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技术领域

本发明属于干细胞及生物医药领域。 具体地， 本发明涉及异体间质血管层细 胞和异体间充质祖细胞在预防或治疗骨性关节 炎中的应用。 背景技术

骨性关节炎 (osteoarthritis, OA)是一种以关节软骨的变性、 破坏及骨质增生为 特征的慢性关节病。 OA在 60岁以上的人群中患病率为 50%， 75岁以上的人群中 则达 80%， 致残率高达 53% (中华医学会骨科学分会， 2007年 《骨关节炎诊治指 南》修订版)。 OA好发于负重大、活动多的关节，如膝关节，� ��为膝骨关节炎（KOA)。 膝骨关节炎是造成老年人活动功能障碍的主要 疾病之一， 同时给医疗保险及家庭 带来沉重的经济负担。

目前膝骨关节炎 （KOA) 的总体治疗原则是通过药物及非药物治疗相结 合， 必要时手术治疗， 以达到减轻或消除疼痛， 矫正畸形， 改善或恢复关节功能， 提 高生活质量的目的。

药物治疗主要包括非甾体类抗炎药 (NSAIDs)等镇痛药、 关节腔内注射透明质 酸 （HA) 或糖皮质激素、 改善病情类药物及软骨保护剂等。 这些药物在一定程度 上可延缓病程、 改善患者症状， 但疗效有限， 不能逆转病理过程， 或修复软骨损 伤， 且大部分药物副作用明显。

当常规疗法无效时， 出现关节畸形及关节功能障碍者， 则需要外科手术治疗。 外科治疗主要通过关节镜 (窥镜)和开放手术， 虽然能够暂时性的缓解疼痛， 但其 费用昂贵， 且长远效果并不理想。 据报道， 关节置换手术一般在 10-15年后就可 能出现磨损甚至假肢松动。 因此， 目前研究旨在探寻新颖的治疗和修复策略

组织工程方面致力于自体软骨细胞移植或基质 诱导的自体软骨细胞移植， 对 于退化关节组织的生物修复或再生提供了长期 解决的可能性。 然而， 此类技术的 主要局限是无法治疗较大的软骨缺损。 其对供体位点造成的破坏， 去分化以及软 骨细胞有限的生存时间等因素的影响， 并不适用于 KOA患者。

目前不少研究也从其他来源的异体间充质祖细 胞着手， 如脂肪异体间充质祖 细胞。 脂肪异体间充质祖细胞存在来源广泛、 安全、 低免疫原型及优异的免疫调 节能力等特性， 在治疗 KOA时显示出独特的疗效。 本公司也开发了自体来源的 脂肪异体间充质祖细胞， 临床疗效确切。 但因部分 KOA患者无法提供自体脂肪， 如具有传染病者或年老瘦弱者， 导致这部分患者不能应用自体脂肪异体间充质 祖 细胞治疗 KOA。

故本公司还开发了异体来源的脂肪异体间充质 祖细胞， 以填补这部分患者的 需求。 发明内容 本发明的目的就是提供异体间质血管层细胞和 异体间充质祖细胞在预防或治 疗膝骨关节炎中的应用。 在本发明的第一方面， 提供了一种异体间质血管层细胞 （SVF ) 和异体间充 质祖细胞（haMPCs) 的用途， 它们被用于制备预防和 /或治疗骨性关节炎的药物组合 物。

在另一优选例中， 所述的骨性关节炎选自下组： 膝骨关节炎、 脊柱骨关节炎、 髋 骨关节炎、 或其组合。

在另一优选例中， 所述的骨性关节炎为膝骨关节炎。

在另一优选例中， 所述的异体间质血管层细胞为异体间质血管层 细胞群。

在另一优选例中， 所述的异体间充质祖细胞为异体间充质祖细胞 群。

在另一优选例中， 所述的异体间质血管层细胞具有选自下组的任 一或多种特征:

(i) 30%以上的细胞具有表面抗原 CD29;

(ii) 50%以上的细胞具有表面抗原 CD73 ;

(iii) 85%以上的细胞具有表面抗原 CD49d;

(iv) 55%以上的细胞具有表面抗原 CD90。

在另一优选例中， 35%以上的细胞具有表面抗原 CD29。

在另一优选例中， 55%以上的细胞具有表面抗原 CD73。

在另一优选例中， 90%以上的细胞具有表面抗原 CD49d。

在另一优选例中， 60%以上的细胞具有表面抗原 CD90。

在另一优选例中， 所述的异体间质血管层细胞具有选自下组的任 一或多种特 征：

(v) 85%以下的细胞具有表面抗原 CD34;

(vi) 15%以下的细胞具有表面抗原 CD45。

在另一优选例中， 80%以下的细胞具有表面抗原 CD34。

在另一优选例中， 12%以下的细胞具有表面抗原 CD45。

在另一优选例中， 所述的异体间质血管层细胞分泌选自下组的细 胞因子： 干细 胞生长因子 (HGF), 血管内皮生长因子 (VEGF)、 血小板衍生因子 (PDGF)、 人转化 生长因子 P(TGF-P)、 巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)、 白介素 -2(IL-2)、 白介素 -10(IL-10)、 或其组合。

