本发明涉及一种新的化合物， 更具体地， 涉及一种抗病毒化合物及其应用。 背景技术

HIV-1病毒最初发现于 1981年在美国发现， 由一系列不明原因的， 以细胞 免疫缺陷为特征的综合征出现以后， 研究人员开始了对其致病源的寻找。 1983 年法国研究小组从一淋巴肿大综合征病人的淋 巴结中， 分离出 HIV-1病毒。它是 一种感染人类免疫系统细胞的慢病毒， 该病毒破坏人体的免疫力， 导致免疫系统 失去抵抗力， 而导致各种疾病以及癌症得以在人体内生存， 从而导致获得性免疫 缺陷综合症一一艾滋病。 目前， 由于对艾滋病教育的普及不充分， 全球的 HIV 感染仍呈上升趋势， 尤其在中国更是进入了快速增长期。尽快阻止 艾滋病在我国 的流行已成了一件刻不容缓的大事。因此， 继续扩大我们对 HIV-1致病机制的认 识， 开发出更有效， 更经济， 更少副作用的抗病毒药物以完全清除残余的 HIV-1 复制， 以及开发出强有力而又长效的抗 HIV-1的疫苗以保护易感人群， 仍将是我 们能否最终战胜艾滋病的关键。

发明内容

本发明提供一种抗病毒化合物在抗 HIV-1病毒药物中的应用，所述的抗病毒 化合物的结构式如式 I所示：

式 I

所述的 R为 4-N(Me)2、 4-N(Et)2、 4-N(Pr) ₂ 、 4-N(i-Pr) ₂ 、 3-OH、 4-OMe、 2-OH

再提供一种抗病毒化合物在抗 HIV-1病毒药物中的应用， 所述的抗病毒化 合物的结构式如式 I所示:

式 I

所述的 R为 3-OH和 4-OMe。

提供一种抗病毒化合物在抗 HIV-1病毒药物中的应用， 所述的抗病毒化合 物的结构式如式 I所示：

式 I 所述的 R为 2-OH和 4-N(Et)2。

再提供一种抗病毒化合物在抗 HIV-1病毒药物中的应用， 所述的抗病毒化 合物的结构式如式 I所示：

(式 II)

X为 0或8。

更具需求再一种抗病毒化合物在抗 HIV-1病毒药物中的应用， 其特征在于， 所述的抗病毒化合物的结构式如式 III、 式 IV或式 V所示：

式 III

Ri为 Cl、 CF ₃ 、 OCF ₃ 、 COOMe、 Me、 t-ButyK OMe、 N(Me) ₂ 或 SMe， 优选， 所述的 Ri和 R ₂ 同时为 Me或 CI 优选， 当 R ₂ 为 H时， Ri为 CF ₃ 、 OCF ₃ COOMe、 t-ButyK OMe、 N(Me) ₂ 或 SMe。

所述的抗病毒化合物还包括所述化合物可接受 的药用盐。

所述的药用盐为钠盐、 钾盐或钙盐。

本发明具有以下优点：

运用 HIV-1 Vif蛋白可以通过泛素化降解 A3G蛋白的功能特性，证实上述通 式的抗病毒化合物能够抑制 Vif蛋白降解 A3G的活性， 导致筛选系统中绿色荧 光蛋白的表达量将回升。 通过在人的原代 CD4+ T淋巴细胞以及 H9、 SupT l等 CD4+ T淋巴细胞系中进行野生型 HIV-1病毒的感染实验证实， 他们均具有较好 的抗病毒作用， 为进一步的抗病毒药物研发提供的强有力的理 论基础和实践基 础， 具有重要的研发价值和开发意义。

