本发明涉及癫痫宁的新用途，具体涉及癫痫宁 在制备预防或治疗 阿尔茨海默病药物中的应用， 属于中医药领域。

背景技术

阿尔茨海默病 （Alazheimer's disease, AD)是一种以进行性认知 障碍和记忆损伤为主的神经系统退行性疾病。 临床上以记忆障碍、失 语、 失用、 失认、 视空间技能损害、 执行功能障碍以及人格和行为改 变等全面性痴呆表现为特征。目前用于治疗阿 尔茨海默病的药物主要 分为两类： 乙酰胆碱酯酶抑制剂 （如加兰他敏） 和 N-甲基 -D-天冬氨 酸受 （ MDA受体） 拮抗剂 （如美金刚）， 但上述药物价格昂贵、 副 作用显著 （幻觉、 意识混沌、 头晕、 头痛和疲倦）， 且只能控制却不 能逆转患者病情。

现代医学对阿尔茨海默病的发病机制进行了多 年的研宄，但是由 于其病因复杂， 该病的发病机制至今仍不明确。 目前较为主流的学说 是 β -淀粉样蛋白 （Α β )学说， 该学说的核心是患者大脑中异常沉积 的 Α β通过自由基反应、线粒体氧化损伤和炎症反� ��等一系列级联反 应， 直接或者间接作用于神经元和神经胶质细胞， 最终导致神经元功 能异常或者死亡， 引发认知损伤及记忆衰退， 最终引起痴呆。

阿尔茨海默病患者的大脑皮层和海马出现 β淀粉样蛋白（Α β )聚 集形成的老年斑 （SP) 是阿尔茨海默病最为主要病理特征之一， β - 淀粉样蛋白可以有效削弱突触结构和功能，是 引起阿尔茨海默病的重 要物质。因此 β淀粉样蛋白已成为公认的筛选预防或治疗阿� ��茨海默 病药物靶标。

阿尔茨海默病病因复杂且发病环节较多， 目前西药针对阿尔茨海 默病的某一特定病理环节进行干预往往会出现 耐药及严重不良反应。 而中药具有多种活性成分、 多靶点的作用特征， 使中药治疗阿尔茨海 默病具有明显的优越性。

发明内容

本发明的目的在于提供癫痫宁的一种新用途， 具体涉及癫痫宁在 制备预防或治疗阿尔茨海默病药物中的应用。

所述的癫痫宁药剂为片剂、 丸剂、 胶囊剂、 口服液或颗粒剂。 剂 型不同不影响癫痫宁在预防或治疗阿尔茨海默 病方面的功能。

所述的癫痫宁在制备预防或治疗阿尔茨海默病 药物中的应用，所 述的癫痫宁为癫痫宁片。

癫痫宁是由蜘蛛香、 石菖蒲、 钩藤、 牵牛子、 千金子、 缬草、 甘 松、 薄荷脑八味药经过现代制药工艺精制而成的中 成药。 目前， 癫痫 宁用于风痰上扰癫痫病， 或用于癔病、 失眠等。