在另一优选例中， 所述的异体间质血管层细胞为异体间质血管层 细胞群。

在另一优选例中， 异体间质血管层细胞分泌的干细胞生长因子 (HGF)的浓度 ^0.5ng/ml, 较佳地 0.8ng/ml。

在另一优选例中， 异体间质血管层细胞分泌的血管内皮生长因子 (VEGF)的浓 度^35 /1111， 较佳地 40pg/ml。

在另一优选例中，异体间质血管层细胞分泌的 人转化生长因子 P(TGF-P)的浓度 ^ 150 g/ml, 较佳地 180 pg/ml。

在另一优选例中，异体间质血管层细胞分泌的 白介素 -2(IL-2)的浓度 15pg/ml， 较佳地 20pg/ml， 更佳地 30pg/ml。 在另一优选例中， 异体间质血管层细胞分泌的白介素 -IO(IL-IO)的浓度

^ 15p在在在在在在在在在在g/ml, 较佳地 20pg/ml， 更佳地 30pg/ml， 最佳地 40pg/ml。

在另另另另另另另另另另另一优选例中， 所述的异体间充质祖细胞具有选自下组的任一 或多种特征：

(i) 95%以上的细胞具有表面抗原 CD90;

(ii) 95%以上的细胞具有表面抗原 CD73 ;

(iii) 95%以上的细胞具有表面抗原 CD29;

(iv) 95%以上的细胞具有表面抗原 CD49d。

一优选例中， 98%以上的细胞具有表面抗原 CD90。

优选例中， 98%以上的细胞具有表面抗原 CD73。

优选例中， 98%以上的细胞具有表面抗原 CD29。

优选例中， 98%以上的细胞具有表面抗原 CD49d。

优选例中， 所述的异体间充质祖细胞具有选自下组的任一 或多种特征：

(v) 2%以下的细胞具有表面抗原 HLA-DR;

(vi) 2%以下的细胞具有表面抗原 Actin;

(vii) 2%以下的细胞具有表面抗原 CD34;

(viii) 2%以下的细胞具有表面抗原 CD45 ;

(ix) 2%以下的细胞具有表面抗原 CD14。

在另一优选例中， 1%以下的细胞具有表面抗原 HLA-DR。

优选例中， 1%以下的细胞具有表面抗原 Actin。

优选例中， 1%以下的细胞具有表面抗原 CD34。

优选例中， 1%以下的细胞具有表面抗原 CD45。

优选例中， 1%以下的细胞具有表面抗原 CD14。

优选例中， 所述的异体间充质祖细胞分泌选自下组的细胞 因子： 血管 内皮生长因子 (VEGF)、 人转化生长因子 a(TGF-a)、 人转化生长因子 P(TGF-P)、 粒 细胞集落刺激生物因子 (GM-CSF)、 肝细胞生长因子 (HGF)、 血小板衍生因子 (PDGF)、 白介素 -2(IL-2)、 白介素 -4(IL-4)、 白介素 -10(IL-10)。

在另一优选例中， 异体间充质祖细胞分泌的血管内皮生长因子 (VEGF)的浓度 ^ lOpg/ml, 较佳地 15pg/ml。

在另一优选例中， 异体间充质祖细胞分泌的人转化生长因子 P(TGF-P)的浓度 ^300pg/ml, 较佳地 400pg/ml。

在另一优选例中， 异体间充质祖细胞分泌的粒细胞集落刺激生物 因子 (GM-CSF) 的浓度 30ng/ml， 较佳地 40ng/ml。

在另一优选例中， 异体间充质祖细胞分泌的肝细胞生长因子 (HGF)的浓度 ^0.4ng/ml, 较佳地 0.5ng/ml。

在另一优选例中， 异体间充质祖细胞分泌的血小板衍生因子 (PDGF)的浓度

^0.008ng/ml, 较佳地 0.01ng/ml。

在另一优选例中， 异体间充质祖细胞分泌的白介素 -2(IL-2)的浓度 25pg/ml， 较佳地 30pg/ml。

在另一优选例中，异体间充质祖细胞分泌的白 介素 -IO(IL-IO)的浓度 30pg/ml， 较佳地 40pg/ml。

在本发明的第二方面， 提供了一种用于预防和 /或治疗骨性关节炎的药物组合 物， 所述的药物组合物包括： 有效量的异体间质血管层细胞 （SVF ) 和异体间充 质祖细胞 （haMPCs ) ， 以及药学上可接受的载体。

在另一优选例中， 所述的药物组合物为皮下注射试剂。

在另一优选例中， 所述的药学上可接受的载体包括 (但并不限于)： 盐水、 缓冲 液、 葡萄糖、 水、 甘油、 乙醇、 及其组合。

在另一优选例中， 所述异体间质血管层细胞的浓度为 Ο. Ι-lOOx lO ⁴ 个 /ml, 较 佳地为 Ι-lOx lO ⁴ 个 /ml, 更佳地为 2χ 10 ⁵ 个 /ml。

