La présente invention concerne la culture en milieu acellulaire de bactéries dont la croissance est sensible à la tension en oxygène, notamment des bactéries qui tolèrent mal des tensions élevées d'oxygène et pour lesquelles une croissance optimale de la dite bactérie requière une atmosphère d'incubation à teneur en oxygène relativement réduite par rapport à la teneur en oxygène de l'air voire des bactéries anaérobies strictes pour lesquelles l'oxygène est toxique et qui doivent être cultivées en absence totale d'oxygène ou ne tolérant que de faibles concentrations d'oxygène. Il convient en effet de noter que certaines bactéries considérées comme anaérobie strictes peuvent parfois tolérer de faibles concentrations en oxygène.

On distingue donc parmi les bactéries sensibles à l'oxygène : -les bactéries microaérophiles c'est-à-dire qu'elles ne sont pas capables de cultiver sous une atmosphère comprenant la concentration d'oxygène ambiante qui est de environ 21%, notamment entre 1% et 20%, le plus communément à environ 2-2,5%, et

-les bactéries anaérobies strictes c'est-à-dire qu'elles ne sont pas capables de cultiver en présence d'oxygène ou dans des concentrations inférieures aux concentrations de microaérophilie, notamment strictement inférieure à 1%, le plus communément inférieure à 0.1%, idéalement 0%. Pour cultiver les bactéries anaérobies strictes, il faut soit les cultiver dans des étuves ne comportant pas d'oxygène, soit dans des tubes qui ont été désoxygénés et elles ne poussent alors qu'au fond du tube.

Parmi les bactéries anaérobies strictes, on cite plus particulièrement les bactéries extracellulaires, c'est à dire des bactéries qui qui ne peuvent vivre qu'à l'extérieur de cellules. Parmi les bactéries cultivables en atmosphère microaérophile, on distingue plus particulièrement, les bactéries intracellulaires, mais aussi des bactéries extracellulaires.

On entend ici par «bactérie intracellulaire», une bactérie qui a la capacité de se multiplier au sein d'une cellule hôte. Les bactéries intracellulaires, ayant la faculté de croître dans certaines conditions dans des milieux acellulaires, sont dénommées "bactéries intracellulaires facultatives".

On entend ici par «bactérie intracellulaire facultative », une bactérie qui a la capacité de se multiplier au sein d'une cellule hôte et en milieu acellulaire.

On entend ici par «bactérie extracellulaire, une bactérie qui n'a pas la capacité de se multiplier au sein d'une cellule hôte et se cultive exclusivement en milieu acellulaire. On entend ici par «milieu de culture acellulaire», un milieu de culture qui ne comprend pas de cellules entières notamment qui ne comprend pas de cellules hôtes entières au sein desquelles la dite bactérie peut se multiplier, lorsque ladite bactérie est intracellulaire ou intracellulaire facultative. On comprend que les cellules entières doivent être vivantes pour permettre une multiplication de la bactérie en leur sein.

Plus particulièrement, la présente invention concerne la culture de bactéries anaérobies et la culture de bactéries microaérophiles intracellulaires. Deux possibilités existent aujourd'hui afin de contrôler la concentration en oxygène dans l'atmosphère utilisée pour l'isolement et la culture des bactéries cultivables en microaérophilie ou en anaérobiose. La première consiste à utiliser des dispositifs de type Gaspak (Oxoid) à base de molécules réductrices qui réagissent et consomment l'oxygène incubé en présence des milieux de culture dans des récipients hermétiques. Un inconvénient de cette approche est qu'elle ne permet pas d'obtenir des concentrations précises en oxygène, ce qui est crucial notamment dans le cas des espèces microaérophiles. La deuxième solution consiste à placer les cultures dans des étuves à concentrations contrôlées en oxygène. Cependant celles-ci sont coûteuses et requièrent une consommation importante en azote ou autre gaz.

Dans l'article Krieg et al. [10], on décrit l'effet de composés oxydants sur la culture de bactéries microaérophiles extracellulaires, notamment Campylobacter jejuni, pour laquelle la cystéine et l'acide ascorbique n'améliorent pas l'aérotolérance (cf. p. 113, 4 ^eme paragraphe cystéine, thioglycolate, mercaptoethanol, thiourea and ascorbic acid do not enhance aerotolerance of C. jejuni on brucella agar and some of thèse actually inhibit growth...In the case of cystéine...the inhibitory action is likely due to génération of H ₂ 0 ₂ during autooxidation") .

L'article Omsland et al. [3] concerne le milieu de culture axénique ACCM contenant de la L. cystéine. Il est indiqué que le remplacement de la L. cystéine par le glutathion ne permet pas de soutenir la croissance de Coxiella burnetii (cf. page 4433, colonne de gauche, fin du 1er paragraphe :"ACCM, containing the alternative antioxydant L. glutathion instead of L. cystéine, did not support C. burnetii growth"). L'article de Podkopaeva et al. [11] concerne la culture de la bactérie microaérophile extracellulaire Spirillum winogradskii en présence de thiosulfate.

Le but de la présente invention est d'améliorer et faciliter les conditions de croissance en culture acellulaire des bactéries dont la croissance est sensible à la tension en oxygène et notamment des bactéries qui tolèrent mal des tensions élevées d'oxygène et pour lesquelles une croissance optimale de la dite bactérie requière une atmosphère d'incubation à teneur en oxygène relativement réduite par rapport à la teneur en oxygène de l'air, lesdites bactéries étant choisies parmi les bactéries suivantes : - les bactéries anaérobies, y compris les bactéries anaérobies strictes, et

- les bactéries microaérophiles intracellulaires facultatives du type citées ci-dessus.

