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UTILISATION D'UN ANTICORPS ANTI-CD151 POUR LE TRAITEMENT DU CANCER

La présente invention est relative à une nouvelle utilisation d'anticorps anti- CDl 51 capables d'inhiber la croissance tumorale, lesdits anticorps étant notamment monoclonaux d'origine murine, chimérique et humanisée. Selon un aspect particulier, l'invention a pour objet l'utilisation de ces anticorps, ou de leurs fragments fonctionnels, à titre de médicament pour le traitement prophylactique et/ou thérapeutique des cancers. L'invention comprend enfin des produits et/ou des compositions comprenant de tels anticorps en association, par exemple, avec des anticorps et/ou des agents anticancéreux ou conjugués avec des toxines et leur utilisation pour la prévention et/ou le traitement de certains cancers.

CD151, appelé aussi PET A-3 ou SFA-I, est une protéine membranaire appartenant à la famille des tétraspanines (Boucheix et Rubinstein, 2001, CeIl Mol. Life Sci. 58, 1189-1205 ; Hemler, 2001, J. CeIl Biol. 155, 1103-1107). Chez l'homme, CD151 possède 253 acides aminés, et comporte 4 fragments membranaires et 2 domaines extracellulaires ECl (18 acides aminés, séquence [40-57]) et EC2 (109 acides aminés, séquence [113-221]), appelés aussi boucles extracellulaires. Il est cependant à noter qu'au niveau de la séquence nucléotidique, deux variants pour CDl 51 ont été identifiés à ce jour, à savoir l'un comprenant les nucléotides A et C respectivement aux positions 395 et 409 (SEQ ID No. 1) [Fitter et al, 1995, Blood 86(4), 1348-1355] et l'autre comprenant pour les mêmes positions les nucléotides G et T au lieu et place des nucléotides A et C [Hasegawa et al., 1996, J. Virol. 70(5), 3258-3263]. De ce fait, une mutation au niveau de la séquence peptidique peut être observée, à savoir une mutation des résidus K (Lys) et P (Pro) respectivement aux positions 132 et 137 en les résidus R Arg) et S (Ser) [Fitter et al, 1995, Blood 86(4), 1348-1355 / Hasegawa et al., 1996, J. Virol. 70(5), 3258-3263].

CDl 51 est surexprimé dans de nombreux cancers, comme par exemple les cancers du poumon [Tokuhara et al., 2001, Clin. Cancer Res. 7, 4109-4114], du colon [Hashida et al, 2003, Br. J. Cancer 89, 158-167], de la prostate [Ang et al, 2004, Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 13, 1717-1721] ou du pancréas [Gesierich et al, 2005, Clin. Cancer Res. 11, 2840-2852].

L'utilisation des souris knock-out n'exprimant pas CDl 51, et d'anticorps anti- CD151 et de siRNA pour bloquer in vitro la fonctionnalité et l'expression de CDl 51

dans différentes types cellulaires a permis de montrer que CDl 51 est impliqué dans plusieurs phénomènes liés au cancer, comme l'adhésion cellulaire (Nishiuchi et al, 2005, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 1939-1944 ; Winterwood et al, 2006, Mol. Biol. CeIl 17, 2707-2721), la motilité cellulaire (Kohno et al, 2002, Int. J. Cancer 97, 336-343), la migration cellulaire (Yauch et al, 1998, Mol. Biol. CeIl 9, 2751-2765 ; Testa et al, 1999, Cancer Res. 59, 3812-3820 ; Penas et al, 2000, J. Invest. Dermatol. 114, 1126- 1135 ; Klosek et al, 2005, Biochem. Biophys. Res. Commun. 336, 408-416), l'invasion cellulaire (Kohno et al, 2002, Int. J. Cancer 97, 336-343 ; Shiomi et al, 2005, Lab. Invest. 85, 1489-1506 ; Hong et al, 2006, J. Biol. Chem. 281, 24279-24292) et l'angiogénèse (Yanez-Mo et al, 1998, J. CeIl Biol. 141, 791-804 ; Sincock et al, 1999, J. CeIl Sci. 112, 833-844 ; Takeda et al, 2006, Blood).

L'une des propriétés remarquable des tétraspanines est leur capacité à s'associer entre elles, ainsi qu'à un nombre important d'autres molécules de surface pour former des complexes macromoléculaires structurés. Au sein de ces complexes, chaque tétraspanine est associée spécifiquement à une ou plusieurs molécules de surface formant ainsi des complexes primaires, constitués d'une tétraspanine et d'une molécule partenaire. Les tétraspanines peuvent organiser des microdomaines particuliers de la membrane plasmique au sein desquels elles recruteraient leurs partenaires moléculaires qui pourraient être couplés fonctionnellement. L'ensemble des interactions impliquant les tétraspanines a été dénommé « réseau des tétraspanines » ou « Tetraspanin Web ».

CDl 51 interagit à la surface des cellules avec différentes protéines membranaires. Des complexes très stables, résistants à l'action de certains détergents, ont notamment été mis en évidence avec les intégrines récepteurs des laminines, et plus particulièrement avec les intégrines α3βl ou α6β4 dont le ligand préférentiel est la laminine 5 (Yauch et al, 1998, Mol. Biol. CeIl 9, 2751-2765 ; Lammerding et al, 2003, Proc. Natl. Acad. Sci USA 100, 7616-7621). Cette association implique les domaines extracellulaires de CDl 51 et des intégrines. La séquence QRD [194-196] de CD151, localisée dans la boucle EC2, est très importante dans cette association puisque la mutation de ce site provoque la perte de l'interaction avec certaines intégrines (Kazarov et al, 2002, J. CeIl Biol. 158, 1299-1309). Des complexes ternaires fonctionnels CD151/intégrine α6β4/c- Met (récepteur du HGF) ont d'autre part été mis en évidence dans les cellules tumorales (Klosek et al, 2005, Biochem. Biophys. Res. Commun. 336, 408-416). L'inhibition de

l'expression de CD 151 par traitement des cellules avec un ARN interférence provoque une inhibition de la croissance et de la migration cellulaire induite par HGF.

Les interactions au sein d'un même cellule de CD151 avec d'autres tétraspanines, nécessaires à la formation du réseau des tétraspanines, dépendraient des régions membranaires et cytoplasmiques de CD151 puisqu'il a été montré que la délétion de la boucle EC2 ne rompait pas l'association de CD151 avec d'autres tétraspanines (Berditchevski, 2001, J. CeIl Sci. 114, 4143-4151).

CD151 est capable de réguler les phénomènes d'adhésion, de migration et d'invasion cellulaire par la modulation de différentes voies de signalisation, comme par exemple la voie des phosphoinositides via une association avec la PI4-kinase (Yauch et al, 1998, Mol. Biol. CeIl 9, 2751-2765), la voie de signalisation de c-Jun via la phosphorylation de FAK, Src, p38-MAPK et JNK (Hong et al, 2006), la phosphorylation des intégrines par la PKC (Zhang et al, 2001, J. Biol. Chem. 276, 25005-25013), l'activation de GTPases de la famille Rho (Shigeta et al, 2003, J. CeIl Biol. 163, 165-176).

Des interactions de type homophilique entre cellules sont aussi responsables d'une augmentation de la motilité cellulaire et de l'expression de la métalloprotéinase MMP-9 (Hong et al, 2006). Ces interactions intercellulaires CDl 51 -CDl 51 provoquent l'activation de c-Jun via la phosphorylation de FAK, Src, p38-MAPK et JNK

A ce jour, en dépit de l'intérêt de la protéine CD151, seul un anticorps à visée thérapeutique a été généré, à savoir l'anticorps monoclonal 50-6.

L'anticorps monoclonal 50-6 (isotype IgGl) dirigé contre CDl 51 a été généré chez la souris par immunisations soustractives avec des cellules humaines de carcinome épidermoïde HEp-3 (Testa et al, 1999, Cancer Res. 59, 3812-3820).