在另一优选例中， 所述异体间充质祖细胞浓度为 Ο. Ι-lOOx lO ⁴ 个 /ml, 较佳地 为 1-lOx lO ⁴ 个 /ml, 更佳地为 2χ 10 ⁵ 个 /ml。

在本发明的第三方面，提供了一种预防和 /或治疗骨性关节炎的方法，包括步骤: 给需要的对象施用异体间质血管层细胞（SVF )和异体间充质祖细胞（haMPCs ) 、 或施用含有异体间质血管层细胞 （SVF ) 和异体间充质祖细胞 （haMPCs ) 的药物 组合物。

在另一优选例中， 所述的对象为人或非人哺乳动物， 优选人。

在另一优选例中， 所述的方法包括步骤：

(1) 给需要的对象施用异体间质血管层细胞； 和

(2) 给需要的对象施用异体间充质祖细胞。

在另一优选例中， 施用部位为所述对象的关节腔内。

在另一优选例中， 步骤 (1)与步骤 (2)之间间隔时间为 1个月以上， 和 /或 3个 月以上。 应理解， 在本发明范围内中， 本发明的上述各技术特征和在下文 (如实施例） 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合 ，从而构成新的或优选的技术方案。 限于篇幅， 在此不再一一累述。 附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案， 而不用于限定由权利要求书所界 定的本发明范围。

图 1显示了异体来源的 SVF与 haMPCs混合疗法治疗 KOA流程。

图 2显示了 SVF的表面抗原检测结果， 图 2A—图 21分别显示 CD34、 CD29、 CD73、 CD49d、 CD90、 CD14、 CD45、 Actin、 HLA-DR抗原的检测结果。

图 3为 haMPCs的 VEGF分泌量的变化； 图 3A显示 LPS刺激 24h后 haMPCs 的 VEGF分泌量的变化； 图 3B显示低氧刺激对 haMPCs的 VEGF分泌量的影响。

图 4显示 haMPCs成软骨诱导实验结果。

图 5显示 haMPCs成骨诱导实验结果。 具体实施方式 本发明人经过广泛而深入的研究， 首次意外地发现， 异体间质血管层细胞和 异体间充质祖细胞在预防或治疗骨性关节炎中 具有极为优异的效果。 具体地， 给 需要的对象施用本发明的异体脂肪来源的异体 间质血管层细胞和异体间充质祖细 胞， 或施用含有异体脂肪来源的异体间质血管层细 胞和异体间充质祖细胞的药物 组合物， 对于骨性关节炎有显著的预防或治疗作用。 异体间充质祖细胞具有很高 的细胞因子分泌能力， 在体内合适条件下可对机体的损伤进行修复： 异体间质血 管层细胞和异体间充质祖细胞具有成软骨分化 及成骨化的能力。 本发明还提供了 一种预防和治疗骨性关节炎的方法以及含有异 体间质血管层细胞和异体间充质祖 细胞的药物组合物。 在此基础上完成了本发明。 术语

如本文所用， 术语 "以上"和 "以下"包括本数， 例如 " 95%以上" 指 95%， " 0.2%以下" 指 0.2%。 骨性关节炎

如本文所用， 术语 "骨性关节炎" 与 "osteoarthritis"或 " OA" 可互换使用。 骨性关节炎是一种慢性关节疾病， 它的主要改变是关节软骨面的退行性变和 继发性的骨质增生， 表现在关节疼痛和活动不灵活， X线表现关节间隙变窄， 软 骨下骨质致密， 骨小梁断裂， 有硬化和囊性变； 关节边缘有唇样增生； 后期骨端 变形， 关节面凹凸不平； 关节内软骨剥落， 骨质碎裂进入关节， 形成关节内游离 体。

在本发明中， 所述的骨性关节炎可以是任选自下组的骨性关 节炎： 膝骨关节 炎、 脊柱骨关节炎、 髋骨关节炎、 或其组合。 本发明所述的骨性关节炎优选为膝骨 关节炎。 脂肪

脂肪是整形和抗衰老治疗的优良来源， 脂肪组织材料可以来源于腰部、 臀部、 腹部、 大腿、 上臂等部位。 本领域技术人员可采用通用的技术方法获得脂 肪组织， 包括 (但不限于)抽吸、 手术分离等方法。

在本发明中， 脂肪组织或脂肪原料没有特别限制， 可以是来源于动物或人的 任何部位的脂肪组织， 优选人的脂肪组织。 较佳地， 脂肪组织可以是腰部、 臀部、 腹部、 大腿、 上臂等部位的组织。 异体间质血管层细胞