附图说明

图 1为细胞筛选模型的构建原理。

图 2为细胞筛选模型的构建原理。 图 3 : 抗病毒化合物具有抑制 Vif活性的作用。

图 4: 抗病毒化合物在表达 A3G蛋白的 H9细胞和不表达 A3G蛋白的 SupTl细 胞中抑制野生型 HIV-1的复制效果。

图 5: 抗病毒化合物具有抑制 Vif活性的作用。

图 6: 抗病毒化合物在表达 A3G蛋白的 H9细胞和不表达 A3G蛋白的 SupTl细 胞中抑制野生型 HIV-1的复制效果。

图 7: 抗病毒化合物具有抑制 Vif活性的作用。

图 8: 抗病毒化合物在表达 A3G蛋白的 H9细胞和不表达 A3G蛋白的 SupTl细 胞中抑制野生型 HIV-1的复制效果。

具体实 ¾ ^式

下面结合具体实施例进一步详细说明本发明。 除非特别说明， 本发明采用的 试剂、 设备和方法为本技术领域常规市购的试剂、 设备和常规使用的方法。 实施例 1

Vif是 HIV的必需蛋白之一， 其主要功能是拮抗宿主中天然的抗病毒因子 APOBEC3G。 APOBEC3G是 H IV-1病毒的一大威胁， 它存在于 HIV-1天然的宿 主细胞（如 CD4+ T细胞和巨噬细胞）中， 能被包裹入 HIV-1病毒颗粒，在 HIV-1 逆转录过程中发挥其极强的抗病毒作用。为此 ， HIV-1 自身编码了 Vif蛋白来特 异性对抗 APOBEC3G的抗病毒活性， 它可将 APOBEC3G导入泛素系统并将其 降解 （图 1 )。 因此， 如何灭活 Vif， 是研发抗 HIV-1病毒药物的一个十分重要的 靶标。

根据 Vif拮抗 APOBEC3G的分子机理， 筛选出若干可让 HIV的 Vif无法降 解 APOBEC3G的小分子药物。 为此我们将建立一种简便的活细胞筛选系统， 如 图 2所示，将表达 APOBEC3G-GFP融合蛋白和表达 Vif的 质粒共转染到细胞中。 以 APOBEC3G-GFP融合蛋白是否被降解为指标。 只要某种化合物在 Vif存在的 情况下还能使 APOBEC3G-GFP融合蛋白不被降解 （即 GFP荧光还在）， 该化合 物就是 Vif的抑制剂。 通过对 Vif靶标的进一步鉴定， 确认化合物是作用于宿主 细胞还是作用在病毒蛋白的 Vif上。

图 1将表达 HIV Vif 蛋白 的质粒和表达 APOBEC3G (A3G) -GFP融合 蛋白的质粒共转染细胞， VIF蛋白会结合 A3G-GFP, 同时结合由 Cul5、 EloB和 EloC构成的蛋白质复合体 E3。 E3是一个泛素化酶， 会在 A3G-GFP蛋白上打上 泛素标签，从而介导 A3G-GFP进入蛋白酶体发生降解，导致观察不到� �色荧光。 图 2 当加入待筛的化合物库后,库中的某种化合物� �制了 Vif 的功能， A3G-GFP融合蛋白能正常表达，可观察到明显的� �色荧光，该种化合物就是 Vif 抑制剂， 可进一步开发成为有抗病毒活性的先导化合物 。 1) 取生长良好的人肾上细胞株 239t细胞， 接种于 96孔透明平底板中， 每 孔 5 X 104细胞。 使用的培养基是完全培养基： 高糖 DMEM, 10%胎牛血清以及 1%双抗， 培养条件是 5%二氧化碳、 37°C ;

2) 24h贴壁后， 共转染 PEGFP-A3G和 pcDNA3.1-Vif两种质粒。 转染采用 脂质体包裹转染， 试剂使用 lipo2000， 转染液 20 μ 1。 3) 转染 4h后， 加入待筛选的化合物， 每孔 2 μ 1， 终浓度为 50 μ Μ。