L'anticorps 50-6 est capable d'inhiber in vitro la migration des cellules humaines de carcinome cervical HeLa transfectées afin de surexprimer CD 151 et des cellules HEp- 3, et l'angiogénèse dans un modèle de néovascularisation de membrane chorioallantoïque induite par le bFGF (basic fibroblast growth factor). Il inhibe in vivo les métastases induites par inoculation de cellules HEp-3 dans 2 modèles d'embryon de poulet (Testa et al, 1999, Cancer Res. 59, 3812-3820). Dans ces modèles, l'activité inhibitrice de l'anticorps 50-6 est déterminée par la mesure de l'activité de la protéine huPA (human urokinase-type plasminogen activator) dans des extraits de poumons. Selon les auteurs,

ce dosage constitue le reflet de la présence de cellules humaines dans les poumons. Après dosage, la réduction des métastases (dissémination des cellules HEp-3 dans les poumons des embryons de poulet) induite par l'anticorps 50-6 est estimée, par comparaison à un anticorps contrôle, à 74% dans un modèle dit de « métastase spontanée » dans lequel l'inoculation des cellules est suivie par une injection de l'anticorps, et à 57% dans un modèle dit de « métastase expérimentale » dans lequel les cellules et l'anticorps sont inoculés conjointement. Selon les auteurs, les propriétés anti-tumorales de l'anticorps 50- 6 observées in vivo ne semblent pas être liées à un effet cytostatique ou cytotoxique puisqu'il n'a montré aucun effet sur la prolifération in vitro des cellules HEp-3.

L'hybridome produisant l'anticorps 50-6 est disponible à l'ATCC sous la référence CRL-2696 (hybridome déposé initialement sous la référence 50-6 [PTA-227]).

Selon un aspect général, la présente invention vise l'utilisation d'au moins un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, capable de se lier à la protéine CDl 51 et ainsi d'inhiber la croissance tumorale pour la préparation d'un médicament destiné au traitement du cancer.

Plusieurs études expérimentales ont montré le rôle majeur des tétraspanines dans la formation de métastases, en agissant soit comme suppresseurs, soit comme promoteurs de métastases. Ainsi, la transfection de tétraspanines comme CD9, CD63 ou CD82 réduit le potentiel métastatique de lignées cancéreuses. En revanche, l'expression des tétraspanines CD151 et Co-029 semble produire l'effet inverse. Ces 2 tétraspanines seraient donc des promoteurs de la métastase. Ces résultats sont cohérents avec différentes études cliniques qui ont démontré que, dans plusieurs cancers (sein, poumon, oesophage, estomac, foie, pancréas, côlon, prostate, mélanome...), CD9 et CD82 sont moins exprimés sur les tumeurs primitives lorsqu'il y a métastase et que leur baisse d'expression prédit un taux de survie inférieur. Dans le cancer du poumon, la diminution combinée de l'expression de CD9 et de CD 82 a été corrélée à un potentiel métastatique plus important que lorsque l'expression d'un seul de ces deux antigènes est réduite.

Plusieurs études rétrospectives ont montré que la surexpression de CD151 était associée à l'agressivité de certains cancers, comme les cancers du poumon, du colon et de la prostate, et pouvait être considérée comme un facteur de mauvais pronostic (Tokuhara et al, 2001, Clin. Cancer Res. 7, 4109-4114 ; Hashida et al, 2003, Br. J. Cancer 89, 158-167 ; Ang et al, 2004, Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 13, 1717-

1721). Dans ces cas, la moyenne de survie est en effet diminuée chez les patients dont la tumeur exprime CD151, comparativement à ceux dont la tumeur n'exprime pas CD151.

La surexpression de CD151 dans différentes lignées tumorales humaines (HeLa, RPMI14788, A172, HT1080), induite par transfection du gène correspondant, provoque une augmentation de la motilité, de la migration et de l'invasion des cellules transfectées (Testa et al, 1999, Cancer Res. 59, 3812-3820 ; Kohno et al, 2002, Int. J. Cancer 97, 336-343). Ces phénomènes sont inhibés en présence d'anticorps anti-CD151.

Selon un autre aspect, les fragments fonctionnels d'anticorps selon l'invention consistent, par exemple, en des fragments Fv, scFv (se pour simple chaîne), Fab, F(ab') ₂ , Fab ¹ , scFv-Fc ou diabodies, ou tout fragment dont la durée de demie-vie aurait été augmentée par modification chimique, comme l'ajout de poly(alkylène) glycol tel que le poly(éthylène)glycol ("PEGylation") (fragments PEGylés appelés Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab') ₂ -PEG ou Fab'-PEG) (« PEG » d'après la nomenclature anglaise Poly(Ethylene) Glycol), ou par incorporation dans un liposome, microsphères ou PLGA, lesdits fragments étant capables d'exercer de manière générale une activité même partielle de l'anticorps dont ils sont issus.

De préférence, lesdits fragments fonctionnels seront constitués ou comprendront une séquence partielle de la chaîne variable lourde ou légère de l'anticorps dont ils sont dérivés, ladite séquence partielle étant suffisante pour retenir la même spécificité de liaison que l'anticorps dont elle est issue et une affinité suffisante, de préférence au moins égale à 1/100, de manière plus préférée à au moins 1/10 de celle de l'anticorps dont elle est issue.

Un tel fragment fonctionnel comportera au minimum 5 acides aminés, de préférence 10, 15, 25, 50 et 100 acides aminés consécutifs de la séquence de l'anticorps dont il est issu.

De préférence, ces fragments fonctionnels seront des fragments de type Fv, scFv, Fab, F(ab') ₂ , F(ab'), scFv-Fc ou diabodies, qui possèdent généralement la même spécificité de fixation que l'anticorps dont ils sont issus. Selon la présente invention, des fragments d'anticorps de l'invention peuvent être obtenus à partir des anticorps tels que décrits précédemment par des méthodes telles que la digestion par des enzymes, comme la pepsine ou la papaïne et/ou par clivage des ponts disulfures par réduction chimique. D'une autre manière les fragments d'anticorps compris dans la présente invention

peuvent être obtenus par des techniques de recombinaisons génétiques bien connues également de l'homme de l'art ou encore par synthèse peptidique au moyen par exemple de synthétiseurs automatiques de peptides tels que ceux fournis par la société Applied.

Selon un aspect de l'invention, l'anticorps utilisé consiste en un anticorps monoclonal murin.

Sont également compris par anticorps selon la présente invention, les anticorps chimériques ou humanisés.

Par anticorps chimérique, on entend désigner un anticorps qui contient une région variable (chaîne légère et chaîne lourde) naturelle dérivée d'un anticorps d'une espèce donnée en association avec les régions constantes de chaîne légère et chaîne lourde d'un anticorps d'une espèce hétérologue à ladite espèce donnée.

Les anticorps ou leurs fragments de type chimérique utilisés selon l'invention peuvent être préparés en utilisant les techniques de recombinaison génétique. Par exemple, l'anticorps chimérique pourra être réalisé en clonant un ADN recombinant comportant un promoteur et une séquence codant pour la région variable d'un anticorps monoclonal non humain, notamment murin, selon l'invention et une séquence codant pour la région constante d'anticorps humain. Un anticorps chimérique de l'invention codé par un tel gène recombinant sera par exemple une chimère souris-homme, la spécificité de cet anticorps étant déterminée par la région variable dérivée de PADN murin et son isotype déterminé par la région constante dérivée de l'ADN humain. Pour les méthodes de préparation d'anticorps chimériques, on pourra par exemple se référer au document Verhoeyn et al. (BioEssays, 8:74, 1988).

Par anticorps humanisés, on entend désigner un anticorps qui contient des régions CDRs dérivées d'un anticorps d'origine non humaine, les autres parties de la molécule d'anticorps étant dérivée d'un (ou de plusieurs) anticorps humains. En outre, certains des résidus des segments du squelette (dénommés FR) peuvent être modifiés pour conserver l'affinité de liaison (Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986 ; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988 ; Riechmann et al., Nature, 332:323-327, 1988).

Les anticorps humanisés ou leurs fragments fonctionnels peuvent être préparés par des techniques connues de l'homme de l'art (comme par exemple celles décrites dans les documents Singer et al., J. Immun. 150:2844-2857, 1992 ; Mountain et al., Biotechnol. Genêt. Eng. Rev., 10:1-142, 1992 ; ou Bebbington et al., Bio/Technology,

10:169-175, 1992). De tels anticorps humanisés sont préférés pour leur utilisation dans des méthodes de traitement prophylactique et/ou thérapeutique in vivo. D'autres techniques d'humanisation sont également connues de l'homme de l'art comme par exemple la technique du « CDR Grafting » décrite par PDL faisant l'objet des brevets EP 0 451 261, EP 0 682 040, EP 0 939 127, EP 0 566 647 ou encore US 5,530,101, US 6,180,370, US 5,585,089 et US 5,693,761. On peut également citer les brevets US 5,639,641 ou encore 6,054,297, 5,886,152 et 5,877,293.

