UTILISATION DE SOUCHES D'ALGUES DEPOURVUES DE PAROI CELLULAIRE POUR LA PRODUCTION DE LIPIDES NEUTRES.

La présente invention concerne l'utilisation de souches d'algues dépourvues de paroi cellulaire pour la production de lipides neutres. Les lipides et particulièrement les triglycérides ont un intérêt commercial important dans le domaine de l'alimentation et plus récemment dans celui des biocarburants. Les triglycérides sont généralement produits par les végétaux supérieurs (colza, tournesol, soja par exemple) où ils s'accumulent dans des organes de réserve spécifiques, les graines. Les algues unicellulaires sont également susceptibles d'accumuler des lipides au sein de leur cellule unique.

Chez les végétaux supérieurs, l'accumulation de triglycérides de réserve a lieu au moment du remplissage du grain, alors que chez les microalgues elle a généralement lieu en réponse à une carence nutritive (carence en azote chez les chlorophycées ou en silice chez les diatomées). Si quelques espèces d'algues ont été répertoriées comme accumulant des quantités significatives de lipides (par exemple les chlorophycées Chlorella vulgaris et Neochloris oleoabundans), d'autres comme Chlamydomonas reinhardtii ont été décrites comme n'accumulant pas de lipides (Sheehan et al, 1998 et Hu et al, 2008). Par ailleurs, chez C. reinhardtii, la carence minérale est aussi connue pour provoquer une augmentation importante du contenu en amidon (Bail et al, 1990).

Une méthode de production de produits huileux (chaînes hydrocarbonées, graisses et cires) à partir de souchee de Dunaliella (algue verte unicellulaire, halophile, mobile et naturellement dépourvues de paroi cellulaire), cultivée dans un milieu enrichi en dioxyde de carbone a été décrite dans la Demande de Brevet français n° 2 461 003. Diverses méthodes ont été proposées pour augmenter le contenu en lipides de végétaux ou d'algues. Ces méthodes reposent principalement sur des techniques de génie génétique : par exemple sur-expression d'un gène codant pour l'acétyl-coenzyme A ou une UDP-glucose pyrophosphorylase (voir les Brevets américains US 5,559,220 et US 5,928,932, et les Demandes Internationales WO 00/66749 et WO 01/81604). Dans un contexte de diminution programmée des réserves de carburant fossile, l'utilisation de microalgues comme source de biocarburants connaît un vif regain d'intérêt (Chisti, 2007 et Haag, 2007). La culture de microalgues présente un certain nombre d'avantages par rapport aux cultures terrestres : production surfacique supérieure, compétition limitée avec la production de denrées alimentaires ou avec les ressources en

eau, pression sur l'environnement maîtrisable (recyclage des intrants). Toutefois, les coûts de production des microalgues d'une part et d'extraction des lipides d'autre part sont encore trop élevés par rapport au prix du produit commercialisable, limitant ainsi les applications. Dans ce contexte, l'amélioration des capacités de production de lipides représente un enjeu majeur (Chisti, 2007 et Hu et ai, 2008).

Les Inventeurs ont entrepris des travaux de recherche sur les mécanismes moléculaires d'accumulation des lipides chez les microalgues. Ils ont choisi comme modèle d'étude l'algue verte unicellulaire biflagellée Chlamydomonas reinhardtii, dont le génome entier a été séquence et pour laquelle des outils moléculaires sont disponibles (par exemple, possibilité de transformer génétiquement ses trois génomes : nucléaire, chloroplastique et mitochondrial). De manière surprenante, les Inventeurs ont mis en évidence une augmentation significative de l'accumulation de lipides neutres (principalement des triglycérides) chez des souches de Chlamydomonas reinhardtii mutantes dépourvues de paroi cellulaire, cultivées dans des conditions de carence en azote par rapport aux souches de type sauvage pourvues d'une paroi cellulaire cultivées dans les mêmes conditions. Ils ont en outre constaté que dans le cas de souches de C. reinhardtii dépourvues de paroi cellulaire et également affectées dans le métabolisme de l'amidon, le contenu en lipides et en acides gras totaux pouvait atteindre respectivement jusqu'à 50% et 41% du poids sec de la culture, après trois à quatre jours de carence totale en azote. La présente invention a donc pour objet l'utilisation d'une souche mutante d'algue dépourvue de paroi cellulaire, pour la production de lipides neutres, de préférence des triglycérides, ladite souche mutante étant obtenue à partir d'une souche sauvage pourvue de paroi cellulaire.

Ces lipides neutres peuvent également être des mono- et/ou di-glycérides (qui peuvent être produits en tant qu'intermédiaires de biosynthèse des triglycérides).

Selon un mode de mise en œuvre préféré de la présente invention ladite algue est une algue verte, de préférence une algue verte unicellulaire (Chlorophycée), choisie de préférence parmi les Chlorococcales, notamment les genres Scenedesmus, Chlorococcum, Clïorella, et les Volvocales, notamment les genres Lobochlamys et Chlamydomonas.

Selon une disposition préférée de ce mode de mise en œuvre, ladite algue est une algue d'eau douce ou de sol, mais n'est pas une algue halophile.

Selon une autre disposition préférée de ce mode de mise en œuvre, ladite algue appartient au genre Chlamydomonas. Avantageusement, ladite algue appartient à l'espèce Chlamydomonas reinhardtii.

On entend par « souche mutante d'algue dépourvue de paroi cellulaire » une souche mutante d'algue ne possédant pas du tout de paroi cellulaire, ou possédant une paroi cellulaire non fonctionnelle (due, par exemple, à l'absence d'attachement à la membrane plasmique).

Des souches mutantes d'algues dépourvues de paroi cellulaire sont connues en elles-mêmes, et peuvent être aisément identifiées notamment sur la base de leur morphologie amiboïde molle et/ou de tests tels que le test au Triton™ X-IOO (Jaenicke et al, 1987) décrit ci-après ; à titre d'exemples non limitatifs on citera les souches de Chlamydomonas décrites par Davies and Plaskitt, (1971), qui ont été réparties par ces auteurs en trois classes :

- classe A : la paroi cellulaire est produite en quantité normale mais n'est pas attachée à la membrane plasmique ;

- classe B : la paroi cellulaire est produite en quantité normale, attachée à la membrane plasmique mais la morphologie des colonies des souches appartenant à cette classe est identique à celle des mutants de classe A ou C, c'est-à-dire que la force structurale des colonies est perdue ; - classe C : de faibles quantités de paroi cellulaire sont produites et ne sont pas attachées à la membrane plasmique.

