一种抗 VEGF抗体的用途

技术领域

本发明涉及医药领域。 具体地， 本发明涉及抗 VEGF抗体在制备 抗肿瘤药物中的用途。 背景技术

血管内皮生长因子 ( vascular endothelial growth factor, VEGF ) 通 过与血管内皮细胞上的相应受体结合促进内皮 细胞增殖， 同时可增加 血管通透性使内皮细胞迁移， 为新的血管生成打下基础。

VEGF具有两大重要功能： 促进血管内皮细胞的分裂增殖和增加 血管通透性。 两种功能是分别通过不同的受体来实现的， 即 Fit- 1和 KDR受体。这两种受体均为酪氨酸激酶受体，当 VEGF与受体结合后， 酪氨酸蛋白激酶被激活， 大量钙离子内流从而导致级联放大反应， 引 起一系列的生物效应。 VEGF与 Fit受体结合后可以促进内皮细胞的分 裂增殖， 从而促进血管的增生。 与 KDR受体结合后则可以增加毛细 血管后静脉和小静脉的通透性， 促进营养物质和炎性物质渗出。

肿瘤的生长需要新的微血管生成， 而新的血管生成提供了肿瘤循 环， 也增加了转移几率， 故微血管密度在许多原发肿瘤中已被作为判 断生物学侵袭性和转移潜能的指标。 肿瘤血管的生成中， 内皮细胞增 殖和细胞外基质的降解是两个基本组成部分。 VEGF在促血管内皮细 胞增殖和增加血管通透性方面的作用恰是肿瘤 新的血管生成所需要 的。

抗 VEGF 单克隆抗体能特异性的与 VEGF 结合而抑制其生物活 性，阻止 VEGF与受体相互作用，从而发挥对肿瘤血管的� �用。Avastin® (安维汀， 贝伐珠单抗， 由美国 Genentech公司开发的鼠源 VEGF单 克隆抗体， 目前已在中国上市）是首个获批上市的抗 VEGF单克隆抗 体， 但是其对 VEGF的亲和力不高， 还因为独家生产， 病人需要花费 高额的费用。 CN102002104A公开了一种抗 VEGF的单克隆抗体

EPI0030 , 其与 VEGF的亲和力和抗肿瘤活性均优于 Avastin。 EPI0030由江苏先声药物研究有限公司和宜康公� �共同开发， 通用名 为赛伐珠单抗。 CN102002104A公开了赛伐珠单抗 （即 EPI0030 ) 及 其在人非小细胞肺癌 NCI-H460细胞和人结肠癌 HCT-116细胞上的活 性。 而本发明人出乎意料地发现， 赛伐珠单抗对人乳腺癌、 人神经胶 质瘤和人肾癌棵小鼠移植瘤有显著抑制作用， 远远优于 CN102002104 公开的赛伐珠单抗对人非小细胞和人结肠癌棵 小鼠移植瘤的作用， 且 抑癌活性比已上市的 Avastin更为卓越。 发明内容

本发明涉及抗 VEGF抗体在制备抗肿瘤药物中的用途。

所述抗 VEGF抗体重链可变区的 CDR具有 SEQ ID N0.1、 SEQ ID NO.2和 SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列， 和 /或其轻链可变区的 CDR 具有 SEQ ID NO.4、 SEQ ID NO.5和 SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。

在一个实施方案中， 所述抗 VEGF抗体重链可变区氨基酸序列如 SEQ ID NO.7所示， 轻链可变区如 SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列。 在另一个实施方案中所述抗 VEGF抗体的重链可变区由 SEQ ID N0.7 所示的氨基酸序列经过取代、缺失和 /或添加一个或更多个氨基酸衍生 并与 SEQ ID NO. 7的氨基酸序列至少有 95%、 96%、 97%、 98%或 99% 的一致性， 且其轻链可变区由 SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列经过取 代、 缺失和 /或添加一个或更多个氨基酸衍生并与 SEQ ID NO. 8的氨 基酸序列至少有 95%、 96%、 97%、 98%或 99%的一致性， 且所述抗 VEGF抗体具有特异性结合 VEGF的活性。

在另一个实施方案中，所述抗 VEGF抗体重链氨基酸序列如 SEQ ID N0.9所示， 轻链如 SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列。 在另一个实 施方案中， 所述抗 VEGF抗体的重链由 SEQ ID NO.9所示的氨基酸序 列经过取代、缺失和 /或添加一个或更多个氨基酸衍生且与 SEQ ID NO. 9的氨基酸序列至少有 95%、 96%、 97%、 98%或 99%的一致性， 且其 轻链由 SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列经过取代、 缺失和 /或添加一 个或更多个氨基酸衍生且与 SEQ ID NO. 10的氨基酸序列至少有 95%、 96%、 97%、 98%或 99%的一致性， 且所述抗 VEGF抗体具有特 异性结合 VEGF的活性。

在本发明的一个实施方案中， 所述抗 VEGF抗体为赛伐珠单抗， "赛伐珠单抗"是指 CN102002104A 公开的抗 VEGF 的单克隆抗体 EPI0030 , 由保藏编号为 CGMCC No.3233的细胞株产生。

在本发明中 , 所述抗 VEGF抗体可以选自单链抗体、 双链抗体、 嵌合抗体、 人源化抗体、 以及上述抗体的衍生物、 功能等同物和同源 物， 抗体的抗原结合片段和含有抗原结合结构域的 任何多肽。

所述肿瘤可以选自乳腺癌、 神经胶质瘤、 肾癌、 肝癌、 前列腺癌、 胰腺癌、 头颈部癌症、 黑色素瘤、 卵巢癌、 多发性骨髓瘤和非霍奇金 淋巴瘤 （NHL )。 优选地， 所述肿瘤选自乳腺癌、 肾癌和神经胶质瘤。 肿瘤可以是转移性的。

本发明进行了对赛伐珠单抗体外抗肿瘤活性及 作用机制研究， 评 价并比较赛伐珠单抗及 Avastin的体外抗肿瘤活性及作用机制。 赛伐 珠单抗及 Avastin均能显著抑制 HUVEC (人脐静脉内皮细胞）中 VEGF 刺激的 VEGFR2/KDR及其下游信号通路的活化； 明显抑制 VEGF刺 激的 HUVEC增殖、 迁移及大鼠动脉环微血管的出芽； 赛伐珠单抗的 上述活性强于 Avastin; 结果说明赛伐珠单抗具有抗新生血管生成作 用， 且活性强于 Avastin。