De manière surprenante, et contre toute attente de la part de l'homme de l'art, la présente invention décrit pour la première fois l'utilisation d'un anticorps anti-CD151 tel que décrit plus haut, ou l'un de ses fragments fonctionnels, capable d'inhiber la prolifération des cellules tumorales et le développement de la tumeur primaire, indépendamment de sa capacité à inhiber l'angiogénèse et/ou la formation des métastases.

Les anticorps décrits dans la demande présentent donc la capacité à inhiber très en amont le développement des tumeurs.

Cette activité anti-tumorale des anticorps objet de la présente invention constitue une propriété nouvelle et inattendue pour un anticorps dirigé contre CD151, puisque aucun anticorps anti-CD151 décrit à ce jour ne possède ce type d'activité. Les anticorps objet de la présente invention présentent donc une propriété différente, et supplémentaire, par rapport aux anticorps précédemment décrit, et notamment par rapport à l'anticorps 50-6 puisque les propriétés anti-tumorales de cet anticorps ne sont pas liées à un effet sur la prolifération des cellules tumorales.

Ce résultat constitue aussi la première mise en évidence d'un lien entre CDl 51 et le développement de la tumeur primaire, voire la prolifération des cellules tumorales in vivo. Seules les activités pro-métastatique et pro-angiogénique de CD151 avaient en effet été décrites à ce jour.

La prolifération désordonnée des cellules d'un organe ou d'un tissu constitue l'une des premières étapes du cancer. Les cellules tumorales sont des cellules qui n'ont plus la capacité d'être soumises aux contrôles normaux de la croissance cellulaire au sein de l'organe ou du tissu concerné. La croissance tumorale est exponentielle, et les cellules tumorales se multiplient de façon excessive sous l'effet de facteurs de croissance et angiogéniques.

Selon un aspect principal, l'invention concerne l'utilisation d'au moins un anticorps anti-CD151, ou l'un de ses fragments fonctionnels, capable d'inhiber le développement de la tumeur primaire et la prolifération des cellules tumorales.

Plus particulièrement, la présente invention concerne l'utilisation d'au moins un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, capable de se lier à la protéine CD151, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des tumeurs primaires.

En outre, la demanderesse avance, sans vouloir être liée par une quelconque théorie, que l'utilisation d'anticorps anti-CD151 dans le cadre du traitement du cancer présenterait un intérêt, non pas uniquement du fait d'une inhibition de l'angiogénèse, mais également du fait de l'inhibition de l'activité promotrice de métastase de CD151.

La présente invention décrit donc l'utilisation d'un anticorps tel que décrit plus haut, ou l'un de ses fragments fonctionnels, capable d'inhiber l'activité promotrice de métastase de ladite protéine CDl 51 au sein des cellules tumorales.

Plus particulièrement, la demanderesse pense que cette inhibition se traduit par une inhibition des différentes étapes du processus métastatique, et notamment de l'adhésion cellulaire, de la migration cellulaire et/ou de l'invasion cellulaire.

Les étapes classiques de ladite activité promotrice, et plus particulièrement de la dissémination tumorale et du processus métastatique, sont les suivantes :

1/ l'invasion du tissu de soutien par les cellules de la tumeur primaire qui nécessite une dégradation par des enzymes protéolytiques (telles que les métalloprotéinases) de la membrane basale et de la matrice extracellulaire constituées de protéines structurales comme la laminine, le collagène ou la fibronectine,

2/ la migration des cellules tumorales à travers les tissus et dans la circulation sanguine,

3/ l'adhésion à la paroi vasculaire et l'arrêt dans un organe,

4/ la sortie du vaisseau (nouvelle étape d'invasion) et l'adaptation au nouvel environnement (prolifération et angiogénèse).

La migration cellulaire est essentielle pendant le développement embryonnaire. Bien que la migration des cellules soit moins importante chez l'adulte, certains types cellulaires, tels que les lymphocytes, les macrophages et les fibroblastes, continueront à se déplacer durant la réponse immunitaire, l'inflammation et la guérison de plaie chez l'adulte pour maintenir l'homéostasie. Cependant, au niveau pathologique, la migration

des cellules tumorales, contribue de façon majeure à la progression de tumeurs au stade métastatique. Un certain nombre de facteurs chimiotactiques sont responsables de cette migration, facteurs dérivés soit des cellules tumorales, soit de l'hôte. Parmi ces facteurs, on cite les facteurs de croissance (notamment ceux qui stimulent l'angiogénèse), les peptides de dégradation du collagène, les protéines d'adhésion comme la laminine et la fibronectine.

Selon un aspect particulier, l'invention concerne l'utilisation d'au moins un anticorps anti-CD151, ou l'un de ses fragments fonctionnels, capable d'inhiber la migration cellulaire des cellules tumorales.

L'invasion est le principal signe de la malignité d'une tumeur : celle-ci déborde son siège d'origine pour s'étendre dans les tissus voisins et à distance. Le caractère invasif traduit la perte des propriétés habituelles d'une cellule : normalement les cellules de la plupart des tissus adhèrent les unes aux autres par des structures appelées desmosomes, par des molécules adhésives; dans un épithélium, elles adhèrent aussi à la membrane basale qui le limite en profondeur. Les cellules tumorales perdent ces propriétés normales pour en acquérir de nouvelles. Les liens entre elles se relâchent et les cellules se libèrent les unes des autres. Elles acquièrent une mobilité qui leur permet de se détacher du foyer primitif, de s'insinuer dans (d'envahir) les tissus voisins, en suivant parfois les fibres du tissu conjonctif. Pour les épithéliums normalement bordés par une membrane basale et pour les carcinomes qui en dérivent, cette membrane est le premier obstacle à franchir. Elle est altérée et dissoute par des enzymes (protéases, cathepsine) sécrétées par les cellules tumorales. Cette destruction de la membrane basale est parfois accentuée par des enzymes normalement sécrétées par des globules blancs et détournées de leurs activités habituelles. Toutes ces modifications biologiques et moléculaires du comportement cellulaire sont la condition de l'invasion.

Selon un autre aspect, l'invention concerne l'utilisation d'au moins un anticorps anti-CD151, ou l'un de ses fragments fonctionnels, capable d'inhiber l'invasion cellulaire des cellules tumorales.

Les cellules de l'organisme adhèrent les unes aux autres ainsi qu'à la matrice extracellulaire qui les entoure. L'adhésion cellulaire est un mécanisme ubiquitaire impliqué dans la plupart des phénomènes cellulaires physiologiques, tels que la survie, la

prolifération ou la différentiation des cellules, mais aussi dans différentes situations pathologiques comme par exemple le cancer et le phénomène de métastase. Différentes protéines de la surface cellulaire sont impliquées dans l'adhésion cellulaire, telles que les cadhérines ou les intégrines.

De manière préférée, l'utilisation selon l'invention repose principalement sur l'inhibition de l'adhésion cellulaire.

Selon encore un autre aspect, l'invention concerne l'utilisation d'au moins un anticorps anti-CD151, ou l'un de ses fragments fonctionnels, capable d'inhiber l'adhésion cellulaire des cellules tumorales.

Comme cela a été dit plus haut, la protéine CD151 fait partie de la famille des tétraspanines et, à ce titre, comprend 2 domaines extracellulaires ECl (18 acides aminés, séquence [40-57]) et EC2 (109 acides aminés, séquence [113-221]), appelés aussi boucles extracellulaires.

Selon la présente invention, les anticorps utilisés sont capables de se lier à au moins un épitope situé dans le domaine extracellulaire. De manière préférée, ledit anticorps se fixera au niveau des boucles ECl et/ou EC2.

Plus particulièrement, selon une forme d'exécution préférée de l'invention, il est décrit l'utilisation d'au moins un anticorps anti-CD151, ou l'un de ses fragments fonctionnels, capable de se lier à un épitope compris dans la boucle extra-cellulaire 1 (ECl) et/ou 2 (EC2), préférentiellement EC2, correspondant respectivement aux acides- aminés 40-57 (SEQ ID No. 6) et 113-221 (SEQ ID No.4) de la protéine CD151.

La boucle ECl [40-57] comprend 18 acides-aminés et présente une masse théorique de 2002,2 Da.

