本发明有关于一种化合物的用途， 特别指丁烯基苯酞的用途、 其使用方法 及将其制备为医药组合物的方法。

背景技术

由于现代人的存活年龄增加， 而伴随着年纪老化及生活压力倍增， 越来越 多人面临各种影响身体健康的疾病， 以及外观老化的问题。 具体来说， 阿兹海 默症为全球发生率最高的神经退化性疾病， 其主要的病理特征在于脑内有过量 的 β类淀粉样蛋白质（β-amyloid protein, Αβ )沉积，形成 Αβ斑块（plaque ) ( Glenner and Wong 1984； Masters, C. L. et al.， 1985 ) 以及细胞内缠结的神经纤维 ( neurofibrillary tangles, NFT ) ( Grundke-Iqbal, I. et al.， 1986； Goedert, M. et al.， 1988 ) 。 而 Αβ斑块由淀粉样前驱蛋白质 （amyloid protein precursor, APP ) ， 经 过 BACE酉孝素 ( β-site amyloid precursor protein cleaving enzyme ) ( Hussain, I. et al.， 1999； Vassar, R. et al.,1999 ) 以及 γ分泌酶（γ-secretase )切割后所产生 （Wolfe, M. S. et al.， 1999； Yu, G. et al.， 2000 ) ， 主要包含有 Αβ40以及 Αβ42两种形式 ( Jarrett, J. T. et al., 1993 ) 。 当 β类淀粉样蛋白质在细胞内外大量累积时， 会成 为神经细胞死亡的主要因素。

唐氏症患者为第 21对染色体减数分裂时， 染色体分离不均， 导致细胞内多 带一条染色体所致。 而由于淀粉样前驱蛋白质的基因位于第 21条染色体上 ( Rumble, B. et al., 1989； Selkoe, D. J.， 1996 ) ， 因而大多认为淀粉样前驱蛋白 质过量表现会使唐氏症患者具有早发性认知障 碍的症状 （Burger, P. C. and F. S. Vogel, 1973 )。目前许多研究显示， Αβ斑块会出现于唐氏症患者的脑内（Masters, C. L. et al., 1985； Beyreuther, K. et al., 1992； Gyure, K. A. et al., 2001； Mori, C. et al., 2002 ) 。 另有研究指出， 利用来自唐氏症患者的诱导型万能干细胞（ind uced pluripotent stem cells, iPSCs )所产生的神经细胞， 可用以重现典型阿兹海默症的 病理特征， 例如 Αβ42及 Αβ40的累积、 高度磷酸化的 Tau蛋白质等。 因此， 利用 唐氏症患者的诱导型万能干细胞分化系统可用 以作为筛选治疗或预防与 β类淀 粉样蛋白质相关神经退化性疾病的药物平台。

目前临床上治疗阿兹海默症的药物包含胆碱酯 酶抑制剂 （ cholinesterase inhibitors )( Birks, J., 2006 )以及 NMDA接受体拮抗剂（NMDA receptor antagonist) ( McShane, R. et al., 2006 ) ， 而该两种药物皆适用以改善阿兹海默症患者认 知 功能， 然而， 对于由阿兹海默症所衍生的疾病， 如忧郁、 失眠等， 须通过其他 适合的药物进行治疗（Tariot, P. N. et al.， 2004； Feldman, H. et al.， 2006； Howard, R. et al., 2012 ) ， 并且， 该两种药物仅能用于改善症状， 不能达到治愈阿兹海默 症的功效 （Farlow, M. R. et al.， 2010 ) 。 除此之外， 许多研究针对减低脑内 Αβ 的累积而设计治疗阿兹海默症的新药 （Hong-Qi， Y. et al.， 2012 ) ， 具体来说， 包含有 BACE 抑制剂（BACE inhibitors )，例如 MK-8931以及 ACI-91 ( Mullard A., 2012)，或 γ分泌酶抑制剂，例如 LY450139( Siemers， E. et al.， 2005 )及 BMS-708163 ( Tong, G. et al., 2012 ) ， 或以免疫途径对抗 Αβ的抗体等。

再者， 虽然局部脱发、 掉发或毛发稀疏等问题对于个体的身体健康不 会产 生不良影响， 但是， 不可否认地会影响个体的外在观感。 据研究指出， 毛发稀 疏者较为容易导致个体情绪不佳， 无法进行社交活动， 可能造成个体产生社交 障碍、 自信心不足、 自我认同等心理问题。 因此， 毛发稀疏或脱发成为现代人 逐渐重视的问题。