Une souche dépourvue de paroi cellulaire peut être identifiée, par exemple, sur la base du test suivant. Il est incubé un volume (environ 100 μl à 1 ml) de cellules (en culture liquide) avec un volume équivalent de 0.5% Triton™ X-100 de préférence pendant 10 à 40 minutes. Après incubation, les cellules sont centrifugées pendant 5 minutes à 10 000 g en présence du Triton™ X-100 et le culot cellulaire est observé. La couleur verte du culot cellulaire indique que la souche est pourvue d'une paroi cellulaire (dont la fonction est intègre) ; la couleur blanche du culot cellulaire indique que la souche est dépourvue de paroi cellulaire. De manière générale, on peut utiliser pour la mise en œuvre de la présente invention, toute souche qui présente une mutation inactivant un gène codant pour un constituant de la paroi cellulaire et/ou des protéines impliquées dans l'intégrité fonctionnelle de la paroi cellulaire (par exemple des glycoprotéines riches en

hyrdoxyproline), ainsi que tout gène impliqué dans la régulation de l'expression des gènes de la voie de biosynthèse de la paroi cellulaire.

A titre d'exemples de gènes codant pour des glycoprotéines riches en hydroxyproline, on peut citer les gènes suivants qui ont été identifiés chez Chlamydomonas reinhardtii :

- les gènes VSP (VSPl, VSP3, VSP4, VSP6 et VSP7) codant pour les protéines VSP correspondantes (hydroxyproline-rich cell wall proteiή),

- les gènes GPl et GP 2 codant pour les protéines gpl (« végétative cell wall protein ») et gp2 (« extracellular matrix protein »), et - les gènes codant pour les pherophorines (Hallman, 2006).

Selon un autre mode de mise en œuvre avantageux de la présente invention, ladite souche mutante dépourvue de paroi cellulaire est en outre affectée dans la synthèse de l'amidon.

On définit comme souche mutante affectée dans la synthèse de l'amidon, une souche qui accumule au plus 90%, de préférence 50% et par ordre croissant de préférence 40%, 30%, 20%, 10%, 5% et 1% de la quantité d'amidon accumulée par une souche de type sauvage de la même espèce, cultivée dans les mêmes conditions.

Les souches mutantes d'algues selon la présente invention accumulant 10% à 1% de la quantité d'amidon accumulée par une souche de type sauvage de la même espèce, cultivée dans les mêmes conditions, sont plus particulièrement préférées.

Il s'agit notamment de souches présentant une mutation inactivant l'une des sous-unités de FADP-glucose pyrophosphorylase (protéines codées par les gènes STAl et STA6), ou d'une mutation inactivant un gène codant une enzyme de la voie de biosynthèse de l'amidon telle que les synthétases so lubies de l'amidon (gènes SSSl à SSS5 et STA3), les synthétases liées au grain d'amidon (gènes GBSS), les enzymes de branchement de l'amidon (gènes SBEl à SBE3), l'isoamylase (gène STAT), les enzymes de débranchement (gènes ISOl à ISO3) et le D-enzyme (gène STAIl). A titre illustratif, un schéma montrant la voie de biosynthèse de l'amidon chez Chlamydomonas reinhardtii dans laquelle interviennent les enzymes ci-dessus est présenté à la Figure 8. A titre d'exemples non limitatifs de souches mutantes dépourvues de paroi cellulaire utilisables selon la présente invention, on citera les souches de C. reinhardtii CC-820 (cw!7 mt-), CC-846 (cwl mt-), CC-847 (cwl4 mt+), CC-848 (cw8 mt+), CC-849 (cw 10 mt-), CC-850 (cwl 8 mt-), CC-851 (cw2 mt+) (souche de la classe A telle que définie ci-dessus), CC-852 (cw9 mt-), CC-853 (cwl 9 mt-), CC-854 (cw20 mt+)

(souche de la classe B telle que définie ci-dessus), CC-855 (cw6 mt+), CC-856 (cwl8 mt+), CC-857 (cw4 mt+), CC-858 (cwl77 mt+), CC-859 (cw51 mt+), CC-860 (cw3 mt+), CC-406 (cwlδ mt-) (souche de la classe C telle que définie ci-dessus), BAFJ3 (mt+ nitl nit2 cwl5 arg7-7 stal-2::ARG7), BAFJ5 {nitl nit2 cwl5 arg7-7 sta6-l:: ARGl) et BAFJ6 (mt+ nitl nit2 cwl5 arg7-7 sta7-l::ARG7), de préférence les souches CC-406, BAFJ3, BAFJ5 et BAFJ6, ainsi que les souches dérivées de celles-ci.

Les souches mutantes CC-820, CC-846, CC-847, CC-848, CC-849, CC- 850, CC-851, CC-852, CC-853, CC-854, CC-855, CC-856, CC-857, CC-858, CC-859, CC-860 et CC-406 sont disponibles auprès du Chlamydomonas Center, Duke University, Durham, NC, Etats-Unis

Parmi ces souches,

- les souches mutantes CC-851, CC-854 et CC-406 sont connues pour ne pas être affectées dans la synthèse de l'amidon ;

- la souche mutante BAFJ3 est connue pour être à la fois dépourvue de paroi cellulaire et affectée dans la synthèse de l'amidon (Van den Koornhuyse et al,

1996). Cette souche est mutée au locus STAl, par insertion d'une cassette d'expression de l'enzyme argininosuccinate lyase (pARG7), dans le gène codant pour la grande sous-unité (sous-unité régulatrice) de l'ADP-glucose pyrophosphorylase ;

- la souche BAFJ5 est aussi connue pour être à la fois dépourvue de paroi cellulaire et affectée dans la synthèse de l'amidon ; cette souche est mutée au locus ST A6, dans le gène codant pour la petite sous-unité catalytique de l'ADP-glucose pyrophosphorylase (Zabawinski et al, 2001) ;

- la souche BAFJ6 est également connue pour être à la fois dépourvue de paroi cellulaire et affectée dans la synthèse de l'amidon ; cette souche est mutée au locus STA 7, par insertion d'une cassette d'expression de l'enzyme argininosuccinate lyase (pARG7), dans le gène codant pour l'isoamylase (Mouille, 1996).