如本文所用，术语 "异体间质血管层细胞" 、 " SVF" 、或 "间质血管碎片" 可以互换使用。

异体间质血管层细胞是从脂肪组织中分离得到 的一种具有多向分化潜能的干 细胞。 SVF能够在体外稳定增殖且衰亡率低， 它取材容易、 体内储备量大、 适宜 大规模培养、 对机体损伤小、 来源广泛、 抗原性极低、 适宜异体移植。 SVF是干 细胞辅助脂肪移植中最重要的组分。 通过胶原酶消化， 从脂肪组织中分离的多种 细胞混合物形成的细胞团就叫做间质血管碎片 。 间质血管碎片中含有丰富的间充 质细胞， 可分化为多种谱系的细胞， 是再生医学、 组织工程等最理想的种子细胞， 本领域的技术人员能够使用通用的方法进行 SVF的分离和纯化。

如本文所用， 术语 "分离方法" 、 " SVF的分离方法" 可以互换使用， 都指 从原始的脂肪组织中获得分离的 SVF的方法和过程。 对于获得的 SVF的脂肪细 胞材料， 首先进行洗涤， 除去血细胞； 脂肪破碎， 消化； 去除未消化的组织， 获 得含 SVF的滤液； 离心得到 SVF。 得到的 SVF可以用于进一步传代、 培养或冻 存。

在一个优选的实施例中， 分离 SVF可以包括步骤 (但不限于)： 将吸脂后的脂 肪用 PBS反复冲洗两次， 然后在 37°C条件下用胶原酶消化 30min， 1200g离心 lOmin后即获得高密度的 SVF碎片， 其中主要包括间质细胞、 血管内皮细胞和壁 细胞。 另外， SVF中也包括一些血管来源的细胞， 如白细胞和红细胞等， 各种细 胞之间具有协同效应。 异体间质血管层细胞的抗原检测

用本发明使用的 SVF具有很高的纯度， 基本上不含有其他类型的细胞或干细 胞。 这可通过细胞表面抗原的检测加以验证。

SVF具有多种特异性抗原和受体， 主要有 CD3、 CD13、 D29、 CD34、 CD45、 CD49e、 CD59、 CD73、 CD90、 CD105、 HLA-ABC等。

CD34抗原是一种高度糖基化 I型跨膜蛋白， 它选择性的表达于人类造血干 细胞 (HSC), 祖细胞 (PC)和血管内皮细胞 (EC)表面， 带有 CD34的脂肪组织祖细胞 在总干细胞的比例优选为 0.2%， 更佳地， 0.2%。

CD45存在于所有造血细胞的表面， 包括造血干细胞和破骨细胞。 带有 CD45 的脂肪组织祖细胞在总干细胞的比例优选为 0.1%。

CD29、 CD73、 CD49d、 CD90等主要存在于脂肪异体间充质祖细胞表面� � 带有 CD29的 SVF在总干细胞的比例优选为 30%， 更佳地 32%， 最佳地 带有 CD73的 SVF在总干细胞的比例优选为 50%， 更佳地 60%， 最佳地 70%。

带有 CD49d的 SVF在总干细胞的比例优选为 85%， 更佳地 90%， 最佳地 95%。

带有 CD90的 SVF在总干细胞的比例优选为 55%， 更佳地 60%， 最佳地 65%。

本领域内技术人员可以使用通用的方法检测 SVF的纯度和分化程度， 如流式 细胞仪法。 检测时， 加入不同的与有针对性的特异抗体， 抗体可以是完整的单克 隆或多克隆抗体， 也可以是具有免疫活性的抗体片段， 如 Fab'或 (Fab)2片段； 抗 体重链； 抗体轻链； 遗传工程改造的单链 Fv分子 (Ladner等人， 美国专利

No.4,946,778); 或嵌合抗体， 如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗 体部 分的抗体。 加入抗体与细胞表面的抗原结合一定时间， 用流式细胞仪对细胞进行 自动分析和分选。 异体脂肪来源的间充质祖细胞

如本文所用， 术语 "异体脂肪来源的间充质祖细胞" 、 " haMPCs " 或

" adipose tissue-derived mesenchymal progenitor cells "含义相同， 可以互换使用。

本发明使用的异体脂肪来源的间充质祖细胞优 选人来源的脂肪来源的异体间 充质祖细胞。

本领域的普通技术人员可以使用常规方法进行 haMPCs的分离和培养， 在一 个优选例的实施例中， 包括步骤：

a. 分装脂肪： 将抽取的脂肪装至离心管中， 抽取的脂肪分两部分， 一部分用 胶原酶消化洗涤后， 用于制备成 SVF细胞悬液， 直接进行现场回输； 另一部分获 得 SVF后继续培养， 以获得脂肪祖细胞；

b. 脂肪分解： 向离心管中加入酶剂， 置恒温振荡器中， 进行脂肪消化， 待消 化完毕， 离心后弃去上层消化后的脂肪， 收集沉淀并洗涤；

c 过滤： 加细胞洗液， 混匀， 用细胞滤网过滤后细胞计数， 离心， 洗涤沉淀。 过滤后的细胞即为血管基质层细胞 SVF ( stromal vasvular fraction Cells ) 。 SVF 是从脂肪组织中分离的多种细胞混合物， 是由多种同种异质细胞组成的细胞群， 其中包括 MPCs样细胞， 内皮 （祖） 细胞， 血管平滑肌细胞以及其他部分的血液 来源细胞， 包括粒细胞、 单核细胞、 淋巴细胞等；