而除通过改变洗发习惯、 饮食习惯延缓毛发掉落外， 目前坊间出现许多改 善毛发脱落或是促进毛发生长的产品， 主要可分为两类， 其中一类为血管舒张 剂， 另一类为前列腺素相关衍生物。 更进一步来说， 血管舒张剂中最为人所熟 知者为 "落健" 其商业名称为米诺地尔 （Minoxidil ) ( Messenger A.G. et a!" 2004 ) ， 主 要 成 分 为 2，4-二胺 基 酸 -6 哌 啶 基 嘧 啶 -3-氧 化 物 ( 2,4-diamino-6-piperidinopyrimidine 3-oxide ) ， 然而， 落健并非对于所有咅分 的毛发稀疏皆具有良好效果， 并且， 效果仅只在有使用产品时， 一旦停止使用 产品， 新生长出的毛发会再次脱落。 而前列腺素 F2a以及前列腺素 E2分别被报 导指出可用以促进睫毛与头发生长 （Woodward, D.F. et a/.，2013 ) ， 不过， 对于 使用者造成如红肿过敏、 色素沉淀等副作用， 并且， 一旦停止使用， 新生长出 的毛发也会脱落。

丁烯基苯酞 （butylidenephthalide , Bdph ) 存在于天然植物中， 例如伞形科 或菊科的植物， 可由丙酮或氯仿萃取而得。 过去研究指出丁烯基苯酞可用于治 疗痉挛 (Ko， W.C. et al , 1980)、 抗血小板凝集 (Teng, CM. et al , 1987)， 并且能抑 制细胞生长、 促进癌细胞死亡， 例如， 通过抑制端粒酶达到抑制肿瘤生长的功 效 (Huang, M.H. et al., 2014; Tsai, N.M. et al , 2006)、 通过抑制 NF-κΒ达到抑制发 炎反应 （Fu，R.H. et «/.，201 1 ) 的功效。 再者， 近期研究也发现， 丁烯基苯酞得 通过活化 Jak2/stat3信息路径， 维持胚胎干细胞的生长， 以及促进诱导型干细胞 的形成 （Liu, S.P. et a/.， 2012 ) 。 Wnt蛋白质是高度保守 （highly conserved) 的分泌性分子， 为调控胚胎发育 与干细胞维持的重要因子。 Wnt得通过和其在细胞膜上的受体 Frizzled ( Frz ) 及 LDL受体相关蛋白质 （LDL-receptor-related protein, LRP5/6 ) 结合形成三元体 结构， 并且作用于细胞内的蓬乱蛋白质 （Dishevelled, Dsh) 。 Dsh能与肝醣合 成酶激酶 -3β ( glycogen synthase kinase-3 , GSK-3 ) 、 腺瘤性结肠息肉蛋白质 ( adenomatous polyposis coli, APC ) 以及 Axin蛋白质 ( axis inhibitor protein ) 结 合， 以抑制肝醣合成酶激酶 -3β的活性， 进而抑制 β-链蛋白质 （β-catenin ) 磷酸 化， 以及 β-链蛋白质经由泛素化作用 （ubiquitination) 分解的途径。 活化 Wnt信 息得引发细胞核内 β-链蛋白质的累积。 β-链蛋白质进入细胞核后， 可启动其他特 殊转录因子， 如 Τ细胞因子 （T cell factor, Tcf) ， 以及淋巴增强因子 （lymphoid enhancer factor, Lef) ， 与 Siamois等， 藉此以调控细胞的成长与个体的发育。 活化细胞内 wnt信息太多或不及， 均会导致生物体的损害， 造成早期胚胎发育上 的缺陷， 或导致晚期成体中产生肿瘤或功能不全 （Fodde，R. et a/.，2007 ) 。

目前许多研究均已证实， 活化 Wnt可以通过刺激表皮干细胞的复制，达到促 进毛发生长的功效 （Lim，X. et «/.， 2013 ) 。 表皮干细胞多存在于毛囊隆起区域 ( bulge ) ， 为一标志残留细胞 （label-retaining cells ) ， 平时细胞多处于休眠状 态， 在表皮受损或组织需要更新时， 才会活化。 Wnt/p-catenin 路径为维持表皮 干细胞自我复制的重要分子， 活化 Wnt signal可使休眠状态的表皮干细胞进入细 胞周期， 使细胞进行复制， 并分化为成熟的毛发细胞 （Thompson, C.C. et al , 2006 ) 。 表现 Wnt7a则可以增加毛囊再生的数目， 相同地， 稳定 β-链蛋白质而不 受泛素化作用分解， 得提高 β-链蛋白质在细胞核的浓度， 促使新生毛囊的产生 ( Gat, U. et al , 1998 )。相反地，抑制 Wnt信息可以防止创伤引起的毛囊形成（Ito， M. et al , 2007 ) 。

由上可知， 先前技术中无法提供一种有效且无副作用的组 合物， 用以治疗 或预防如阿兹海默症的神经退化性疾病， 以及改善脱发或促进毛发生长。 因此， 开发一种新颖并且能够有效改善或治疗上述症 状的组合物为目前最重要的研究 课题。

发明内容

因此， 本发明揭露一种丁烯基苯酞或 /及其类似物的用途， 其可用于作为促 进毛发的外用组合物的活性成分， 或是可用以作为治疗或预防神经退化性疾病 的医药组合物的活性成分。

本发明的主要目的在于提供一种促进毛发生长 的外用组合物， 其能够用以 减少对于人体副作用， 并且达到有效促进毛发生长的功效。

为了达成上述目的， 本发明揭露丁烯基苯酞或 /及其类似物的用途， 其将丁 烯基苯酞、 其类似物或上述成分的组合用于制备促进毛发 生长的外用组合物， 其中， 该丁烯基苯酞具有活化 Wnt信号的能力。