On entend par « souches de C. reinhardtii, dérivées de la souche X » (X étant les souches mutantes CC-820, CC-846, CC-847, CC-848, CC-849, CC-850, CC-851, CC-852, CC-853, CC-854, CC-855, CC-856, CC-857, CC-858, CC-859, CC-860, CC-406, BAFJ3, BAFJ5 ou BAFJ6, ou toute autre souche mutante dépourvue de paroi cellulaire, et éventuellement affectée dans la synthèse de l'amidon, telle que définie ci-dessus), des souches de Chlamydomonas reinhardtii obtenues soit par croisement avec une autre souche soit par mutagénèse ou par transformation génétique de la souche X, et conservant au moins les propriétés d'accumulation des lipides neutres de la souche X. Il peut s'agir de

souches résultant d'un croisement entre la souche X et une souche de C. reinhardtii de type sauvage (par exemple, la souche 137C), telles que par exemple la souche CC-3491 (cwl5 mt-) (disponible auprès du Chlamydomonas Center) qui résulte d'un tel croisement à partir de la souche CC-406. Il peut s'agir également de souches dans lesquelles un ou plusieurs des gènes endogènes de la souche X a (ont) été muté(s) et/ou de souches résultant de la transformation génétique de la souche X par un ou plusieurs gène(s) d'intérêt, de manière à modifier certaines de ses propriétés physiologiques et/ou conférer à ladite souche des caractéristiques physiologiques supplémentaires (par exemple, forte productivité de biomasse, fort taux de division, antennes chlorophylliennes de taille réduite, résistance au stress oxydatif, résistance aux pathogènes). Ces souches peuvent être obtenues à partir de la souche X par les techniques classiques de mutagénèse aléatoire (par exemple mutation aux rayons X ou par insertion) ou dirigée et de transformation génétique de C. reinhardtii, telles que celles décrites par exemple par Harris, 1989 ; Boyton et al, 1988 ; Fernandez et al, 1989 ; Debuchy et al, 1989 et Shimogawara et al, 1998.. L'utilisation d'une souche mutante d'algue dépourvue de paroi cellulaire telle que définie ci-dessus pour la production de lipides neutres, présente en outre l'avantage de faciliter la récupération des gouttelettes lipidiques produites par ladite souche, les cellules pouvant être aisément cassées par choc osmotique ou mécanique. Les gouttelettes lipidiques peuvent ensuite être récoltées par flottaison, centrifugation par séparation de phase ou fïltration par exemple.

La présente invention a aussi pour objet un procédé de production de lipides neutres, notamment de triglycérides, qui comprend une étape de culture d'une souche mutante d'algue dépourvue de paroi cellulaire, et optionnellement aussi affectée dans la synthèse de l'amidon, telle que définie ci-dessus, en conditions photoautotrophes (lumière comme source d'énergie et dioxyde de carbone comme source de carbone) et de carence totale ou partielle en azote, et sous atmosphère d'air enrichi à environ 1% à 5% de dioxyde de carbone (CO ₂ ), de préférence 2%.

On définit comme « conditions de carence totale en azote » la culture d'une souche mutante d'algue telle que définie ci-dessus dans un milieu de culture ne contenant pas d'azote.

On définit comme « conditions de carence partielle en azote » la culture d'une souche mutante d'algue telle que définie ci-dessus dans un milieu de culture dont la concentration en azote, de préférence sous forme d'ammonium (NH ₄ Cl), est strictement

inférieure à 7,5 mM, de préférence inférieure ou égale à 5 mM, et par ordre croissant de préférence, inférieure ou égale à 2,5 mM, 1 mM, 0,5 mM, 0,25 mM et 0,1 mM.

Le procédé selon la présente invention peut comprendre en outre une étape d'extraction des lipides. Les techniques d'extraction des lipides à partir de microorganismes eucaryotes et plus particulièrement d'algues unicellulaires sont connues de l'homme du métier (voir par exemple les Demandes Internationales WO 01/54510 et WO 2008/013548).

La présente invention a également pour objet une méthode de criblage de souches mutantes de Chlamydomonas qui accumulent des lipides comprenant les étapes suivantes : a) incubation des souches de Chlamydomonas en présence de Rouge Nil (7-diethylamino-3,4-benzophenoxazine-2-one), b) excitation des souches de Chlamydomonas à une longueur d'onde comprise entre 450 nm et 540 nm, de préférence à 488 nm, c) mesure de la fluorescence émise par les souches de Chlamydomonas à une longueur d'onde comprise entre 560 et 640 nm, de préférence à 580 nm, d) comparaison de la quantité de fluorescence émise par les différentes souches de Chlamydomonas. Selon un mode de mise en œuvre avantageux de ladite méthode de criblage, les souches de Chlamydomonas sont préalablement cultivées en conditions photoautotrophes et de carence totale ou partielle en azote et sous atmosphère d'air enrichi à environ 1% à 5% de dioxyde de carbone (CO ₂ ), de préférence 2%.

Selon une disposition particulière de ce mode de mise en œuvre, les souches de Chlamydomonas sont cultivées en milieu minimum (Harris, 1989) et sous atmosphère d'air enrichi à 2% de dioxyde de carbone, puis mises en conditions de carence azotée totale (par exemple, pendant 3 jours).

Selon un autre mode de mise en œuvre avantageux de ladite méthode de criblage, les souches de Chlamydomonas sont incubées, de préférence à l'obscurité, en présence de Rouge Nil pendant au moins cinq minutes, de préférence de dix à quarante minutes, et de préférence encore pendant vingt minutes.

Les dispositifs permettant de mesurer la fluorescence émise par un microorganisme sont bien connus de l'Homme du métier. Il peut par exemple utiliser un spectrofluoromètre.

Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples illustrant les propriétés d'accumulation de lipides neutres des souches mutantes de Chlamydomonas reinhardtii dépourvues de paroi cellulaire, ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels :

- la Figure 1 illustre le contenu en amidon et en acides gras totaux (exprimé en μg d'amidon ou d'acides gras totaux /10 ⁶ cellules) en réponse à une carence totale en azote chez différentes souches de Chlamydomonas reinhardtii. Les cellules sont cultivées en milieu minéral sous air enrichi avec 2% CO ₂ . Au cours de la phase exponentielle de croissance, les cellules sont récoltées par centrifugation et mises en suspension dans un milieu minéral dépourvu d'azote. Les mesures sont soit effectuées en phase exponentielle de croissance (+N), soit à différents temps après la carence totale en azote (-N, 1 à 4 jours après la carence). Contenu intracellulaire en amidon (A) et en acides gras totaux (C) de la souche de C. reinhardtii mutante stal-1 (17) affectée dans la voie de biosynthèse de l'amidon et de la souche de type sauvage 137C (CC-124) dont la souche stal-1 est issue. Contenu intracellulaire en amidon (B) et en acides gras totaux (D) des souches de C. reinhardtii mutantes stal-2 (BAFJ3), staό (BAFJ5) et stal (BAFJ6) dépourvues de paroi cellulaire et affectées dans la synthèse de l'amidon et de la souche de mutante cv/15 (CC-406), dépourvue de paroi cellulaire, dont les souches stal -2, staό et sta7 sont issues. Le contenu intracellulaire en acides gras totaux est dosé par chromatographie en phase gazeuse / spectrométrie de masse ;

- la Figure 2 illustre le contenu intracellulaire en lipides neutres en réponse à une carence totale en azote chez les souches de C. reinhardtii 137C (A), cwl5 (B), 17 (C) et BAFJ3 (D). Les cellules sont cultivées dans les conditions décrites pour la Figure 1 ci-dessus. Le contenu intracellulaire en lipides neutres est suivi quotidiennement par la mesure de la fluorescence émise à 580 nm après coloration des cellules par une sonde fluorescente spécifique des lipides, le Rouge Nil (ajouté à une concentration finale de 1 μg/ml) et exprimé en unité arbitraire ;

- la Figure 3 est un tableau représentant le contenu en lipides totaux en réponse à une carence totale en azote chez les souches de C. reinhardtii 137C (CC-124), stal-1 (17), cwl5 (CC-406), staό (BAFJ5) et stal -2 (BAFJ3). Les cellules sont cultivées dans les conditions décrites pour la Figure 1 ci-dessus. La masse totale de lipides est déterminée par gravimétrie. A) Le contenu intracellulaire en lipides totaux est exprimé en

μg de lipides totaux /10 ⁶ cellules. B) La productivité des souches est exprimée en pourcentage de lipides totaux par rapport au poids sec cellulaire ;

- la Figure 4 illustre l'évolution des différentes classes de lipides en réponse à une carence azotée totale chez différentes souches de C. reinhardtii : CC- 124 (137C), CC-406 (cwl5), 17 (stal-1), et BAFJ3 (stal-2) et BAFJ6 (sta7). Les cultures sont prélevées soit en phase exponentielle de croissance (+N), soit quatre jours après l'application d'une carence totale en azote (-N, T+4). Leur contenu lipidique est analysé en chromatographie sur couche mince. La migration est effectuée dans un solvant n- hexane/diéthyl éther/acide acétique (85:15:1) et la révélation est réalisée par vapeur d'iode. La position des lipides polaires et neutres (notamment les triglycérides, représentés par un astérisque) est indiquée ;

- la Figure 5 illustre la localisation subcellulaire des vésicules de stockage de triglycérides chez différentes souches de C. reinhardtii (CC- 124 (137C), CC- 406 (cwl5), 17 et BAFJ3) après coloration des cellules au Rouge Nil et observation en microscopie à épifluorescence. Les colorations au Rouge Nil sont effectuées sur des échantillons de culture soit prélevés en phase exponentielle de croissance (+N), soit à différents temps après la carence azotée totale (-N, 1 à 4 jours après la carence). Les images sont obtenues en lumière visible (panneau haut) et après excitation à 488 nm des échantillons colorés (panneau bas). La fluorescence jaune est émise par les lipides neutres intracellulaires colorés au Rouge Nil (580 nm) et la fluorescence rouge correspond à P autofluorescence de la chlorophylle (670 nm). Les flèches indiquent : ». fluorescence rouge (autofluorescence de la chlorophylle) ; > fluorescence jaune (lipides neutres) ; fluorescence orangée (lipides polaires, dégradation des membranes) ; - la Figure 6A illustre la fluorescence émise par les microalgues à 580 nm en réponse à une excitation à 488 nm et mesurée grâce à un spectrofluorimètre (Perkin Elmer), après 20 min d'incubation à l'obscurité en présence de Rouge Nil. Des gammes de concentrations cellulaires allant de 3.10 ³ à 10 ⁷ cellules/mL et de concentrations en Rouge Nil allant de 10 ^"4 à 10 ^"2 mg/mL sont testées. Ces essais ont permis de déterminer une gamme de concentrations cellulaires dans laquelle le signal de réponse au Rouge Nil est proportionnel à la quantité de cellules (et donc de lipides neutres). La Figure 6B illustre la validation expérimentale de la méthode de criblage en comparant la réponse de la souche BAFJ5 accumulatrice de lipides (souche mutante) et d'une souche de type sauvage (CC-

124). Deux volumes de culture (lOOμL et 200μL) sont testés et donnent des résultats comparables ;

- la Figure 7 illustre la voie de biosynthèse de l'amidon chez Chlamydomonas reinhardtii ; - la Figure 8A illustre l'accumulation d'amidon et d'acides gras totaux en réponse à une carence totale en azote chez la souche de Chlamydomonas reinhardtii de type sauvage CC-408. Les mesures sont soit effectuées en phase exponentielle de croissance (+N), soit à différents temps après la carence totale en azote (-N, 1 à 3 jours après la carence). Le contenu intracellulaire en amidon est exprimé en μg d'amidon/10 ⁶ cellules. Le contenu intracellulaire en acides gras totaux est dosé quotidiennement par chromatographie en phase gazeuse / spectrométrie de masse ; la Figure 8B illustre l'évolution des différentes classes de lipides en réponse à une carence azotée totale chez la souche CC-408. Les cultures sont prélevées soit en phase exponentielle de croissance (+N), soit 1, 2 ou 3 jours après l'application d'une carence totale en azote (-N, T+l, T+2, T+3). Leur contenu lipidique est analysé en chromatographie sur couche mince. La migration est effectuée dans un solvant n-hexane/diéthyl éther/acide acétique (85:15:1) et la révélation est réalisée par vapeur d'iode. La position des lipides neutres (notamment les triglycérides, TG) est indiquée par un astérisque ;