On entend ici par «atmosphère microaérophile», de l'air appauvri en oxygène avec une proportion molaire en oxygène inférieure à 10%, de préférence 5%, de préférence encore inférieure à 2,5%. Pour les bactéries anaérobies strictes, la teneur en oxygène doit être proche de 0%, notamment inférieure à 0.1%, comme mentionné ci-dessus, la tolérance à de très faibles quantités d'oxygène étant variable selon les espèces de bactéries anaérobies.

Les inventeurs ont découvert de façon fortuite que l'ajout de certains composés antioxydants dans un milieu de culture acellulaire pouvait permettre de:

- améliorer la croissance des dites bactéries en obtenant plus rapidement des bactéries en concentration suffisante pour être détectables après multiplication et/ou en augmentant la concentration en bactéries après un délai donné de culture, c'est-à-dire par unité de temps, et

- cultiver avec au moins un même niveau de croissance voire à un niveau plus élevé, des bactéries anaérobies strictes en présence de quantité plus élevées d'oxygène qu'en l'absence de composé antioxydant, c'est-à-dire en atmosphère microaérophile, notamment avec des teneurs en oxygène de 2 à 5%, mais aussi des teneurs en oxygène supérieures à 5%, voire en aérobie, c'est-à-dire en présence d'un taux d'oxygène équivalent à la tension en oxygène proche de l'air ambiant soit environ 21%, et

- cultiver avec au moins un même niveau de croissance, dans une atmosphère contenant des tensions d'oxygène plus élevées, desdites bactéries intracellulaires microaérophiles, cultivables en l'absence de composé antioxydant, en atmosphère microaérophile, voire avec un niveau de croissance plus élevé comme c'est le cas pour la bactérie Coxiella burnetii; et

- cultiver avec un niveau de croissance plus élevé, en atmosphère microaérophile, des bactéries cultivables, en l'absence de composé antioxydant, dans une atmosphère contenant une tension d'oxygène plus élevée, mais inférieure à la teneur en oxygène de l'air, comme c'est le cas pour la bactérie intracellulaire facultative Mycobacterium tuberculosis. La présente invention fournit donc un procédé de culture in vitro de bactéries en milieu de culture acellulaire, de bactéries dont la croissance est sensible à la teneur en oxygène, la croissance optimale desdites bactéries exigeant une atmosphère d'incubation à teneur en oxygène relativement réduite, voire nulle, par rapport à la teneur en oxygène de l'air, lesdites bactéries étant choisies parmi les bactéries anaérobies et les bactéries microaérophiles intracellulaires, caractérisé en ce que l'on ajoute dans le dit milieu de culture acellulaire un composé antioxydant choisi parmi l'acide ascorbique, le glutathion et l'hydrosulfure de sodium, et l'on cultive la dite bactérie dans ledit milieu de culture en présence d'oxygène.

Plus particulièrement, les inventeurs ont découvert que l'ajout d'un composé antioxydant confère un effet tampon au regard de la teneur en oxygène pour les bactéries, notamment les bactéries anaérobies strictes et les bactéries intracellulaires car cet ajout permet de tolérer une croissance en présence de teneur en oxygène relativement plus élevée, notamment pour les bactéries microaérophiles intracellulaires telles que Coxiella burnetii et les bactéries anaérobies strictes. Et, cet ajout permet aussi pour certaines bactéries telles que Mycobacterium tuberculosis cultivables à des tensions d'oxygènes plus élevées en l'absence de composé antioxydant, d'améliorer leur croissance à des tensions en oxygène diminuées en présence de composé antioxydant.

Les inventeurs formulent l'hypothèse non encore totalement élucidée et démontrée que l'effet du composé antioxydant pourrait provenir d'une réaction avec les radicaux libres oxygénés toxiques ayant un effet inhibiteur de la toxicité des dits radicaux à rencontre de la croissance de la dite bactérie. Ces radicaux résultant de l'action de l'oxygène sur des substances issues des bactéries et/ou milieu de culture, seraient responsables des difficultés de culture et mauvaise tolérance de la croissance des dites bactéries en présence de teneurs élevées d'oxygène.

Plus particulièrement, le dit milieu acellulaire est un milieu autre qu'un milieu constitué essentiellement à partir d'un lysat ou broyât cellulaire d'un type de cellules eucaryotes donné, notamment autre qu'un filtrat de dit broyât ou lysat, de préférence un milieu autre qu'un milieu acellulaire de lysat ou broyât cellulaire d'un type de cellules eucaryotes donné au sein desquelles la dite bactérie peut être cultivée, notamment autre qu'un filtrat de dit broyât ou lysat, notamment lorsqu'il s'agit d'une bactérie intracellulaire.

Plus particulièrement, le dit milieu acellulaire est choisi parmi un milieu axénique constitué de substances chimiques ou biologiques défini qualitativement et quantitativement, et un milieu comprenant un extrait de broyât ou lysat de tissu pluricellulaire.

Plus particulièrement encore, le dit milieu acellulaire est un milieu axénique constitué de substances chimiques ou biologiques défini qualitativement et quantitativement, lorsque la dite bactérie est une bactérie intracellulaire facultative, et le dit milieu acellulaire est constitué à partir d'un broyât ou lysat de tissu pluricellulaire, notamment un filtrat de dit broyât ou lysat, notamment de tissu sanguin ou tissu de cœur et/ou poumon, lorsque ladite bactérie est une bactérie extracellulaire. De tels milieux de culture acellulaires qu'ils soient liquides, solides ou biphasiques sont bien connus de l'homme de l'art.

Plus particulièrement, on cultive la dite bactérie dans une dite atmosphère d'incubation comprenant une proportion molaire en oxygène supérieure à la tension maximale tolérée en l'absence de composé antioxydant pour un même niveau de croissance dans une même durée de culture.