较佳地， 丁烯基苯酞可由天然植物中萃取而得， 如伞形科植物、 菊科植物 等， 其中， 所使用的萃取技术为该技术领域且具通常知识 者周知。

较佳地， 丁烯基苯酞或其类似物得由化学合成技术所制 备而得， 其中， 所 使用的化学合成技术为该技术领域且具通常知 识者周知的化学合成方法。

本发明的另一目的在于提供一种促进毛发增生 的方法， 其将一促进毛发生 长的外用组合物， 涂抹在一个体的皮肤上， 其中， 该外用组合物包含一有效量 的丁烯基苯酞、 其类似物或上述成分的组合， 以及一药学或美容产品上能接受 的载体。

较佳地， 该皮肤为具有毛囊的区域。

较佳地， 该促进毛发生长的外用组合物直接涂抹在该个 体的皮肤上。

较佳地， 该促进毛发生长的外用组合物喷洒在该个体的 皮肤上。

较佳地， 该丁烯基苯酞的浓度为 1μΜ-1ηιΜ。

本发明的次一目的在于提供丁烯基苯酞或 /及其类似物的用途， 其用于预防 或治疗神经退化性疾病， 如阿兹海默症。

为能达成上述目的， 本发明揭露一种治疗神经退化性疾病的方法， 其投予 一含有有效量的丁烯基苯酞、 其类似物或上述成分的组合的医药组合物至一 个 体。

较佳地， 该神经退化性疾病为脑内累积过量 β类淀粉样蛋白质的病征。 较佳地， 该神经退化性疾病为阿兹海默症。

较佳地， 丁烯基苯酞可自天然植物中萃取而得， 例如伞形科植物、 菊科植 物等， 其中， 所使用的萃取技术为该技术领域且具通常知识 者周知。

较佳地， 丁烯基苯酞可由化学合成技术所制备而得， 其中， 所使用的化学 合成技术为该技术领域且具通常知识者周知的 化学合成方法。

本发明的又一目的在于提供一种上述医药组合 物的制备方法， 其用以降低 医药组合物内活性成分的细胞毒性， 达到提升医药组合物安全性及减少副作用 的功效。

为能达成该目的， 本发明揭露一种医药组合物的制备方法， 其将丁烯基苯 酞与高分子物质以重量比 1 : 1〜1： 2混合后， 加入一极性有机溶剂及水， 使丁 烯基苯酞与高分子物质在水相通过分子间引力 进行吸附作用而使该高分子物质 包覆丁烯基苯酞， 再去除该极性有机溶剂。

较佳地， 该极性有机溶剂为类杂环醚类化合物。

较佳地， 该极性有机溶剂为四氢呋喃 （tetrahydrofuran) 。

较佳地， 该高分子物质为 F127高分子物质。

较佳地， 去除该极性有机溶剂的方法为加热法。

本发明的有益效果为：

本发明所揭丁烯基苯酞或其类似物能作为于促 进毛发生长的外用组合物的 活性成分， 而通过以如喷洒、 涂抹等方式投予于个体特定部位的皮肤上， 达到 促进毛发增生， 同时提升个体外观的功效， 也能达到避免习知产品对于个体具 有副作用的功效。 再者， 本发明所揭医药组合物制备方法能以高分子物 质作为 药物载体， 减缓或降低丁烯基苯酞的细胞毒性， 能有效提升医药组合物的安全 性。而通过本发明的方法所制得的医药组合物 具有降低细胞内 β类淀粉样蛋白质 浓度的功能， 因此， 通过投予有效量的医药组合物至生物体， 能达到治疗或预 防神经退化性疾病的功效。

附图说明

图 1为各组转染 Top-flash质体 DNA的细胞经不同条件培养后， 侦测各组 细胞的冷光酶表现并且经统计分析出的结果。

图 2为转染 Top-flash质体 DNA或该 Fop-flash质体 DNA的细胞经不同条 件培养后， 侦测各组细胞的冷光酶表现并且经统计分析出 的结果。

图 3为各组小鼠分别经不同处理后的外观变化。

图 4为以包覆高分子物质 F127的丁烯基苯酞及未包覆高分子物质 F127的 丁烯基苯酞进行细胞毒性试验的结果。

图 5为 T21诱导性万能干细胞进行神经分化培养的流程 图。

图 6为 T21诱导性万能干细胞进行神经分化培养后， 以免疫荧光染色分析 观察其内 N-cadherin表现的结果， 其中， 红色为经免疫荧光染色的 N-cadherin， 蓝色为以 DAPI染色的细胞核。

图 7为 T21诱导性万能干细胞进行神经分化培养后， 以免疫荧光染色分析 观察其内 nestin表现的结果， 其中， 绿色为经免疫荧光染色的 nestin, 蓝色为以 DAPI染色的细胞核。

图 8为 T21诱导性万能干细胞进行神经分化培养后， 以免疫荧光染色分析 观察其内 Pax-6蛋白质表现的结果， 其中， 红色为经免疫荧光染色的 Pax-6蛋白 质， 蓝色为以 DAPI染色的细胞核。

