« Utilisation de polyphénols du cacao pour le traitement de l' hyperplasie de la prostate, extrait de cacao spécifique et applications »

La présente invention est relative à l' utilisation .de polyphénols du cacao pour le traitement de l' hyperplasie de la prostate, à un extrait de cacao spécifique ainsi qu' aux applications dudit extrait dans les domaines alimentaires et pharmaceutiques . Elle concerne plus précisément l' utilisation de polyphénols du cacao pour le traitement à titre préventif ou curatif de l ' hyperplasie de la prostate, à un extrait polyphénolique de cacao comportant également, notamment, des lipides et/ou des xanthines , dont l' utilisation s' avère particulièrement, efficace contre le cancer de la prostate, contre les troubles cognitifs , en particulier par la modulation du niveau d' expression de la dopamine, contre le stress oxydatif et le cholestérol .

L' hyperplasie de la prostate est une affection caractérisée par une augmentation en volume de la prostate . Cette augmentation en volume peut résulter d' une simple hyperplasie bénigne de la prostate ou correspondre un cancer de la prostate .

L' hyperplasie bénigne de la prostate (HBP) , appelée également adénome de la prostate ou hypertrophie bénigne de la prostate, est caractérisée par une hyperplasie des cellules du stroma et de l' épithélium prostatique .

L' HBP concerne environ 50% des hommes de plus de 50 ans . Dans certains cas , elle peut entraîner des troubles fonctionnels du bas appareil urinaire, en particulier, des troubles mictionnels (obstruction, irritation) . Les traitements auj ourd' hui disponibles sont la phytothérapie, l ' administration d' alpha-bloquants ou d' inhibiteur de la 5 alpha réductase et le traitement chirurgical . On considère

auj ourd' hui qu' un homme de 40 ans a environ 37% de chances d' être opéré d' une HBP s ' il atteint l ' âge de 80 ans .

Les travaux des inventeurs ont permis de démontrer que l' administration d' une composition à base de polyphénols du cacao permet de traiter l' hyperplasie de la prostate en général et plus particulièrement l' HBP.

Selon un premier aspect , l' invention vise donc l' utilisation de polyphénols du cacao pour là préparation d' un médicament pour le traitement de l ' hyperplasie de la prostate . Par « hyperplasie de la prostate », on vise, l' hyperplasie bénigne de la prostate ainsi que l' hyperplasie de la prostate, résultant d' un cancer de la prostate .

Les traitements selon l' invention peuvent avoir pour but de soulager les symptômes de l' hyperplasie, ou être à visée préventive ou curative . ^' Les exemples 1 et 2 démontrent l' activité d' un extrait polyphénolique de cacao dans un traitement préventif et curatif d' hyperplasie induite chimiquement chez le rat .

L' invention propose également des méthodes de traitement thérapeutique comportant l' administration à un patient d' une composition à base de polyphénols du cacao associés à des excipients pharmaceutiquement acceptables afin de prévenir/soulager les symptômes/guérir une hyperplasie de la prostate, qu' elle soit bénigne ou qu' elle résulte d' un cancer de la prostate déj à diagnostiqué . Avantageusement, les polyphénols du cacao introduits dans la composition proviennent d' un extrait polyphénolique de cacao .

Par « extrait polyphénolique de cacao », on entend un extrait obtenu par extraction de fèves de cacao ou de produits dérivés des fèves de cacao, comportant des polyphénols du cacao .

Le médicament obtenu peut être administré seul ou en association avec d' autres médicaments tels que des décongestionnants pelviens , des alpha-bloquants et/ou des

inhibiteurs de la 5-alpha réductase . Le mode d' administration peut être systémique ou topique , de préférence par voie orale, parentérale ( intraveineuse ou sous-cutanée) , rectale ou topique et se présenter par exemple sous la forme de comprimés simples ou dragéifiés , de gélules, de crèmes, pommades , suppositoires solutions inj ectables ou suspensions buvables . Le médicament peut enfin être prescrit en complément d' un traitement chirurgical .

La posologie est adaptable selon la nature et la sévérité de l' affection, le but thérapeutique recherché, la voie d' administration ainsi que le sexe et l' âge du patient .