本发明进行了赛伐珠单抗对人肺癌 NCI-H460棵小鼠移植瘤的疗 效评价， 并比较赛伐珠单抗、 Avastin对人肺癌 NCI-H460棵小鼠移植 瘤的疗效。 赛伐珠单抗明显抑制人非小细胞肺癌 NCI-H460棵小鼠移 植瘤的生长， 抑制作用有明显的剂量依赖性； Avastin同样明显抑制 NCI-H460的生长， 但缺乏剂量依赖性。 荷瘤小鼠对二药均能很好耐 受。 相比较而言 , 赛伐珠单抗对 NCI-H460的疗效明显优于 Avastin。 本发明进行了赛伐珠单抗对人结肠癌 Ls- 174t棵小鼠移植瘤的疗效评 价， 评价并比较赛伐珠单抗、 Avastin对人结肠癌 Ls-174t棵小鼠移植 瘤的疗效。 赛伐珠单抗明显抑制人结肠癌 Ls-174t棵小鼠移植瘤的生 长， 改善小鼠的一般状态 （如体重下降等） ， 并引起部分小鼠肿瘤缩 小； 在一定剂量范围内， 抑制作用有明显的剂量依赖性。 Avastin对 Ls- 174t同样有效， 也有一定的剂量依赖性。 赛伐珠单抗对 Ls-174t的 疗效似乎优于 Avastin。

本发明考察了赛伐珠单抗对人乳腺癌 MDA-MB-231棵小鼠移植 瘤的疗效，评价并比较赛伐珠单抗、 Avastin对人乳腺癌 MDA-MB-231 棵小鼠移植瘤的疗效。 赛伐珠单抗明显抑制人乳腺癌 MDA-MB-231 棵小鼠移植瘤的生长， 抑制作用有剂量依赖性； Avastin对

MDA-MB-231 同样有效， 但其疗效明显不及赛伐珠单抗（P<0.01 , 7.5 mg/kg组比较）。 荷瘤小鼠对以上药物均能 ^艮好地耐受。

本发明的一个实施方案是评价赛伐珠单抗对 人神经胶质瘤 SF763棵小 鼠移植瘤的疗效， 评价并比较赛伐珠单抗、 Avastin对人神经胶质瘤 SF763棵小鼠移植瘤的疗效。赛伐珠单抗显著抑� ��人神经胶质瘤 SF763 棵小鼠移植瘤的生长， 抑制作用有剂量依赖性； 各剂量组赛伐珠单抗 均引起部分肿瘤缩小 （PR )。 Avastin对 SF763同样有明显疗效， 但缺 乏明显的剂量依赖性， 且其疗效不及赛伐珠单抗 （P<0.05 vs 赛伐珠 单抗 7.5 mg/kg组）。 荷瘤小鼠对以上二药均耐受良好。

本发明评价了赛伐珠单抗对人肾癌 Caki-1棵小鼠移植瘤的疗效， 评价并比较赛伐珠单抗、 Avastin对人肾癌 Caki-1棵小鼠移植瘤的疗 效。 赛伐珠单抗明显抑制人肾癌 Caki- 1棵小鼠移植瘤的生长， 抑制作 用有明显的剂量依赖性； 相同剂量、 相同方案比较， 赛伐珠单抗对 Caki- 1的疗效明显优于 Avastin ( P<0.05, 7.5 mg/kg组比较）。 荷瘤小 鼠对以上药物均能很好地耐受。

对比赛伐珠单抗对多种不同的棵小鼠移植瘤的 抑制活性， 可知赛 伐珠单抗对多种肿瘤均有抑制作用， 其中对人乳腺癌 （7.5mg/kg赛伐 珠单抗组抑癌率为 77% )、 人神经胶质瘤 （ 7.5mg/kg赛伐珠单抗组抑 癌率为 132% ) 和人肾癌 （ 7.5mg/kg赛伐珠单抗组抑癌率为 59% ) 有 着极高的抑制活性， 抑癌活性强于 Avastin。 2011年， 基于 Avastin治 疗乳腺癌的疗效并不明显， FDA除移了 Avastin治疗乳腺癌这一适应 症。 此后英国也未批准 Avastin治疗乳腺癌的用途。 结合本发明实施 例的实验数据， 2.5mg/kg剂量下， 赛伐珠单抗对人乳腺癌 MDA-MB-231棵小鼠移植瘤抑制率为 59% , 远高于 Avastin的 26%; 在 7.5mg/kg剂量下， 赛伐珠单抗的抑瘤率为 77% , 远高于 Avastin的 41 %。 上述数据显示赛伐珠单抗对人乳腺癌的抑癌作 用要强于

Avastin, 提示了赛伐珠单抗可用于人乳腺癌的治疗。 发明详述

除非另有定义， 本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术 人 员所理解的相同含义。 关于本领域的定义及术语， 专业人员具体可参 考 Current Protocols in Molecular Biology ( Ausubel )。 氛基酸残基的缩 写是本领域中所用的指代 20个常用 L-氨基酸之一的标准 3字母和 /或 1字母代码。

术语"抗体"和"免疫球蛋白"在本文中可以互换� �用。 这些术语均 为本领域技术人员所熟知的术语， 具体是指由能特异结合抗原的一种 或多种多肽构成的蛋白质。 抗体的一种形式构成了抗体的基本结构单 元。 这种形式是四聚物， 它由两对完全相同的抗体链构成， 每一对都 有一个轻链和一个重链。 在每对抗体链中， 轻链和重链的可变区联合 在一起共同负责结合抗原， 而恒定区则负责抗体的效应器功能。

目前己知的免疫球蛋白多肽包括 κ和 λ轻链， 以及 α, γ ( Igd , IgG ₂ , IgG ₃ , IgG ₄ ), δ, ε和 μ重链或它们的其它类型等价物。 全长的 免疫球蛋白"轻链"（大约 25kDa或大约 214 个氨基酸）包含一个由 NH ₂ 末端上大约 110 个氨基酸形成的可变区， 以及一个 COOH末端上的 κ 和 λ恒定区。 全长的免疫球蛋白"重链"（大约 50kDa 或大约 446 个 氨基酸）， 同样包含一个可变区 （大约 116 个氨基酸） ， 以及重链恒 定区之一， 例如 γ (大约 330个氨基酸）。