d. SVF悬液制备： 将过滤后的 SVF细胞配制成 5ml细胞悬液， 用注射剂将悬 液吸入后， 将悬液注入 100ml生理盐水袋中；

e. 细胞培养： 根据计数细胞的量调整接种密度接种至培养瓶 置 CO ₂ 培养箱培 养；

f. 传代： 接种 3天左右出现少量贴壁异体间充质祖细胞， 培养 5-7天贴壁细 胞呈集落时， 消化传代， 收集并计数细胞， 原代贴壁情况 1 : 1-2的比例传代， 传 代培养 2至 3周， 收集细胞 （异体脂肪来源的祖细胞） ；

g. 制备脂肪来源的祖细胞悬液： 将收集的脂肪来源的祖细胞离心洗涤后， 注 入生理盐水， 制成细胞悬液。 脂肪来源的异体间充质祖细胞的抗原检测

本发明使用的异体脂肪来源的间充质祖细胞具 有极高的纯度和活性。

本领域的普通技术人员可以使用常规方法对异 体间充质祖细胞表面抗原进行 检测， 如过流式细胞仪法等。

脂肪来源的异体间充质祖细胞具有多种特异性 抗原和受体， 主要有： CD29、

CD73、 CD90、 CD49d等。

带有 CD73抗原的异体间充质祖细胞在总异体间充质� �细胞中的比例 95 % , 更佳地 98 %， 更佳地 99 %， 最佳地为 100%。

带有 CD90抗原的异体间充质祖细胞在总异体间充质� �细胞中的比例 95 %, 更佳地 98%， 更佳地 99%， 最佳地为 100%。

带有 CD29抗原的异体间充质祖细胞在总异体间充质� �细胞中的比例 95 %, 更佳地 98%， 更佳地 99%， 最佳地为 100%。

带有 CD49d抗原的异体间充质祖细胞在总异体间充质� ��细胞中的比例 95 %, 更佳地 98%， 更佳地 99%， 最佳地为 100%。

脂肪来源的异体间充质祖细胞的阴性指标包括 ： HLA-DR、 Actin、 CD34、 CD45、 CD14等。

带有 HLA-DR抗原的异体间充质祖细胞在总异体间充质 祖细胞中的比例 2%， 更佳地 1%， 更佳地 0.5%， 最佳地没有 HLA-DR抗原。

带有 Actin抗原的异体间充质祖细胞在总异体间充质� ��细胞中的比例 2%， 更佳地 1%， 更佳地 0.5%， 最佳地没有 Actin抗原。

带有 CD34的异体间充质祖细胞在总异体间充质祖细� �中的比例 2%， 更佳 地 1%， 更佳地 0.5%， 最佳地没有 CD34。

带有 CD45的异体间充质祖细胞在总异体间充质祖细� �中的比例 2%， 更佳 地 1%， 更佳地 0.5%， 最佳地没有 CD45。

带有 CD14的异体间充质祖细胞在总异体间充质祖细� �中的比例 2%， 更佳 地 1%， 更佳地 0.5%， 最佳地没有 CD14。

本发明使用的 haMPCs优选是可以大量分泌 VEGF、TGF- a、TGF-p、GM-CSF、 HGF、 PDGF、 IL-2、 IL-4、 IL-10等生子因子的人来源的 haMPCs, 并具有极强克 隆形成能力和极低的免疫原性。

本领域的普通技术人员可以使用常规方法对 haMPCs进行使用、 处理、 施用 等操作。 如： 每批 haMPCs发放或使用之前， 必须通过无菌、 内毒素和支原体检 查， 以及 DNA同一认定。每批发放的细胞都要符合细胞活 力 95%、细胞纯度 (阳 性指标 95%， 阴性指标<2%)。 haMPCs急毒、 过敏检测结果均呈阴性， 均有一 份相应的检测报告。 药物组合物及其应用

本发明还提供了一种药物组合物， 它含有有效量的异体间质血管层细胞和异 体间充质祖细胞， 以及药学上可接受的载体。

通常， 可将异体间质血管层细胞和异体间充质祖细胞 配制于无毒的、 惰性的 和药学上可接受的水性载体介质中， 如生理盐水中， 其中 pH通常约为 5-8， 较佳 地， pH约为 7-8。

如本文所用，术语 "有效量" 或 "有效剂量" 是指可对人和 /或动物产生功能 或活性的且可被人和 /或动物所接受的量。

如本文所用， "药学上可接受的" 的成分是适用于人和 /或哺乳动物而无过度 不良副反应 （如毒性、 刺激和变态反应） 的， 即具有合理的效益 /风险比的物质。 术语"药学上可接受的载体"指用于治疗剂给药� ��载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

