La diarrea neonatal en rumiantes domésticos es una de las principales causas de pérdidas económicas directamente relacionada con la mortalidad y morbilidad, con los costes de tratamiento y los retrasos en el crecimiento de los animales. Es un proceso de etiología multifactorial, y son varios los agentes enteropatógenos que pueden estar implicados en brotes epidémicos. Además, el manejo de los animales, estado nutricional y el entorno son factores que repercuten en la aparición de la enfermedad. La prevalencia de los agentes responsables difiere según el área geográfica y la edad del animal. Sin embargo, diversos estudios señalan a Cryptosporidium parvum como el enteropatógeno más comúnmente diagnosticado en las ganaderías bovina, ovina y caprina (de Graaf, D. C.; Vanopdenbosch, E.; Ortega-Mora, L. M.; Abbassi, H and Peeters, J. E. Int. J Parasitol. (1999) 29 : 1269-1287). Las formas infectantes, los ooquistes, se eliminan en grandes cantidades en las heces de los individuos parasitados durante la fase aguda de la infección, tienen un pequeño tamaño (4, 5-5 um) y son resistentes a las condiciones ambientales y a los desinfectantes habitualmente empleados. Además, el parásito presenta una gran capacidad de multiplicación en el hospedador, siendo la dosis mínima infectante muy baja y ofreciendo una resistencia notable a la terapia específica (Kosek, M.; Alcantara, C.; Lima, A. M. A. and Guerrant, L. R. Lancetlfnfect. Dis. (2001) 1 : 262- 269.

Paralelamente, la frecuente presencia de C. parfum como parásito oportunista en enfermos inmunocomprometidos, así como su asociación con el incremento en la morbilidad y malnutrición infantil en países en vías de desarrollo, son hechos que denotan la importancia de <BR> <BR> la cryptosporidiosis (Fayer, R. Cryptosporidium and Cryptosporidiosis (R. Fayer (Ed. ). CRC Press, Boca raton, Florida. 1997). Por otra parte, Cryptosporidium ha emergido como un nuevo agente contaminante de medios hídricos, aguas residuales y purines entre otros, al estar implicado en brotes epidémicos desencadenados por el consumo de agua de bebida contaminada que alertaron a la opinión pública, ya que es el mecanismo de transmisión más importante por sus potenciales repercusiones numéricas (Smith, H. V. and Rose, J. B. Parasitol.

Today. (1998) 14 : 14-22).

El objeto de la invención es la utilización de la (3-ciclodextrina en la preparación de medicamentos y cualquier clase de forma farmacéutica para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de la cryptosporidiosis presente en humanos y animales.

Aunque ciertos fármacos ofrecieron mejorías clínicas y/o parasitológicas, la ausencia actual de una terapia específica frente a la infección por Cyptosporidiun2 sigue representando una cuestión pendiente para la sanidad humana y animal.

En rumiantes recién nacidos y de hasta tres meses de edad, en la actualidad, tan sólo el lactato de halofuginona, la paromomicina y el decoquinato han demostrado ser parcialmente efectivos en la prevención y en el tratamiento de la cryptosporidiosis, al disminuir el período de excreción ooquística y la gravedad de la diarrea, cuando se administran durante períodos que oscilan entre 3 y 21 días e incluso hasta 8 semanas. Sin embargo, en algunos casos, ciertos autores comprobaron la aparición de reinfecciones asintomáticas una vez suspendido el tratamiento (Villacorta, I. ; Peeters, J. E.; Vanopdenbosch, E.; Ares-Mazás, E. and Heys, H..

Antimicrob. Agents Chemother. (1991) 35 : 283-287; Fayer ; R. and Ellis, W. J : Parasitol.

(1993) 79 : 771-774; Naciri, M.; Mancassola, R.; Yvoré, P. and Peeters, J. E. Vet. Parasitol.

(1993) 45 : 199-207; Mancassola, R.; Richard, A. and Naciri, M. Vet. Parasitol. (1997) 69 : 31- 37; Causapé, A. C.; Sánchez-Acedo, C.; Quílez, J.; del Cacho, E. and Viu, M. Res. Rev.

Parasitol. (1999) 59 : 41-46; Viu, M.; Quílez, J.; Sánchez-Acedo, C.; del Cacho, E. and López- Bernad, F. Vet. Parasitol. (2000) 90 : 283-287). De ellos y parauso exclusivamente veterinario, el lactato de halofuginona ha sido comercializado bajo el nombre de Halocur (g), formulado como solución oral (0,5 mg/mL) e indicado para la prevención y reducción de diarreas ocasionadas por C. parfum en terneros recién nacidos, debiendo ser administrado una vez al día y a la misma hora durante 7 días consecutivos.

