5): 7.73, 7.46 (2 d, 2 1 H, C(3)H und C(5)H, ³ J = 2.0 Hz), 6.27 (t, 1 H, C(4)H, ³ J = 2.0 Hz), 5.05 (s, 2H, C(2)H ₂ ), 4.14 (q, 2H, C(6)H ₂ , ³ J = 7.2 Hz), 1.20 ppm (t, 3H, C(7)H ₃ , ³ J = 7.2 Hz).

¹³ C-NMR (DMSO-de, <5): 168.3, 139.2, 131.4, 105.6, 61.0, 52.3, 14.0 ppm.

HRMS (ESI, m/z), berechnet für [C7H ₁₀ N ₂ O2 + H] ⁺ : 155.0815; gefunden: 155.0812.

1.4 2-(1 H-Pyrazol-1-yl)essigsäurehydrazid (4)

Es werden 2.5 g 2-(1 /-/-Pyrazol-1-yl)essigsäureethylester (3) in 50 mL Methanol gelöst, 3.0 mL 80%iges Hydrazinhydrat hinzugegeben und die klare Lösung für 14 h unter Rückfluss erhitzt. Anschließend lässt man auf Raumtemperatur abkühlen und entfernt das Lösungsmittel sowie überschüssiges Hydrazin im Teilvakuum an der Drehschieberpumpe bei < 10 ^~2 mbar. Das langsam erstarrende Öl wird mit 3 ^χ 10 mL Toluen azeotrop getrocknet. Man erhält die Titelverbindung in Form eines farblosen Feststoffes mit einer Rohausbeute von 2.3 g (quantitativ), der für die weitere Umsetzung ausreichend rein ist.

DC-Kontrolle (mobile Phase: Dichlormethan/Methanol/konz. NH ₃ 93 : 7 : 0.5 (VA/); Detektion mit 1 % Co(NÖ ₃ ) ₂ in Methanol): R _f 0.33 (orange).

¹ H-NMR DMSO-de, <5): 9.31 (s br, 1 H, NH), 7.70, 7.42 (2 dd, 2 1 H, C(3)H und C(5)H, ³ J = 2.0 Hz, J = 0.4 Hz), 6.24 (t, 1 H, C(4)H, ³ J = 2.0 Hz), 4.72 (s, 2H, C(2)H ₂ ), 4.32 ppm (s br, 2H, NH ₂ ).

¹³ C-NMR (DMSO-de, <5): 165.9, 138.9, 131.2, 105.2, 52.6 ppm.

HRMS (ESI, m/z), berechnet für [C ₅ H ₇ N ₄ 0 + H] ⁺ : 141.0771 ; gefunden: 141.0767. Schmelzpunkt: 1 13 °C (nach Umkristallisation aus Propan-2-ol).

1.5 W 4-Hydroxybenzyliden)-2-(2-methyl-1 H-imidazol-1-yl)essig-säurehydrazid (5)

Man löst 640 mg 2-(2-Methyl-1 H-imidazol-1 -yl)essigsäurehydrazid (2) und 510 mg 4- Hydroxybenzaldehyd in 30 ml_ Ethanol erhitzt für 90 min unter Rückfluss. Im Laufe der Reaktion fällt die Titelverbindung in Form eines feinkristallinen, gelb gefärbten Feststoffes aus. Nach Umkristallisation aus einem größeren Volumen Methanol erhält man 509 mg (47 %) der Titelverbindung in Form eines hell-gelb gefärbten Feststoffes, der von Acetonitril/Wasser umkristallisiert wird (Zers. 297-300 °C).

DC-Kontrolle (mobile Phase: Dichlormethan/Methanol/konz. NH ₃ 93 : 7 : 0.5 (VA/); Detektion mit 1 % Co(N0 ₃ ) ₂ in Methanol und im UV bei 254 nm): R _f 0.28 (violett).