本发明的药物组合物含有的载体包括 (但并不限于)： 盐水、 缓冲液、 葡萄糖、 水、 甘油、 乙醇、 及其组合。 通常药物制剂应与给药方式相匹配， 本发明的药物 组合物可以被制成针剂形式， 例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水 溶液 通过常规方法进行制备。 所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。 活性成分的给 药量是治疗有效量。 本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。

本发明所述异体间质血管层细胞和异体间充质 祖细胞的有效量可随给药的模 式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。 优选的有效量的选择可以由本领域普通 技术人员根据各种因素来确定 (例如通过临床试验)。 所述的因素包括但不限于： 所述药代动力学参数例如生物利用率、 代谢、 半衰期等； 患者所要治疗的疾病的 严重程度、 患者的体重、 患者的免疫状况、 给药的途径等。

本发明的药物组合物优选为皮下注射试剂。 在另一优选例中， 所述皮下注射 试剂的异体间质血管层细胞的浓度为 0.1-lOOx lO ⁴ 个 /ml，较佳地为 1-I0x l0 ⁴ 个 /ml, 更佳地为 2χ 10 ⁵ 个 /ml; 和 /或异体间充质祖细胞浓度为 0.1-lOOx lO ⁴ 个 /ml, 较佳地 为 1-lOx lO ⁴ 个 /ml, 更佳地为 2χ 10 ⁵ 个 /ml。

本发明还提供了一种使用本发明所述药物组合 物的方法， 在一个具体地实施 例中， 包括步骤：

(1) 给需要的对象施用异体间质血管层细胞， 优选的施用部位为所述对象的 关节腔内； 和

(2) 给需要的对象施用异体间充质祖细胞， 优选的施用部位为所述对象的关 节腔内； 优选的使用时间为步骤 (1)之后的 1个月， 和 /或 2个月。

本发明所述的施用流程见图 1。

本发明的主要优点如下：

(1) 本发明的 SVF和 haMPCs来源广泛；

(2) 本发明的 SVF和 haMPCs在体内使用是安全的；

(3) 本发明的 SVF和 haMPCs用于大鼠， 异种间未出现任何免疫排斥反应； (4) 本发明使用的 haMPCs经 LPS、低氧等刺激后， 各种细胞因子的表达量会 出现均明显上升， haMPCs具有较高的细胞因子分泌能力， 在体内合适条件下能 进行机体损伤修复；

(5) 本发明的 haMPCs具有典型的间充质干细胞特性， 在体内的合适条件下 具有潜在的分化能力， 从而满足机体相对需求；

(6) 本发明的 SVF与 haMPCs混合疗法中， haMPCs在特定诱导条件下可转 化为软骨细胞和骨细胞， 应用于预防或治疗骨性关节炎。 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明 本发明而不用于限制本发明的范围。 下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件如 Sambrook等人，分子克隆：实验室手册 (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。 实施例 1

SVF和 haMPCs治疗膝骨关节炎 （KOA) 患者男性， 53岁， 双侧膝关节疼痛 6年余， 加重 1月。 持续性疼痛， 仅能耐 受室内行走， 上下楼梯困难， 平地行走疼痛， 伴晨僵。 X线检查提示： 关节边缘 增生， 骨赘形成， 关节间隙变窄， 有硬化性改变。 WOMAC评分 103分。 诊断： 中度膝骨关节炎。

从整形外科获取 Lipokit抽取的清洁脂肪约 30ml (脂肪提供者为 29岁健康女 性， 因减肥到整形外科抽脂， 抽脂前 BMI为 26.73。 ） ， 其中从 10ml新鲜获取的 脂肪组织中分离出血管基质部分， 经胶原酶消化、 过滤、 离心除去成熟脂肪细胞 后得到 SVF, 对所述 SVF进行表面抗原鉴定， 鉴定结果见图 2。

将每侧剂量均为 1 * 10 ⁷ 个细胞 /2ml的 SVF注射于患者双侧关节腔内。 剩余脂 肪组织分离提纯后培养 P2-P5代获得 haMPCs。 haMPCs冷冻保存， 待解冻复苏后 可再次培养， 待首次注射后的第 1、 3个月再各接受一次双侧关节腔， 每侧的量均 为 1* 10 ⁷ /个 /2ml。 每次注射后 24小时、 72小时、 1周均检测血尿常规、 肝肾功能、 凝血功能、 电解质等指标。

结果： 各次上述指标检测未见明显异常。 患者疼痛缓解， 活动能力明显提高， 平地行走及上下楼梯时疼痛减轻； X线检查见关节面较前稍改善。 WOMAC评分 为 62分。 实施例 2 SVF及 haMPCs的鉴定

1.流式检测

通过酶消化法将细胞收集到离心管中， 细胞悬液调整密度为 l x l0 ⁵ /mL，

800r/min(120g), 离心 5 min， 弃掉上清， 用 4°C的冷 D-Hanks 冲洗重悬细胞， 再 次将细胞悬液以 800 r/min， 离心 5 min， 之后弃去上清。 然后用 D-Hanks 将细胞 重悬至 1 mL， 加入抗体 5〜10 L， 避光， 冰上放置 30 min。 用 D-Hanks 冲洗， 离 心，弃上清，重复该冲洗过程 2〜3次，确保将未结合抗体除净最后，加入约 200 至 300 的 D-Hanks 制成悬液， 用流式细胞仪检测 （图 2 ) 。