En pratique, plus particulièrement encore, on cultive la dite bactérie dans une dite atmosphère d'incubation comprenant une proportion molaire en oxygène inférieure ou égale à 20% Avantageusement toutefois, on cultive lesdites bactéries selon la présente invention dans une atmosphère comprenant une teneur en oxygène supérieure à 5%, notamment dans de l'air contenant 5% de C0 ₂ (soit une teneur en oxygène inférieure à 16%), voire dans une atmosphère aérobie. Plus particulièrement encore, dans certains cas, comme explicité ci-après, on cultive la dite bactérie microaérophile intracellulaire dans une dite atmosphère d'incubation microaérophile comprenant une proportion molaire en oxygène inférieure à 5%, de préférence de 2 à 5%, de préférence encore 2,5%. De préférence, on ajoute dans ledit milieu de culture une concentration déterminée d'un composé antioxydant déterminé.

Les inventeurs ont en effet testé différentes molécules présentant une activité antioxydante et ont découvert que certains composés anti-oxydants dans certaines concentrations présentent un effet supérieur sur la croissance des dites bactéries.

Plus particulièrement, le dit composé antioxydant est choisi parmi l'acide ascorbique, le glutathion (y-L-Glutamyl-L-cysteinylglycine) et l'hydrosulfure de sodium. L'acide ascorbique et le glutathion sont préférés car ils sont capables à des doses précises de permettre la culture à un niveau d'oxygène plus élevé.

Plus particulièrement encore, le dit composé antioxydant est mis en œuvre à une concentration de 1 pg/ml à 2 mg/ml, ou concentration molaire de 10 ^"6 M à 10 ^"2 M, de préférence au moins 100 pg/ml ou au moins 10 ^"5 M.

De préférence, le dit composé antioxydant est l'acide ascorbique et/ou le glutathion, de préférence à une concentration d'au moins 100 Mg/ml. Plus particulièrement, la dite bactérie est une bactérie cultivable dans un dit milieu de culture en l'absence de dit composé oxydant sous une atmosphère d'incubation comprenant une proportion molaire en oxygène inférieure à la proportion molaire d'oxygène dans l'air, de préférence inférieure à 20%, et on cultive la dite bactérie en présence de dit composé oxydant dans le dit milieu de culture sous une atmosphère d'incubation comprenant une teneur en oxygène inférieure ou égale à la proportion d'oxygène dans l'air, de préférence inférieure à 20%, de préférence encore supérieure à 5%.

Selon un premier mode de réalisation, la dite bactérie est une bactérie anaérobie extracellulaire cultivable en atmosphère anaérobie en l'absence de dit composé antioxydant, et l'on obtient une croissance de la dite bactérie en présence d'oxygène avec une proportion molaire inférieure ou égale à la proportion d'oxygène dans l'air.

Parmi les bactéries extracellulaires anaérobies, on cite plus particulièrement les bactéries appartenant aux genres Peptostreptococcus, Finegoldia, Anaerococcus, Peptoniphilus, Veillonella, Propionibacterium, Lactobacillus, Actinomyces, Clostridium, Bacteroides, Porphyromonas, Prevotella, Firmicutes, Solobacterium, Atopobium, Ruminococcus et Fusobacterium, de préférence les espèces choisies parmi Finegoldia magna, Bacteroides massiliensis, Fusobacterium necrophorum, Finegoldia magna, Prevotella nigrescens, Solobacterium morei, Atopobium vaginae et Ruminococcus gnavus.

Selon ce premier mode de réalisation plus particulier, on cultive une bactérie extracellulaire anaérobie dans un dit milieu acellulaire en présence d'une proportion molaire d'oxygène inférieure ou égale à celle de l'air et en présence de composé antioxydant, de préférence l'acide ascorbique, le gluthation ou l'hydrosulfure de sodium, de préférence encore l'acide ascorbique à une concentration d'au moins 100 pg/ml, de préférence encore au moins 1 mg/ml, ou le gluthation à au moins lOOpg/ml, de préférence à une concentration d'au moins 500pg/ml, ou encore d'un mélange d'acide ascorbique et de gluthation à des concentrations respectives de 500pg/ml chacun.

Plus particulièrement, le dit milieu de culture de bactéries anaérobies peut se trouver sous forme liquide ou de préférence, solide ou semi-solide, notamment gélosé ou semi gélosé, gélosé ou semi gélosé.

Plus particulièrement, ledit milieu de culture est un milieu acellulaire conventionnel de bactérie anaérobie, de préférence un milieu comprenant des composant choisis parmi un extrait de broyât ou lysat de tissu pluricellulaire, un digestat enzymatique, notamment un digestat enzymatique de caséine, soja et/ou de tissu animal, une peptone, un extrait de levure, un sucre tel que dextrose ou glucose, un sel NaCI et/ou Na ₂ P0 ₄ .

Plus particulièrement encore, la bactérie est une bactérie anaérobie cultivée en tube dans un milieu conventionnel de culture de bactéries anaérobies tel que les milieux dits bouillon de type cœur- cervelle, milieux Columbia à 5% de sang de mouton ou milieu Schaedler tels que décrits ci-après. D'autres milieux conventionnels appropriés sont les milieux Brucella ou Wilkins-Chagren. Ces milieux sont utilisables avec agar (solide ou semi-solide) ou sans agar (liquide).

Plus particulièrement, lesdites bactéries sont des bactéries anaérobies strictes du tube digestif choisies parmi Bacteroides massiliensis, Fusobacterium necrophorum, Finegoldia magna, Prevotella nigrescens, Solobacterium morei, Atopobium vaginae, Ruminococcus gnavus.