La boucle EC2 [113-221] possède un site de N-glycosylation (résidu Asnl59) et 6 résidus Cystéine formant 3 ponts disulfure. Un modèle structural de la boucle EC2 des tétraspanines, et notamment de CD151, a été proposé à partir de la structure tridimensionnelle de la boucle EC2 de la tétraspanine CD81 (Seigneuret et al, 2001, J. Biol. Chem. 276, 40055-40064). Selon ce modèle, les tétraspanines possèdent une charpente commune, relativement conservée et constituée de 3 hélices α, et un domaine spécifique variable. Pour CD151, cette charpente serait constituée des régions [113-157] et [209-221], et le domaine variable de la région [158-208].

Le domaine variable de la boucle EC2 serait plus particulièrement impliqué dans les interactions spécifiques de CD151 avec des protéines de la famille des intégrines. Des expériences de mutation dirigée ont notamment montré l'importance de la région [193- 208], et plus précisément du tripeptide QRD [194-196] et du résidu Cystéine en position 192, dans l'association de CD151 avec certaines intégrines récepteurs de la laminine, telles que les intégrines α3βl ou α6β4 (Kazarov et al., 2002, J. CeIl Biol. 158, 1299- 1309).

De manière encore plus préférée, la présente invention vise l'utilisation d'au moins un anticorps anti-CD151, ou l'un de ses fragments fonctionnels, capable de se lier à un épitope de la région EC2 comprenant au moins les acides-aminés Glutamine, Arginine et Aspartate respectivement aux positions 194, 195 et 196 (QRD ^194'196 ) de la protéine CD151.

Selon un autre aspect, il faut comprendre que l'invention consiste principalement en l'utilisation d'au moins un anticorps anti-CD151, ou l'un de ses fragments fonctionnels, qui consiste en un anticorps monoclonal.

Il faut entendre par « anticorps monoclonal » un anticorps issu d'une population d'anticorps sensiblement homogènes. Plus particulièrement, les anticorps individuels d'une population sont identiques à l'exception de quelques mutations éventuelles pouvant se produire naturellement qui peuvent se retrouver en proportions minimes. En d'autres termes, un anticorps monoclonal consiste en un anticorps homogène résultant de la prolifération d'un seule clone cellulaire (par exemple un hybridome, une cellule hôte eucaryote transféctée avec une molécule d'ADN codant pour l'anticorps homogène, une cellule hôte procaryote transféctée avec une molécule d'ADN codant pour l'anticorps homomgène, etc.) et qui est généralement caractérisé par des chaînes lourdes d'une seule et même classe et sous-classe, et des chaînes légères d'un seul type. Les anticorps monoclonaux sont fortement spécifiques et sont dirigés contre un seul antigène. En outre, contrairement aux préparations d'anticorps polyclonaux qui comprennent classiquement différents anticorps dirigés contre différents déterminants, ou épitopes, chaque anticorps monoclonal est dirigé contre un seul épitope de l'antigène.

Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, l'anticorps monoclonal utilisé est choisis parmi les anticorps TSl 51 et TS 15 Ir. Dans la suite de la description, les expressions TS 15 Ir et TS 15 IR sont interchangeables.

La présente invention décrit donc l'utilisation d'au moins un anticorps anti- CD151, ou l'un de ses fragments fonctionnels, ledit anticorps consistant en l'anticorps TS151 et/ou l'anticorps TS 15 Ir.

Plus particulièrement, l'anticorps TS151 est défini en ce qu'il comprend au moins : les 3 CDRs de la chaîne lourde CDR-Hl, CDR-H2 et CDR-H3 respectivement de séquence SEQ ID No. 7, 8 et 9 ; et les 3 CDRs de la chaîne légère CDR-Ll, CDR-L2 et CDR-L3 respectivement de séquence SEQ ID No. 11, 12 et 13.

Selon une autre forme de réalisation, l'anticorps TS151 est caractérisé en ce qu'il comprend une chaîne lourde comprenant la séquence SEQ ID No. 10 et une chaîne légère comprenant la séquence SEQ ID No. 14.

Le tableau 1 ci-dessous reprend ces éléments.

Tableau 1

Pour ce qui est de l'anticorps TS 15 Ir, ce dernier est défini en ce qu'il comprend au moins : les 3 CDRs de la chaîne lourde CDR-Hl, CDR-H2 et CDR-H3 respectivement de séquence SEQ ID No. 15, 16 et 17 ; et les 3 CDRs de la chaîne légère CDR-Ll, CDR-L2 et CDR-L3 respectivement de séquence SEQ ID No. 19, 20 et 21.

Selon une autre forme de réalisation, l'anticorps TS 15 Ir est caractérisé en ce qu'il comprend une chaîne lourde comprenant la séquence SEQ ID No. 18 et une chaîne légère comprenant la séquence SEQ ID No. 22.

Le tableau 2 ci-dessous résume ces éléments.

Tableau 2

Selon une autre forme de réalisation, le tableau 3 ci-dessous regroupe les séquences nucléotidiques des anticorps TS151 et TS 15 Ir.

Tableau 3

La génération desdits anticorps est détaillée au niveau de l'exemple 1. Ces 2 anticorps sont dirigés contre des épitopes différents puisque le TS151 reconnaît CDl 51 aussi bien lorsqu'il est associé aux intégrines ou libre à la surface de la cellule (Chometon et al, 2006, Exp. CeIl Res. 312, 983-995), alors que le TS151r ne reconnaît pas les complexes CD151-intégrines (Serru et al, 1999, Biochem. J. 340, 103-111 ; Geary et al, 2001, Tissue Antigens 58, 141-153 ; Kazarov et al, 2002, J. CeIl Biol. 158, 1299-1309 ; Sterk et al, 2002, J. CeIl Sci. 115, 1161-1173). L'épitope reconnu par le TS151r est localisé dans la boucle EC2 et comporte les résidus Q194, R195 et D196 (Kazarov et al, 2002, J. CeIl Biol. 158, 1299-1309). Cet anticorps est donc, en partie au moins, dirigé contre le site de CD151 impliqué dans les interactions avec les intégrines. Le résidu C 192 serait lui aussi impliqué dans la reconnaissance de CDl 51 par le TS 15 Ir (Kazarov et al, 2002, J. CeIl Biol. 158, 1299-1309). L'épitope de l'anticorps TS151, bien qu'il soit différent de celui du TS 15 Ir, n'a pas été déterminé avec précision.

Le traitement de kératinocytes humains (lignée épithéliale HaCaT) par l'anticorps TS 15 Ir provoque une perte du contact cellule-cellule, un réarrangement du cytosquelette, une redistribution intracellulaire de l'intégrine α6β4 et une augmentation de la migration des cellules sur la laminine 1 (Chometon et al, 2006, Exp. CeIl Res. 312, 983-995).

Plus particulièrement, l'anticorps utilisé préféré consiste en l'anticorps TS151.

De manière préférée, l'utilisation des anticorps anti-CD151 dans le cadre du traitement du cancer se justifie tout particulièrement dans les cancers surexprimant ce même récepteur CD 151.

De tels cancers consistent en le cancer du colon [Hashida et al., Br. J. Cancer 89 (2003) : 158-167], le cancer du poumon, préférentiellement du poumon non à petites cellules [Tokuhara et al., Clin. Cancer Res. 7 (2001) ."4109-4114], le cancer de la prostate [Ang et al., Cancer Epidemiol. Biomarkers 13 (2004) : 17] et le cancer du pancréas [Gesierich et al., Clin. Cancer Res. 11 [2005) :2840-2852].

La présente invention revendique donc l'utilisation d'un anticorps tel que décrit plus haut pour le traitement du cancer, ledit cancer consistant préférentiellement en les cancers du colon, du poumon, de la prostate ou du pancréas.

L'invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant à titre de principe actif un composé consistant en un anticorps, ou l'un de ses composés

dérivés ou fragments fonctionnels, de préférence additionné d'un excipient et/ou d'un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

Plus particulièrement, l'invention vise l'utilisation d'un anticorps selon l'invention pour la préparation d'une composition pharmaceutique comprenant, en outre, au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable

Dans la présente description, on entend désigner par véhicule pharmaceutiquement acceptable, un composé ou une combinaison de composés entrant dans une composition pharmaceutique ne provoquant pas de réactions secondaires et qui permet par exemple la facilitation de l'administration du ou des composés actifs, l'augmentation de sa durée de vie et/ou de son efficacité dans l'organisme, l'augmentation de sa solubilité en solution ou encore l'amélioration de sa conservation. Ces véhicules pharmaceutiquement acceptables sont bien connus et seront adaptés par l'homme de l'art en fonction de la nature et du mode d'administration du ou des composés actifs choisis.