In den NMR-Spektren treten zahlreiche Signale aufgrund von cis/trans-lsomeren doppelt auf und werden in diesem Fall entsprechend paarweise angegeben:

¹ H-NMR (DMSO-de, <5): 1 1 .54/1 1.50 (s, 1 H, NH), 9.96 (s br, 1 H , OH), 8.10/7.92 (s, 1 H, C(7)H), 7.50-7.58 (m, 2H, C(9)H), 7.03 (d, 1 H, C(4)H, ³ J = 1 .2 Hz), 6.80-6.83 (m, 2H, C(10)H), 6.72/6.70 (d, 1 H, C(3)H, ³ J = 1.2 Hz), 5.14/4.68 (s, 2H, C(2)H ₂ ), 2.24/2.20 (s, 3H, C(6)H ₃ ).

¹³ C-NMR (DMSO-de, <5): 168.1/162.9, 159.5/159.2, 147.6/144.7, 144.5/144.1 , 128.8/128.6, 125.9/125.6, 124.8, 121 .1/120.8, 1 15.5, 47.1/46.5, 12.5/12.4.

HRMS (ESI, m/z), berechnet für [Ci ₃ H ₁₄ N ₄ 02 + H] ⁺ : 259.1 190; gefunden: 259.1 165; berechnet für [Ci ₃ H ₁₄ N ₄ 0 ₂ - H] ^~ : 257.1044; gefunden: 257.1038.

Schmelzbereich: 291-295 °C unter Zersetzung (nach Umkristallisation aus Methanol).

1.6 W-(2-Hydroxybenzyliden)-2-(2-methyl-1 H-imidazol-1-yl)essigsäurehydrazid (6)

Man löst 250 mg 2-(2-Methyl-1 /-/-imidazol-1 -yl)essigsäurehydrazid (2) und 198 mg Salicylaldehyd in Methanol und lässt im Mikrowellenreaktor reagieren (Anfahrtszeit: 1 min; Reaktionszeit: 4 min; 200 W, 1 10 °C). Nach Abkühlen auf 0 °C fällt ein farbloser Feststoff aus, welcher aus Ethanol umkristallisiert wird. Man erhält 148 mg (36 %) der Titelverbindung in Form eines farblosen Feststoffes (Schmp. 264 °C).

DC-Kontrolle (mobile Phase: Dichlormethan/Methanol/konz. NH ₃ 93 : 7 : 0.5 (VA/); Detektion mit 1 % Co(N0 ₃ ) ₂ in Methanol und im UV bei 254 nm): R _f 0.64 (gelb).

In den NMR-Spektren treten zahlreiche Signale aufgrund von cis/trans-lsomeren doppelt auf und werden in diesem Fall entsprechend paarweise angegeben:

¹ H-NMR (DMSO-de, <5): 1 1 .92/1 1 .61 (s br, 1 H, NH), 10.96/10.14 (s br, 1 H, OH), 8.45/8.34 (s, 1 H, C(7)H), 7.76/7.56 (dd, 1 H, C(13)H, ³ J = 7.6 Hz, J = 1.6 Hz), 7.23-7.29 (m, 1 H, C(1 1)H), 7.05/7.03 (d, 1 H, C(4)H, ³ J = 1.2 Hz), 6.85-6.92 (m, 2H, C(10)H und C(13)H), 6.74/6.71 (d, 1 H, C(3)H, ³ J = 1 .2 Hz), 5.17/4.74 (s, 2H, C(2)H ₂ ), 2.25/2.20 (s, 3H, CH ₃ ).

¹³ C-NMR (DMSO-de, <5): 168.2/163.3, 157.3/156.4, 147.4/141 .4, 144.9/144.7, 131.5/131 .3, 129.0/126.3, 126.0/125.7, 121.2/120.9, 120.1/1 18.7, 1 19.3, 1 16.3/1 16.1 , 47.1/46.6, 12.6/12.5.

HRMS (ESI, m/z), berechnet für [Ci ₃ H ₁₄ N ₄ 02 + H] ⁺ : 259.1 190; gefunden: 259.1216; berechnet für [Ci ₃ H ₁₄ N ₄ 0 - H] ^~ : 257.1044; gefunden: 257.1044.

Schmelzpunkt: 264 °C (nach Umkristallisation aus Ethanol).