Il s'agit de bactéries anaérobies strictes du tube digestif, qui normalement ne se cultivent que dans des conditions strictement anaérobies. Ceci se traduit quand on inocule une dite bactérie dans un tube désoxygéné par le fait qu'un voile de culture n'apparait que dans la partie basse du tube, tandis que la partie haute reste vierge de culture. Si on ajoute, un composé antioxydant selon la présente invention, la culture se fait pratiquement jusqu'à la surface, voire complètement jusqu'à la surface à la concentration de 500pg/ml et encore mieux à 1 mg/l, ou avec un mélange d'acide ascorbique à 500pg/ml et de gluthation à 500pg/ml montrant que l'acide ascorbique à une certaine concentration permet la culture des bactéries anaérobies.

Dans un autre mode de réalisation, la dite bactérie est une bactérie microaérophile intracellulaire apte à être cultivée dans un dit milieu de culture acellulaire, sous atmosphère d'incubation microaérophile avec une proportion molaire en oxygène de pas plus de 5%, de préférence pas plus de 2,5% dans l'atmosphère d'incubation, en l'absence de dit composé antioxydant, et on cultive la dite bactérie en présence de dit composé oxydant dans un dit milieu de culture sous une atmosphère d'incubation microaérophile comprenant une proportion molaire en oxygène entre 2,5% et 20%, de préférence entre 5% et 16%, notamment de l'air enrichi à 5% de C0 ₂ . La présente invention s'applique plus particulièrement aux bactéries microaérophiles intracellulaires facultatives ou aux bactéries intracellulaires strictes rendues facultatives, le cas échéant du fait, entre autres, de l'ajout dédit composé antioxydant. Plus particulièrement les bactéries choisies parmi les bactéries des genres Bartonella, Rickettsia, de préférence R. conorii et R. africae, Coxiella, de préférence Coxiella burnetii, Tropheryma, de préférence Tropheryma whipplei, mycobactéries, de préférence Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae et Mycobacterium ulcerans et Orientia spp., de préférence Orientia tsutsugamushi.

Les bactéries intracellulaires vivent avec une tension d'oxygène qui est celle à l'intérieur des cellules qui est de 5%, qui est beaucoup plus basse que celle de l'air ambiant (environ 21%). Un des éléments clé de la culture de Coxiella burnetii a été la culture avec des tensions d'oxygène basse de l'ordre de 5%. Cette bactérie est réputée difficilement cultivable sur un milieu axénique, comme la plupart des bactéries intracellulaires. Cette technique de culture exige d'avoir des étuves particulières et une manipulation particulière. Selon la présente invention, on a pu obtenir une croissance de Coxiella burnetii optimale en présence de composé antioxydant à des proportions molaires en oxygène inférieure ou égale à 16%, notamment de l'air enrichi à 5% de C0 ₂ .

La croissance des mycobactéries en milieu acellulaire, notamment Mycobacterium tuberculosis requière une atmosphère d'incubation à teneur en oxygène réduite par rapport à la teneur de l'air, notamment de l'air enrichi à 5% de C0 ₂ . Cependant les inventeurs ont mis en évidence que leur difficulté de croissance dans un tel milieu était due à une mauvaise tolérance à l'oxygène et ils ont mis en évidence que les bactéries du complexe tuberculeux Mycobacterium tuberculosis, en présence de composé antioxydant, poussaient mieux à une tension réduite d'oxygène de l'ordre de 5% que quand elles étaient exposées à de l'air enrichi à 5% de C0 ₂ . Les inventeurs ont donc découvert que, en présence de composé antioxydant, il est possible d'améliorer la croissance dans de l'air enrichi à 5% de C0 ₂ et donc de se passer de cultiver ces bactéries dans une tension davantage diminuée en oxygène. Et, de manière tout à fait surprenante, selon la présente invention, les bactéries ont une meilleure croissance, non seulement en tension normale en oxygène dans de l'air à 5% de C0 ₂ , mais encore meilleure en tension contrôlée en oxygène à moins de 5% d'oxygène. Ceci signifie que le composé antioxydant constitue d'une certaine manière un facteur de croissance pour les mycobactéries même lorsqu'elles sont cultivées lors de basse tension d'oxygène.

Plus particulièrement encore, la dite bactérie est choisie parmi Coxiella burnetii, Mycobacterium tuberculosis.

Plus particulièrement encore, on cultive une bactérie Coxiella burnetii, le dit composé antioxydant étant l'acide ascorbique, le glutathion ou l'hydrosulfure de sodium, de préférence l'acide ascorbique à une concentration d'au moins 100 pg/ml, dans un milieu axénique constitué de composants chimiques définis en phase liquide , sous une atmosphère d'incubation contenant une proportion molaire en oxygène inférieure à 20%, de préférence inférieure ou égale à 16%, notamment dans de l'air enrichi par 5% de C0 ₂ .

Plus particulièrement encore, le dit milieu de culture axénique est le milieu dénommé ACCM [3] comprenant les composant suivants aux concentrations suivantes: tampon citrate (acide citrique: 2,5 g/ml; citrate de sodium tribasique: 4,74 mg/ml); du phosphate de potassium (0,5 mg/ml), du chlorure de magnésium (0,2 mg/ml), du chlorure de calcium (0,013 mg/ml), du sulfate de fer (2 pg/ml), de la L-cystéine (0,26 mg/ml), de la néopeptone (0,1 mg/ml), des casamino acides (2,5 mg/ml), de la méthyl béta cyclodextrine (1 mg/ml). Ce milieu de culture est un milieu chimiquement défini décrit dans WO 2010/096640 dénommé ACCM (ACCM = acidified citrate cystéine médium) amélioré en AACM-2 adapté aux bactéries pathogènes donnant comme exemple C. burnetii. Ce milieu a permis l'obtention de colonies (0,01 mm de diamètre) en 6 jours.

Selon la présente invention, en présence de composé antioxydant dans un dit milieu axénique, sous une atmosphère à proportion molaire en oxygène inférieure à 20%, notamment inférieure à 16% (de l'air enrichi à 5% de C0 ₂ ), on peut multiplier la concentration de bactérie Coxiella burnetii d'au moins un facteur 10 (1 log) en pas plus de 9 jours.