De préférence, ces composés seront administrés par voie systémique, en particulier par voie intraveineuse, par voie intramusculaire, intradermique, intrapéritonéale ou sous-cutanée, ou par voie orale. De manière plus préférée, la composition comprenant les anticorps selon l'invention, sera administrée à plusieurs reprises, de manière étalée dans le temps.

Leurs modes d'administration, posologies et formes galéniques optimaux peuvent être déterminés selon les critères généralement pris en compte dans l'établissement d'un traitement adapté à un patient comme par exemple l'âge ou le poids corporel du patient, la gravité de son état général, la tolérance au traitement et les effets secondaires constatés.

Selon l'invention, il est décrit une composition pour le traitement du cancer, caractérisée en ce qu'elle comprend à titre de principe actif au moins un anticorps anti- CD151, ou l'un de ses fragments fonctionnels, capable de se lier à la protéine CD151.

Selon l'invention, il est décrit une composition pour le traitement du cancer, caractérisée en ce qu'elle comprend à titre de principe actif au moins un anticorps anti- CD151, ou l'un de ses fragments fonctionnels, capable de se lier à la protéine CDl 51 et/ou d'inhiber son activité promotrice de métastase.

Selon l'invention, il est également décrit une composition pour le traitement du cancer, caractérisée en ce qu'elle comprend à titre de principe actif au moins un anticorps anti-CD151, ou l'un de ses fragments fonctionnels, capable d'inhiber le développement de tumeurs primaires.

Selon un autre aspect e l'invention, il est décrit une composition comprenant au moins un anticorps anti-CD151, ou l'un de ses fragments fonctionnels, ledit au moins un anticorps étant un anticorps monoclonal sélectionné parmi les anticorps TS151 ou TS 15 Ir.

Selon encore un aspect de l'invention, il est revendiquée une composition qui comprend une combinaison des anticorps TS151 et TS 15 Ir, ou de leur fragments fonctionnels.

Il ressort de la littérature que la protéine CDl 51 est surexprimée dans les cancers et, tout particulièrement, dans les carcinomes du colon [Hashida et al., Br. J. Cancer 89 (2003): 158-167], les cancers du poumon non à petites cellules [Tokuhara et al., Clin. Cancer Res. 7 (2001): 4109-4114], les cancers de la prostate [Ang et al., Cancer Epidemiol. Biomarkers 13 (2004): 1717-1721] et les cancers du pancréas [Gesierich et al, Clin. Cancer Res. 11 (2005): 2840-2852].

Bien évidemment, la liste ci-dessus n'est donnée qu'à titre illustratif et tout cancer doit être compris comme surexprimant la protéine CD 151 et donc susceptible d'être traité conformément à la présente invention.

Une autre forme d'exécution complémentaire de l'invention consiste en une composition telle que décrite plus haut qui comprend, en outre, comme produit de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, un agent cytotoxique/cytostatique et/ou un anticorps monoclonal.

La présente invention concerne donc également une composition telle que décrite plus haut, caractérisée en ce qu'elle comprend, en outre, comme produit de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, au moins un agent cytotoxique/cytostatique et/ou une toxine cellulaire et/ou un radioélément et/ou un anticorps monoclonal.

On entend par "utilisation simultanée", l'administration des deux composés de la composition selon l'invention compris dans une seule et même forme pharmaceutique.

On entend par "utilisation séparée", l'administration, en même temps, des deux composés de la composition selon l'invention, compris dans des formes pharmaceutiques distinctes.

On entend par "utilisation étalée dans le temps", l'administration successive des deux composés de la composition selon l'invention, compris chacun dans une forme pharmaceutique distincte.

D'une façon générale, la composition selon l'invention augmente considérablement l'efficacité du traitement du cancer. En d'autres termes, l'effet thérapeutique de l'anticorps selon l'invention est potentialisé de manière inattendue par l'administration d'un agent cytotoxique. Un autre avantage subséquent majeur produit par une composition selon l'invention, concerne la possibilité d'utiliser des doses efficaces en principe actif plus faibles, ce qui permet d'éviter ou de réduire les risques d'apparition des effets secondaires, en particulier l'effet de l'agent cytotoxique. De plus, cette composition selon l'invention permettrait d'atteindre l'effet thérapeutique escompté plus rapidement.

Par « agents thérapeutiques anti-cancer » ou « agents cytotoxiques », il faut comprendre une substance qui, lorsqu'elle est administrée à un patient, traite ou prévient le développement du cancer chez le patient. A titre d'exemple non limitatif pour de tels agents, il peut être mentionné les agents « alkylant », les antimétabolites, les antibiotiques anti-tumoraux, les inhibiteurs mitotiques, les inhibiteurs de fonction chromatine, les agents anti-angiogénèse, les anti-œstrogène, les anti-androgène ou les immuno-modulateurs.

De tels agents sont, par exemple, cités dans le VIDAL, à la page consacrée aux composés attachés à la cancérologie et l'hématologie colonne « Cytotoxiques », ces composés cytotoxiques cités par référence à ce document sont cités ici comme agents cytotoxiques préférés.

Les « agents alkylants » font référence à toute substance qui peut se coupler de manière covalente ou alkyler toute molécule, préférentiellement un acide nucléique (ex. : ADN), au sein d'une cellule. Comme exemples de tels agents alkylants, il peut être cité les moutardes à l'azote comme la méchloréthamine, le chlorambucil, le melphalan, le chlorhydrate, le pipobroman, la prednimustine, le phosphate disodique ou l'estramustine ; les oxazaphosphorines comme la cyclophosphamide, l' altretamine, la trofosfamide, la sulfofosfamide ou l'ifosfamide ; les aziridines ou ethylènes-imines

comme le thiotepa, la triéthylèneamine ou l'altétramine ; les nitrosourées comme la carmustine, la streptozocine, la fotémustine ou la lomustine ; les sulfonates d'alkyle comme le busulfan, le tréosulfan ou Fimprosulfan ; les triazènes comme la dacarbazine ; ou encore les complexes du platine comme le cisplatine, Poxaliplatine ou le carboplatine.

Les « antimétabolites » font référence à des substances qui bloquent la croissance et/ou le métabolisme cellulaire en interférant avec certaines activités, généralement la synthèse d'ADN. A titre d'exemple d'antimétabolite, il peut être mentionné les methotrexate, 5-fluorouracile, floxuridine, 5-fluorodeoxyuridine, capecitabine, cytarabine, fludarabine, cytosine arabinoside, 6-mercaptopurine (6-MP), 6- thioguanine (6-TG), chlorodésoxyadénosine, 5-azacytidine, gemcitabine, cladribine, deoxycoformycine et la pentostatine.

Les « antibiotiques anti-tumoraux » font référence aux composés qui peuvent prévenir ou inhiber la synthèse d'ADN, d'ARN et/ou de protéines. Des exemples de tels antibiotiques anti-tumoraux comprennent la doxorubicine, daunorubicine, idarubicine valrubicine, mitoxantrone, dactinomycine, mithramycine, plicamycine, mitomycine C, bleomycine, et la procarbazine.

Les « inhibiteurs mitotiques » préviennent la progression normale du cycle cellulaire et de la mitose. En gênerai, les inhibiteurs des microtubules ou « taxoides » comme le paclitaxel et le docétaxel sont capables d'inhiber la mitose. Les alcaloïdes de vinca, comme la vinblsatine, la vincristine, la vindésine et la vinorelbine sont également capables d'inhiber la mitose.

Les « inhibiteurs de fonction chromatine » ou « inhibiteurs de topo- isomérases » font référence à des substances qui inhibent la fonction normale des protéines modelant la chromatine comme les topo-isomérases I et IL Des exemples de tels inhibiteurs comprennent, pour la topo-isomérase I, la camptothécine ainsi que ses dérivés comme l'irinotécan ou le topotécan et, pour la topo-isomérase II, l'étoposide, le phosphate d'étiposide et le téniposide.