术语 "抗体 "和 "免疫球蛋白"包括任何同型体的抗体或免疫球� ��

Fab , Fv, scFv和 Fd片段、 嵌合抗体、 人源化抗体、 单链抗体以及包 含抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白质的融合 蛋白质。 抗体可以被标 记和检测， 例如， 可以通过放射性同位素、 能产生可检测物的酶、 荧 光蛋白质、 生物素等等进行标记并被检测。 抗体还可以结合于国相载 体， 包括但不限于聚苯乙烯平板或珠粒等等。 该术语还包括 Fab' 、 单克隆抗体。

"抗 VEGF抗体"是与 VEGF以足够的亲和力以及特异性结合的抗 体。 在本发明的一些实施方案中， 所述的 "抗 VEGF抗体"是赛伐珠单 抗。 赛伐珠单抗是 CN102002104A公开的抗 VEGF的单克隆抗体 EPI0030 , 制备方法参见说明书实施例的部分。

术语 "特异性结合"是指抗体或其抗原结合片段与抗� ��形成在生理 条件下相对稳定的复合物。 确定抗体与抗原是否特异性结合的方法是 本领域周知的， 包括例如平衡透析、表面等离子体共振等。与 人 VEGF 特异性结合的抗体也可以与其他抗原 （例如， 来源于其他 （非人） 物 种的 VEGF分子） 具有交叉反应性。

术语"单克隆抗体 （MAb ) ，，和 "单抗 "在本文中可以互换使用， 是 指对于特定抗原的抗体的同类群体并且该抗体 仅包含一种类型的抗原 结合位点并且只结合抗原决定簇上的一个表位 。 通过本领域技术人员 所公知的方法可以获得对于特定抗原的单克隆 抗体。 例如单克隆抗体 可以通过杂交瘤法， 或者重组 DNA法制备。

在一些实施方案中， 本发明的抗 VEGF抗体包括抗体的抗原结合 片段如 Fv、 scFv ( sc指单链）、 Fab、 F(ab，）2、 Fab，、 scFv-Fc片段或 者双抗体 （diabody )、 或者通过化学修饰或通过掺入脂质体中应能够 增加半寿期的任何片段， 所述化学修饰例如添加聚 （亚烷基） 二醇如 聚乙二醇 （ "聚乙二醇化， PEG化"）（被称为 Fv-PEG、 scFv-PEG, Fab-PEG、 F(ab')2-PEG 或 Fab'-PEG的聚乙二醇化片段）（ "PEG" 为 聚乙二醇）， 所述片段具有 VEGF结合活性。 优选地， 所述抗体的抗 原结合片段将由其来源抗体的重或轻可变链的 部分序列构成或者包含 它们， 所述序列足以保留与其来源抗体相同的结合特 异性和充分的亲 和力。 在一些实施方案中， 本发明的抗 VEGF抗体可以是人抗体或人源 化抗体， 以降低在人中的抗原性。 人抗体或人源化抗体的制备方法是 本领域技术人员公知的。

与来源序列相比， 本发明公开的抗 VEGF抗体可以在重链和轻链 序列中包含一个或更多个 （例如 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或 10 个或更多个）氨基酸取代、 缺失和 /或添加。 在一个实施方案中， 本发 明的抗 CD48抗体可在重链和轻链序列包含一个或更多� �（例如 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或 10个或更多个）保守性氨基酸替换。 本领域 普通技术人员从本文公开的重链和轻链序列出 发可容易地产生包含一 个或更多个改变的多种抗体。 一旦得到， 可容易地检测包含一个或更 多个改变的抗体的一个或更多个期望性质， 例如结合特异性提高、 结 合亲和力增加、 拮抗或竟争生物学特性 （根据具体情况） 的提高或增 强、 免疫原性降低等。 以这种一般方式得到的抗体涵盖在本发明内。

本发明所述的抗体序列一致性可以使用序列分 析软件测量。 蛋白 质分析软件使用分配给多种替换、 缺失和其他改变 （包括保守氨基酸 替换） 的相似性计量来匹配相似序列。 例如， GCG软件包含程序如 Gap和 Bestfit, 其可用缺省参数来确定密切相关的多肽。 也可用使用 缺省或推荐参数的 FASTA比较多肽序列。当将本发明的序列与包含� �� 量来源于不同生物体的序列的数据库进行比较 时， 另一优选算法是使 用缺省参数的计算机程序 BLAST, 尤其是 BLASTP或 TBLASTN。 参 见， 例如 Altschul等（1990) J. Mol. Biol. 215:403-410和 Altschul等 (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402。

本发明所述的药物组合物可以用改善转移、 递送、 耐受性等的合 适载体、 赋形剂和其他试剂配制。 所采用的剂型可以包括例如： 片剂、 粉剂、 糊剂、 膏剂、 凝胶剂、 蜡状物、 油、 脂质、 含脂质嚢泡、 DNA 缀合物等。 所述药物的施用方式根据具体应用而不同， 包括但不限于 静脉内、 皮下、 皮内和肌内注射、 滴注等。 附图说明 图 1. 赛伐珠单抗及 Avastin对 VEGF刺激的 HUVEC中 KDR信 号通路的作用。

图 2. 赛伐珠单抗及 Avastin对 VEGF刺激的 HUVEC细胞迁移的 作用 （实验体系不含 FBS )。

图 3. 赛伐珠单抗及 Avastin对 VEGF刺激的大鼠动脉环微血管出 芽的作用。

图 4. 赛伐珠单抗、 Avastin对人肺癌 NCI-H460棵小鼠移植瘤的 疗效。

图 5. 赛伐珠单抗、 Avastin对荷瘤棵小鼠 （人肺癌 NCI-H460 ) 体重的影响。

图 6. 赛伐珠单抗、 Avastin对人肺癌 NCI-H460棵小鼠移植瘤的 疗效. 肿瘤照片。

图 7. 赛伐珠单抗、 Avastin对人结肠癌 Ls-174t裸小鼠移植瘤的疗 效。

图 8. 赛伐珠单抗、 Avastin对荷瘤棵小鼠（人结肠癌 Ls-174t )体 重的影响。

图 9. 赛伐珠单抗、 Avastin对人结肠癌 Ls-174t棵小鼠移植瘤的疗 效. 肿瘤照片。

图 10. 赛伐珠单抗、 Avastin对人乳腺癌 MDA-MB-231棵小鼠移 植瘤的疗效。

图 11. 赛伐珠单抗、 Avastin对荷瘤棵小鼠 （人乳腺癌

MDA-MB-231 ) 体重的影响。

图 12. 赛伐珠单抗、 Avastin对人乳腺癌 MDA-MB-231棵小鼠移 植瘤的疗效. 肿瘤照片。

图 13. 赛伐珠单抗、 Avastin对人神经胶质瘤 SF763棵小鼠移植瘤 的疗效。

图 14. 赛伐珠单抗、 Avastin对荷瘤棵小鼠（人神经胶质瘤 SF763 ) 体重的影响。

图 15. 赛伐珠单抗、 Avastin对人神经胶质瘤 SF763棵小鼠移植瘤 的疗效. 肿瘤照片。 图 16. 赛伐珠单抗、 Avastin对人肾癌 Caki-1棵小鼠移植瘤的疗 效。