En el hombre, y debido a que el curso clínico de la cryptosporidiosis depende fundamentalmente del estado inmunitario, las opciones terapéuticas varían considerablemente.

En adultos inmunocompetentes y en niños, la infección suele ser autolimitada por lo que no está indicado tratamiento. Sin embargo, al tratarse de una enfermedad diarreica se aconseja la hidratación. En enfermos de SIDA, en los que la infección puede cronificarse, el tratamiento ideal implica la restauración parcial de la función inmune con terapia antirretroviral. Palella, F. J. et al. NewEng. J. Med. (1998) 338 : 853-860, comprobaron que la morbilidad ymortalidad por infecciones oportunistas han decrecido enormemente con el empleo de esta terapia. Incluso varios estudios demostraron un descenso en la prevalencia de la cryptosporidiosis subsecuente a la aplicación de este tratamiento (Kim, L. S. et al. J. Clin. Infec. Dis. (1998) 27 : 655-656; Lemoing, V. et al. AIDS (1998) 12 : 1395-1397). Además, varios trabajos han demostrado la resolución de la diarrea por Cryptosporidiunz coincidiendo con un aumento en el número de linfocitos T CD4 paralelo a la administración de la terapia antirretroviral triple (Carr, A. et al.

Lancet (1998) 351 : 256-261 ; Foudraine, N. A. et al. AIDS (1998) 12 : 35-41).

Si este tratamiento antirretroviral no es posible, pueden ser considerados varios antibióticos que demostraron una cierta eficacia frente a Cryptosporidium, como la paromomicina, la nitazoxanida y la azitromicina. De ellos, la paromomicina es la más ampliamente empleada y presenta cierta actividad en modelos experimentales y ensayos clínicos (Fichtenbaum, C. J. et al. Clin. Infec. Dis. (1993) 16 : 298-300 ; Flanigan, T. P. etal Am.

J. Med. (1996) 100 : 370-372). Una combinación paromomicina-azitromicinaha sido propuesta por Smith, N. H. et al. Iizfec. Dis. (1998) 178 : 900-903) pudiendo ser consideradas terapias experimentales (Crabb, J. H. Adv. Parasitolz (1998) 40 : 121-149.

La nitazoxanida es uno de los últimos fármacos evaluados frente a la cryptosporidiosis humana. Es un nitrotiazol benzamida con amplia actividad frente a protozoos, helmintos y bacterias. En un estudio realizado en México, en 15 enfermos de SIDA con cryptosporidiosis, se observó la resolución de la infección en la totalidad de los enfermos tras una pauta de 1-2 g/día administrada durante 10-30 días (Feregrino, G. M. et al. XI Inte7netional Co7jference on AIDS. (1996). Vancover, Canada. Resultados similares fueron obtenidos enun estudio llevado a cabo en Africa (Doumbo, O. et al. Am. J. Trop. Med. Hyg. (1997) 56 : 637-639.

En el caso de algunos fármacos ensayados en el tratamiento de la cryptosporidiosis humana y animal, hemos podido detectar ciertas características físico-químicas que nos inducen a plantear que una mejora en sus propiedades biofarmacéuticas repercutiría favorablemente en su eficacia. Algunos de los problemas que frecuentemente presentan los fármacos son su baja solubilidad y estabilidad. El descubrimiento de las ciclodextrinas supuso un avance notable en la solución de estos problemas.

La formación de complejos de inclusión con ciclodextrinas permite mejorar la solubilidad de los principios activos y por consiguiente su paso a través de membranas cuando la solubilidad es un factor limitante de la misma. Por otra parte, al mejorar la solubilidad del principio activo, aumenta la fracción que difunde, con lo cual se puede disminuir la dosis de administración y lograr un mismo efecto terapéutico, lo que supone una ventaja adicional de la disminución de los efectos secundarios como consecuencia de las altas dosis administradas.

Algunos principios activos con relativa eficacia en el tratamiento de la cryptosporidiosis humana y/o animal presentan escasa solubilidad (espiramicina, furoato de diloxanida, furazolidona, halofuginona, entre otros) o problemas de estabilidad (como por ejemplo la paromomicina) y su eficacia puede ser mejorada formulándose como complejos de inclusión con ciclodextrinas.