图 9为 T21诱导性万能干细胞进行神经分化培养后， 以免疫荧光染色分析 观察其内 βΠΙ微管蛋白质表现及神经突起生长情形的结 果， 其中， 绿色为经免 疫荧光染色的 βΠΙ微管蛋白质， 蓝色为以 DAPI染色的细胞核。

图 10为经不同细胞所分化的神经细胞，分别以酵� ��连结免疫吸附分析法统 计分析各细胞内 Αβ40表现量的结果。

图 11为 T21诱导性万能干细胞所分化的神经细胞经不同 处理条件进行培养 后， 以酵素连结免疫吸附分析法统计分析各细胞内 Αβ40表现量的结果。

具体实施方式

本发明揭露丁烯基苯酞的用途、 其使用方法及将的制备为医药组合物的方 法。基于丁烯基苯酞具有促进毛发生长以及降 低神经细胞内 β类淀粉样蛋白质含 量的能力， 因此， 通过投予有效量的丁烯基苯酞至生物体中能达 到改善个体健 康及外观的功效， 具体来说， 丁烯基苯酞对于过量累积 β类淀粉样蛋白质在细胞 内会导致神经退化性疾病， 如阿兹海默症， 能达到预防或治疗的功效， 并且丁 烯基苯酞作为外用组合物的活性成分， 能够有效促进其投予部位毛发生长。 此 外， 本发明所揭制备医药组合物的方法， 其通过有机合成反应制备该医药组合 物， 通过如 F127的高分子物质与丁烯基苯酞间产生共价键� �， 使高分子物质包 覆丁烯基苯酞， 达到减少医药组合物对于生物体细胞毒性的功 效。

除非另有定义， 本发明的说明书及权利要求书所使用的技术及 科学名词的 意义， 其与本发明所属技术领域且具通常知识者的一 般理解相同。 若有矛盾的 情形， 以本发明内容为准。

本发明所揭丁烯基苯酞的结构式为如式 （I) ： ( I) ， 其 制备或取得方式为该所属技术领域且具通常知 识者的一般知识， 并且非本发明 的技术特征， 故于本发明不加以赘述。 举例来说， 中国专利申请， 申请号为 20091006666.6中揭露丁烯基苯酞可以有机溶剂自� �形科或菊科植物萃取而得； 中国专利公告第 1041725C号揭露丁烯基苯酞以化学合成方式合成� ��

本发明所揭 "毛发" 一词包含个体身上各处的毛发， 包含有， 但不限于， 头发、 体毛、 睫毛、 眉毛。

本发明所揭 "萃取" 一词指利用物质在不同萃取剂中溶解度的差异 ， 将混 合物中特定成分由甲相转移到乙相中， 达到分离的目的， 例如溶剂萃取、 超临 界萃取。 一般来说， 萃取剂包含有， 但不限于， 丙酮、 氯仿、 二氧化碳。

本发明所揭 "化学合成技术" 一词指为得到特定产物而进行的一系列化学 反应， 如有机反应、 无机反应。

本发明所揭 "有效量" 一词指欲产生所求特定效果所需化合物或活性 成分 的量， 可以其在组合物中所占重量百分比表示。 如同本发明所属技术领域中具 通常知识者所了解， 该有效量会因为欲引起特定效果的投予方式而 有所不同。 一般来说， 活性成分或化合物在组合物中的量可占该组合 物重量的约 1 %至约 100%， 较佳者为约 30%至约 100%。

本发明所揭 "药学或美容产品上能接受的载体" 一词包含任何标准在医药 或美容产品上所使用的载体， 而该载体依据组合物的型态， 得为固态、 半固态 或液态。 举例来说， 载体包含， 但不限于， 明胶、 乳化剂、 烃类混合物、 水、 甘油、 生理食盐水、 缓冲生理盐水、 羊毛脂、 石蜡、 蜂蜡、 二甲基硅油、 乙醇。

本发明所揭 "类似物"一词包含有化合物的盐类、 其酯类、 其结构异构物， 如 Z型结构或 E型结构， 或进行结构修饰后的产物。

本发明所揭高分子物质 F127， 其为聚氧乙烯-聚氧丙烯 -聚氧乙烯的三嵌段

CH ₃

聚合物， 化学式如式 （II) ： H(OCH ₂ CH ₂ ) _x {OCH ₂ CH) _y (OCH ₂ CH ₂ ) _z QH _{( π )} ， 其中， x、 y、 z分别为大于 1的整数。 由于高分子物质 F127两端的聚氧乙烯具有 亲水性， 中段的聚氧丙烯属于疏水性， 因此， 高分子物质 F127为两性物质。 当 高分子物质 F127存在于水溶液中时， 其会逐渐向界面扩散并吸附在界面上， 使 表面张力下降， 并且， 通过控制高分子物质内亲疏水基的比例， 能达到控制高 分子物质的表面活性。