1.7 /V'-(4-Hydroxy-3-methoxybenzyliden)-2-(1 H-pyrazol-1 -yl)essigsäurehydrazid (7)

Man löst 216 mg 2-(1 /-/-Pyrazol-1 -yl)essigsäurehydrazid (4) und 235 mg Vanillin in Methanol und lässt im Mikrowellenreaktor reagieren (Anfahrtszeit: 1 min; Reaktionszeit: 4 min; 200 W, 1 10 °C). Nach Abkühlen auf 0 °C fallen blass gelb gefärbte Kristalle aus, welche aus Methanol umkristallisiert werden. Man erhält 405 mg (82 %) der Titelverbindung in Form eines farblosen Feststoffes (Schmp. 240 °C). DC-Kontrolle (mobile Phase: Dichlormethan/Methanol/konz. NH ₃ 93 : 7 : 0.5 (VA/); Detektion mit 1 % Co(N0 ₃ ) ₂ in Methanol und im UV bei 254 nm): R _f 0.74 (orange).

In den NMR-Spektren treten zahlreiche Signale aufgrund von cis/trans-lsomeren doppelt auf und werden in diesem Fall entsprechend paarweise angegeben:

¹ H-NMR (DMSO-de, δ): 11.55/1 1.48 (s, 1 H, NH), 9.15 (s br, 1 H, OH), 8.11/7.90 (s, 1 H, C(6)H), 6.81-7.76 (m, 5H, C(3)H, C(5)H, C(8)H), C(11)H und C(12)H), 6.26-6.28 (m, 1 H, C(4)H), 5.37/4.89 (s, 2H, C(2)H ₂ ), 3.82/3.80 (s, 3H, CH ₃ ).

¹³ C-NMR (DMSO-de, <5): 168.2/162.8, 149.1/148.8, 148.1/144.3, 148.0, 139.1/138.6, 131.6/131.5, 125.4/125.3, 122.1/121.5, 1 15.4, 109.3, 105.3/105.2, 55.6, 53.2/52.3.

HRMS (ESI, m/z), berechnet für [Ci ₃ H ₁₄ N ₄ 0 ₃ + H] ⁺ : 275.1139; gefunden: 275.1 171 ; berechnet für [Ci ₄ H ₁₇ N ₅ 0 - H] ^~ : 273.0993; gefunden: 273.0994.

Smp.: 240 °C aus MeOH.

2. Biologische Testung

2.1 Bestimmung der Hemmwirkung mit dem GPx-Assay

Mit dem Glutathion-Peroxidase-Assay (GPx-Assay) soll die inhibitorische Aktivität der Substanzen auf die Glutathion-Peroxidase nachgewiesen werden. Der kinetische Assay basiert im Wesentlichen auf dem von Wendel ²⁵ publizierten Verfahren und wurde für 96-well Mikrotiterplatten umgestellt. Die Assay-Lösung besteht aus 50 mM Kaliumphosphatpuffer (EDTA, 0.1 % Triton X-100, pH = 7.0), 0,050 U/mL Glutathion-Peroxidase aus Rindererythrozyten, eine 0,200 U/mL Glutathion-Reduktase, 0.20 mM Glutathion, 0.20 mM NADPH und die entsprechende Testsubstanz in verschiedenen Konzentrationen. Nach Zugabe von 0.5 mM H ₂ 0 ₂ wird die Absorption bei λ = 340 nm alle 10 s über einem Gesamtzeitraum von 4 min bei Raumtemperatur gemessen, um den Verbrauch von NADPH (bei λ = 340 nm) zu verfolgen. Als Blindwert (0 % Enzymaktivität) wird der Absorptionsverlauf ohne GPx-Zugabe gemessen. Mercaptosuccinat (40 μΜ) dient als Referenzinhibitor. ¹⁹ Fig. 1 zeigt repräsentative Ergebnisse für die Hemmung von Rinder-GPx mit 40 μΜ Mercaptosuccinat und verschiedenen Konzentrationen der Verb. 5. Kontrollversuche haben gezeigt, das durch Verb. 5-7 die Glutathion-Reduktase bis zu einer Konzentration von 250 μΜ nicht gehemmt wird. 2.2 Bestimmung der Resistenz in B-Lymphom-Zellen, behandelt mit verschiedenen Zytostatika und Testsubstanz