Investigamos la aplicación tanto in vitro como ira vivo de nuevas formulaciones farmacéuticas con complejos de inclusión con P-ciclodextrina en el tratamiento de la

cryptosporidiosis. Los principios activos, furoato de diloxanida, un derivado furánico sintético (G-1), lactato de halofuginona y paromomicina entre otros, se seleccionaron por su potencial actividad anticryptosporidial. De entre los fármacos ensayados algunos formaron complejos de inclusión (por ejemplo furoato de diloxanida y G-1) mientras que otros fueron incapaces, debido a su estructura molecular, de incorporarse a la cavidad de la P-ciclodextrina. La caracterización de los diferentes complejos empleando técnicas instrumentales adecuadas demostró la formación de complejos estables en estado sólido y en disolución, mejorando propiedades como la solubilidad y velocidad de disolución de los fármacos, e incluso la estabilidad en productos como el G-1, que se degrada en disoluciones acuosas o sufre problemas de sublimación.

Para evaluar la actividad in vitro, ooquistes purificados de C. parvum se sometieron durante diferentes tiempos de exposición (30,60, 90 y 120 minutos) a la acción, en solución acuosa, de los principios activos seleccionados : furoato de diloxanida (10 mg/kg peso vivo) y derivado furánico G-1 (20 mg/kg peso vivo) y a dos complejos de inclusión : furoato de diloxanida : (3-ciclodextrina (1 : 1) y derivado furánico G-1 : (3-ciclodextrina (2,5%).

Paralelamente, se realizaron controles con agua destilada y 3-ciclodextrina (2,5%).

La viabilidad ooquística se determinó mediante técnicas de desenquistamiento y de inclusión/exclusión de colorantes vitales fluorogénicos. Los resultados obtenidos con ambos principios activos demostraron que a medida que aumenta el tiempo de exposición, disminuye el porcentaje de ooquistes desenquistados (ooquistes vacíos detectados por contraste de fases) y aumenta el número de ooquistes inviables (ooquistes que incorporan el colorante vital yoduro de propidio). Se comprobó que su formulación como complejos de inclusión mejora su actividad.

Sorprendentemente, el control de la (3-ciclodextrina (2,5%) mostró un efecto importante sobre la viabilidad ooquística, observado tan sólo transcurridos los primeros 30 minutos de exposición. Esta inesperada acción también se detectó a los distintos tiempos, obteniendo unos resultados al final del ensayo, que demuestran una mayor actividad de la ß- ciclodextrina que del furoato de diloxanida y de su complejo de inclusión, y ligeramente inferiores a los obtenidos con el derivado furánico. Además, la acción de la P-ciclodextrina llegó a ser superior a la causada por ambos principios activos durante los primeros 90 minutos, y solamente fue superada cuando el derivado furánico se formuló con 0-ciclodextrina.

Posteriormente, mediante bioensayos en ratones lactantes Swiss CD-1, se evaluaron las eficacias profiláctica y terapéutica del furoato de diloxanida y su correspondiente complejo de inclusión formulado en la proporción mol : mol para la dosis de 10 mg/kg peso vivo, y del

derivado furánico G-1 y sus correspondientes complejos de inclusión formulados en la proporción mol : mol y con un exceso de (3-ciclodextrina (2,5%), ensayados para las dosis de 10,20, 25 y 3 O mg/kg peso vivo de principio activo. La determinación de la eficacia se realizó estableciendo el porcentaje de animales infectados y la intensidad de infección a los 7 días postinfección mediante examen de la totalidad del contenido intestinal homogeneizado. Se comprobó, bajo ambos regímenes de tratamiento, una reducción significativa en la intensidad de parasitación tanto con los principios activos como con sus correspondientes complejos de inclusión respecto a las camadas control. De nuevo, el control realizado con (3-ciclodextrina ofreció resultados inesperados, por lo que, se evaluaron ambas eficacias profiláctica y terapéutica de una suspensión acuosa de P-ciclodextrina (2,5%) administrada tanto en una única dosis como en dosis múltiples. Se consiguió erradicar la infección cuando se administró /3-ciclodextrina dos horas antes de provocar la infección y los días 1 y 2 postinfección cada 12 horas (Tabla 1).

Tabla 1. Eficacias profiláctica y terapéutica de la (3-ciclodextrina evaluadas en ratones lactantes infectados con 2, 5x104Ooquistes de C. pasvumn.

Ensayo n° Intensidad de infección* Ratones infectados (%) 1 (control infección) 2,6 1, 6 100 2 (eficacia profiláctica : monodosis) 0,3 : E 0, 1 100 3 (eficacia terapéutica : monodosis) 0,2 i 0,1 100 4 (eficacia profiláctica : dosis múltiples) 0,1 : 1 : 0, 1 100 5 (eficacia profiláctica : dosis múltiples) 0,0 A 0,0 0,0 6 (eficacia terapéutica : dosis múltiples) 0, 1 i 0, 0 33,3 7 (eficacia terapéutica : dosis múltiples) 0,1 0,0 6,2 * media =L DE x 106 ooquistes/totalidad del intestino homogeneizado.