Pour l'isolement et la culture des mycobactéries du complexe Mycobacterium tuberculosis, on dispose de milieux solides, de milieux liquides, et de milieux biphasiques comportant une phase liquide et une phase solide. Les milieux solides sont fabriqués à base de gélose ou d'agar. Les milieux contenant de l'œuf entier sont d'utilisation très courante et le milieu le plus utilisé est le milieu de Lowenstein Jensen. Une catégorie de milieux solides sont les milieux à l'agar en particulier le milieu Middlebrook 7H10 et le milieu 7H11 (milieu 7H10 plus 0,1% de caséine hydrolysée). Le milieu de Middlebrook contient 2% de glycérol, qui facilite la culture des mycobactéries du complexe Mycobacterium avium. Les milieux liquides correspondent essentiellement au milieu Middlebrook 7H9.

Cependant, l'isolement des mycobactéries du complexe Mycobacterium tuberculosis est lent puisque la totalité des souches des différentes espèces du complexe Mycobacterium tuberculosis est isolée dans un délai compris entre 6 et 8 semaines. Tout gain de temps sur ce délai représente donc une amélioration significative du diagnostic de laboratoire de la tuberculose et les autres infections à mycobactérie.

Dans un mode de réalisation plus particulier, la dite bactérie est une bactérie Mycobacterium tuberculosis, le dit composé anti-oxydant étant l'acide ascorbique, le glutathion ou l'hydrosulfure de sodium, de préférence l'acide ascorbique à une concentration d'au moins 100 pg/ml, sous une atmosphère d'incubation microaérophile contenant une proportion molaire en oxygène inférieure à 20%, de préférence encore de 2 à 5%, le dit milieu de culture étant de préférence un milieu de type Middlebrook.

Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture de Mycobacterium tuberculosis est un milieu de culture solide type Middlebrook de référence 7H10, additionné de produit gélifiant choisi de préférence parmi les géloses et agar, de préférence dans une proportion pondérale de 0.5 à 5%, de préférence encore de 1 à 2%.

Ainsi, selon la présente invention, on peut multiplier la concentration de bactérie Mycobacterium tuberculosis d'au moins un facteur 10 (1 log), en pas plus de 5 jours sous atmosphère à proportion molaire en oxygène inférieure à 20%, notamment inférieure à 16% (de l'air enrichi à 5% de C0 ₂ ), et en pas plus de 48 heures en microaérophilie avec une proportion molaire d' oxygène inférieure à 5%. On peut même détecter par autofluorescence des minicolonies de bactéries Mycobacterium tuberculosis de 0,3 mm en 36 heures. De tels niveaux de croissance dans un temps aussi court n'ont jamais été rapportés dans la littérature.

On a décrit dans WO 2010063911 un milieu de culture permettant l'isolement plus rapide des mycobactéries du complexe Mycobacterium tuberculosis et des autres mycobactéries, à partir d'échantillons de prélèvement cliniques. Ce milieu de culture permet l'isolement des mycobactéries, aussi bien en milieu liquide adapté aux automates de détection qu'en milieu solide pour une détection manuelle, et, de surcroît, est compatible avec une décontamination à la chlorhexidine dans le cas de prélèvements cliniques pouvant comprendre des bactéries de la flore commensale risquant d'inhiber la croissance des mycobactéries. Ce milieu de culture de mycobactéries, comprend des facteurs de croissance de mycobactéries et, de préférence, des antibiotiques sans activité à l'égard des mycobactéries, et il est caractérisé en ce qu'il comprend les composants additionnels suivants : - de la lécithine, et

- du sang défibriné, et

- du sérum de veau fœtal décomplémenté.

Le sérum de veau fœtal est décomplémenté, c'est-à-dire que l'on lui a retiré, de façon connue, l'ensemble des protéines appelées "complément sérique" par chauffage, notamment à 56°C pendant une heure. Ce complément sérique est connu pour avoir une activité antibactérienne.

Ce milieu de culture de mycobactéries est constitué d'un milieu de culture de base, connu pour la culture des mycobactéries, comprenant notamment des sels minéraux, sucres, acides aminés, protéines et vitamines, ledit milieu de culture de base étant supplémenté par lesdits composants additionnels mentionnés ci-dessus.

Selon des caractéristiques préférées de réalisation : - la lécithine est comprise dans une proportion pondérale de 0,1 à 5%, de préférence 0,5 à 1%,

- la lécithine est de la lécithine de jaune d'œuf,

- le sérum de veau fœtal décomplémenté est compris dans une proportion en volume de 2,5 à 25%, de préférence de 10 à 20%, - le sang est compris dans une proportion en volume de 2,5 à

15%, de préférence de 5 à 10%,

- le sang est du sang défibriné de lapin ou, de préférence, de mouton.

Plus particulièrement, un milieu de culture de mycobactéries selon l'invention comprend un milieu de culture de mycobactéries de base comprenant, outre de l'eau distillée, les composants suivants : sulfate d'ammonium, sulfate de magnésium, sulfate de cuivre, sulfate de zinc, citrate de sodium, citrate d'ammonium ferrique, chlorure de sodium, chlorure de calcium, phosphate monopotassique, phosphate disodique, acide L-glutamique, biotine et pyridoxine. Ces composants sont, notamment, les composants contenus dans les milieux de culture de mycobactéries dénommés milieux Middiebrook.

En pratique, ce milieu de culture se présente initialement sous forme d'un liophylisat desdits composants listés ci-dessus, destiné à être dilué dans de l'eau distillée pour former le milieu de culture selon l'invention. Selon une première variante de réalisation de l'invention, ledit milieu de culture de Mycobacterium tuberculosis est un milieu de culture liquide.