Zwei Nicht-Hodgkin B-Zell-Lymphom-Zelllinien (DOGUM und GUMBUS ²⁶ ) werden in einem RPMI 1640 Medium (RPMI 1640, + L-Glutamin, + 2.0 g/L NaHC0 ₃ mit 10 % FCS und Streptomycin/Penicillin G) kultiviert. Sie wurden durch Vorbehandlung mit den vier Zytostatika Methotrexat, Etopisid, Cisplatin oder Bortezomib resistent gemacht. Die Zellen sollen als resistent gelten, wenn der Quotient (Resistenzfaktor) aus dem IC ₅ o-Wert der behandelten Zellen und dem IC ₅ o-Wert der nativen Ausgangszellen mindestens 3 beträgt.

Um die Zellwachstumshemmung durch die Zytostatika festzustellen, wurde ein MTT-Assay (MTT, 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium-bromid] in 96- Well Mikrotiterplatten angewendet. ²⁷ Zellen werden entweder mit 25 μΜ Testsubstanz behandelt oder als unbehandelte Kontrolle nur mit dem Lösungsmittel DMSO. In alle Testreihen beträgt der DMSO-Anteil 0.4%. Des Weiteren werden die mit Testsubstanz behandelten und nicht behandelten Zellen mit 5 steigenden Konzentrationen der Zytostatika Methotrexat, Etoposid, Cisplatin oder Bortezomib versetzt. Beim Einsatz von Cisplatin wird das ansonsten verwendete Lösungsmittel DMSO durch DMF ersetzt. Die Zellen werden anschließend für 72 h bei 37 °C unter befeuchteter 5%iger C0 ₂ -Luft-Atmosphäre kultiviert. Nachher werden in jedem Well 20 einer MTT-Lösung in Dulbecco's phosphatgepufferte Salzlösung (pH = 7.4) zugefügt und die Zellen für weitere 5 h im Brutschrank inkubiert. Abschließend werden zu allen Testreihen 100 einer HCI-Lösung (4 % HCl in Isopropanol) hingefügt und die Absorption bei λ = 570 nm mit einem Plattenleser gemessen.

3. Biologische Testergebnisse

3.1 Inhibition der Glutathion-Peroxidase-Aktivität durch 5-7 und Mercaptosuccinat

Bei einer Konzentration von 40 μΜ hemmt die Referenzsubstanz Mercaptosuccinat vollständig die katalytische Aktivität der GPx (Tabelle 1). Im Vergleich dazu sind die Substanzen 5-7 schwächere Inhibitoren dennoch hemmen sie bei einer Konzentration von 50 μΜ das Enzym signifikant. Verbindung 7 zeigt dabei ungefähr die 2fache Hemmwirkung von 5 (Tabelle 1 ). Kontrollversuche haben bewiesen, dass 5-7 die Glutathion-Reduktase, die Glutathiondisulfid zu Glutathion reduziert, bis zu einer Konzentration von 250 μΜ nicht hemmen. Deswegen muss die Hemmung des zeitabhängigen NADPH-Umsatzes durch die Hemmung der GPx zustande kommen. Tabelle 1 Mittlere GPx-Hemmwirkung (%) ± Standarabweichung (N > 3)

Substanz (50 μΜ)

Fig. 2 zeigt die konzentrationsabhängige Hemmung von Rinder-GPx durch 5. Bei etwa 250 μΜ hemmte die Substanz die GPx-Aktivität um 50 %. Höhere Konzentrationen konnten aufgrund der eingeschränkten Wasserlöslichkeit über 250 μΜ von 5 nicht weiter untersucht werden.