本发明所揭 "分子间引力" 包含有， 但不限于， 凡得瓦力、 库伦作用力、 氢键、 疏水键力。

本发明所揭 "医药组合物" 一词包含一有效量的欲产生特定效果的所需化 合物或活性成分， 以及至少一药学上能接受的载体。 如同本发明所属技术领域 中具通常知识者所了解， 医药组合物的型态可随着欲引起特定效果的投 予方式 有所不同， 如锭剂、 粉剂、 针剂等， 并且， 该载体也随着医药组合物的型态而 可为固态、 半固态或液态。 举例来说， 载体包含， 但不限于， 明胶、 乳化剂、 烃类混合物、 水、 甘油、 生理食盐水、 缓冲生理盐水、 羊毛脂、 石蜡、 蜂蜡、 二甲基硅油、 乙醇。 本发明所揭 "高分子物质" 一词指通过聚合反应而生成具有相当高分子量 的大分子， 一般来说， 高分子物质皆为有机分子。

以下， 为能更进一步说明本发明的功效， 将列举若干实施例作详细说明， 然而， 该等实施例为用以解说的例示， 其中所使用的任何词汇并不限制本发明 说明书及权利要求的范围及意义。

另 须加 以 说 明 的 是 ， 下列 实施例 中 所使用 的丁烯基苯酞

( n-butylidenephthalide， Bdph， W333301 ) 由美国西格玛奧瑞奇集团 ( Sigma-Aldrich) 所取得。

实施例 1 : Wnt活性测试

于六孔培养皿准备幼仓鼠肾脏纤维母细胞 BHK21数量约 5分满，每孔培养皿 分别以 5(^L的 Opti-MEM培养基 （ Invitrogen公司） 与 2 L的微脂粒 2000 ( Lipofectamine 2000 , Invitrogen公司） 于 1.5mL微量离心管混合 5分钟， 形成一 微脂粒混合液。

分别将 50μ 的 Opti-MEM培养基与 9.6 g的 Top-flash质体 DN A或 Fop-flash质 体 DNA混合， 形成一 Top-flash质体混合液及一 Fop-flash质体混合液， 其中， Top-flash质体具有原生型 TCF结合点 （wild-type TCF binding site ) ， 用以作为实 验组； Fop-flash质体具有突变 TCF结合点 （ mutant TCF binding site ) ， 控制组； 而该两种质体均接有冷光酶 （Luciferase ) 的序列。

于第一测试组中， 将 Top-flash质体混合液加入该微脂粒混合液中， 使其成 为一总体积为 ΙΟΟμΙ^的混合液， 共有 3组混合液。 将各组混合液于室温静置反应 20分钟后， 抽出各组该混合液， 分别加入培养皿中， 轻摇使其均匀分布， 再以 Opti-MEM培养基补满到液面刚好覆盖过细胞 BHK21 , 于 37°C培养 4小时， 而后 再以 Opti-MEM培养基补至每孔 2mL的培养基体积， 约 18〜24小时后更换培养 基， 并且给予各组不同培养条件， 其中， 第一组为空白组， 第二组加入 0.4μΜ 的化合物 ΒΙΟ， 第三组加入 0.4μΜ的丁烯基苯酞。 将各组再进行培养约 18〜24小 时， 而后分别自各组的该培养皿中收集细胞 BHK21 , 侦测其冷光酶活性， 结果 如图 1所示， 其中， *号表示在 0.05的显著水准之下。

于第二测试组中， 将该 Top-flash质体混合液或该 Fop-flash质体混合液的产 物加入该微脂粒混合液中，分别使其成为一总 体积为 10( L的 Top-flash混合液或 Fop-flash混合液， 而共有 4组混合液， 其中， 第一组为 Fop-flash混合液， 第二至 四组皆为 Top-flash混合液。 将各组混合液于室温静置反应 20分钟， 并且抽出而 加入培养皿中， 轻摇使其均匀分布， 再以 Opti-MEM培养基补满到液面刚好覆盖 过细胞 BHK21 , 于 37°C培养 4小时， 而后再以 Opti-MEM培养基补至每孔 2mL的 培养基体积， 约 18〜24小时后更换培养基， 并且给予各组不同培养条件， 其中， 第一组加入 4μΜ的丁烯基苯酞， 第二组未添加任何化合物， 第三组加入 Ι μΜ的 丁烯基苯酞， 第四组加入 4μΜ的丁烯基苯酞。 将各组再进行培养约 18〜24小时， 而后分别自各组的该培养皿中收集细胞 BHK21 , 侦测其冷光酶活性， 结果如图 2 所示， 其中， *号表示在 0.05的显著水准之下。

而侦测冷光酶活性的方法如下： 先吸除细胞 BHK21的培养液， 再以磷酸盐 缓冲液清洗 2次。 每孔培养皿加入 20(^L的 IX PLB试齐 U ( Passive Lysis Buffer, Promega公司） ， 于室温下震荡 15分钟后， 待细胞裂解， 取其细胞溶解物， 再以 转速 12000rpm， 于 4°C下离心 1分钟后， 收集其上清液。 取 2(^L的上清液至 96孔 盘， 加入 10( L冷光酶分析试剂 （Luciferase Assay Reagent) ， 置入冷光仪， 以 波长 595nm测量冷光酶的活性。