A titre d' exemple, le médicament peut être administré à une dose de 15 à 30 mg/kg/j our par voie orale, dans le but d' un traitement préventif et à une dose de 40 à 60 mg/kg/j our par voie orale, lorsque le traitement est à visée curative . Ces posologies peuvent avantageusement être le cas échéant administrée en plusieurs prises .

Avantageusement , l ' extrait polyphénolique de cacao utilisé dans le médicament aura la composition suivante : 20 à 50% en masse en équivalent épicatéchine de polyphénols , dont 55% à 80% de flavonoïdes ,

3 à 15% en masse de lipides dont 1 à 15% de β-sitostérol,

5 à 20% en masse de xanthines .

L' extrait selon l' invention peut être utilisé brut ou purifié .

Selon un seconde aspect de l' invention, celle-ci vise également ledit extrait polyphénolique de cacao décrit ci- dessus . En effet , cet extrait est particulièrement efficace dans le traitement d' autres pathologies que l' hyperplasie . La mesure du taux de polyphénols a été effectuée selon la méthode de Folin-Ciocalteu .

L' extrait de cacao selon l' invention contient un taux élevé de polyphénols, notamment de polyphénols ayant une activité antioxydante élevée tel que les flavonoïdes , plus

spécialement, les flavonoïdes tels que la catéchine , 1' épicatéchine et leurs dérivés . Avantageusement, l' extrait selon l' invention comporte de 10 à 30% d' épicatéchine . En outre , l' extrait selon l' invention est particulièrement riche en polyphénols oligomères composés de 1 à 6 monomères .

Par xanthines , on entend principalement la caféine et la théobromine .

Des exemples d' extrait sont donnés dans l' exemple 3, avec référence aux figures 12 et 13. De tels extraits peuvent être obtenus à partir de fèves de différentes origines , de préférence, des fèves originaires du Cameroun, de Tanzanie ou de Côte d' Ivoire .

De manière avantageuse, l' extrait de cacao est obtenu à partir de fèves non fermentées, séchées, puis éventuellement réhumidifiées . Celles-ci sont ensuite nettoyées , décortiquées afin d' obtenir du grain vert . Une extraction dans un mélange éthanol-eau ( 70 : 30 ) est ensuite opérée pendant environ 24 heures sous agitation, avec un ratio cacao/solvant de l' ordre de 1/2 à 1/4. Le j us obtenu est ensuite filtré , rincé, concentré et évaporé à sec . Il est impératif qu' aucune étape de dégraissage ne soit opérée tout au long du procédé .

L' extrait selon l' invention contient donc à la fois du β- sitostérol , des xanthines et des polyphénols . La présence de β-sitostérol permet d' améliorer l' assimilation des polyphénols par l ' organisme . Par ailleurs, le travail des inventeurs a permis de démontrer que contrairement à ce qui était suggéré dans l' art antérieur, la présence de xanthines avec les polyphénols ne nuisait pas à l' activité polyphénolique et permettait au contraire d' apporter des effets avantageux dans certaines applications , en particulier, les applications cognitives .

Selon un troisième aspect, l ' extrait polyphénolique de cacao est utilisé afin de traiter le cancer de la prostate .

Le cancer de la prostate, une tumeur maligne dépendant de l' âge, est la deuxième cause courante de mortalité par cancer chez les hommes aux Etats-Unis et en Europe de l' Ouest . Bien que l' étiologie de ce cancer soit inconnue, plusieurs facteurs de risque incluant l' âge, la race, l' environnement et le régime alimentaire ont été identifiés . D' autres facteurs de risques comprennent des répétitions polymorphiques du gène du récepteur d' androgène et des concentrations élevées d' androgènes en circulation . L' importance de la testostérone dans le développement du cancer de la prostate est soulignée par la découverte selon laquelle le cancer de la prostate survient rarement chez les mâles castrés ou chez les mâles présentant une déficience en 5α-réductase, l' enzyme chargée de convertir la testostérone en son métabolite actif, la dihydrotestostérone . Plusieurs études ont identifié diverses substances alimentaires ayant des propriétés antioxydantes et un effet inhibiteur sur le développement et/ou la progression du cancer de la prostate . Parmi ces substances , les polyphénols sont les antioxydants naturels les plus abondants que l' on trouve dans les fruits , les boissons ( j us de fruits , vin, thé, café, chocolat et bière) et dans une moindre mesure dans les légumes , les légumes secs et les céréales . Ils j ouent un rôle dans diverses maladies associées à un stress oxydatif telles que le cancer, les maladies cardiovasculaires et l' inflammation . Les polyphénols sont des agents réducteurs , et conj ointement à d' autres agents réducteurs alimentaires, tels que la vitamine C, la vitamine E et les caroténoïdes , ils protègent les tissus du corps contre le stress oxydatif . L' importante diversité de leurs structures les rend différents des autres antioxydants et a une incidence sur leurs propriétés biologiques : biodisponibilité, activité antioxydante, interactions spécifiques avec les récepteurs cellulaires et les enzymes... Les polyphénols sont divisés en sous-groupes tels que les isoflavones , les flavonoïdes et les