- la Figure 9A illustre l'accumulation d'amidon et d'acides gras totaux en réponse à une carence totale en azote chez la souche de Chlamydomonas reinhardtii mutante CC-851 (dénommée aussi cw2) ; la Figure 9B illustre l'évolution des différentes classes de lipides en réponse à une carence azotée totale chez la souche mutante CC-851. La position des lipides neutres (notamment les triglycérides) est indiquée par un astérisque. Les conditions expérimentales sont identiques à celles pour la souche CC-408. EXEMPLES

I- MATERIELS ET METHODES

Souches et conditions de culture

Les souches de Chlamydomonas reinhardtii de type sauvage CC- 124 (dénommée aussi 137C) (mt- nitl nitl) et CC-408 (mt+), et les souches mutantes de C. reinhardtii dépourvues de paroi cellulaire CC-406 (mt- cw!5) (dénommée aussi cwl5 ; souche totalement dépourvue de paroi cellulaire) et CC-851 (mt+ cw2) (dénommée aussi cw2 ; souche mutante de classe A) utilisées dans cette étude ont été obtenues auprès du Chlamydomonas Center (Duke University, Durham, NC, USA). Les souches de C.

reinhardtii mutées dans le métabolisme de l'amidon stal-2 (souche BAFJ3, mt+ nitl nit2 cwl5 argl-7 stal-2::ARG7, Van den Koornhuyse et al, 1996), stal-1 (souche 17, mt- nitl nit2 stal-1, Bail et al, 1991), staό (souche BAFJ5, nitl nit2 cw!5 argl-7 sta6-l::ARG7, Zabawinski et al, 2001), et sta7 (souche BAFJ6, mt+ nitl nit2 cwl5 arg7-7 sta7-l::ARG7, Mouille et al, 1996) ont été obtenues auprès de l'Université des Sciences et Technologies de Lille, France.

Les souches de C. reinhardtii sont maintenues à 25 °C en milieu liquide TAP (Harris, 1989) sous éclairage constant (150 μmol.m ^"2 .sec ^" ') et agitées continuellement afin d'obtenir des cultures « starters » {inocula). Pour les cultures sous concentration élevée en CO ₂ , les cultures starters en fin de phase logarithmique sont utilisées pour inoculer une nouvelle culture dans une colonne de 300 ml contenant 200 ml de Milieu Minimum (Harris, 1989) ajusté à 80 mM de Trizma (pH 7,4) à une densité de départ de 1x10 ⁵ cellules.ml ^"1 sous éclairage constant (150 μmol.m^.sec ^"1 ) et sous atmosphère d'air enrichi à 2% (v/v) de CO ₂ (bullage du milieu de culture). Après 72 heures, la culture en milieu de phase logarithmique est récoltée (4x10 ⁶ cellules / ml), remise en suspension dans 200 ml de Milieu Minimum sans azote et mise sous atmosphère d'air enrichi à 2% (v/v) de CO ₂ pendant 3 à 4 jours. La croissance des cellules est suivie par comptage cellulaire à l'aide d'un compteur de cellules automatisé (Multisizer™ 3 Coulter Counter - Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA). Quantification de Ia chlorophylle et de l'amidon

La quantification de la chlorophylle et de l'amidon est réalisée en utilisant, respectivement, la méthode de Lichtenthaler (1987) et un protocole adapté de la méthode citée dans Klein et Betz (1978). 2x10 ⁶ cellules de Chlamydomonas reinhardtii cultivées dans du Milieu Minimum, 80 mM Trizma et sous atmosphère d'air enrichi à 2% (v/v) CO ₂ sont récoltées, soit pendant la phase exponentielle de croissance ou à différents temps après la carence totale en azote, et stockées à -80 ⁰ C. Les culots de cellules sont remis en suspension dans 2 ml de méthanol pour l'extraction de la chlorophylle, mélangés vigoureusement pendant 1 min et centrifugés. Les surnageants sont utilisés pour quantifier la chlorophylle par photométrie selon la méthode de Lichtenthaler (1987). Les culots sont utilisés pour quantifier l'amidon. Les culots sont rincés avec 1 ml de tampon acétate de sodium (100 mM, pH 4,5), remis en suspension dans 500 μl de tampon acétate de sodium et passés à l'autoclave pendant 15 min à 120 °C pour solubiliser l'amidon. L'amidon total est ensuite quantifié en suivant la conversion enzymatique en glucose à l'aide d'un kit

commercial basé sur une méthode enzymatique (Starch Assay Kit SA-20 - Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), selon les recommandations du fournisseur.

Analyse de Ia teneur en lipides neutres en utilisant Ia coloration au Rouge NiI Le Rouge Nil (9-diéthylamino-5H-benzophénoxazine-5-un) est un colorant qui est excité à 488 nm et émet une fluorescence jaune-or (λ _max = 580) en présence de lipides neutres et orange-rouge (A^ _13x = 615) en présence de lipides polaires. Il est largement utilisé pour la coloration des lipides, car il peut interagir et fluorescer en présence de phospholipides, cholestérols, esters cholestéryl et triglycérides (Greenspan and Fowler, 1985). La teneur en lipides cellulaires est ainsi déterminée en utilisant le Rouge Nil (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA, N3013), tel que décrit dans de la Jara et al. (2003). L'intensité de fluorescence des cellules colorées au Rouge Nil est linéairement corrélée à la teneur en lipides polaires et neutres telle que déterminée par gravimétrie (de la Jara et al, 2003). Les solutions de Rouge Nil sont préparées dans du méthanol (0,1 mg.ml ^" '). Brièvement, 2x10 ⁶ cellules de C. reinhardtii sont incubées dans l'obscurité pendant 20 min avec la solution de coloration (0,1 μg.ml ^"1 de Rouge Nil dans du TBS IX). Les mesures de fluorescence sont effectuées en utilisant un spectrofluoromètre (Perkin-Elmer LS50B) (λexcitation ⁼ 488 nm, λémission = 580 nm). Les cellules non colorées sont utilisées comme contrôles d'autofluorescence. Extraction des lipides et chromatographie sur couche mince

Les lipides sont extraits des cellules de C. reinhardtii en utilisant la méthode en deux étapes décrite dans Bligh et Dyer (1959). La masse totale de lipides est déterminée par gravimétrie après élimination des solvants à l'aide d'un léger courant de N ₂ gazeux. Pour l'analyse par chromatographie sur couche mince (CCM), les lipides sont dissouts dans l'hexane et séparés sur les plaques de chromatographie (250 μM, 20 x 20 cm ; Adsorbosil-Plusl, Alltech, France) avec du n-hexane / diéthyl éther / acide acétique (85:15:1, v/v). Les différentes classes de lipides sont visualisées à l'aide de la vapeur d'iode.