图 17. 赛伐珠单抗、 Avastin对荷瘤棵小鼠 （人肾癌 Caki-1 ) 体 重的影响。

图 18. 赛伐珠单抗、 Avastin对人肾癌 Caki-1棵小鼠移植瘤的疗 效. 肿瘤照片。

具体实施方式

本发明公开了一种抗 VEGF抗体在制备抗肿瘤药物中的用途， 本 领域技术人员可以借鉴本文内容， 适当改进工艺参数实现。 特别需要 指出的是， 所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说 是显而易见 的， 它们都被视为包括在本发明。 本发明的应用已经通过较佳实施例 进行了描述， 相关人员明显能在不脱离本发明内容、 精神和范围内对 本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与 组合， 来实现和应用本 发明技术。

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的 技术方案， 下面结 合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。 实施例 1： 制备本发明所述人源化 VEGF单抗

通过杂交瘤细胞技术制备兔单克隆抗体。 有关实验方案参见 US Patent: 7,429,487, 特另' J是 Example 1-4。

首先通过重组技术制备 IgG Fc-hVEGF-A (Human VEGF165)融合 蛋白， 其中 IgG Fc序列为兔源。 将 IgG Fc-hVEGF-A的 DNA序列克隆 入 pTT5质粒， 瞬时转染该质粒进入 ΗΕΚ 293-6Ε细胞株， 无血清培养细 胞， 收集培养上清液， 用 Protein Α柱纯化瞬时表达的 IgG Fc-hVEGF-A 融合蛋白。

用纯化的 IgG Fc-hVEGF-A (作为抗原组分）与完全弗氏佐剂混合 进行皮下多点注射， 对新西兰白兔（ New Zealand rabbits )进行首次免 疫，此后每三周 1次用纯化蛋白和不完全弗氏佐剂混合后皮下� �射对兔 进行加强免疫，在取脾脏前 4天用抗原加 PBS对兔静脉注射进行最终免 疫。

根据美国专利 US7429487的方法， 将兔脾细胞与免疫脾细胞来源 相同的永生化 HRGTP-的 B淋巴细胞 240E-W2细胞按 2: 1比例融合， 在 96孔板中以 HAT培养基培养， 然后进行杂交瘤细胞筛选， 所得细胞克 隆进入新的 IgG Fc-hVEGF-A结合筛选。

鉴定筛选过程分为 2个阳性克隆筛选步骤： ①将 IgG Fc-hVEGF-A 抗原固定化于 96孔酶联免疫吸附板上， 加入克隆表达上清孵育 lh后， 用 PBS洗涤 3次， 使用酶标记的抗体鉴定具有 IgG Fc-hVEGF-A结合活 性细胞克隆上清， 从而获得可与 IgG Fc-hVEGF-A直接结合的阳性克 隆。 ②随后将步骤①中的阳性克隆转移入 24孔板培养， 以获得更多的 表达产物。 将 IgG Fc-VEGFR2 ( KDR/Flk-1 )胞外区固定化于 96孔酶联 免疫吸附板上， 加入 IgG Fc-hVEGF-A和克隆表达产物共同孵育 lh, 再 用 PBS洗涤 3次， 使用酶标记的抗体检测 IgG Fc-hVEGF-A的含量， 以 鉴定克隆对 VEGF-VEGFR2 结合活性的抑制作用， 从而鉴别出能够阻 断 VEGF-VEGFR2结合的阳性克隆。

将所筛选的阳性克隆的杂交瘤细胞裂解， 提取 mRN A后逆转录得 cDNA。 以此 cDNA为模板， 采用 PCR方法分别扩增出兔 IgG抗体的轻 链和重链可变区核酸序列， 对重链可变区、 轻链可变区进行分析， 其 编码的重链可变区含有 SEQ ID NO.1的亲本序歹l ( Ser Asn Asn Asp Val Met Cys Trp )、 SEQ ID N0.2的亲本序列 ( Gly Cys lie Met Thr Thr Asp Val Val Thr Glu Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Ser ) 和 SEQ ID NO.3的亲本序 列 ( Arg Asp Ser Val Gly Ser Pro Leu Met Ser Phe Asp Leu Trp )、 轻链可 变区含有 SEQ ID NO.4的亲本序列（ Gin Ala Ser Gin Ser Val Tyr Gly Asn Asn Glu Leu Ser )、 SEQ ID NO.5的亲本序列 （ Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser ) 和 SEQ ID NO.6的亲本序列 （ Gly Gly Tyr Lys Ser Tyr Ser Asn Asp Gly Asn Gly )。 轻链核酸序列被克隆入 pTT5质粒。 重链可变区核酸序 列被克隆入已有重链恒定区的 pTT5质粒。 共转染轻、 重链质粒至 ΗΕΚ 293-6Ε细胞株， 培养 5天后， 用 Protein Α纯化上清， 最终获得重组表达 的兔抗人 VEGF165单克隆抗体。 采用上述阳性克隆陣选方法， 对表达 的重组抗体进行亲和力确认。

人源化技术参见美国专利 US 7,462,697 , 特别是优化实施方式的 详细描述部分 ( DETAILED DESCRIPTION OF PREFERRED

EMBODIMENTS )。

采用美国专利 US7,462,697所描述的技术，用人序列 VKI-2-l-( U ) -A20— JK4和 VH3-1-3-3-21— JH4作为参比序列。 表达的兔抗 VEGF单抗 序列经人源化后， 各得到 4个版本的 VK和 VH。 轻链可变区包括