Ensayo 4 : dosis cada 12 horas ; ensayo 5 : dos horas antes de provocar la infección y dosis cada 12 horas; ensayo 6 : dosis cada 12 horas; ensayo 7 : dosis cada 8 horas.

Por otra parte, se evaluaron las eficacias profiláctica y terapéutica de la (3-ciclodextrina frente a la cryptosporidiosis en rumiantes domésticos. Para ello, corderos recién nacidos se infectaron experimentalmente el primer día de vida con lux106 ooquistes de C. parvu7n de origen ovino. La administración de (3-ciclodextrina se realizó por vía oral y en forma de suspensión acuosa siendo la dosis de 1 g/kg peso vivo. En los ensayos de eficacia profiláctica, los corderos se trataron durante los tres primeros días de vida, y en el ensayo terapéutico la ß- ciclodextrina se administró, con igual pauta, a partir del inicio del proceso diarreico y confirmación de la presencia de ooquistes en las heces. La eficacia se determinó teniendo en cuenta la eliminación ooquística, la presencia de diarrea y la ganancia de peso corporal los días

15 y 30 de vida de los animales. Los resultados (Gráfico 1) demostraron que la P-ciclodextrina fue altamente efectiva como profiláctico al impedir la aparición de procesos diarreicos en los corderos infectados y evitar la infección en uno de ellos, así como al disminuir notablemente la intensidad y duración del período de patencia. Administrada terapéuticamente, disminuyó la gravedad del proceso diarreico y acortó el período de excreción ooquística. Los animales tratados aumentaron significativamente su peso corporal y no se observaron toxicidad aparente ni reinfecciones.

Aunque desconocemos el mecanismo de acción por el cual la P-ciclodextrina impide la implantación de la infección, la literatura consultada y ciertas observaciones realizadas, nos conducen a plantear posibles mecanismos de acción. Así, es conocido el hecho de que las ciclodextrinas provocan la lisis de los eritrocitos al disolver, y por tanto eliminar, componentes de su membrana como el colesterol y ciertos fosfolípidos, la fosfatidilcolina y la esfingomielina (Ohtani, Y. et al. J Europ. J Biochem. (1989) 186 : 17-22; Arima, H. et al. V International Symposium on Cyclodextrin. (1990). París, Francia); compuestos lipídicos detectados en la pared de los ooquistes de C. pat-vus (Mitschler, R. R. et al. J. Euka7 : Microbiol. (1994) 41 : 8-12). Cuando nosotros observamos microscópicamente, y utilizando una solución de verde malaquita, ooquistes de C. parvum expuestos a la acción in vitro de la (3- ciclodextrina, pudimos comprobar que algunos incorporaban el colorante, lo que indica una alteración en la permeabilidad de la pared ooquística. Además, los resultados de los ensayos de viabilidad demostraron que estos ooquistes son permeables al colorante ioduro de propidio.

Ciertos autores (Horan, P. K. y Kappler, J. W. J. Inmunol. (1977) 18 : 309-316) indican que sólo las células que presentan membranas alteradas o rotas, pueden ser teñidas por este colorante vital. Nosotros sospechamos que la P-ciclodextrina modifica, quizá al captar algunos de estos lípidos, la integridad de la pared ooquística que sirve de barrera protectora a los esporozoítos invasivos.

Por otra parte, Comini, S.; Olivier, P.; Riottot, M. and Duhamel, D. Clin. Chim. Acta (1994) 228 : 94-181, demostraron la afinidad de la (3-ciclodextrina por el ácido taurocólico, empleado en nuestros ensayos in vitro, como su sal sódica en la técnica de desenquistamiento.

Recientemente, Gold, D.; Stein, B. and Tzipori, S. J. Parasitol. (2001) 87 : 997-1000, observaron que la presencia de esta sal biliar en cultivos celulares estimula la liberación de los esporozoítos. Tal vez, la fonnación de los correspondientes complejos de inclusión (ácido taurocólico : (3-ciclodextrina) justifiquen el descenso en el porcentaje de ooquistes desenquistados tras su exposición in vitro a la acción de la P-ciclodextrina, respecto al control con agua destilada.