3.2 Effekte von 5 auf die Zytostatika-Resistenz der humanen Lymphom-Zelllinien GUMBUS und DOGUM zu Methotrexat, Etoposid, Cisplatin und Bortezomib

Die humanen B-Zell-Lymphom-Linien GUMBUS und DOGUM wurden von Chemotherapie- resistenten Patienten isoliert und in Kultur gebracht. ²⁶ Sie zeigen sich als besonders fähig, schnell eine Resistenz gegenüber verschiedenen Zytostatika in Kultur zu bilden. Exemplarisch wurden die beiden Zelllinien gegenüber den Zytostatika Methotrexat (MTX), Etoposid (ETO), Cisplatin (CDDP) und Bortezomib (BOR) durch wiederholte Gabe des entsprechenden Wrkstoffes über mehrere Monate zunehmend resistenter gemacht bis die IC ₅₀ -Werte der Zytostatika mindestens 3-fach höher lagen, als für die ursprünglichen „nativen" Linien. Insgesamt werden acht resistenten Zelllinien erzeugt: GUMBUS-MTX, GUMBUS-ETO, GUMBUS-CDDP, GUMBUS-BOR, DOGUM-MTX, DOGUM-ETO, DOGUM- CDDP und DOGUM-BOR.

Fig. 3 zeigt eine repräsentative Dosis-Wrkungskurven für die native GUMBUS- und resistente GUMBUS-BOR-Linien, behandelt mit steigenden Konzentrationen an Bortezomib, mit und ohne eine Kombinationsbehandlung mit 25 μΜ 5. Die Kombination Bortezomib und 5 führt zu einem deutlichen Zuwachs der Wrkungsstärke gegenüber den Versuchen mit nur Bortezomib.

Tabellen 2 und 3 fassen die IC ₅₀ -Werte (Zytostatikum-Konzentration, die das Zellwachstum um 50 % hemmt gegenüber unbehandelter Kontrolle) der nativen GUMBUS- bzw. DOGUM- Linien gegenüber Methotrexat, Etoposid, Cisplatin und Bortezomib, sowie die IC ₅₀ -Werte der entsprechenden Zytostatika-resistenten Zelllinien zusammen. Die resistenten Linien für GUMBUS (d. h. GUMBUS-MTX, GUMBUS-ETO, GUMBUS-CDDP, GUMBUS-BOR) sind 22- , 14-, 9- bzw. 6-fach resistent gegenüber Methotrexat, Etoposid, Cisplatin bzw. Bortezomib (Tabelle 2) während die für DOGUM (d. h. DOGUM-MTX, DOGUM-ETO, DOGUM-CDDP, DOGUM-BOR ) entsprechend 4-, 4-, 11- bzw. 4-fach resistent sind (Tabelle 3).

Werden die Zellen außer mit den Zytostatika zusätzlich mit 25 μΜ 5 behandelt, beobachtet man eine deutliche Senkung der IC ₅₀ -Werte bei allen Zelllinien gegenüber den IC ₅₀ -Werten ohne 5, insbesondere bei den Zytostatika-resistenten Zelllinien (Tabellen 2 und 3). Die entsprechenden resistenten Linien für GUMBUS sind nun nur noch 5-fach resistent gegenüber sowohl Methotrexat als auch Etoposid und nicht mehr resistent gegenüber Cisplatin und Bortezomib (Tabelle 2). Für die DOGUM-Linie sind die entsprechenden resistenten Linien nun nur 2-und 4-fach resistent gegenüber Etoposid und Cisplatin und nicht mehr resistent gegenüber Methotrexat und Bortezomib. (Tabelle 3) Diese Ergebnisse zeigen eine deutliche Aufhebung der Zytostatika-Resistenz durch den GPx-lnhibtor 5 in den acht resistenten B-Lymphom-Zelllinien.

Tabelle 2 IC ₅ o-Werte (μΜ, Mittelwert ± Standardabweichung) der Zelllinie GUMBUS und der entsprechenden Zytostatika-resistenten Zelllinien (N > 3)

Tabelle3 IC ₅ o-Werte (μΜ, Mittelwert ± Standardabweichung) der Zelllinie DOGUM, und die entsprechenden Zytostatika-resistenten Zelllinien (N > 3)

MTX: Methotrexat, ETO: Etoposid, CDDP: Cisplatin, BOR: Bortezomib

*) nur 2 Bestimmungen

Literatur

¹ .T. Kuo (2009) Antioxid. Redox Signal. 1 1 : 1 -35.