VK-HZDK如 SEQ ID NO.12 )、VK-HZD2(如 SEQ ID NO.14 )、VK-HZD5 (如 SEQ ID NO.16 ) 和 VK-HZD6 (如 SEQ ID NO.8 ); 重链可变区包 括与 VH-HZDU如 SEQ ID NO.11 )所示、 VH- HZD2(如 SEQ ID NO.13 )、 VH- HZD5 (如 SEQ ID NO.15 ) 和 VH- HZD6 (如 SEQ ID NO.7 )。 与 VK-HZD1比较， VK-HZD2在 CDR1区具有 2个不同的残基。在 VK-HZD1 和 VK-HZD2 N端添加 2个额外的氨基酸残基后即分别成为 VK-HZD5和 VK-HZD6。 VH-HZD1与 VH-HZD2的 71位残基不同， VH-HZD1的 71位 是 K, VH-HZD2的 71位是 R。 VK(H)-HZD1和 VK(H)-HZD 2序列中含有 兔源信号肽， 而 VK(H)-HZD5和 VK(H)-HZD6的序列中含有人源信号 肽。

将 4个版本的 VK和 VH的 DNA序列通过人工合成后分别克隆 进已有人 CK序列和人 CH序列的 pTT5质粒中，通过人信号肽表达抗 体。 将上述两个质粒共转染 ΗΕΚ 293-6Ε 细胞， 瞬时表达人源化抗 VEGF抗体，使用实施例 1 中的筛选方法，选定亲和力适宜的 HZD-V6 克隆作为最终使用的克隆， 其表达的人源化抗 VEGF 抗体称为 EPI0030 , 其氨基酸序列如 SEQ ID NO.9所示的重链和 SEQ ID NO.10 所示的轻链。

为提高产量， 获得工业用生产细胞株， 将氨基酸序列如 SEQ ID NO.9所示的重链和 SEQ ID NO.10所示的轻链表达质粒共转染入中国 仓鼠卵巢细胞株 （CHO ), 于 2009年 8月 20 日保藏在中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心， 地址为北京市朝阳区大屯路， 保 藏编号为 CGMCC No.3233。 其产生的单克隆抗体的重链氨基酸序列 如 SEQ ID N0.9所示， 轻链如 SEQ ID NO.10所示， 在本发明的实施 例中， 命名为赛伐珠单抗 (即 CN102002104A公开的 EPI0030抗体）。

参照 CN102002104A, 细胞试验及动物体内试验证明， 本发明所述 抗体可在体外抑制 VEGF诱导的内皮细胞增殖和迁移， 并且可在动物 体内抑制肿瘤生长， 可用于治疗 VEGF相关性疾病。

实施例 2. 赛伐珠单抗体外抗肿瘤活性及作用机制研究

1.1 实验材料

1.1.1 受试药物

实验药物： 赛伐珠单抗由江苏先声药物研究有限公司提供 ； Avastin购自 Genentech公司。

配制方法： 赛伐珠单抗放在 -80 °C保存； Avastin放在 4 °C保存。 使用时用不含血清的培养液配成所需浓度。

1.1.2 细胞株及实验动物

HUVEC ( Human Umbilical Vein Endothelial Cells , 人脐静脉内皮 细胞） 通过以下方法提取： 新鲜产后脐带去除血细胞后， 用胶原酶对 脐静脉进行消化， 分离得到静脉内皮细胞， 细胞在含 20 g/ml ECGS、 20 %胎牛血清的 M199培养基中培养， 2-6代的细胞用来进行实验。

6周龄 SD ( Sprague Dawley )大鼠购自上海斯莱克实验动物中心。

1.1.3 试剂及仪器

Ml 99购自 Gibco BRL公司； 胎牛血清 FBS购自 Hyclone公司； 酶标仪 SPECTRA MAX 190购自 Molecular Devices公司； SRB 购自 Sigma公司； 人重组因子 VEGF ₆₅ 购自 R&D公司 （ Minneapolis, MN, Germany ); phospho-ERKl/2 antibody, ERK 1/2 antibody购自 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, US A)公司； 4G10抗体购自 upstate 公司（Charlottesville, VA , USA); β-tubulin antibody购自 Sigma公司； 抗兔 IgG二抗， 抗小鼠 IgG二抗， 硝酸纤维素膜， 以及 ECL检测试剂 盒购自 Amersham公司； Boyden Chamber Transwell购自 Corning公司； Matrigel购自 Becton Dickinson Labware公司； 其他试剂购自 Sigma公 司。

1.2 试 3 方法

1.2.1 Western blot法

HUVEC接种于六孔板中。不同浓度的赛伐珠单抗� �� Avastin与 50 ng/ml VEGF预孵育 30分钟， 再作用于 HU VEC 5分钟， 然后收集细 胞。细胞用 I x SDS凝胶上样緩冲液（ 50 mM Tris-HCl (pH 6.8) , 100 mM

DTT , 2 % SDS , 10%甘油， 0. 1 %溴酚蓝） 裂解。 细胞裂解物在沸水浴 中加热解热变性。

取上清液进行 SDS-PAGE电泳， 电泳结束后， 用湿转系统将蛋白 转移至硝酸纤维素膜， 然后将膜置于一抗溶液中温育。 用含 TBS/T洗 涤。 将膜置于二抗溶液中室温反应 1小时； 同上洗膜三次后， 用 ECL 试剂发色， 压片， 显影。

1.2.2 SRB法

应用横酰罗丹明 B蛋白染色法 （ Sulforhodamine B,SRB ) 检测药 物对 HU V E C增殖生长的抑制作用。 主要步骤如下：

接种一定数量的对数生长期 HUVEC于 96孔培养板。 贴壁生长 24小时 , 然后把不同浓度的赛伐珠单抗或 Avastin与 20 ng/ml VEGF 预孵育 30分钟， 再作用于 HUVEC。 每个浓度设复孔， 同时设相应浓 度的溶媒对照。 然后 HUVEC在 37 °C、 5% C0 ₂ 条件下再培养 72小时， 用 TCA固定细胞。 然后加入 SRB ( Sigma ) 溶液， 室温中染色， 去上 清液， 用 1 %醋酸洗涤， 空气干燥。 最后加入 Tris 溶液， 酶标仪