SVF的流式检测结果见表 1。

表 1

通过流式细胞仪对 SVF进行细胞表面抗原标记表达的分析， 结果表明： 新鲜 分离的祖细胞中 SVF比例为 60%， 且造血祖细胞含量为 70%， 混合细胞较多。

haMPCs的流式检测结果见表 2。

表 2

CD45 〜0% 阴性

CD80 0.02

CD86 0.01

2.细胞分泌因子的检测

将 SVF及 haMPCs在培养室培养 48h， 取上清， 检测细胞分泌因子， 脐带干 细胞为对照组， 检测结果见表 3。

表 3

结果表明： SVF及 haMPCs均有良好的分泌细胞因子的功能， 与脐带干细胞 相当。 实施例 3

haMPCs剌激试验

( 1 ) 分别将新鲜及冻存的 haMPCs置于完全培养基及 5%FBS培养基中培养， 并检测 haMPCs分泌的 VEGF。

结果显示（图 3A)， 完全培养基培养的新鲜 haMPCs组随着 LPS浓度的增加，

VEGF的浓度下降； 5%FBS培养基培养的新鲜 haMPCs组在 200ng/ml时， VEGF 与对照组浓度基本一样， 100ng/ml和 300ng/ml分别有所下降， 完全培养基培养的 冻存 haMPCs组随着 LPS浓度的增加， VEGF的浓度基本变化不大。 整体来看， 血清培养的要比完全培养基的 VEGF要高。

( 2) 检测在低氧刺激下 haMPCs的 VEGF的分泌量， 结果发现， 低氧刺激下

VEGF的分泌量是正常培养下中的 2-3倍， 且 48小时的分泌量是 24小时的 2倍，

VEGF的增量与细胞浓度的增量成正比 （图 3B ) 。

实施例 4

haMPCs成软骨分化试验

采用 GIBCO STEMPRO成软骨分化试剂盒制备成软骨分化培养� �，将 haMPCs 消化离心获取 P3代细胞， 使用标准培养基制备 1.6 X 10 ^Λ 7活细胞 /mL的细胞悬液 待用。 用加样枪吸取 5 L细胞悬液 （细胞量 8 x l0 ⁴ ) ， 接种于多孔培养板板孔中 心， 置于 CO ₂ 培养箱中预培养 2小时。

预培养结束后， 在实验孔中添加 lmL 37°C水浴锅预热的成软骨分化完全培养 基，在对照孔中添加 lmL 37°C水浴锅预热标准培养基，并将多孔培养板� ��于 37°C， 5%CO ₂ 浓度的 CO ₂ 培养箱中进行培养。 在培养过程中， 每隔 2-3天对相应板孔进 行换液。经过足够培养时间后（7、 14天），在当天配置 4%福尔马林溶液（ImL 40% 甲醛溶于 9mL水中）和 1% Alcian Blue染液（O. lg Alcian Blue溶于 10mL 0.1 N HCL 中） 。 对各孔进行固定和染色处理。 吸除培养基， DPBS洗涤一次， 并将细胞使用 4%福尔马林溶液固定 30分钟。 固定后用 DPBS洗涤， 然后加入 1% Alcian Blue 溶液 (溶于 0.1N的 HC1) 染色 30分钟。 使用 0.1N的 HC1洗涤三次， 加入蒸熘水中 和酸性， 然后在光镜下对各实验组及对照组进行观察， 保存图片。 成功分化为软 骨细胞的实验组经 Alcian Blue染色后会因软骨细胞合成的蛋白聚糖而呈� �色。

实验结果： 在实验进行第 7天对细胞生长状况进行观察， 并选取 Al、 A3、 C1 孔拍照分析。 经观察可见孔 A1 (图 4.1 ) 中细胞集中于接种的中心区域， 细胞形 态为圆形， 与软骨细胞接近， 细胞的贴壁紧密程度一般， 但经过几次换液仍能保 持贴壁状态； 孔 A3 (图 4.2) 中的细胞形成了一个球状高度聚集的细胞团结 构， 在肉眼下可见一个乳白色小球状结构， 该结构经过几次换液之后仍然存在， 而且 排除了污染的可能性； 孔 C1 (图 4.3 ) 作为对照组加入标准培养基， 细胞形态和 标准的 haMPCs贴壁细胞相符合。 因此， 从形态上来看， 经分化培养基培养的 haMPCs与对照组相比有比较明显的差异。

在实验进行第 14天的 Alcian Blue染色结果表明， C1孔（图 4.6) 没有出现明 显蓝色染色； 相比之下， A1 (图 4.4) 孔出现了明显的蓝色染色， 证明存在软骨细 胞合成的粘多糖； 而 A3 (图 4.5 ) 孔可能由于细胞过于致密， 所以导致染色呈蓝 黑色。 因此， 经分化培养基培养的 haMPCs在经典染色条件下呈现了分化为软骨 细胞的特征。