4) 培养 48h后， 检测绿色荧光蛋白 GFP的表达情况。 如果出现绿色荧光 蛋白 GFP表达上升的情形， 该化合物可能成为抗病毒候选药物。 实验结果如图 3、 5和 7所示， 从实验结果可以看出， 抗病毒化合物均具有 抑制 Vif活性的作用。 实施例 2

Vif蛋白在 HIV-1病毒复制过程中具有重要作用， vif缺陷的 HIV病毒不能 在 CD4+T细胞、 巨噬细胞内复制， 即不能在上述 "非允许"细胞内复制； 而含 有 vif基因的野生株病毒可在上述细胞内复制。 Vif缺失株病毒进入某些靶细胞后 可进行反转录， 但不能合成前病毒 DNA。 研究显示 HIV复制处决于一种细胞抑 制因子的出现或缺失，这种内源性的抑制因子 是 APOBEC3G，它属于细胞内 RNA 编辑酶，能使 mRNA中的胞嘧啶脱氨基形成尿嘧啶，导致 G和 A突变体的累积， 进而是病毒 DNA降解， vif通过与 APOBEC3G结合形成复合物阻断 APOBEC3G 的抑制活性。 在 APOBEC3G存在的细胞系如 H9细胞中， APOBEC3G与 vif蛋 白结合通过泛素化系统降解， 如果化合物能够抑制 APOBEC3G被 vif蛋白降解， 宿主细胞将不能够被 HIV-1感染； 而在 APOBEC3G不存在的情细胞系如 SupTl 细胞中， HIV-1蛋白可以正常感染该宿主细胞； 那么这个化合物将有可能成为抗 HIV-1 Vif蛋白的化合物。

APOBEC3G是细胞的自我保护机制， 但 vif是 HIV-1病毒对抗 APOBEC3G 功能的蛋白， 导致 HIV-1病毒逃避细胞内自我清除过程。利用 HIV-1的允许细胞 和不允许细胞中的抗病毒实验的效果比较，从 而能进一步在野生型病毒实验中确 定靶标化合物可以拮抗 HIV-1的 Vif蛋白， 抑制 HIV-1病毒的复制。

1 ) 取生长良好的淋巴细胞系 H9和 Supt l , 细胞用量为 2 X 10 ⁵ /孔， 分别感 染包装好的 HIV-1病毒上清， 病毒用量为 lOng/Ι Χ ΙΟ ⁶ 细胞； （感染时使 用促感染试剂 polybrene)

2) 感染 3h后换液， 使用 PBS清洗三次， 弃上清， 使用 1640培养基 （10% 胎牛血清， 1%双抗） 培养， 培养基每孔 200 μ 1， 化合物每孔 2 μ 1 (终浓 度 50 μ Μ);

3 ) 使用 2%Triton -100处理收样的上清，收培养了 4day的细胞上清，测 P24 Elisa。

实验结果如图 4、 6和 8所示。 从实验结果可以看出， 抗病毒化合物在 H9 细胞中具有良好的抗 HIV-1病毒作用， 而在 SupTl细胞中没有效果。 实施例 3

1 ) 取生长良好的淋巴细胞系 H9， 细胞用量为 2χ 10 ⁵ /孔， 感染包装好的

HIV-1病毒上清， 病毒用量为 lOng/l x lO ⁶ 细胞； （感染时使用促感染试剂 polybrene)

感染 3h后换液，使用 PBS清洗三次，弃上清，使用 1640培养基（ 10% 胎牛血清， 1%双抗） 培养， 培养基每孔 200μ1， 加入化合物每孔 2μ1，终 浓度分别为 50μΜ， 5μΜ， 0.5μΜ， 0.05μΜ， 0.005μΜ, 0.0005μΜ, ΟμΜ;

3 ) 使用 2%Triton -100处理收样的上清， 收样 4day， 测 P24 Elisa。 实验结果如表 1、 2和 3所示。 从实验结果可以看出， 抗病毒化合物均具有 较好的抑制病毒的效果

表 1抑制病毒的效果

Compd. R IC ₅₀ ( )' No.