Analyse des esters méthyliques d'acides gras (FAMEs) par chromatographie en phase gazeuse / spectrométrie de masse

Les acides gras totaux des cellules entières de C. reinhardtii sont quantifiés par chromatographie en phase gazeuse / spectrométrie de masse (GC/MS). Les lipides extraits sont d'abord dérivés au trifiuorure de bore (BF3) dans du méthanol (7%, p/v) pour obtenir des esters méthyliques d'acides gras (FAMEs), selon Morrison et Smith

(1964). L'acide heptadécanoïque (17:0) est utilisé comme standard externe. Les esters lipidiques sont ensuite extraits par l'hexane et injectés dans un chromatographe en phase gazeuse (FOCUS) couplé à un spectromètre de masse quadripolaire (DSQ II, Thermo Fisher Scientific, San José, CA, USA). L'hydrogène est utilisé comme gaz porteur. L'injecteur et la ligne de transfert sont maintenus à 225 ⁰ C et 250 °C respectivement, et la source d'ions à 200 °C. Les FAMEs sont séparés sur une colonne TR-WAX (30 m x 0,25 mm x 0,25 μm ; Thermo Fisher Scientific) en mode split (ratio de fractionnement 5:1) à une température de four de 45 °C. Après 1,5 min, la température du four est portée à 150 °C à 15 ⁰ CuIm ^"1 , puis à 240 °C à 6 ⁰ CmIn ^"1 et tenue à 240 ⁰ C pendant 3 min. Les esters méthyliques d'acides gras sont identifiés et quantifiés par comparaison aux standards (FAME Mixture Me-100, Larodan Fine Chemicals AB, Malmô, Suède). Les chromatogrammes et spectres de masse sont analysés en utilisant le logiciel Xcalibur (Thermo Fisher Scientific).

Observation par microscopie à épifluorescence du Rouge Nil et de Ia chlorophylle

La fluorescence du Rouge Nil et de la chlorophylle des cellules de C. reinhardtii est observée à l'aide d'un microscope à épifluorescence Leica DMRXA en utilisant un objectif à immersion à huile 63 X/1.6 (Leica Microsystems, Germany ; filtre d'excitation ByPass 475/40 et filtre barrière Long Pass 510). Les images sont saisies avec le logiciel Spot Insight 4 (Diagnostic Instruments, Inc, Sterling Heights, MI).

II- COMPARAISON DU CONTENU INTRACELLULAIRE EN AMIDON ET EN LIPIDES NEUTRES DE LA SOUCHE DE C. REINHARDTII DE TYPE SAUVAGE 137C (CC-124) AVEC LA SOUCHE CC-406 DEPOURVUE DE PAROI CELLULAIRE Les contenus intracellulaires en amidon et en lipides neutres de la souche de C. reinhardtii de type sauvage CC- 124 (137C) et de la souche mutante CC-406 (cwl5) dépourvue de paroi cellulaire ont été comparés dans des conditions photoautotrophes dans un milieu minéral sous air enrichi en CO ₂ (2 %) et de carence totale en azote.

Les résultats sont présentés aux Figures 1 et 2. Au cours de la phase exponentielle de croissance, le contenu cellulaire en amidon est de l'ordre de 10 à 15 μg.10 ^"6 cellules quelque soit la souche considérée. Ce contenu s'accroît dès le premier jour de carence azotée totale pour atteindre environ 50 μg.10 ^"6 cellules et se stabiliser ensuite chez la souche sauvage ou continuer à augmenter pour atteindre 130-140 μg.10 ^" cellules chez la souche mutante CC-406 (Figures IA et IB). Quant au contenu intracellulaire en

lipides neutres suivi par la fluorescence du Rouge Nil (Figure 2A et 2B), il évolue assez peu chez la souche sauvage. A l'inverse, chez la souche mutante CC-406 (cwl5) dépourvue de paroi cellulaire, on observe une forte augmentation de cette fluorescence indiquant un accroissement net du contenu en lipides neutres. L'accumulation de lipides neutres intervient après 3 jours de carence totale, ce qui correspond au moment où l'accumulation d'amidon atteint un plateau.

III- COMPARAISON DU CONTENU INTRACELLULAIRE EN AMIDON ET EN LIPIDES NEUTRES DE DEUX SOUCHES DE C. REINHλRDTII AFFECTEES DANS LA SYNTHESE DE L'AMIDON ET DEPOURVUES (BAFJ3) OU NON (17) DE PAROI CELLULAIRE

Les contenus intracellulaires en amidon et en lipides neutres ont été comparés chez deux mutants affectés dans la biosynthèse de l'amidon : BAFJ3 et 17. La souche 17, issue de la souche sauvage CC-124 (137C), possède une paroi cellulaire normale (Bail et al, 1991). La souche BAFJ3, issue de la souche CC-406 (cwl5), est dépourvue de paroi cellulaire (Van der Koornhuyse et al, 1996). Les deux souches sont mutées au même locus, STAl, dans le gène codant pour la sous-unité régulatrice de PADP-glucose pyrophosphorylase (Bail et al 1991 ; Van der Koornhuyse et al, 1996).

Les résultats sont représentés aux Figures 1 et 2. En réponse à une carence totale en azote, les mutants BAFJ3 et 17 n'accumulent que peu d'amidon (Figures IA et IB), comme cela avait été précédemment observé (Bail et al, 1991 et Van der Koornhuyse et al, 1996). En revanche, on observe dès le premier jour de carence totale en azote chez la souche affectée dans la synthèse de l'amidon et dépourvue de paroi cellulaire, BAFJ3, une forte augmentation de la fluorescence du Rouge Nil indiquant une accumulation de lipides neutres (Figure 2D). Quant à la souche 17, qui est affectée dans la synthèse de l'amidon mais qui présente une paroi cellulaire normale, une faible augmentation de la fluorescence du Rouge Nil des lipides neutres est observée (Figure 2C), suggérant que cette souche accumule peu de lipides neutres au cours de la carence totale en azote. On remarque que la cinétique d'accumulation de lipides neutres diffère entre les deux souches dépourvues de paroi cellulaire. En effet, l'accumulation semble survenir plus tôt (à J+2) chez la souche BAFJ3 que chez la souche CC-406 (à J+3).