由图 1的结果显示， 通过未经化合物处理的第一组， 其冷光值可作为实验的 参考值。 相对于第一组， 当细胞处理 0.4μΜ的化合物 BIO或丁烯基苯酞时 （第二 组及第三组） ， 有转染 Top-flash质体 DNA的细胞冷光值显著升高， 表示细胞中 TCF启动子被活化， 而使细胞冷光酶的活性及表现被侦测到。

由图 2的结果显示， 由于第一组具有突变的 Fop-Flash报导基因， 因此， 即使 加入丁烯基苯酞， 第一组中也无法侦测到冷光酶活性， 换言之， 细胞冷光值未 增加。 第二组至第四组的细胞冷光值随着丁烯基苯酞 添加剂量增加而提升。 由 此可知， 冷光酶的活化具有专一性并且具有剂量效应。

如同过去文献中所指出， BIO为一种 Wnt活化剂，能与 Top-flash质体中的 TCF 结合点结合， 而于细胞 Wnt信号被活化下， 会促进冷光酶的表现， 并且， 由图 1 及图 2的结果可知， 丁烯基苯酞能随着添加剂量增加， 而能显著提高冷光酶的活 性， 据此， 本发明所揭丁烯基苯酞具有活化 Wnt信息的能力。

实施例 2: 动物试验

选取 6〜8周龄的 C57BL/6小公鼠， 分为三组， 每组 2只小公鼠， 而各该小鼠 的无毛处分别为背部近尾端处表皮， 面积为 2平方公分， 每日分别以不同条件予 以处理其无毛处， 经过 21天后， 观察各该组小鼠的毛发生长、 体重、 外观有无 异常， 其中， 第一组为对照组， 在无毛处仅涂抹磷酸生理食盐水； 第二组为实 验组， 在无毛处涂抹经乳化的组合物， 其含有丁烯基苯酞， 浓度为 10μΜ; 第二 组为实验组，在无毛处涂抹经乳化的组合物， 其含有丁烯基苯酞，浓度为 100μΜ。 结果如图 3所示。 由图 3的结果显示， 各该组小鼠的体重不具有异常现象。 相较于第一组， 第 二组及第三组小鼠背部无毛处的毛发有明显增 生， 并且， 第三组小鼠背部无毛 处的毛发增生现象更为显著。 由此可知， 涂抹本发明所揭丁烯基苯酞能有效促 进毛发增生， 并且增生的效果能随着剂量提升而显著增加。

实施例 3 : 合成水相丁烯基苯酞

取 自美国西格玛奧瑞奇集团 （ Sigma-Aldrich ) 取得丁烯基苯酞 ( n-butylidenephthalide , Bdph, W333301 ) 及 F127高分子物质 ( Pluronic F127 , P2443 ) 。 将 10毫克丁烯基苯酞与 F127高分子物质以重量比 1 : 1或 1 : 2的比例混 合后， 溶于 2毫升的四氢呋喃 （tetrahydrofuran) ， 再将之加入 10毫升的水中， 而后快速加热去除四氢呋喃， 进行冷冻干燥。 之后， 再回溶于水， 于溶液中乳 化后的丁烯基苯酞微粒大小约为 30〜200nm， 多分散指数（polydispersity index) 为 0.2-0.5。

实施例 4 : 细胞培养

将人类万能干细胞培养于无血清培养基 Essential 8™ ( Life Technology公司， 美国） 中， 并且以 matrigel ^TM 基质胶 （ Becton-Dickinson公司， 美国） 进行贴附 培养。 将培养液吸除， 以磷酸盐缓冲液冲洗细胞 2次后， 加入酵素 Accutase ^TM ( Merck Millipore公司， 美国）反应 2〜5分钟后以培养液中和， 并且将细胞冲刷 下来后打散为小团块， 进行离心 1000rpm、 2分钟， 再吸除上清液， 放入新培养 皿中进行培养约 3〜5天， 进行继代培养， 且在培养期间须每天更换培养液。

实施例 5 : 神经细胞分化

将人类万能干细胞培养至 8-9分满， 以磷酸盐缓冲液冲洗细胞 2次后， 以酵 素 Accutase™作用 2〜5分钟后， 加入培养液稀释酵素， 再将细胞冲洗下来， 打 散至适当大小后以 800rpm的速度进行离心约 2分钟，再将细胞置于含有 20 %替代 血清 (knock out serum replacement, 简禾尔 KSR， Life Technology公司， 美国)的 DMEM-F12培养基， 以无盖培养皿进行悬浮培养 2天， 获得类胚体 （Embryonic body) 悬浮液。

将悬浮的类胚体置于离心管， 待自然沉降后， 去除上清液， 以含有 BiSF小 分子药物的神经诱导培养基进行悬浮培养 2天， 而后， 悬浮的类胚体会出现环状 的上皮细胞结构， 其中， 小分子药物包含有 0.5μΜ的 BIO ( Sigma-Aldrich公司， 美国） 、 10ng/mL的纤维母细胞生长因子 -2 ( FGF-2, Peprotech公司， 美国） 以 及 10μΜ的 SB431542 ( Sigma-Aldrich公司， 美国） ； 神经诱导培养液的成分如下 表 1所示。 表 1 神经诱导培养液的成分