2 4-N(Et) _: 0.00295 3 4-N(Pr) ₂ 1.09

4

6 3-OH, 4-OMe 0.0685

表 2抑制病毒的效果

No.

1 0 2.38

2 s 5.92 表 3抑制病毒的效果 Compd ID Ri R ₂ IC ₅₀ C"M)

1 CI CI 1.25

2 CF ₃ H 1.13

3 OCF ₃ H 1.35

4 COOMe H 1.68

5 Me Me 1.64

6 /-Butyl H 1.04

7 OMe H 4.42

8 N(Me) ₂ H 2.68

9 SMe H 0.75

实施例 4

MTS(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5(3-carboymethoyphenyl)-2-( 4-sulfopheny)-2H-tet razolium, inner salt)是一种新合成的四唑类化合物， 它与 MTT的应用原理相同， 即被活细胞线粒体中的多种脱氢酶还原成各自 有色的甲瓒产物，其颜色深浅与某 些敏感细胞株的活细胞数在一定范围内呈高度 相关。 根据测得的 490η的吸光度 值 （OD值）， 来判断活细胞数量， OD值越大， 细胞活性越强， 则表示药物毒性 1 ) 接种细胞， 用含 10%胎小牛血清的 DMEM培养液将 293t配成单个细胞 悬液， 以每孔 1000个细胞接种到 96孔板， 每孔体积 200ul

2) 24h贴壁后加入化合物， 每孔 2μ1， 终浓度分别为 50μΜ， 5μΜ， 0.5μΜ，

0.05μΜ, 0.005μΜ， 0.0005μΜ， ΟμΜ

3 ) 培养 48h后， 每孔加 MTS溶液 20ul， 继续在培养箱中孵育 2~4 h

4)选择 490nm波长， 在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值， 观察化合物 对 293t细胞的细胞毒性

实验结果如表 4、 5和 6所示。 从实验结果可以看出， 抗病毒化合物毒性较 低， 在 293t细胞中均呈现成无细胞毒现象。

表 4细胞毒性实验

Compd. R CC ₅ o( M) ^a No.

4-N(Me) ₂ >50

4-N(Et) ₂ >50 3 4-N(Pr) ₂ >50

4

6 3 -OH, 4-OMe >50 表 5细胞毒性实验

Compd. CCso ( M)

X

No.

1 0 >50

2 s >50 表 6细胞毒性实验

Compd ID Ri R ₂ CC ₅₀ (μΜ)

1 CI CI >50

2 CF ₃ H >50

3 OCF ₃ H >50

4 COOMe H >50

5 Me Me >50

6 /-Butyl H >50

7 OMe H >50

8 N(Me) ₂ H >50

9 SMe H >50

本发明的化合物的细胞毒性较低。

实施例 5

取 R为 4-N(Et) ₂ 和 R为

3-OH和 4-OMe， 两种化合物。 51. 取生长良好的淋巴细胞系 H9，细胞用量为 2x l0 ⁵ /孔，感染包装好的 HIV-1 病毒上清， 病毒用量为 lOng/l x lO ⁶ 细胞； （感染时使用促感染试剂 polybrene)

52. 感染 3h后换液， 使用 PBS清洗三次， 弃上清， 使用 1640培养基（10% 胎牛血清， 1%双抗） 培养， 培养基每孔 200μ1， 加入化合物每孔 2μ1， 终浓度分 别为 50μΜ， 5μΜ， 0.5μΜ, 0.05μΜ， 0.005μΜ, ΟμΜ;