( SPECTRA max 190 ) 510 nm波长下测定 OD值， 以下列公式计算细 胞生长抑制率：

抑制率 = ( OD值对照孔― OD值给药孔 ) I OD值对照孔 x l 00%

根据各浓度抑制率， 计算半数抑制浓度 IC ₅ 。。

1 .2.3 HUVEC迁移 ( Migration ) 抑制试马

用 Boyden Chamber Transwell检测细胞迁移能力。 该装置分内外 两室。 内室底部为多聚碳酸盐滤膜。 HUVEC悬于无血清 M199培养 液中并种入内室。 把不同浓度的赛伐珠单抗或 Avastin与 20 ng/ml VEGF预孵育 30分钟， 然后加入外室。 37 °C孵育 16 h后， 弃去孔中 培养液， 用乙醇固定细胞。 用棉签擦去内室上层未迁移的细胞， 结晶 紫常温染色， 在显微镜下观察受试物对 HUVEC迁移能力的影响。

1 .2.4 大鼠动永环试马

选用 6周龄 SD ( Sprague Dawley ) 大鼠， 乙醚麻醉后， 分离主动 脉。 用手术刀将动脉切成 1 mm厚的薄片置于 96孔板中， 每孔加入 Matrigel包埋。 把不同浓度的赛伐珠单抗或 Avastin与 20 ng/ml VEGF 在不含 FBS的 M 199培养液中预孵育 30分钟， 然后加入孔中。 在培 养箱内常规培养， 第 7天取出， 显微镜下拍照观察。

1 .3 结果

1 .3. 1 赛伐珠单抗抑制了 VEGF刺激的 HUVEC中 KDR及下游信 号的活化

如图 1所示， VEGF能显著诱导高表达 KDR的 HUVEC中 KDR 的磷酸化。 而赛伐珠单抗与 VEGF预孵育后， 在 0.01 g/ml就能明显 抑制 VEGF刺激的 KDR以及下游因子 ERK1/2的磷酸化，其活性要强 于阳性对照抗体 Avastin。

1 .3.2 赛伐珠单抗抑制了 VEGF刺激的 HUVEC的增殖

如表 1所示， 赛伐珠单抗能显著抑制 VEGF刺激的 HUVEC的增 殖， 其 IC ₅ 。为 19.2 ng/ml„ 其抑制活性要远强于阳性对照抗体 Avastin ( IC ₅₀ = 146.3 ng/ml )。

表 1. 赛伐珠单抗及 Avastin对 VEGF刺激的 HUVEC增殖的作用

Agent IC ₅₀ (ng/ml)

赛伐珠单抗 19.2

Avastin 146.3

1 .3.3 赛伐珠单抗抑制了 VEGF刺激的 HUVEC的迁移

如图 2所示， FBS本身能够刺激 HUVEC迁移（Control); 在不含 FBS的情况下， VEGF同样能显著诱导 HUVEC的迁移， 而该迁移可 被赛伐珠单抗和 Avastin抑制。 赛伐珠单抗在 0. 1 μ^πιΐ就能明显抑制 VEGF刺激的 HUVEC的迁移， 其活性要强于阳性对照抗体 Avastin。 1.3.4 赛伐珠单抗抑制了 VEGF刺激的大鼠动脉环微血管的出芽 如图 3所示， VEGF能显著诱导大鼠动脉环微血管的出芽， 而赛 伐珠单抗在 1 g/ml能明显抑制 VEGF诱导的大鼠动脉环微血管的出 芽， 其活性要强于阳性对照抗体 Avastin。

1.4 结论

赛伐珠单抗及 Avastin均能显著抑制 HUVEC(人脐静脉内皮细胞 ) 中 VEGF刺激的 VEGFR2/KDR及其下游信号通路的活化； 明显抑制 VEGF刺激的 HUVEC增殖、 迁移及大鼠动脉环微血管的出芽； 赛伐 珠单抗的上述活性强于 Avastin; 结果说明， 赛伐珠单抗的体内抗肿瘤 作用可能是通过抑制新生血管生成。 实施例 3. 赛伐珠单抗对人肺癌 NCI-H460棵小鼠移植瘤的疗效评价

2.1 实验材料

受试药物： 赛伐珠单抗由江苏先声药物研究有限公司提供 ； Avastin购自 Genentech Co.„

配制方法： 赛伐珠单抗、 Avastin均用含 0.1 %BSA生理盐水配成 所需浓度。

实验动物： BALB/cA-nude棵小鼠， 6-7周， $ , 购自上海斯莱克 实验动物有限责任公司。 合格证号： SCXK (沪 ) 2007 - 0005。 饲养 环境： SPF级。

2.2 实验步骤

棵小鼠皮下接种人肺癌 NCI-H460细胞，待肿瘤生长至 60-200mm ³ 后， 将动物随机分组（d0)。 给药剂量和给药方案见表 2。 每周测 2 - 3 次瘤体积， 称鼠重， 记录数据。 肿瘤体积 （V ) 计算公式为：

V = l/2xaxb ² 其中 a、 b分别表示长、 宽。

T/C(%)=(T-T ₀ )/(C-Co)x lOO 其中 T、 C为实验结束时的肿瘤体积； T。、 C。为实验开始时的肿瘤体积。

2.3 结果

如表 2、 图 4-6所示， 赛伐珠单抗明显抑制人非小细胞肺癌 NCI-H460棵小鼠移植瘤的生长， 抑制作用有明显的剂量依赖性； Avastin同样明显抑制 NCI-H460的生长， 但缺乏剂量依赖性。 荷瘤小 鼠对二药均能 4艮好耐受。 相比较而言， 赛伐珠单抗对 NCI-H460的疗 效明显优于 Avastin ( P=0.003 )。

表 2. 赛伐珠单抗、 Avastin对人肺癌 NCI-H460棵小鼠移植瘤的疗效

Velucle D0、 Ί、 7、 10 IP 139.3 ± ie.7 24^3.4 ± 6661 - - 12 赛伐珠单抗 [i mg/I DO, 3、 7、 10 IP 145.8 ± 32.0 19Ώ.6 ± 455.2 21 0.12S 6 赛伐珠单抗 D0、 3、 7、 10 IP 150.0 ± 1S.3 1532.4 ± 541 .7 59 41 0.009 6 赛伐珠单抗 7.5mg/] DO3、 7、 10 IP 1 S.0 ± 36.6 724.9 ± 409.1 25 75 0.000 6 Avastin 2.5mg/kg DO, 3, 7、 10 IP 155.3 ± 33.3 1439.2 ± 255.7 55 45 0.002 6 Avastin 7.5mg¾ D0、 、 7、 10 IP 153.3 ± 16.5 1439.4 ± 241 .5 55 45 0.002 6 d0: 第一次给药时间； P 值指与对照相比。 对照组 n=12, 治疗组 n=6。