本发明将转基因秀丽线虫株系 CL4176作为筛选预防或治疗阿尔 茨海默病药物的病理模型来评价癫痫宁预防或 治疗阿尔茨海默病的 作用， 是基于： 阿尔茨海默病患者的大脑皮层和海马出现 β淀粉样蛋 白（Α β )聚集形成的老年斑 （SP) 是阿尔茨海默病最为主要病理特征 之一， β -淀粉样蛋白可以有效削弱突触结构和功能， 是引起阿尔茨 海默病的重要物质。 转基因秀丽线虫品系 CL4176 在 25°C温度诱导 下肌肉特异性表达人类 Α β， Α β在肌肉组织聚集， 最终导致线虫麻 痹。 将药物作用于线虫株系 CL4176, 如果线虫群体麻痹状况得到改 善， 具体表现为线虫的麻痹时间显著延滞， 则说明药物具有预防或治 疗阿尔茨海默病作用。 与现有技术相比， 本发明具有如下有益效果： 本发明评估癫痫宁片对秀丽隐杆线虫阿尔茨海 默病模型麻痹表 型的作用，结果证实了癫痫宁片对秀丽隐杆线 虫阿尔茨海默病模型麻 痹表型具有明显的抑制作用， 具有预防或治疗阿尔茨海默病的潜力。 因此，中成药癫痫宁片可用于制备预防或治疗 阿尔茨海默病的药 物。 附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一 步详细的描述。 图 1 为阳性药物盐酸美金刚的水溶解液对秀丽隐杆 线虫阿尔茨 海默病模型麻痹表型的影响。 图 2 为癫痫宁片的水溶解液对秀丽隐杆线虫阿尔茨 海默病模型 麻痹表型的影响。 具体实施方式 以下提供具体实施例以实现本发明所述的癫痫 宁在制备预防或 治疗阿尔茨海默病药物中的应用， 但不限于这些实施例。 实施例一 盐酸美金刚对秀丽隐杆线虫 CL4176的作用 1.生物材料 ( 1 )秀丽隐杆线虫 CL4176购自 Caenorhabditis Genetics Center; 为转基因品系， 在 25°C温度诱导下肌肉特异性表达人类 Αβ， Αβ在 肌肉组织聚集， 最终导致线虫麻痹， 本实施例采用秀丽线虫品系 CL4176作为筛选预防或治疗阿尔茨海默病症药物 的病理模型。

(2) 大肠杆菌 ΟΡ50 (尿嘧啶渗漏突变株）， 购自 Caenorhabditis Genetics Center, 作为秀丽隐杆线虫的食物。

2.试剂

(1) 盐酸美金刚 （MEM)， 化学名称： 1-氨基 -3， 5-二甲基金刚 烷胺盐酸盐， 分子式： C ₁₂ H ₂₁ N*HC1， 购自百灵威科技， CAS: 41100-52-1； 盐酸美金刚为非竞争性 MDA受体拮抗剂， 用于治疗 中重度至重度阿尔茨海默型痴呆， 文献报道美金刚 （2.16mg/ml) 能 够显著抑制转基因线虫株系 CL4176麻痹表型， 本实施例将其作为阳 性药物。

(2) 固体 NGM (Nematode Growth Medium) 培养基成分与制作 (以 1升为例）：

固体 NGM培养基配制好后， 121 °C下高压恒温灭菌 20min， 在无菌 操作台下加入 5mg/ml胆固醇 1ml， 1M MgS0 ₄ lml, 1M CaCl ₂ lml，摇匀， 趁热倒入已灭菌的 9cm培养板， 约 20ml/板。 静置等待培养基凝固， 备用。

(3) 配制含盐酸美金刚的 NGM培养基

盐酸美金刚溶解于无菌水中， 配制成为 2.16mg/ml的母液， 分别 配制含盐酸美金刚终浓度为 215.76 u g/mK 107.88 u g/mK 21.58 u g/mK 4.32 μ g/mK 0.86 μ g/ml的 NGM培养基。 空白对照为同样条件下加入与盐酸美金刚等体 积无菌水的 NGM培 养基。

上述培养基上均涂布大肠杆菌 0P50作为线虫的食物。

(4) M9液配方

( 5 )裂解液的配制： 6.4% NaC10 ₃ 溶液和 1 M NaOH溶液按体积 比 1 : 1混合。

3. 实施步骤

( 1 ) 线虫的培养： 将线虫接在涂有大肠杆菌 OP50的固体 NGM板上， 然后置于 16 °C的培养箱中培养， 当线虫长到成虫时进行同步化处理。

(2 ) 线虫同步化： 挑选含有大量成虫并且有部分线虫卵已经孵出 的 NGM培养基， 用 M9液将线虫从培养基上冲下， 转移到离心管中， 静置使线虫自由 沉降至管底， 弃上清。 视线虫量多少向离心管中加入线虫碱裂解液， 在漩祸搅拌器上振荡 5-7 分钟待线虫全部断裂时停止涡旋,并分装于 1.5mL离心管中， 用 M9溶液洗线虫卵三次。