IV- MESURES QUANTITATIVES DU CONTENU INTRACELLULAIRE EN LIPIDES TOTAUX ET EN ACIDES GRAS TOTAUX CHEZ LES SOUCHES CC- 124 (137C), CC-406 (cw!5), 17 (stal-1) ET BAFJ3 (stal-2)

Les résultats essentiellement qualitatifs obtenus avec le Rouge Nil ont été confirmés par des mesures de la production en lipides totaux par méthode gravimétrique, et du contenu intracellulaire en acides gras totaux, effectuées après trans-estérification par chromatographie en phase gazeuse couplée à un spectromètre de masse.

Les dosages ont été effectués en triplicat sur des cellules en phase exponentielle de croissance (+N), ou pendant 4 jours de carence totale en azote (-N, T+l, T+2, T+3, T+4). Les lipides totaux ont été dosés par méthode gravimétrique. Les esters méthyliques d'acides gras (AG totaux) obtenus après trans-estérification des lipides totaux sont analysés et dosés par chromatographie en phase gazeuse couplée à un spectromètre de masse. Le contenu intracellulaire en acides gras totaux est exprimé en μg d'AG totaux /10 ⁶ cellules (les résultats sont présentés à la Figure 1). La productivité en acides gras totaux et lipides totaux est exprimée pour chaque souche en pourcentage par rapport à la matière sèche (P écart-type est calculé sur les trois répétitions). Les résultats sont présentés au Tableau 1 ci-dessous et à la Figure 3.

Les données de productivité en lipides de chaque souche présentées à la Figure 3 montrent que la souche BAFJ3 dépourvue de paroi cellulaire et affectée dans la voie de biosynthèse de l'amidon accumule des lipides de façon significative (jusqu'à 48% du poids sec) au cours de la carence azotée. Dans les mêmes conditions, le contenu en lipides de la souche sauvage CC- 124 (137C) pourvue d'une paroi cellulaire ne dépasse pas 18% du poids sec. En parallèle, les dosages d'acides gras totaux (exprimés en μg AG totaux par 10 ⁶ cellules) indiquent que leur contenu intracellulaire augmente d'un facteur allant jusqu'à 3 pour la souche dépourvue de paroi cellulaire CC-406 (cwl 5) et d'un facteur allant jusqu'à 7 pour BAFJ3 entre la phase exponentielle de croissance et après 4

jours de carence azotée (Figure ID). A l'inverse, ces concentrations restent stables pour la souche CC- 124 et n'augmentent pas même d'un facteur 2 pour la souche 17 (Figure IC). Enfin, en terme de productivité en acides gras et/ou lipides totaux (quantité exprimée en pourcentage par rapport à la matière sèche formée), les souches CC-406 et CC- 124 contenant respectivement beaucoup plus d'amidon que les souches BAFJ3 et 17, produisent moins d'acides gras ou de lipides : par exemple, 17 % d'AG totaux pour CC-406 contre 30% pour BAFJ3 après 4 jours de carence azotée.

V- ANALYSE DU CONTENU INTRACELLULAIRE EN AMIDON ET EN LIPIDES DE DEUX SOUCHES DE C. REINHARDTII AFFECTEES DANS LA SYNTHESE DE L'AMIDON ET DEPOURVUES DE PAROI CELLULAIRE (BAFJ5 ET BAF J6)

Les contenus intracellulaires en amidon et en lipides des souches mutantes de C. reinhardtii BAFJ5 (dénommée aussi staό) et BAFJ6 (dénommée aussi sta7) ont été comparés dans des conditions photoautotrophes dans un milieu minéral sous air enrichi en CO ₂ (2 %) et de carence totale en azote. Les protocoles expérimentaux sont décrits à l'Exemple I ci-dessus.

L'analyse du contenu intracellulaire en amidon de ces deux souches a montré (voir Figure IB) qu'au cours de la carence en azote, la souche BAFJ5 n'accumulait pas d'amidon (contrairement à la souche CC-406 (cwl5) dont elle est issue), et que la souche BAFJ6 accumulait de très faibles quantités (environ 3 μg d'amidon /10 ⁶ cellules) de phytoglycogène, une forme soluble d'amidon.

Le contenu en lipides totaux (exprimé en μg.10 ^"6 cellules ou en % par rapport à la matière sèche cellulaire) de la souche BAFJ5 (staό) est représenté à la Figure 3. On peut remarquer que le contenu en lipides totaux de cette souche augmente de manière significative en réponse à une carence en azote.

Le contenu en acides gras totaux des souches BAFJ5 (staό) et BAFJ6

(staT) a fortement augmenté en réponse à la carence en azote pour atteindre respectivement

18 μg.10 ^"6 cellules et 28 μg.10 ^"6 cellules après 4 jours de carence en azote (voir Figure ID).

Les résultats de productivité en acides gras totaux (quantité exprimée en pourcentage par rapport à la matière sèche formée) des souches BAFJ5 et BAFJ6 sont représentés au Tableau 2 ci-dessous.

VI- ANALYSE DES LIPIDES PRODUITS PAR LES SOUCHES DEPOURVUES DE PAROI CELLULAIRE (CC-406, BAFJ3 ET BAFJ6) La séparation par chromatographie sur couche mince des différentes classes de lipides accumulés au cours de la carence totale en azote confirme que les lipides représentés chez les mutants dépourvus de paroi cellulaire (CC-406, BAFJ3 et BAFJ6) sont essentiellement des lipides neutres de type triglycérides (Figure 4). De plus, l'observation par microscopie à épifluorescence des cellules colorées au Rouge Nil révèle la présence de vésicules lipidiques de couleur jaune chez les souches CC-406 (cwl5), BAFJ3 (staJ-2) et BAFJ6 (staT). Ces mêmes vésicules sont respectivement absentes et peu nombreuses chez les souches CC-124 (137C) et 17. Les triglycérides accumulés au cours de la carence totale en azote chez les souches mutantes dépourvues de paroi cellulaire seraient donc stockés dans ces vésicules pour remplir la quasi-totalité du volume cellulaire en fin d'expérience (Figure 5).