2.4 结论

赛伐珠单抗和 Avastin均明显抑制人非小细胞肺癌 NCI-H460棵小 鼠移植瘤的生长； 赛伐珠单抗对 NCI-H460的疗效明显优于 Avastin。 实施例 4. 赛伐珠单抗对人结肠癌 Ls-174t棵小鼠移植瘤的疗效评价

3.1 实验材料

受试药物： 赛伐珠单抗由江苏先声药物研究有限公司提供 ； Avastin购自 Genentech Co.„

配制方法： 赛伐珠单抗、 Avastin均用生理盐水配成所需浓度。 实验动物： BALB/cA-nude棵小鼠， 6-7周， $ , 购自上海斯莱克 实验动物有限责任公司。 合格证号： SCXK (沪 ) 2007 - 0005。 饲养 环境： SPF级。

3.2实验步骤

棵小鼠皮下接种人结肠癌 Ls-174t细胞，待肿瘤生长至 60-150mm ³ 后， 将动物随机分组（d0)。 给药剂量和给药方案见表 3。 每周测 2 - 3 次瘤体积， 称鼠重， 记录数据。 肿瘤体积 （V ) 计算公式为：

V = l/2xaxb ² 其中 a、 b分别表示长、 宽。 T/C(%)=(T-T ₀ )/(C-Co)xlOO 其中 T、 c为实验结束时的肿瘤体积； T。、 C。为实验开始时的肿瘤体积。

3.3 结果

如表 3、 图 7-9所示， 高剂量赛伐珠单抗 （ 7.5 mg/kg) 明显抑制 人结肠癌 Ls-174t棵小鼠移植瘤的生长， 改善小鼠的一般状态 （如体 重下降等） ， 并引起部分小鼠肿瘤缩小 （ 1/6肿瘤）； 在一定剂量范围 内 （如高、 中剂量给药时）， 抑制作用有明显的剂量依赖性； 但中、 低 剂量赛伐珠单抗对 Ls-174t没有明显的疗效； Avastin对 Ls-174t同样 有效， 也有一定的剂量依赖性。 赛伐珠单抗对 Ls-174t的疗效似乎优 于 Avastin, 但没有统计学差异 （ P=0.29, 7.5 mg/kg给药组之间比较）。 表 3. 赛伐珠单抗、 Avastin对人结肠癌 Ls-174t棵小鼠移植瘤的疗效

II (1 II

ι (λ、

ϋ: .i . - 赛伐珠单抗 10. 3' ？' w ± n -■ 赛伐珠单抗 ∑>0. 7, · ij: ± 3 5 ^ 赛伐珠单抗 7. ½ 1>0. ： ψ 9' -■ '27 .·,-..■·■

,' 'i i：- -2 59 41

ίϊ ' ± . ^; ..".-■ - dO: 第一次给药时间； P 值指与对照相比。 对照组 n=12, 治疗组 n=6,

3.4结论

赛伐珠单抗、 Avastin均明显抑制人结肠癌 Ls-174t棵小鼠移植瘤 的生长； 赛伐珠单抗对 Ls-174t的疗效似乎优于 Avastin。 实施例 5. 赛伐珠单抗对人乳腺癌 MDA-MB-231棵小鼠移植瘤的疗效 评价

4.1 实验材料

受试药物： 赛伐珠单抗由江苏先声药物研究有限公司提供 ； Avastin购自 Genentech Co.„

配制方法： 赛伐珠单抗、 Avastin均用生理盐水配成所需浓度。 实验动物： BALB/cA-nude棵小鼠， 6-7周， $, 购自上海斯莱克 实验动物有限责任公司。 合格证号： SCXK (沪 ) 2007 - 0005。 饲养 环境： SPF级。

4.2实验步骤

棵小鼠皮下接种人乳腺癌 MDA-MB-231细胞， 待肿瘤生长至

60-200mm ³ 后， 将动物随机分组（d0)。 给药剂量和给药方案见表 4。 每 周测 2-3次瘤体积， 称鼠重， 记录数据。 肿瘤体积（V)计算公式为：

V= l/2xaxb ² 其中 a、 b分别表示长、 宽。

T/C(%)=(T-T。)/(C-C。）xl00 其中 T、 C为实验结束时的肿瘤体积； T。、 C。为实验开始时的肿瘤体积。

4.3结果

如表 4、 图 10-12所示， 赛伐珠单抗明显抑制人乳腺癌

MDA-MB-231棵小鼠移植瘤的生长， 抑制作用有剂量依赖性； Avastin 对 MDA-MB-231 同样有效，但其疗效明显不及赛伐珠单抗（P&l t;0.01, 7.5 mg/kg组比较）。 荷瘤小鼠对以上药物均能 ^艮好地耐受。

表 4. 赛伐珠单抗、 Avastin对人乳腺癌 MDA-MB-231棵小鼠移植瘤 的疗效

平均 平均

Veliicle DO- 3- 7- 10- 14- 17 IV 1143 ±17.0 ±43 98S.S ±292.2 ±S4.3 - - - 12 赛伐珠单抗 0Sn¾fl¾ D0-. 3-. Ί.. 10-. 14-. 17 IV 109.4 ±15.7 ±6.4 935.5 ±151.8 ±62.0 95 5 0.717 6 赛伐珠单抗 25mgf^ DO- 3- 7- 10- 14- 17 IV 105 S ±14.9 ±6.1 460.3 ±15S.l ±64.5 11 59 0.001 6 赛伐珠单抗 75ic DO- 3- 7- 10- 14- 17 IV 1043 ±13.6 ±56 307.8 ±102.5 ±41.8 23 77 0.000 6

Austin .5η¾Λ¾ DO-. 3-. Ί-. 10-. 14-. 17 IV 109.1 ±15.3 ±62 155 & ±201.3 ±S2.2 71 26 0.10S 6

Austi 7.5n¾/hg DO- 3- 7- 10- 14- 17 IV 107.7 ±9.5 ±39 ΰ19.3 ±95.8 ±39.1 59 41 0.010 6 d0: 第一次给药时间； P 值指与对照相比。 对照组 n=12, 治疗组 n=6。