再将类胚体进行沉降后， 放入含有 10ng/mL的纤维母细胞生长因子 -2的神 经基础培养基中进行培养， 其中， 神经基础培养基的成分如下表 2所示。 悬浮 2天后， 待类胚体沉降后， 以外力或酵素 Accutase™将之打散至小团块， 置于 已涂布 l % matrigel ^TM 基质胶超过 1 小时的培养皿中进行细胞贴附。 大约 2〜7 天细胞会贴附、生长并且长出神经构造。而于 细胞生长至 7〜8分满时进行分盘， 其中， 细胞分盘时使用磷酸盐缓冲液冲洗 1 次后， 以磷酸盐缓冲液与酵素 Accutase 以等比例混合的酵素溶液进行作用约 2〜5分钟，再以神经基础培养 基稀释， 而后使用细胞刮勺将细胞刮起并以机械力打散 成为小团块或单细胞， 进行 800〜1000rpm的离心约 2〜5分钟， 再吸除上清液进行贴盘， 并且贴盘时 须加入 10μΜ的 Y27632 ( Stemgent公司， 美国） 1天， 以帮助细胞贴附。

表 2 神经基础培养基的成分

实施例 6: 细胞毒性试验

将人类胚胎干细胞 TW1培养于 Essential 8™培养基中， 并且在继代时分为 三组， 分别于 6孔盘放入 1.2xl 0 ⁵ 的细胞量以下述条件进行培养， 其中， 第一组 为单纯以培养基进行培养；第二组在培养基中 添加未包覆 F127高分子物质的丁 烯基苯酞， 浓度为 10μΜ; 第三组在培养基中添加如实施例 1所制得包覆 F127 高分子物质的丁烯基苯酞， 浓度为 10μΜ。 在培养过程中观察各组细胞型态， 并 且于培养 4〜5天， 进行细胞计数， 每组重复 1〜3次， 结果如图 4所示， 其中， 图 4的结果经单因子变异数分析（one-way ANOVA)及多重比较测定（Tukey's Multiple Comparison Test 分析） 而得， P值小于 0.05， 95 %信心水准， 记号 * 表示在 0.05的显著水准之下， 记号 * *表示在 0.01的显著水准之下。

由图 4的结果可知， 在培养 5天后， 第二组的细胞数量显著少于第一组或 第三组的细胞数量。 由此可知， 丁烯基苯酞会对于细胞具有较高的细胞毒性， 而通过包覆高分子物质 F127得有效减少丁烯基苯酞的细胞毒性。

实施例 7: T21诱导性万能干细胞进行神经细胞分化培养

请参阅实施例 4及图 5， 将 T21诱导性万能干细胞 （T21-iPSCs ) 依据实施 例 2所述进行神经分化， 并且在第 8天进行贴附。 在细胞贴附后第 12天进行免 疫荧光染色分析，用以观察神经干细胞标的， 包含 N-cadherin、 Nestin以及 Pax-6 蛋白质的表现， 结果如图 6至图 8所示。 另观察 T21诱导性万能干细胞进行神 经分化培养后的神经突起生长状况， 在培养第 27天以免疫荧光染色分析， 通过

Tuj-1抗体观察其内如 βΠΙ微管蛋白质 （tubulin) 的成熟神经标记的表现， 结果 如图 9所示。

而免疫荧光染色分析的操作流程如下：将细胞 培养于盖玻片的 4孔培养皿， 进行染色时， 先将细胞培养液吸除后， 以磷酸盐缓冲液冲洗 2次后， 加入 4%的 三聚甲醛 （paraformaldehyde, PFA) 于冰上作用 5分钟进行细胞固定后移除， 再以磷酸盐缓冲液冲洗 3次后， 加入 0.3%的 triton ( PBST)于冰上作用 10分钟 进行打洞， 再以磷酸盐缓冲液冲洗 3 次后， 加入浓度为 5%的马血清进行阻断 (blocking) 1 小时， 吸除液体并加入配置于为浓度 3%马血清的一级抗体， 室 温下作用 4小时或于 4°C反应 16小时。 之后， 吸除一级抗体并以 PBST冲洗液 冲洗 3次， 每次 5分钟。 二级抗体配置于磷酸盐缓冲中， 吸除 PBST后加入二 级抗体并避光作用 1小时后再以 PBST冲洗液冲洗 3次，加入浓度为 l g/mL的 细胞核染剂 DAPI室温避光作用 10分钟， 而后以 PBST冲洗液冲洗 2次， 再以 甘油与磷酸盐缓冲液以等比例混合成的溶液 20(^L浸湿后， 进行挑片， 封片后 在正立荧光显微镜下观察荧光。