Les « agents anti-angiogénèse » font références à toute drogue, composé, substance ou agent qui inhibe la croissance des vaisseaux sanguins. Des exemples d'agents anti-angiogénèse comprennent, sans aucune limitation, les razoxin, marimastat, batimastat, prinomastat, tanomastat, ilomastat, CGS-27023A, halofuginone, COL-3, neovastat, BMS-275291, thalidomide, CDC 501, DMXAA, L-651582, squalamine,

endostatine, SU5416, SU6668, interferon-alpha, EMD121974, interleukine-12, IM862, angiostatine et la vitaxine.

Les « anti-œstrogène » ou « agents anti-oestrogénique » font référence à toute substance qui diminue, antagonise ou inhibe l'action des oestrogènes. Des exemples de tels agents sont les tamoxifène, toremifène, raloxifène, droloxifène, iodoxyfène, anastrozole, letrozole, et l'exemestane.

Les « anti-androgènes » ou « agents anti-androgène » font référence à toute substance qui réduit, antagonise ou inhibe l'action d'un androgène. Des exemples d'anti- androgènes sont les flutamide, nilutamide, bicalutamide, sprironolactone, cyproterone acétate, finasteride et la cimitidine.

Les immunomodulateurs sont des substances qui stimulent le système immunitaire. Des exemples de tels immunomodulateurs comprennent les interférons, les interleukines comme l'aldesleukine, OCT-43, denileukin diflitox ou l'interleukine-2, les facteurs de nécrose tumorale comme la tasonermine, ou d'autres types d'immunomodulateurs comme le lentinan, le sizofiran, le roquinimex, le pidotimod, la pégadémase, la thymopentine, le poly I :C, ou le levamisole en combinaison avec le 5- fluorouracil.

Pour plus de détails, l'homme de l'art pourra se reporter au manuel édité par l'Association Française des Enseignants de Chimie Thérapeutique intitulé « traité de chimie thérapeutique, Vol. 6, Médicaments antitumoraux et perspectives dans le traitement des cancers, édition TEC & DOC, 2003 ».

Les anticorps monoclonaux préférés sont choisis parmi les anticorps capables d'inhiber spécifiquement l'activité tyrosine kinase des récepteurs IGF-IR, EGFR, HER2/neu, cMET, VEGFR, VEGF, etc., (ou tout autre anticorps anti-tumoral connu de l'homme de l'art), isolés, ou leurs fragments fonctionnels et composés dérivés, capables d'inhiber l'activité proliférative et/ou anti-apoptotique et/ou angiogénique et/ou inductrice de dissémination métastatique promues par lesdits récepteurs.

Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, ladite composition comme produit de combinaison selon l'invention est caractérisée en ce que ledit agent cytotoxique est couplé chimiquement audit anticorps pour une utilisation simultanée.

Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, ladite composition selon l'invention est caractérisée en ce que ledit agent cytotoxique/cytostatique est choisi

parmi les agents inhibiteurs ou stabilisateurs du fuseau, de préférence la vinorelbine et/ou la vinflunine et/ou la vincristine.

Afin de faciliter le couplage entre ledit agent cytotoxique et ledit anticorps selon l'invention, on pourra notamment introduire des molécules espaceurs entre les deux composés à coupler, telles que des poly(alkylènes)glycols comme le polyéthylèneglycol, ou encore des acides aminés, ou, dans un autre mode de réalisation, utiliser des dérivés actifs desdits agents cytotoxiques dans lesquels auront été introduites des fonctions capables de réagir avec ledit anticorps selon l'invention. Ces techniques de couplage sont bien connues de l'homme de l'art et ne seront pas développées dans la présente description.

L'invention est, sous un autre aspect, relative à une composition caractérisée en ce que l'un, au moins, desdits anticorps, ou l'un de leur composé dérivé ou fragment fonctionnel, est conjugué avec une toxine cellulaire et/ou un radioélément

De préférence, ladite toxine ou ledit radioélément est capable d'empêcher la croissance ou la prolifération de la cellule tumorale, notamment d'inactiver totalement ladite cellule tumorale.

De préférence encore, ladite toxine est une toxine d'entérobactéries, notamment l'exotoxine A de Pseudomonas.

Les radioéléments (ou radio-isotopes) préférentiellement conjugués à l'anticorps employés en thérapie sont des radio-isotopes qui émettent des rayons gamma et préférentiellement l'iodine ¹³¹ , l'yttrium ⁹⁰ , l'or ¹⁹⁹ , le palladium ¹⁰⁰ , le cuivre ⁶⁷ , le bismuth ²¹⁷ et Fantimony ²¹¹ . Les radio-isotopes qui émettent des rayons beta et alpha peuvent également être utilisés en thérapie.

Par toxine ou radioélément conjugué à au moins un anticorps, ou l'un de leur fragment fonctionnel, selon l'invention, on entend désigner tout moyen permettant de lier ladite toxine ou ledit radioélément audit au moins un anticorps, notamment par couplage covalent entre les deux composés, avec ou sans introduction de molécule de liaison.

Parmi les agents permettant une liaison chimique (covalente), électrostatique ou non covalente de tout ou partie des éléments du conjugué, il peut être mentionné tout particulièrement le benzoquinone, le carbodiimide et plus particulièrement l'EDC (1- ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]-carbodiimide hydrochloride), le dimaleimide, l'acide dithiobis-nitrobenzoic (DTNB), le N-succinimidyl S-acetyl thio-acetate (SATA),les

agents dits de « bridging » présentant un ou plusieurs groupements, ayant un ou plusieuyrs groupements phenylaside, réagissant avec les ultraviolets (U.V.) et tout préférentiellement le N-[-4-(azidosalicylamino)butyl]-3 '-(2'-pyridyldithio)propionamide (APDP), le N-succinimid-yl 3-(2-pyridyldithio)propionate (SPDP) et le 6-hydrazino- nicotinamide (HYNIC).

Une autre forme de couplage, tout spécialement pour les radioéléments, peut consister en l'utilisation d'un chélateur d'ions bifonctionnel.

Parmi ces chélateurs, il est possible de mentionner les chélates dérivés de l'EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) ou du DTPA (diethylenetriaminepentaacetic acid) qui ont été développés pour lier des métaux, particulièrement des métaux radioactifs, et des immunoglobulines. Ainsi, le DTPA et ses dérivés peut être substitué par différents groupements sur le chaîne de carbones de manière à augmenter la stabilité et la rigidité du complexe ligand-métal (Krejcarek et al. (1977); Brechbiel et al. (1991); Gansow (1991); US patent 4 831 175).

Par exemple, le DTPA (diethylenetriaminepentaacetic acid) et ses dérivés, qui a été très largement utilisé en médecine et en biologie pendant longtemps soit sous sa forme libre, soit sous la forme d'un complexe avec un ion métallique, présente la caractéristique remarquable de former des chélates stables avec des ions métalliques et d'être couplé à des protéines d'intérêt thérapeutique ou diagnostique comme des anticorps pour le développement de radio-immunoconjugués en thérapie du cancer (Meases et al., (1984); Gansow et al. (1990)).

La présente invention comprend en outre l'utilisation de la composition selon l'invention pour la préparation d'un médicament.

La présente invention vise donc plus particulièrement l'utilisation d'une composition telle que décrite plus haut pour la préparation d'un médicament destiné au traitement du cancer. Parmi les cancers qui peuvent être prévenus et/ou traités, on préfère le cancer du colon, du poumon, de la prostate ou du pancréas.

En outre, selon un aspect particulièrement innovant et avantageux, la présente invention vise l'utilisation d'une composition telle que décrite plus haut pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des tumeurs primaires.

L'invention a également pour objet l'utilisation d'un anticorps selon l'invention, pour la préparation d'un médicament destiné au ciblage spécifique d'un composé biologiquement actif vers des cellules exprimant ou surexprimant le récepteur CD151.

On entend désigner ici par composé biologiquement actif tout composé capable de moduler, notamment d'inhiber, l'activité cellulaire, en particulier leur croissance, leur prolifération, la transcription ou la traduction de gène.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description avec les exemples et les figures dont les légendes sont représentées ci- après.

LEGENDES DES FIGURES

La figure 1 montre les séquences nucléotidiques et protéiques de la protéine CD151, séquences sur lesquelles sont mises en évidences les boucles ECl et EC2.

La figure 2 est un schéma illustrant la structure des tétraspanines dont fait parti la protéine CDl 51, et tout particulièrement les deux boucles extra-cellulaires ECl et EC2.