综上所述， 本实施例表明， 本发明的 haMPCs在分化培养基的培养条件下在 细胞形态学及经典化学染色处理呈现了软骨细 胞的特征， 表明 haMPCs具备向软 骨细胞的分化潜能。 实施例 5

haMPCs成骨分化试验

采用 GIBCO STEMPRO成骨分化试剂盒制备成骨分化培养基， 将 haMPCs消 化离心获取 P3代细胞， 使用适量的生长培养基制备细胞悬液待用。 按照 5* 10 ³ 个 细胞 /cm ² 的密度将 haMPCs接种于多孔培养板， 置于 CO ₂ 培养箱中预培养 2小时。

预培养结束后，在实验孔中添加 ImL 37°C水浴锅预热的成骨分化完全培养基， 在对照孔中添加 ImL 37°C水浴锅预热标准培养基， 并将多孔培养板置于 37°C， 5%CO ₂ 浓度的 CO ₂ 培养箱中进行培养。 在培养过程中， 每隔 3-4天对相应板孔进 行换液。 经过足够培养时间后 （>21天） ， 在当天配置 4%福尔马林溶液和 2% Alizarin Red S 染液， 对各孔进行固定和染色处理。 吸除培养基， DPBS洗涤一次， 并将细胞使用 4%福尔马林溶液固定 30分钟。 固定后用蒸熘水洗涤 2次， 然后加 入 2% Alizarin Red S 染液 (PH为 4.2) 染色 2-3分钟。 使用蒸熘水洗涤三次， 然后 在光镜下对各实验组及对照组进行观察， 保存图片。

实验结果： 在实验进行第 25天对细胞生长状况进行观察： 实验组染色显示结 节状沉积为淡棕色， 证实了结节状沉积为钙盐沉积 （图 5.1 ) ； 对照组染色显示为 阴性 （图 5.2) 。

综上所述， 本实施例表明， 本发明的 haMPCs在成骨分化培养基的培养条件 下在细胞形态学及经典化学染色处理呈现了骨 细胞的特征， 表明 haMPCs具备向 骨细胞的分化潜能。 实施例 6

SVF动物安全性试验

对 SD大鼠采用尾静脉注射人脂肪来源的间质血管� ��细胞 （hSVF) ， 细胞剂 量为高剂量组 1.0x l0 ⁹ /65kg， 适量组 5.0x l0 ⁷ /65kg。 48小时后， 未见皮疹、 皮毛竖 起、 呼吸急促、 震颤等异常过敏反应， 无大鼠死亡发生； 观察 10周， 大鼠生活状 态良好， 体温、 食欲和体重变化正常， 其中平均体重变化适量组、 高剂量组与对 照组从原来 100g分别增长至 502g、 489g及 493g， 比较均无显著性差异。 hSVF 注射结束后 2周 SD大鼠血清白蛋白、球蛋白及白蛋白 /球蛋白水平在正常范围（表 4) ， ALT, 尿素氮、 肌酐、 葡萄糖等指标也在正常范围 （表 5 ) ， 实验组和对照 组比较无明显差异。 本研究结果表明静脉注射 SVF对大鼠是安全的， 异种间使用 SVF未见免疫排斥反应。

表 4

实施例 7

冻存复苏后 haMPCs安全性试验

传代培养第三代 （P3代） haMPCs冻存复苏后裸鼠尾静脉注射， 剂量为适量 组 3.1 x l0 ² /g， 高剂量组 1.5x l0 ³ /g。 注射后连续观察 14天， 实验动物生活状态良 好， 未见异常反应， 体温、 食欲和体重变化正常， 其中体重增长适量组、 高剂量 组与对照组分别为 11.8%、 13.9%及 14.3%， 组间比较无显著性差异。 haMPCs体 内注射未对肝、 脾、 肾、 肺、 脑、 心、 胸腺、 甲状腺及睾丸 /卵巢等主要脏器产生 明显影响， 脏器指数无显著改变。 光镜下观察肝、 肾、 脾及睾丸 /卵巢结构正常， 未见间质增生、 脂肪浸润及炎性细胞浸润等病理改变。 只有在实验组脾脏中可见 到明显增多的巨核或多核巨细胞， 可能与 haMPCs注射后的巨噬细胞免疫反应有 关， 有待进一步研究。 本实验中小鼠血液生化指标均在正常范围内变 化， 适量组 及高剂量组与对照组比较未见显著性差异 （表 6-8 ) 。 本研究结果表明静脉注射 haMPCs对小鼠是安全的， 异种间使用 haMPCs未见免疫排斥反应。 表 6

表 7

表 8

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作 为参考， 就如同每一篇文献被 单独引用作为参考那样。 此外应理解， 在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本 领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改 ， 这些等价形式同样落于本申请所 附权利要求书所限定的范围。