Plus particulièrement, un milieu de culture de mycobactéries selon l'invention comprend un milieu de culture de base qui est un milieu liquide Middiebrook de référence 7H9 et des facteurs de croissance de mycobactéries additionnels suivants : hydrolysat de caséine, glycérol, polysorbate, hemin, acide lactique, biotine, stéarate de polyoxyéthylène, sérum albumine bovine, dextrose et de préférence du supplément H. Le supplément H est une digestion de caséine hautement raffinée.

Selon une seconde variante de réalisation d'un milieu de culture selon l'invention, ledit milieu de culture est un milieu de culture aqueux solide de type Middiebrook de référence 7H10, additionné de dit produit gélifiant et des facteurs de croissance de mycobactéries additionnels suivants : acide oléique, albumine bovine, de préférence la fraction V de l'albumine bovine, dextrose, catalase et glycérol. Le vert de malachite, contenu dans le milieu 7H10, est un inhibiteur de croissance des bactéries autres que mycobactéries. Les facteurs de croissance de mycobactéries additionnels ci-dessus, autres que le glycérol, sont connus sous la dénomination facteurs OADC. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont présentés dans la description détaillée et les exemples qui suivent.

Exemple 1 : Effet de l'acide ascorbique, du gluthation et du mélange acide ascorbique + glutathion sur la croissance axénique des bactéries anaérobies du genre Bacteroides.

On a utilisé Bacteroides massiliensis (CCUG48901) [7] isolée pour la première fois en 2005 dans des hémocultures et depuis dans des prélèvements de selles. croissance de souches de la dite bactérie strictement anaérobie c'est à dire cultivant habituellement en absence totale d'oxygène, a été testée en présence d'une faible tension en oxygène.

Un inoculum de 10 ⁷ bactéries /mL a été inoculé sur toute la hauteur d'un tube d'un milieu de culture du type bouillon cœur-cervelle contenant 5 mL d'infusion de cœur-cervelle («Brain Heart Infusion») avec 5% d'agar (Becton Dickinson, Le Pont-de-Claix, France), en tube à vis enrichi avec 100 pg/ml d'acide ascorbique.

Le milieu cœur cervelle présentait la composition suivante pour 1 litre:

-Infusion solide de cervelle 12.5 g

-Infusion solide de cœur de bœuf 5 g

-Proteose peptone 10 g

-Glucose 2 g

-NaCI

-Phosphate disodique 2.5 g Les tubes ont été incubés à 37°C dans une étuve anaérobie stricte durant 48 heures. Dans ces conditions, il a été observé une croissance habituelle de B. massiliensis depuis le fond du tube jusqu'à 1 cm en dessous de la surface du bouillon en absence d'acide ascorbique témoignant du caractère anaérobie de cette bactérie, et une croissance jusqu'à 2 mm de la surface en présence de 100 pg/mL (5,6 X 10 ^"4 M) d'acide ascorbique indiquant une croissance en présence d'une tension d'oxygène plus grande qu'en l'absence d'acide ascorbique.

Exemple 2 : Effet de l'acide ascorbique sur la croissance axénique d'autres bactéries anaérobies des genres Fusobacterium, Finegoldia, Prevotella, Solobactreium, Atopobium et Ruminococcus.

Dans cet exemple, la croissance de souches de bactéries strictement anaérobies c'est à dire cultivant en absence totale d'oxygène, a été testée en présence de concentrations variables en oxygène. Ces bactéries sont Fusobacterium necrophorum, Finegoldia magna, Prevotella nigrescens, Solobactreium morei, Atopobium vaginae, Ruminococcus gnavus, toutes isolée en situation pathogène chez l'homme [9].

La procédure de culture est réalisée sur des tubes de milieu de culture du type Schaedier avec 0,2% d'agar (Biomerieux, Marcy l'étoile, France).

Le milieu Schaedier présentait la composition suivante pour 1 litre:

-Digestat enzymatique de caséine 5.6 g

-Digestat enzymatique de tourteau de soja 1 g -Digestat enzymatique de tissus animal 5 g

-Extrait de levure 5 g

-NaCI 1.7 g

-Phosphate de potassium 0.82 g -Dextrose 5.82 g

-Tris (hydroxymethyl) Aminomethane 3 g

-Hemine 0.01 g

-L-cysteine 0.4g -Agar (i milieu semi-solide) 0.2%

Pour chaque bactérie on inocule 2 tubes, un tube régénéré sans acide ascorbique et un tube régénéré dans lequel on ajoute 500pg/ml ou lmg/ml d'acide ascorbique. Pour régénérer le tube, on le place au bain marie à 100°C jusqu'à ce que toutes les bulles de gaz visibles dans le milieu aient disparu. Ensuite, pour le tube avec acide ascorbique, on attend le refroidissement du tube à 50°C (schématiquement jusqu'à pouvoir le tenir dans la main sans se brûler) et on ajoute la suspension d'acide ascorbique. On homogénéise ensuite par retournement (3-4 pour assurer un bon mélange). Pour chaque bactérie un inoculum de 10 ⁷ bactéries /ml a été inoculé sur toute la hauteur des tubes Schaedler 0,2%, un normal et un complémenté en acide ascorbique. Les tubes ont été incubés à 37°C dans une étuve anaérobie stricte durant 24-48 heures.

Dans ces conditions, il a été observé une croissance habituelle des bactéries depuis le fond du tube jusqu'à 1,5 cm en dessous de la surface du milieu en absence d'acide ascorbique témoignant du caractère anaérobie de cette bactérie, et une croissance jusqu'à la surface en présence de 500 pg/ml (28 X 10 ^"4 M) d'acide ascorbique indiquant une croissance en présence d'une tension d'oxygène plus grande qu'en l'absence d'acide ascorbique.