由图 6至图 8的结果可知， T21诱导性万能干细胞于神经细胞分化培养第 12天时会表现 N-cadherin、 Nestin及 Pax-6神经干细胞特殊蛋白质， 显示 T21 诱导性万能干细胞以上述培养基进行培养后能 成功分化成为 T21神经细胞。 再 者， 由图 9的结果可知， T21诱导性万能干细胞于经过 27天的培养分化后， 其 具有大量神经突起， 并且能表现为成熟神经标的的 βΠΙ微管蛋白质， 显示 T21 诱导性万能干细胞经过 27天的分化培养化成为成熟的 T21神经细胞。

实施例 8: 神经细胞的 Αβ40表现量 将贴附培养的 T21诱导性万能干细胞所分化的神经细胞进行细 胞计数后， 贴盘于 4孔培养皿中， 每 48小时更换一次培养液， 将每 48小时收集的培养液 保存于 -20°C， 通过酵素连结免疫吸附分析法 （ELISA) 进行 Αβ40表现量的分 析， 并且使用核型正常的人类胚胎干细胞 TW1分化的神经细胞作为控制组， 其 中， 每组试验重复 2或 3次。 分析结果如图 10所示。

而酵素连结免疫吸附分析法的操作流程如下： 以培养缓冲液 （working incubation buffer) 将 ELISA套组的 Αβ标准蛋白进行序列稀释， 用以作为标准 曲线。 将收取的细胞培养液与该培养缓冲液以 1 : 2 的比例进行稀释。 分别取 10( L的标准品溶液及样本放入 96孔盘中， 置于 4°C、 16小时。 吸除液体后， 以 30(^L冲洗孔盘，并且晾干。加入 20(^L的 TMB受质，室温避光反应约 40〜 45分钟后， 读取 620nm的吸光值。

由图 10的结果可知， 于分化第 20天开始， 由 T21诱导性万能干细胞所分 化的神经细胞内 Αβ40表现量开始高于由人类胚胎干细胞 TW1所分化的神经细 胞， 并且在分化第 25天开始出现差异。 详言之， 由 T21诱导性万能干细胞所分 化的神经细胞内 Αβ40表现量， 在分化第 25天时为 105.38pg/mL， 在分化第 30 天时为 155.68pg/mL， 并在分化第 42天时为 264.47pg/mL。

据此可知， 由 T21诱导性万能干细胞所分化的神经细胞内 Αβ40表现量会 随着分化时间增加而显著上升， 因而能作为用以筛选治疗或预防神经退化性疾 病的平台。

实施例 9: 药物筛选

将 T21诱导性万能干细胞进行神经分化培养至第 39天时分为三组，分别给 予不同培养条件后， 再进行培养 3天， 即在第 42天时， 以酵素连结免疫吸附分 析各该组内的 Αβ40浓度， 并且与未进行神经分化培养的 T21诱导性万能干细 胞比较， 结果如图 11所示， 其中， 第一组为未进行神经分化培养的 T21诱导性 万能干细胞； 第二至四组为进行神经分化培养的 T21诱导性万能干细胞， 而第 二组在培养过程中未添加任何药剂，第三组在 培养第 39天时添加 γ分泌素抑制 剂 DAPT, 第四组在培养第 39天时添加 ΙΟμΜ的包覆 F127高分子物质的丁烯 基苯酞。 每组试验进行 2〜3次， 并且以单因子变异数分析及多重比较测定分析 数值是否存在显数差异， 其中， Ρ值小于 0.05， 95 %信心水准， 记号 *表示在 0.05的显著水准之下， 记号 表示在 0.01的显著水准之下。

由图 11 的结果可知， 第一组的 Αβ40浓度显著低于第二组的 Αβ40浓度， 而第三组及第四组的 Αβ40 浓度分别较第二组下降。 由此可知， 本发明所揭丁 烯基苯酞能显著降低神经细胞内的 Αβ40浓度，并且其效果类似于投予 γ分泌素 抑制剂 DAPT。 据此， 本发明所揭丁烯基苯酞确实具有改善或减缓细 胞内累积 过量 β类淀粉样蛋白质的能力， 而能达到治疗或预防神经退化性疾病的功效。

通过上述实验例结果可知， 本发明所揭丁烯基苯酞具有活化 Wnt信息的能 力， 而能确实地达到促进毛发增生的功效， 因此， 本发明所揭丁烯基苯酞或其 类似物能作为于促进毛发生长的外用组合物的 活性成分， 而通过以如喷洒、 涂 抹等方式投予于个体特定部位的皮肤上， 达到促进毛发增生， 同时提升个体外 观的功效， 也能达到避免习知产品对于个体具有副作用的 功效。 再者， 本发明 所揭医药组合物制备方法能以高分子物质作为 药物载体， 减缓或降低丁烯基苯 酞的细胞毒性， 确实能有效提升医药组合物的安全性。 而通过上述方法所制得 的医药组合物确实具有降低细胞内 β类淀粉样蛋白质浓度的功能， 因此， 通过 投予有效量的医药组合物至生物体，能达到治 疗或预防神经退化性疾病的功效。

以上仅是通过各该实施例详细说明本发明， 熟知该技术领域者于不脱离本 发明精神下， 而对于说明书中的实施例所做的任何简单修改 或是变化， 均应为 本案权利要求书所涵摄。

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