La figure 3 représente la comparaison PBS / anticorps contrôle dans le modèle orthotopique A549.

La figure 4 représente l'évaluation de l'activité antitumorale de l'anticorps TSl 51 in vivo dans le modèle orthotopique .Des souris immunodéprimées (n=10) sont greffées par voie intrapleurale avec 1.10 ⁶ cellules A549. Sept jours après la greffe, les souris sont traitées par voie intrapéritonéale avec une dose d'appel de 500 μg d'anticorps TS151 suivie d'un traitement, deux fois par semaine, durant 5 semaines, avec une dose de 250 μg d'anticorps par souris. Le lot témoin est injecté avec du PBS selon le même schéma d'administration.

La figure 5 illustre l'expression de la molécule CD151 chez des patients atteints de cancer de la prostate. Chaque lettre correspond à l'étude d'un patient et pour chaque patient le panel supérieur correspond au tissus normal adjacent à la tumeur et le panel inférieur correspond au tissus tumoral.

La figure 6 illustre l'expression de la molécule CDl 51 chez des patients atteints de cancer du poumon. Chaque lettre correspond à l'étude d'un patient et pour chaque

patient le panel supérieur correspond au tissus normal adjacent à la tumeur et le panel inférieur correspond au tissus tumoral.

La figure 7 illustre l'activité in vivo des anticorps TS151 et TS 15 IR dans le modèle de xénogreffe PC3. Des souris Swiss Nude (n=6) ont été greffées en sous cutanée avec les cellules PC3. Cing jours après greffe des cellules les souris reçoivent, par voie i.p. une dose d'appel de 2 mg/souris des anticorps à tester suivie de deux administrations par semaine d'une dose de 1 mg/souris de ces anticorps. Le volume tumoral est évalué par la formule π/6 x Longueur x largeur x épaisseur et un test de Mann et Whitney est effectué pour l'évaluation statistique des résultats.

La figure 8 illustre l'évaluation de la spécificité des anticorps TS151 et TSl 5 Ir pour la forme humaine de CD151 par western blot.

La figure 9 illustre l'inhibition de l'adhésion des cellules A549 sur la laminine 5. A/ Inhibition de l'adhésion cellulaire par différents anticorps anti-intégrines. B/ Inhibition de l'adhésion cellulaire par une combinaison TS151/anticorps anti-intégrine α3.

Exemple 1 : Génération des anticorps TS151r et TS151

Génération de l'anticorps TS 15 Ir

Pour générer l'anticorps TS 15 Ir, des souris BALB/c ont été immunisées par voie intrapéritonéale à l'aide de 10 ⁷ cellules HeLa. Après 3 immunisations et une injection de rappel finale, les cellules de la rate d'une souris ont été fusionnées à des cellules de myélome P3X63AG8 par les techniques classiquement décrites par Kohler et Milstein (5.10 ⁷ cellules de rate / 3.10 ⁷ cellules de myélome). Les surnageants des hybridomes résultant de la fusion ont ensuite été criblés sur leur capacité de reconnaissance des cellules HeLa par cytométrie de flux, puis sur leur capacité à immunoprécipiter CDl 51 à partir d'un lysat de cellules HeLa en préparé en présence du détergent Brij 97, et à entraîner la co-immunoprécipitation de CD9. L'anticorps TS 15 Ir s'est avéré posséder ces différentes propriétés.

Génération de l'anticorps TS 151

Pour générer l'anticorps TS 151, des souris BALB/c ont été immunisées par voie intrapéritonéale à l'aide de 10 ⁷ cellules Jurkat puis 10 ⁷ HEL (2 immunisations). Après

une injection de rappel finale à l'aide de complexes protéiques contenant la protéine ADAM10 obtenus à partir de lysats de cellules Jurkat et HEL, les cellules de la rate ont été fusionnées à des cellules de myélome P3X63AG8 par les techniques classiquement décrites par Kohler et Milstein (5.10 ⁷ cellules de rate / 3.10 ⁷ cellules de myélome). Les surnageants des hybridomes résultant de la fusion ont d'abord été criblés sur leur capacité de reconnaissance des cellules Jurkat et HEL par cytométrie de flux. L'anticorps TS151 a ensuite été sélectionné sur sa capacité à immunoprécipiter CD151 à partir d'un lysat cellulaire préparé en présence du détergent Brij 97, et à entraîner la co- immunoprécipitation d'autres tétraspanines.

Exemple 2 : Evaluation in vivo de l'activité anti-tumorale des anticorps TS151 et TS151r dans un modèle orthotopique A549

Matériel et Méthode

Après vérification de l'expression de la protéine CDl 51 (données non montrées), les cellules A549 originaires de l'ATCC sont cultivées en routine en milieu F12K, 10 mM de glutamine, 10% de SVF. Ces cellules sont divisées 2 jours avant la greffe afin qu'elles soient en phase exponentielle de croissance. Pour la greffe, des souris immunodéprimées de 7 semaines sont anesthésiés avant de recevoir 1.10 ⁶ cellules A549 par voie intrapleurale. La tumeur primaire se développe rapidement et envahie en 4 jours les structures adjacentes au site d'injection incluant le médiastin, les poumons et le diaphragme. Pour mieux mimer la maladie, le début du traitement ne commence que 7 jours après implantation des cellules, par voie intra péritonéale. Après injection d'une dose d'appel de 500 μg/souris, l'anticorps TS 151 purifié est administré 2 fois par semaine, durant 5 semaines à la dose de 250 μg/souris. Un groupe de souris recevant du PBS est introduit comme contrôle étant donné que des expériences effectuées précédemment ont montré que l'administration d'un isotype contrôle IgGl était sans aucun impact sur la survie des animaux.

La figure 3, issue de données préliminaires, démontre la spécificité de l'activité observée avec l'anticorps anti-CD151. En effet, le traitement des animaux avec une IgGl murine (mlgGl) utilisée comme isotype contrôle montre que cette dernière n'a aucun impact sur la survie des animaux injecté avec le PBS utilisé comme véhicule de ces anticorps.

Le paramètre d'évaluation de ce modèle est la survie des animaux et l'activité anti-tumorale est exprimée par le calcul du T/C%= médiane de survie des animaux traités/médiane de survie des animaux du groupe control X 100. Il a été établi qu'un T/C% supérieur ou égale à 125 % signe une activité du produit.

Résultats

La Figure 4 montre une activité antitumorale de l'anticorps TS151 avec un T/C% calculé de 140%

Exemple 3 : Comparaison de l'activité anti-tumorale in vivo des anticorps TS151 et 50-6 dans un modèle orthotopique A549

Matériel et Méthode

Le protocole mis en œuvre est identique à celui de l'exemple 2 ci-dessus.

Résultats

Les données obtenus mettent clairement en évidence que l'anticorps TS151 présente une activité anti-tumorale nettement supérieure à celle montrée par l'anticorps 50-6 qui ne présente, quant à lui, qu'un T/C% de 118, c.a.d. inférieur à 1 avaleur seuil de 125% (données non montrées).

Les résultats obtenus, à savoir le T/C% calculé comme défini plus haut, sont représentés dans le tableau 4 ci-dessous.

Tableau 4

Exemple 4 : Etude de l'expression de la molécule CD151

L'expression de la protéine CDl 51 a été recherchée par immunohistochimie dans des échantillons de tissus humains issus de patients atteints de cancers de la prostate ou de cancer du poumon. Pour ces patients des lames de tissus normaux adjacents à la tumeur étaient disponibles et ont donc été incluses pour calibrer le niveau d'expression dans les tissus tumoraux versus normaux.

Pour ces expériences, des lames de type « Tissue array » commerciales sont utilisées. Après déparaffinage, un démasquage antigénique est effectué à 30°C à l'aide d'une solution enzymatique contenant de la pepsine (Labvision réf. AP-9007-005). Cette étape est suivie par une étape d'élimination des peroxydases endogènes par incubation des coupes dans une solution de peroxyde d'hydrogène (Sigma) à 0,3% dans l'eau. Une saturation des sites non spécifiques est alors effectuée avec une solution d'Ultra- V-Block (Labvision, réf. TA-125-UB) et le marquage est effectué à l'aide d'un anticorps murin anti-CD151 commercial (Serotech, Réf. MCA 1856) utilisé à une concentration finale de 5 μg/ml. Un anticorps isotype contrôle IgGl murin (DakoCytomation, Réf. X0931) est utilisé comme contrôle négatif d'expérience. La révélation du marquage se fait avec le système de révélation Envision Dual Link (DakoCytomation, Réf. K4061) et la référence de la DAB, substrat des peroxydases est S3309 de DakoCytomation.