4.4 结论

赛伐珠单抗、 Avastin均明显抑制人乳腺癌 MDA-MB-231棵小鼠 移植瘤的生长； 赛伐珠单抗对 MDA-MB-231的疗效明显优于 Avastin。 实施例 6. 赛伐珠单抗对人神经胶质瘤 SF763棵小鼠移植瘤的疗效

5.1 实验材料

受试药物： 赛伐珠单抗由江苏先声药物研究有限公司提供 ；

Avastin购自 Genentech Co.„

配制方法： 赛伐珠单抗、 Avastin均用生理盐水配成所需浓度。

实验动物： BALB/cA-nude棵小鼠， 6-7周， $ , 购自上海斯莱克 实验动物有限责任公司。 合格证号： SCXK (沪 ) 2007 - 0005。 饲养 环境： SPF级。

5.2 实验步骤

棵小鼠皮下接种人神经胶质瘤 SF763细胞， 待肿瘤生长至 60-150 mm ³ 后， 将动物随机分组（d0 )。 给药剂量和给药方案见表 5。 每周测 2 - 3次瘤体积， 称鼠重， 记录数据。 肿瘤体积 （V ) 计算公式为：

V = l/2xaxb ² 其中 a、 b分别表示长、 宽。

T/C(%)=(T-T ₀ )/(C-Co)x lOO 其中 T、 C为实验结束时的肿瘤体积； T。、 C。为实验开始时的肿瘤体积。

5.3 结果

如表 5、 图 13-15所示， 赛伐珠单抗显著抑制人神经胶质瘤 SF763 棵小鼠移植瘤的生长， 抑制作用有剂量依赖性； 各剂量组赛伐珠单抗 均引起部分肿瘤缩小 （PR )。 Avastin对 SF763同样有明显疗效， 但缺 乏明显的剂量依赖性， 且其疗效不及赛伐珠单抗 （P<0.05 vs 赛伐珠 单抗 7.5 mg/kg组）。 荷瘤小鼠对以上二药均耐受良好。

表 5. 赛伐珠单抗、 Avastin对人神经胶质瘤 SF763棵小鼠移植瘤

Vehicle DO. 3- 7- 10- 14 17 IV 1172 ± S.l 349.0 ± 232.6 - 0 12 赛伐珠单抗 Ci.8n¾/1¾ DO- 3- 7- 10- 14, 17 IV 1143 ± 17.8 124.9 ± 3S.S 1 96 0.03S 3 6 赛伐珠单抗. DO. 3- Ί-. 10. 1 17 IV 1233 ± 15.3 112.S ± 44.9 -9 109 0.025 3 6 赛伐珠单抗 DO. 3-. Ί 10. 1 17 IV 1173 ± 15.4 802 ± 29.7 -32 132 0.014 5 6

Austin 2.5n¾/kg D0-. 3-. Ί 10-. 14, 17 IV 1343 ± 23.2 137.1 ± ΰ0.0 5 95 0.042 3 6

Avastm7.5mg¾ DO. 3- Ί 10. 14. 17 IV ΥΏ.5 ± 16.2 Ώ4.6 ± 30.2 1 99 0.031 1 6 d0: 第一次给药时间； P 值指与对照相比。 对照组 n=12 , 治疗组 n=6。

5.4结论

赛伐珠单抗、 Avastin均明显抑制人神经胶质瘤 SF763棵小鼠移植 瘤的生长； 赛伐珠单抗对 SF763的疗效强于 Avastin; 荷瘤小鼠对以上 二药均耐受良好。 实施例 7. 赛伐珠单抗对人肾癌 Caki-1棵小鼠移植瘤的疗效评价

6.1 实验材料

受试药物： 赛伐珠单抗由江苏先声药物研究有限公司提供 ； Avastin购自 Genentech, Inc.„

配制方法： 赛伐珠单抗、 Avastin均用生理盐水配成所需浓度。 实验动物： BALB/cA-nude棵小鼠， 6-7周， $ , 购自上海斯莱克 实验动物有限责任公司。 合格证号： SCXK (沪 ) 2007 - 0005。 饲养 环境： SPF级。

6.2 实验步骤

棵小鼠皮下接种人肾癌 Caki-1细胞， 待肿瘤生长至 60- 150 mm ³ 后， 将动物随机分组（d0)。 给药剂量和给药方案见表 6。 每周测 2 - 3 次瘤体积， 称鼠重， 记录数据。 肿瘤体积 （V ) 计算公式为：

V = l/2xaxb ² 其中 a、 b分别表示长、 宽。

T/C(%)=(T-T。)/(C-C。）x l00 其中 T、 C为实验结束时的肿瘤体积； T。、 C。为实验开始时的肿瘤体积。

6.3 结果

如表 6、 图 16- 18所示， 赛伐珠单抗明显抑制人肾癌 Caki- 1棵小 鼠移植瘤的生长， 抑制作用有明显的剂量依赖性； 相同剂量、 相同方 案比较， 赛伐珠单抗对 Caki-1的疗效明显优于 Avastin(P<0.05, 7.5mg/kg组比较）。 荷瘤小鼠对以上药物均能 ^艮好地耐受。

表 6. 赛伐珠单抗、 Avastin对人肾癌 Caki-1棵小鼠移植瘤的疗效 途

Vehicle D0、 3、 Ί、 10、 14、 17 IV 115.9 ± 1SJ≤ 920.7 ± 194.0 - - - 12 赛伐珠单抗 O.Snig/^ D0、 3、？、 10、 14、 Π IV 11S.5 ± 2 5 710J ± 319.4 74 Έ o.oes 赛伐珠单抗 2.5mg/kg D0、 3、 7、 10、 14、 Π IV 113.4 ± 149 6295 ± 134.5 64 36 0.005 赛伐珠单抗 7.5mg/kg D0、 3、 7、 10、 14、 Π IV 111.6 ± 233 «1.1 ± 37.0 41 59 0.000

dO: 第一次给药时间； P 值指与对照相比。 对照组 n=12 , 治疗组 n=6。 6.4结论

赛伐珠单抗明显抑制人肾癌 Caki- 1棵小鼠移植瘤的生长； 赛伐珠 单抗对 Caki-1的疗效明显优于 Avastin。 以上所述仅是本发明的优选实施方式， 应当指出， 对于本技术领 域的普通技术人员来说， 在不脱离本发明原理的前提下， 还可以做出 若干改进和润饰， 这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

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