53. 使用 2%Triton X-100处理收样的上清， 收样 4day， 测 P24 Elisa。 结果如图 9和图 10所示。

实施例 6

取 R为 4-N(Et) ₂ 和 R为 3-OH和 4-OMe， 两种化合物进行 SPR测试， 结果分别由图 11和图 12所示。

SPR ( Surface Plasmon Resonance): 当入射光以临界角入射到两种不同折射 率的介质界面 （比如玻璃表面的金或银镀层） 时， 可引起金属自由电子的共振， 由于共振致使电子吸收了光能量， 从而使反射光在一定角度内大大减弱。 其中， 使反射光在一定角度内完全消失的入射角称为 SPR角。 SPR随表面折射率的变 化而变化， 而折射率的变化又和结合在金属表面的生物分 子质量成正比。 因此可 以通过获取生物反应过程中 SPR角的动态变化， 得到生物分子之间相互作用的 特异性信号。 生物分子相互作用分析是基于 SPR原理的新型生物传感分析技术， 无须进行标记， 也可以无须纯化各种生物组分。在天然条件下 通过传感器芯片实 时、 原位和动态测量各种生物分子如多肽、 蛋白质、 寡核苷酸、 寡聚糖， 以及病 毒、 细菌、 细胞、 小分子化合物之间的相互作用过程。

基于这一原理， 我们利用 GE Healthcare公司的 Biacore T100仪器来分析， 小分 子化合物对于 A3G蛋白和 Vif蛋白之间的相互作用的影响。 Biacore CM5传感芯 片和胺偶联试剂盒直接从 GE公司购买。

1 )在 Pet-32a载体上插入 Vif或者 A3G的基因片段， 构建可以表达带 his-标签的 的原核表达质粒，然后将 pet-32a-vif和 pet-32a-A3G转化到 E.coli BL21感受态细 胞中

2) 摇菌， 用 ImM的 IPTG诱导带有目的基因的大肠杆菌的表达 4h， 随后收菌， PBS溶液重悬并超声裂解

3 ) 裂解后 10000g离心 10min， 取上清过 Ni柱纯化 vif和 A3G蛋白

4) 在 Biacore仪器上摸索 vif蛋白固定到芯片上的条件， 最后确定为 PH=4 ， 浓 度为 100 g/mL溶于 10 mM醋酸盐溶液中， 注射时间为 7min

5 ) A3G-His蛋白分别与 DMSO, 14， 26预混 30min， 然后以 30ul/min的流速通过 CM5芯片， 跟 vif-his蛋白相互作用的时间控制在 120s， 每个循环的分离时间控 制在 200s

6) 分析 Biacore T100的实验结果， 说明了 14和 26都可以影响 vif蛋白和 A3G 蛋白之间的相互作用

实施例 7 小鼠急性毒性实验

R为 4-N(Et) ₂ 和 R为

3-OH和 4-OMe， 两种化合物进行小鼠急性毒性测试， 结果分别由图 13和图 14 所示。

1 )在中山大学动物实验中心订购 4-6周大小的雄性 Balb/c小鼠 18只。 随机 的将他们分成 6组， 每组 3只。 其中 3组用来检测 14的急毒实验， 3组用来检 测 26的急毒实验

2) 合成化合物 14， 26， 具体方法如下： 2 i^E^s^ a2&i-2-yl-3^4~< y mi» i r^e (M), lbs ile n'j s

《dieiiii5i3iaias¾eszg^de 5ide ½iste4 of 4- meE¾y €i5Bsde¾yd*. Yield: 4Q%. ^l H HR MHz- D¾SSO-i¾): S 12.73 {¼· s, !¾ S.ll ， !H V.S¾ (d. /= Si Hz, 2H} _: 7,56 (¾r 2H). ?-22-?.l§ (as. 2H), g.8

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3) 以灌胃的方式将化合物 14,26注入小鼠体内， 注射量分别为 Omg/kg(PBS)， 500mg/kg， 1000mg/kg， 每组 3只小鼠

4) 两周后， 取小鼠血样检测肝功能和肾功能， 实验结果显示正常

5)处死后， 取小鼠心肝脾肺肾各个组织样本， HE染色， 观测是否有器官发生病 变， 实验结果显示， 1000mg/kg剂量的化合物对小鼠是无毒安全的。