(3 ) 盐酸美金刚 （MEM) 对秀丽隐杆线虫 CL4176的作用 将同步化后分装于离心管中的线虫卵转移到涂 布有 OP50并混合 不同浓度的盐酸美金刚的 NGM培养皿和空白对照为涂布有 OP50并 加有与盐酸美金刚等体积无菌水的 NGM培养皿中， 每个培养皿 60 条线虫， 每个药物浓度三个培养皿作为平行， 16°C培养 3天至 L3期。

为了使线虫表达 A β， 将 L3期线虫转至 25 °C下进行诱导， 34h 后开始计数线虫麻痹条数。每两小时计数一次 ， 直至所有线虫都麻痹 (麻痹是指机械刺激线虫身体时，线虫不能运� �或者只有头部运动）， 结果见图 1。

由图 1可以看出， 水溶解的阳性药物盐酸美金刚在 21.58 g/ml、 4.32 g/m 0.86 g/ml 时能够显著抑制 CL4176 麻痹表型， 215.76 u g/ml 的 107.88 g/ml盐酸美金刚强烈抑制线虫发育。 实验结果表 明本实验体系正常， 说明本发明能够采用秀丽线虫品系 CL4176作为 筛选预防或治疗阿尔茨海默病药物。

实施例二 癫痫宁对秀丽隐杆线虫 CL4176的作用

1.生物材料 同实施例一。

2.试剂

( 1 ) 癫痫宁片： 生产厂家： 昆明中药厂， 批准文号： 国药准字 Z53020771 o

(2 ) 固体 NGM (Nematode Growth Medium) 培养基成分与制作

(以 1升为例）： 同实施例一。

(3) 配制含水溶解的癫痫宁片的 NGM培养基

火焰加热癫痫宁片， 剥去糖衣。 将癫痫宁片用研钵研成粉末， 溶 解于无菌水中， 并配置成为 150mg/ml 癫痫宁片水溶解液， 室温下超 声 30min， 并于 lOOOOrpm下离心 10min， 取上清， 于 4°C保存。 将癫 痫宁片水溶解液加入融化的 NGM培养基中， 配制成为含癫痫宁片终浓 度为 1. 0 mg/ml、 5. 0 mg/ml、 15. Omg/ml的 NGM培养基。

空白对照为同样条件下加入与癫痫宁水溶解液 等体积无菌水的 NGM培养基。

上述培养基上均涂布大肠杆菌 0P50作为线虫的食物。

(4) M9液配方: 同实施例一。

( 5 ) 裂解液的配制： 同实施例一。

3. 实施步骤

( 1 ) 线虫的培养： 同实施例一。

(2 ) 线虫同步化： 同实施例一。

(3 ) 癫痫宁片对秀丽隐杆线虫 CL4176的作用 将同步化后分装于离心管中的线虫卵转移到涂 布有 OP50并混合 不同浓度的癫痫宁水溶解液的 NGM 培养皿和空白对照为涂布有 OP50并加有与癫痫宁水溶解液等体积无菌水的 NGM培养皿中， 每 个培养皿 60条线虫， 每个药物浓度三个培养皿作为平行， 16°C培养 3天至 L3期。 为了使线虫表达 A β， 将 L3期线虫转在 25 °C下进行诱导， 34h 后开始计数线虫麻痹条数。每两小时计数一次 ， 直至所有线虫都麻痹 (麻痹是指机械剌激线虫身体时，线虫不能运� �或者只有头部运动）， 结果见图 2。

由实验结果可以看出， 水溶解的癫痫宁片在 15mg/ml、 5mg/ml 能显著抑制转基因秀丽线虫 Α β过度表达引起的麻痹， 尤其是 15mg/ml 癫痫宁片极为显著地抑制 Α β引起的线虫麻痹表型 （ρ < 0.001 )， 且上述各组均呈现出一定的量效关系。

总之， 由上述本实施例可以看出， 癫痫宁片对阿尔茨海默病动物 病理模型秀丽隐杆线虫 Α β聚集引起的麻痹表型具有明显的抑制作 用， 说明癫痫宁片具有预防或治疗阿尔茨海默病的 潜力。 本发明的新 用途扩大了癫痫宁的适应症，可在制备预防或 治疗阿尔茨海默病药物 中应用。