Además, hemos de comentar que Harp, J. A. J. Parasitol. (1999) 85 : 952-955, comprobó que ciertos azúcares, como la sacarosa y en menor medida la isomaltosa, reducen significativamente la intensidad de infección por C. parvum en ratones lactantes y que este efecto depende de la presencia y concentración de los azúcares en el intestino del hospedador.

Así, el autor comprobó mediante exámenes histológicos una hipervacuolización de los enterocitos del íleon transcurridas 24 horas del tratamiento con sacarosa, sugiriendo que este azúcar interacciona con el epitelio intestinal al inducir cambios osmóticos, haciendo que las células sean menos susceptibles a la infección por el parásito. En nuestro laboratorio realizamos estudios histológicos de intestino de ratones experimentalmente infectados y tratados con P-ciclodextrina, administrada a la misma dosis y pauta de tratamiento con la que se logró erradicar la infección y no observamos cambios morfológicos en las células epiteliales con respecto a los correspondientes estudios realizados con animales que recibieron agua destilada.

Finalmente, en estudios electroforéticos llevados a cabo en nuestro laboratorio con extractos solubles de ooquistes de C. pat-vus sometidos, previamente y durante 24 horas a la acción de la (3-ciclodextrina, revelaron unos patrons polipeptídicos en los que se detectó la ausencia de la fracción proteica comprendida entre 15,7-17, 5 kDa, considerada como altamente inmunogénica. Así, Tilley, M.; Fayer, R.; Guidry, A.; Upton, S. J. and Blagburn, B. L. Infect. Immunol. (1990) 58 : 2966-2971, demostraron la presencia de una glucoproteína de 14,5-16, 5 kDa en las superficie de los esporozoítos que fue uno de los principales antígenos reconocidos por el calostro bovino hiperinmune. Estudios posteriores demostraron que en ratones lactantes experimentalmente infectados, el tratamiento con anticuerpos monoclonales frente a esta glucoproteína, incluso a dosis bajas, redujo significativamente el número de estados de desarrollo endógeno del parásito en el tracto intestinal y disminuye la producción ooquística (Tilley, M.; Upton, S. J.; Fayer, R.; Barta, J. R.; Chrisp, C. E.; Freed, P. S.; Blagburn, B. L.; Anderson, B. C. and Barnard, S. M. Infect. Immunol. (1991) 59 : 1002-1007.

Gráfico 1. Representación gráfica del número de corderos con diarrea y de la intensidad de parasitación por C. parvum en el grupo control experimental no tratado y en los grupos tratados con (3-ciclodextrina Grupo control experimental no tratado cru 5 In 4 4 3 ° 3 b 2 b 1 U 1 7.. d 3 Id 0 1 2 0 0 Di D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 Dll D12 D14 D16 D18 D20 D22 D24 Días de eliminación ooquística Grupo profiláctico 5 4 r 2 0 r 1 : ñ 4 ; g ó 3. ex a. 8 b ,. 2 b 1 z 0 0 Di D2 D3 D4 DS D6 D7 D8 D9 D10 Dll D12 D13 D15 D17 D19 D21 D23 Días de eliminación ooquística Grupo terapéutico S 4 4 c'o v 4 : ° 3 o 2 S T- ? M o 2. b Í t o. d 0 0 b 1 1 C o z 0 0 Dl D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 Dll D12 D13 D15 D17 D19 D21 D23 D25 Días de eliminación ooquística

La (3-ciclodextrina administrada por vía oral no es tóxica ya que no se absorbe a través del tracto gastrointestinal, impidiéndose así su acumulación en órganos (Irie, T. and Uekama, K. J. Pharrnac. Science. (1997) 86 : 147-162). Estudios de toxicidad demostraron que, vía oral, los valores de DLso superan a 12, 5 ; 18,5 y 5 g/kg peso vivo para ratones, ratas y perros respectivamente (Szejtli, J. Cyclodextrins in Technology. (1988). J. Szejli (Ed). Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Holanda). Tampoco se observaron efectos tóxicos en ratas cuya dieta fue suplementada en un 10% con (3-ciclodextrina durante 90 días (Irie, T. and Uekama, K. J. Pharmac. Science. (1997) 86 : 147-162). Por otra parte, la (3-ciclodextrina,

además de ser un producto biodegradable, se utiliza en acuicultura para la elaboración de formulaciones farmacéuticas destinadas al tratamiento de peces de cultivo. (Luzardo-Alvarez, A. et al. Aquaculture 622027 (2002) (en prensa).

Los resultados obtenidos demuestran que la (3-ciclodextrina presenta una mayor eficacia que los principios activos ensayados solos o formando complejos de inclusión.