Les résultats présentés dans la figure 5 montrent que plusieurs patients développant des tumeurs de la prostate présentent une sur-expression de la molécule CD151. Cette sur-expression peut être très significative pour 20% des patients étudiés (patients A et C) ou modérée (patients A et D). Il est à noter que, excepté au niveau des cellules endothéliales, les tissus normaux prostatiques correspondant n'expriment pas ou peu le CD151 et que, en cas d'expression, celle-ci semble être limitée à des structures de type glandulaires. Le patient E présente un exemple de tumeur n'exprimant pas CD151.

Dans le cas du cancer du poumon (Figure 6), une expression modérée (patient A) à forte (patient B) est observée au niveau de certaines cellules du tissu pulmonaire normal. Cependant le tissu tumoral présente une très grande densité de cellules fortement marquées (patients A et B). Le patient C présente un exemple de tumeur n'exprimant pas CD151.

Exemple 5 : Effet des anticorps TS151 et TS151R sur Ia croissance in vivo de la tumeur PC3 implantée en sous cutanée chez la souris Nude.

Etant donné les résultats obtenus en immunohistochimie sur les « tissue array » de prostate, une évaluation des anticorps anti-CD151 sur une xénogreffe de tumeur PC3 a été envisagée. La lignée PC3 est une lignée prostatique androgéno-indépendante originaire de l'ATCC et cultivée en milieu F12K+10% SVF+L-Glutamine. Pour l'évaluation, 5.10 ⁶ cellules PC3 sont implantées sur le flanc droit de souris Swiss Nude.

Cinq jours après implantation, les animaux sont randomisés sur la base du volume tumoral et répartis en 3 groupes comparables. Le volume tumoral du lot d'animaux greffé sélectionné est compris entre 41 et 47 mm ³ (volume calculé avec la formule π/6 x Longueur x largeur x épaisseur) au jour 0 du traitement. Les animaux reçoivent alors les anticorps purifiés à tester ou du PBS. Les doses d'anticorps et la fréquence des injections sont les suivantes : dose d'appel 2 mg/dose d'anticorps ; dose de maintien 1 mg/dose 2 fois par semaine.

Les résultats présentés en figure 7 montrent que les deux anticorps testés (TS151 et TS 15 IR) se comportent de façon comparable et inhibent très significativement la croissance de la tumeur PC3 implantée en position sous-cutanée chez la souris Swiss Nude. Le tableau 5 ci-dessous résume les analyses statistiques de ces résultats.

Tableau 5

Des études menées en parallèle et présentées dans la figure 8 montrent que les anticorps TSl 51 et TS 15 IR reconnaissent spécifiquement la molécule CDl 51 humaine sans aucune réaction croisée avec le récepteur murin. Cette observation suggère donc que l'activité observée dans le modèle de xénogreffe chez la souris nude ne peut être attribuée qu'à un effet direct sur le tissus humain greffé et exclue, par conséquent, toute interférence des anticorps TS151 et TS 15 IR avec des cellules du stroma de la tumeur ou des cellules endothéliales murines. Par ailleurs, TS 151 et TS 15 IR sont deux IgGl murine et de ce fait et comme connu par l'homme de l'art, il est peu probable que l'activité observée soit liée à des fonctions effectrices de type ADCC et CDC qui sont plus particulièrement médiées par des anticorps de type IgG2a murine chez la souris.

L'ensemble de ces résultats est donc en accord avec un mécanisme d'action directement lié à l'inhibition de la prolifération cellulaire tumorale in vivo par les anticorps TS151 et TS 15 IR.

Exemple 6 : Spécificité des anticorps TS151 et TS151r

La spécificité des anticorps TS151 et TS 15 Ir a été évaluée par western blot. Des lysats de tissus humains et murins de poumon, pancréas et colon (Biochain, 10 μg de protéines totales), ainsi que des quantités croissantes de lysat cellulaire de HT-29 (10, 20 et 50 μg de protéines totales) ont été déposés sur un gel d'acrylamide 4-12 % (BioRad). Après électrophorèse (conditions non réductrices), les protéines ont été transférées sur membrane de nitrocellulose. Les membranes de transfert ont ensuite été incubées avec les anticorps TS151 et TS 15 Ir purifiés, puis avec un anticorps polyclonal de lapin anti-Ig de souris couplé à la péroxydase (GE Healthcare) avant révélation de type ECL.

Les anticorps TS 151 et TS 15 Ir présentent une spécificité pour la forme humaine de CDl 51 comme en atteste la reconnaissance par western blot de CDl 51 dans des lysats de cellules HT-29 et de différents tissus d'origine humaine (figure 8). L'absence de réactivité avec le CD151 murin dans les lysats de différents tissus prélevés chez la souris confirme la spécificité des anticorps TS151 et TS 15 Ir pour la forme humaine de CD151.

Exemple 7 : Inhibition de l'adhésion cellulaire

Les expériences d'adhésion de cellules tumorales sur la laminine 5, ligand des intégrines α3βl et α6β4 avec lesquelles peut s'associer CD151, sont réalisées en plaque 96 puits. Après immobilisation de la laminine 5 (Chemicon, 200 μl à 1 μg/ml) pendant 1 heure à 37 ⁰ C, les puits sont saturés par de la BSA à 2 mg/ml (200 μl, 1 h à 37°C). Les cellules A549 en suspension sont marquées à l'aide de 5-chlorométhylfluorescéine diacétate (CMFDA, Invitrogen), puis ajoutées à raison de 100000 cellules (100 μl) par puit en présence ou absence d'anticorps (100 μl). Après incubation à 37°C pendant 15, 30 ou 60 minutes, les cellules n'ayant pas adhéré sont éliminées. Après lecture de la chimioluminescence à l'aide d'un luminomètre (Mithras, Berthold), le pourcentage de cellules ayant adhéré est déterminé à l'aide d'une gamme de cellules marquées au CMFDA. L'anticorps anti-CD151 TS151 et les anticorps anti-intégrine α3 P1B5, anti-α.6 NKI-Go3 et anti-β4 ASC-3 (Chemicon) sont évalués à la concentration finale de 20 μg/ml. L'anticorps 9G4, dirigé contre une protéine de la membrane de Escherichia coli, est utilisé comme contrôle isotypique.

L'anticorps anti-intégrine α3 P1B5 inhibe l'adhésion des cellules A549 sur la laminine 5 (Figure 9A), alors que les anticorps anti-intégrine α6 NKI-Go3 et anti- intégrine β4 ASC-3 n'inhibent pas l'adhésion des cellules A549 sur ce même ligand. On constate toutefois une perte d'inhibition en fonction du temps. L'inhibition induite par le P1B5 est en effet supérieure à 90% à 15 min, mais tombe à environ 20% après 1 h. L'association de l'anticorps P1B5 avec l'anticorps anti-intégrine α6 NKI-Go3 ou l'anticorps anti-intégrine β4 ASC-3 permet de maintenir une forte inhibition d'adhésion après 1 h : celle-ci est supérieure à 90% pour l'association avec l'anticorps anti-D6, et d'environ 70% pour la combinaison avec l'anticors anti-β4. Ces résultats démontrent que les cellules A549 adhèrent sur la laminine 5 dans un premier temps par l'intermédiaire de l'intégrine α3βl, puis dans un deuxième temps par l'intermédiaire de l'intégrine α6β4.

L'anticorps anti-CD151 TS151 n'inhibe pas l'adhésion des cellules A549 sur la laminine 5 lorsqu'il est utilisé seul (Figure 9B). L'effet d'une combinaison du TS151 avec le P1B5 sur l'adhésion des cellules A549 a ensuite été évalué et comparé avec les combinaisons précédemment mentionnées. Cette combinaison TS151/P1B5 donne un résultat comparable à l'association d'anticorps anti-α6/anti-α3 et anti-β4/anti-α3. On

observe en effet un maintien de l'inhibition d'adhésion, de l'ordre de 80% après 1 h. L'anticorps TS151 serait donc capable d'inhiber l'adhésion des cellules A549 par l'intermédiaire d'un effet antagoniste sur l'intégrine α6β4.