Des tests en tous points identiques ont été réalisés soit avec du gluthation à 500pg/l soit avec un mélange gluthation à 500pg/l + acide ascorbique à 500μ g/1. Avec le gluthation seul, la croissance est identique à ce qui est observé avec l'acide ascorbique. Avec le mélange gluthation + acide ascorbique, la croissance observée sous la surface est encore plus intense que ce qui est observé avec chaque composé individuellement.

Enfin, afin de valider définitivement la capacité de ces composés à autoriser la croissance de bactéries anaérobies strictes en présence d'oxygène, on a préparé des milieux solides constitués de milieu

Columbia avec 5% de sang de sang de mouton dans lesquels ont été ajouté du gluthation à 500pg/l, ou un mélange gluthation à 500pg/l + acide ascorbique à 500pg/l ou de l'acide ascorbique à lmg/l. Ces géloses inoculées de bactéries anaérobies ont été incubées soit en air ambiant soit en air ambiant enrichi de 5% de C0 ₂ . Bien que fine, une pousse a été observée avec les seuls milieux complémentés avec les antioxydants, la meilleure pousse ayant été obtenue avec de l'acide ascorbique à lmg/l . Ces tests ont été réalisés un milieu Columbia 5% de sang de mouton présentant la composition suivante pour 1 litre:

-Digestat enzymatique de caséine 5 g

-Digestat enzymatique de tissus animal 8 g

-Peptone enrichie de levure 10 g

-Amidon de maïs 1 g

-NaCI 5 g

-Agar (si milieu gélosé) 14 g

-Sang de mouton 5%

Exemple 3: Effet des antioxydants sur la culture axénique de

C.burnetii

L'effet de 3 molécules anti-oxydantes a été testé sur la croissance de C. burnetii en milieu axénique, à savoir l'acide ascorbique, le glutathion et un donneur d'hydrogène disulfure (H2S), l'hydrosulfure de sodium (NaHS).

Les inventeurs ont étudié la croissance d'une souche Nine Mile de phase II de la bactérie Coxiella burnetii. L'inoculum de 10 ⁵ bactéries par ml a été obtenu à partir d'une boîte de culture de Coxiella burnetii Nine Mile de phase II sur cellules Vero après purification par sonication puis centrifugations successives. Cet inoculum a été quantifié à l'aide de la coloration de Gimenez [4], en estimant qu'une bactérie par champ sur une moyenne de 10 champs observés au microscope à l'objectif 100 correspondait à 10 ⁴ bactéries par ml [5]. L'inoculum était ensuite dilué au dixième dans le milieu de culture.

Des agents antioxydants ont été testés en utilisant comme milieu de culture axénique: le milieu ACCM2 pour «Acidified Cystein Citrate Médium 2» [3]. Le milieu ACCM2 comprend les composant suivants aux concentrations suivantes: tampon citrate (acide citrique: 2,5 mg/ml; citrate de sodium tribasique: 4,74 mg/ml); du phosphate de potassium (0,5 mg/ml), du chlorure de magnésium (0,2 mg/ml), du chlorure de calcium (0,013 mg/ml), du sulfate de fer (2 pg/ml), de la L-cystéine (0,26 mg/ml), de la néopeptone (0,1 mg/ml), des casamino acides (2,5 mg/ml), de la méthyl béta cyclodextrine (1 mg/ml).

Les réactifs en poudre ont été pesés à l'aide d'une balance de précision avant d'être dilués dans 125 ml de milieu RPMI et 865 ml d'eau distillée. Ce milieu ACCM2 permet une croissance de 1 log (multiplication par 10 de la concentration en bactéries) à J6 en milieu liquide quand on incube les cultures en étuve microaérophile à une teneur de 2,5% en oxygène sans agitation du milieu. Cette condition expérimentale constitue le témoin positif pour les expérimentations en présence de composés anti-oxydants. L'acide ascorbique, le glutathion et l'hydrogénosulfure de sodium en poudre ont été pesés à l'aide d'une balance de précision puis dilués directement dans le milieu ACCM2 de façon à obtenir une concentration finale de: - 1 pg/ml (5,6 X 10 ^"6 M), 10 pg/ml (5,6 X 10 ^"5 M) et 100 pg/ml

(5,6 X 10 ^"4 M) pour l'acide ascorbique;

-1,5 pg/ml (4,9 X 10 ^"6 M), 15 pg/ml (4,9 X 10 ^"5 M) et 150 pg/ml (4,9 X 10 ^"4 M) pour le glutathion; et

- 10 pg/ml (8,3 X 10 ^"4 M), 100 pg/ml (8,3 X 10 ^"3 M) et 1 mg/ml (8,3 X 10 ^"2 M) pour l'hydrogénosufure de sodium.

Les différents milieux ont ensuite été filtrés à l'aide d'un filtre à 0,2 μιτι afin d'en assurer la stérilité. Les cultures ont été réalisées en phase liquide, dans des plaques à 12 puits et la quantification a été effectuée à J0, J3, J6 et J9 à l'aide la coloration de Gimenez, complétée dans un deuxième temps par une PCR quantitative ciblant le spacer spécifique ISllll [8]. A partir de J3, la moitié de la quantité de milieu de chaque puits était renouvelée en la remplaçant par du milieu frais. La quantité de milieu retirée était elle-même complétée par la même quantité de milieu frais dans une nouvelle plaque de culture. Ce changement partiel de milieu a été répété ensuite tous les 3 jours.

Le milieu ACCM2 sans anti-oxydant incubé à 37°C dans une étuve à teneur d'oxygène contrôlée à 2,5% a été utilisé comme témoin positif; le milieu ACCM2 incubé dans une étuve classique en atmosphère d'air enrichi par 5% de C0 ₂ et 37°C a été utilisé comme témoin négatif.