VII- ANALYSE DU CONTENU INTRACELLULAIRE EN AMIDON, EN LIPIDES ET EN ACIDES GRAS TOTAUX DES SOUCHES CC-408 ET CC-851

Afin de montrer le rôle de l'intégrité fonctionnelle de la paroi cellulaire sur l'accumulation des lipides, le contenu intracellulaire en amidon, lipides et acides gras a été comparé chez deux souches de C. reinhardtii : la souche de type sauvage CC-408 (pourvue d'une paroi cellulaire fonctionnelle) et la souche mutante CC-851, qui produit une paroi cellulaire en quantité normale mais qui n'est pas attachée à la membrane plasmique.

Le dosage de l'amidon et des lipides a été effectué en triplicat sur des cellules en phase exponentielle de croissance (+N), ou pendant 3 jours après une carence totale en azote (-N, T+l, T+2, T+3). Les protocoles expérimentaux sont décrits à l'Exemple I ci-dessus.

Les résultats du dosage et de l'analyse des lipides totaux de la souche CC-408 sont présentés au Tableau 3 ci-dessous et à la Figure 8.

Les résultats du dosage et de l'analyse des lipides totaux de la souche CC-851 sont présentés au Tableau 4 ci-après et à la Figure 9.

II ressort de ces résultats que :

- le contenu intracellulaire en acides gras totaux de la souche de type sauvage CC-408 est resté inchangé au cours de la carence azotée (comme pour la souche CC- 124). En revanche, on observe chez la souche mutante CC-851 (cw2) une forte accumulation d'amidon (jusqu'à 80 μg.10 ^"6 cellules) et d'acides gras (jusqu'à 22 μg.10 ^"6 cellules). L'analyse des lipides accumulés par la souche CC-851 (cw2) a montré que ceux- ci étaient principalement des lipides neutres (triglycérides) ; - le dosage des lipides totaux (quantité exprimée en μg.10 ^"6 cellules) indique que leur contenu dans la souche CC-851 double en réponse à la carence en azote (comme pour la souche CC-406). Cette réponse similaire entre les souches CC-851 (cw2) et CC-406 (cwl5) suggère que l'intégrité fonctionnelle de la paroi cellulaire, plutôt que la présence des constituants de la paroi cellulaire, est impliquée dans l'accumulation des triglycérides, c'est-à-dire que l'accumulation des lipides neutres semble être induite par la perte de l'intégrité fonctionnelle de la paroi cellulaire.

VIII- MISE AU POINT ET VALIDATION D'UNE METHODE DE CRIBLAGE SUR PLAQUE MULTI-PUITS POUR LA SELECTION DE SOUCHES MUTANTES DE C. REINHARDTII QUI ACCUMULENT DES LIPIDES. Dans le but de cribler des mutants de l'algue Chlamydomonas reinhardtii sur-producteurs de lipides de réserve, un crible de sélection, basé sur la coloration des lipides par une sonde fluorescente spécifique, le Rouge Nil, a été mis au point et validé. Après excitation à 488 nm du Rouge Nil, l'émission maximale de fluorescence se situe

autour de 580 nm (dans le jaune) pour les lipides neutres et de 620 nm (dans le rouge) pour les lipides polaires.

Une méthode de criblage faisant appel à des plaques multi-puits de type Elisa a été mise au point pour cribler un grand nombre de souches (Figure 6A). Pour cela, la souche mutante BAFJ5 accumulatrice de lipides a été utilisée. Cette souche a été préalablement cultivée en Milieu Minimum et sous atmosphère d'air enrichi à 2% de CO ₂ puis placée pendant 3 jours en carence azotée totale. Il a été ensuite procédé à la validation de cette méthode de criblage sur micro-puits par comparaison de la fluorescence émise à 580 nm en présence de Rouge Nil par une souche sauvage (137C) non productrice de lipides et la souche BAFJ5 productrice de lipides. Les résultats montrent une nette différence de fluorescence entre la souche sauvage et la souche mutante (Figure 6B).

Ce crible est donc utilisable pour le criblage haut-débit de banques de mutants d'algues dans le but de rechercher des mutants qui accumulent ou au contraire n'accumulent pas ou peu de lipides, ces mutants présentant un intérêt pour la production de lipides elle-même ou pour la caractérisation des mécanismes moléculaires impliqués dans l'accumulation de lipides.

IX- PROCEDE DE PRODUCTION DE LIPIDES NEUTRES EN CONDITIONS DE CARENCE PARTIELLE EN AZOTE A PARTIR DE LA SOUCHE MUTANTE DE C. REINHARDTII BAFJ3 La souche de Chlamydomonas reinhardtii mutante BAFJ3 a été cultivée dans un premier temps en conditions mixotrophes (milieu TAP et lumière à 250 μmol.m ^{" 2} .sec ^" ') sous agitation constante. Une fois la phase exponentielle de croissance atteinte (4 à 8.10 ⁶ cellules/ml), la préculture a été utilisée pour réaliser une culture en conditions photoautotrophes (milieu minimum et lumière à 150 μmol.m ^"2 . sec ^"1 ) bullée sous air enrichi à 2% de CO ₂ en présence d'une concentration faible mais non nulle en azote (0,75 mM et 1,5 mM NH ₄ Cl au lieu de 7,5 mM). L'inoculum a été effectué à 0,5.10 ⁶ cellules/ml et des échantillons ont été prélevés durant 4 jours.

Les acides gras totaux ont été dosés et analysés selon les protocoles expérimentaux décrits à l'Exemple I ci-dessus. Le résultat du dosage des acides gras totaux est présenté au Tableau 5 ci-après (prélèvements à T+l et T+4).

L'analyse, par chromatographie sur couche mince, des lipides accumulés par la souche BAFJ3, a montré que ceux-ci étaient principalement des lipides neutres (triglycérides).

Il ressort de ces résultats qu'une concentration nulle (cf. Exemples IV et VI) ou faible en azote dans le milieu de culture permet d'induire une accumulation significative de lipides intracellulaires, notamment des lipides neutres chez la souche mutante BAFJ3 de C. reinhardtii.

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