² M. Hollstein, D. Sidransky, B. Vogelstein, C.C. Harris (1991 ) Science 253: 49-53.

³ S.W. Lowe. (1995) Curr. Opinion Oncol. 7: 547-553.

⁴ M. Lopez-Lazaro (2007) Cancer Lett. 252: 1 -8.

⁵ L. Wang, P. Chanvorachote, D. Toledo, C. Stehlik, R R. Mercer, V. Castranova, Y. Rojanasakul. (2008) Mol. Pharmacol. 73: 1 19-127.

⁶ A.L. Ortega, S.Mena, J.M. Estrela (201 1 ) Cancers ^: 1285-1310.

⁷ E.A. Veal, A.M. Day, B.A. Morgan (2007) Mol. Cell 26: 1 -14.

⁸ S. Li, T. Yan, J.-Q. Yang, T.D. Oberley, L.W. Oberley. (2000) Cancer Res. 60: 3927-3839.

⁹ M. Timur, S. H. Akbas, T. Ozben (2005) Acta Biochem. Polonica 52: 897-902.

¹⁰ L.K. Hosking, R.D. H. Whelan, S.A. Shellard, P. Bedford, B T. Hill (1990) Biochem. Pharmacol. 40: 1833-1842.

¹¹ B.L. Samuels, J.L. Murray, M.B. Cohen, A R. Safa, B.K. Sinha, A.J. Townsend, M.A. Beckett, R R. Weichselbau (1991 ) Cancer Res. 51 : 521 -527.

¹² U. Masanek, G. Stammler, M. Volm (1997) Anti-Cancer Drugs 8: 189-198.

¹³ C. Andreadis, P.A. Gimotty, P. Wahl, R. Hammond, J. Houldsworth, S.J. Schuster, T R. Rebbeck. (2007) Neoplasie 109:3409-3416.

¹⁴ E.V. Kalinina, N N. Chernov, A.N. Saprin, Y.N.Notova, Y. A. Andreev, V.S. Solomka, N.P. Scherbak. (2006) Biochemistry (Moscow) 71 : 1200-1206.

¹⁵ C. Glorieux, N. Dejeans, B. Sid, R. Beck, P.B. Calderon, J. Verax. (201 1 ) Biochem. Pharmacol. 82: 1384-1390.

¹⁶ S. Gromer, J. K. Eubel, B. L. Lee, J. Jacob (2005) Cell. Mol. Life Sei. 62: 2414- 2437

¹⁷ O. Epp, R. Ladenstein, A.Wendel. (1983) Eur. J. Biochem. 133: 51 -69.

¹⁸ J. Chaudiere, E.C. Wilhelmsen A.L. Tappel (1984) J. Biol. Chem. 259: 1043-1050.

¹⁹ J. Chaudiere, A. L. Tappel. (1984)J Inorg. Biochem. 20: 313-325.

²⁰ J. R. Roberts, C. F. Shaw. (1998) Biochem. Pharmacol. 55: 1291 -1299.

²¹ P.A. Insel. (1996) In: Pharmakologische Grundlagen der Arzneimitteltherapie, 9. Auflage (J. G. Hardman, L.E. Limbird, Eds) McGraw-Hill, N.Y., S. 663-665.

²² K.S. Kumar, J.F. Weiss. (1986) Biochem. Pharmacol. 35: 3143-3146.

²³ S.A. Leibel, C.B. Scott, T.B. Pajak (1991 ) Semin. Radial Oncol. 1 : 32-49. ⁴ K. Bracht, T. Kiefer, G. Dölken, P.J. Bednarski (2007) J. Cancer Res. Clin. Oncol. 133: 957-967.

²⁵ A. Wendel (1980) In: Enzymatic Basis of Detoxification, Vol. 1 (Ed. W.B. Jacoby), Academic Press, NY, NY, S 333-348.

²⁶ K. Bracht, T. Kiefer, G. Dölken, P.J. Bednarski (2007) J. Cancer Res. Clin. Oncol. 133: 957-967.

²⁷ K. Bracht, Boubakari, R. Grünert, P.J. Bednarski (2006) Anti-Cancer Drugs 17: 41 - 51.