Le milieu ACCM2 incubé dans les deux atmosphères ci-dessus (c'est à dire en atmosphère d'air enrichi par 5% de C0 ₂ et dans une étuve à teneur d'oxygène contrôlée à 2,5%) a été testé avec ajout des différentes concentrations ci-dessus des différents composés antioxydants ci-dessus. A JO, le nombre de bactéries observées dans tous les puits, dans les deux atmosphères était de 10 ⁵ bactéries/ml correspondant à l'inoculum utilisé.

Pour le témoin positif ACCM2 en étuve à pression d'oxygène contrôlée à 2,5% sans anti-oxydant, on a quantifié 5.10 ⁵ bactéries/ml à J3 et 10 ⁶ bactéries/ml à J6 et 5. 10 ⁶ bactéries /ml à J9, montrant une croissance bactérienne avec une multiplication d'un facteur de 50 de la concentration bactérienne en 9 jours. Pour le témoin négatif (5% de C0 ₂ ) sans antioxydant, on a quantifié 5.10 ⁵ bactéries/ml à J3, J6 et J9.

Les mêmes résultats ont été observés dans les puits additivés de glutathion à 15 pg/ml et 150 pg/ml et dans les puits additivés de hydrogénosulfure de sodium à 10 pg/ml et 1 mg/ml et ACCM2 sous une atmosphère contenant 5% de C0 ₂ . Ces résultats indiquent une absence de croissance bactérienne dans ces conditions.

Dans une étuve à atmosphère contrôlée à 2,5 % d'oxygène, en présence d'acide ascorbique à 100 pg/mL, les inventeurs ont observé une numération de Coxiella burnetii de 5 x 10 ⁵ à J0, une numération de 10 ⁶ , une numération de 10 ⁶ à J6 et une numération de 5 x 10 ⁶ à J9. Ces résultats indiquent une croissance de Coxiella burnetii et une multiplication par 50 du nombre de bactéries à J9. Ces résultats sont identiques à ceux obtenus dans le témoin positif de croissance.

En revanche, sous atmosphère contenant 5% de C0 ₂ , en présence d'acide ascorbique à 100 pg/ml, les inventeurs ont observé une augmentation de la croissance de Coxiella burnetii à J3 avec 5.10 ⁵ à 10 ⁶ bactéries/ml, 10 ⁶ bactéries/ml à J6 et 1.10 ⁶ bactéries/ml à J9, montrant une croissance bactérienne avec une multiplication de la concentration bactérienne d'un facteur 10 en 9 jours.

Egalement, sous atmosphère contenant 5% de C0 ₂ , en présence de glutathion à 1,5 pg/ml, les inventeurs ont observé une amélioration de la croissance à J3 à 5.10 ⁵ bactéries/ml, puis la quantité de bactéries a diminué à J6 à 10 ⁵ et remonté à J9 à 5.10 ⁴ bactéries/ml. Les mêmes observations ont été faites en présence d' hydrogénosulfure de sodium à 100 pg/ml.

L'ensemble de ces résultats a été confirmé en PCR quantitative dont la méthode a été exposée ci-dessus.

Ces résultats montrent un effet le plus favorable de l'acide ascorbique à 100 pg/ml sur la culture axénique de Coxiella burnetii en conditions atmosphériques contenant 5% de C0 ₂ .

Exemple 4 : Effet de l'acide ascorbique sur la croissance axénique de Mycobacterium tuberculosis

Les inventeurs ont testé l'effet de l'acide ascorbique à la concentration finale de 100 pg/mL sur la croissance de Mycobacterium tuberculosis en milieu axénique. Pour ce faire, les inventeurs ont utilisé 3 souches comprenant la souche de référence Mycobacterium tuberculosis H37Rv et deux souches cliniques issues de l'activité de routine diagnostique du laboratoire. Ces deux souches ont été isolées de prélèvement d'expectoration de deux patients différents. Ces souches ont été calibrées à 10 ⁶ mycobactéries/mL dans du tampon phosphate puis ont été déposées sur une gélose Middlebrook 7H10 en présence ou non d'acide ascorbique à la concentration finale de 100 pg/mL. Les géloses ont été incubées sous une atmosphère anaérobie stricte (pas d'oxygène) obtenue par technique Gazpack (Oxoid), et en atmosphère microaérophile (2,5% d'0 ₂ ) obtenue par technique Gazpack ou encore en air enrichi en C0 ₂ contenant 5% de C0 ₂ dans un incubateur à 37°C. Les inventeurs ont suivi le développement des colonies bactériennes par l'observation des colonies en autofluorescence [1, 2] (méthode qui n'est pas utilisée en routine pour la détection de microcolonies de mycobactéries) et l'identification a été confirmée après coloration de Ziehl-Neelsen par analyse en spectrométrie de masse [6]. Ces travaux ont montré une détection de colonies de Mycobacterium tuberculosis pour les trois souches, dès 36 heures d'incubation en présence d'acide ascorbique (100 pg/mL) mais pas de colonies à 36 h en absence d'acide ascorbique, en atmosphère de microaérophilie.

Une croissance améliorée de 1 log bactéries par rapport au témoin cultivé sans antioxydant avec une atmosphère microaérophile à 2,5%, a été observé à 48 heures, en présence d'acide ascorbique (100 pg/mL) (5,6 x 10 ^"4 M) et également un accroissement de 1 log par rapport au témoin positif en 5 jours en atmosphère à 5% C0 ₂ . Des minicolonies de 0,3 mm ont été détectées en autofluorescence dès 36h. L'autofluorescence des mycobactéries est connue [1, 2]. Le nombre de colonies détectées à 48hr était plus important en présence qu'en l'absence de composé antioxydant dans tous les cas, et le nombre de colonies détectées à 48hr était plus important, en présence de composé antioxydant, en atmosphère microaérophile que dans l'air enrichi à 5% de C0 ₂ .

Références bibliographiques

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