lignans . On a récemment découvert que plusieurs polyphénols extraits de diverses plantes étaient de puissants inhibiteurs de l' angiogénèse .

Les fèves de cacao ont été identifiées comme une source riche en polyphénols . Les polyphénols de cacao modulent les fonctions immunitaires et la fonction plaquettaire, réduisent l' oxydation des lipoprotéines de faible densité (LDL) , inhibent la croissance des cellules cancéreuses humaines in vi tro et des tumeurs expérimentales in vivo sur les modèles de carcinogénèse multi-organes chez le rat .

Selon un quatrième aspect, l' invention vise donc l' utilisation d' un extrait polyphénolique de cacao tel que décrit ci-dessus , pour la préparation d' un médicament destiné à prévenir et/ou traiter le cancer de la prostate . L' invention vise encore l ' utilisation d' un extrait polyphénolique de cacao tel que décrit ci-dessus, pour la préparation d' un médicament destiné à soulager les symptômes du cancer de la prostate .

Selon un aspect avantageux, l' invention vise encore l' utilisation d' un extrait polyphénolique de cacao tel que décrit ci-dessus , pour inhiber sélectivement la prolifération des cellules tumorales prostatiques humaines, et ceci sans inhiber les cellules saines de prostate humaine .

Ainsi , l' extrait polyphénolique de cacao de l' invention permet par exemple d' inhiber la prolifération des cellules cancéreuses prostatiques 22RvI et DU145, sans inhiber les cellules épithéliales saines de prostate humaine RWEP-I . « 22RvI » représentant la lignée cellulaire cancéreuse humaine de prostate loco-régionale, « DU145 », la lignée cellulaire cancéreuse humaine de prostate issue d' un site métastatique d' origine cérébrale et « RWEPl » la lignée cellulaire humaine saine de prostate .

L' extrait polyphénolique de cacao de l' invention permet d' inhiber les effets du cancer de la prostate chimiquement

induit chez le rat , et à la connaissance des Inventeurs , c' est la première fois que de tels résultats ont pu être obtenus .

La présente invention a encore pour obj et l' utilisation telle que définie ci-dessus de l' extrait polyphénolique de cacao, dans laquelle l' extrait est administré chez un mammifère à des doses allant de 15 à 60 mg/kg/j , de préférence allant de 20 à 40 mg/kg/j .

Plusieurs milliers de polyphénols ont été identifiés dans des plantes , et notamment des plantes consommables , ainsi que dans des boissons . Leur rôle sur la prévention du cancer, 1' ostéoporose ou les maladies coronariennes est actuellement à l' étude . Leurs effets antioxydants et anti-inflammatoires ont été prouvés par plusieurs études in vitro et in vivo . Les flavonoïdes , la plus importante classe de polyphénols , se trouvent dans de nombreux fruits, légumes et boissons .

De nombreuses études épidémiologiques ont montré que la consommation de fruits et de légumes est associé en ordre inversé avec les maladies cardiovasculaires et la mortalité due à des maladies dégénératives . Les polyphénols contenus dans l' alimentation ont des effets biologiques protecteurs et bénéfiques chez les êtres humains en cas de stress oxydant . Un stress oxydant chez des rats exposés à une attaque cardiaque induit une surproduction de radicaux libres en circulation qui nuisent aux performances de la mémoire et de l' apprentissage .

Un déséquilibre entre la formation d' espèces oxydantes réactives et la défense anti-oxydante est appelé stress oxydatif . Des espèces oxydantes réactives sont des radicaux libres incluant un anion superoxydant, du peroxyde d' hydrogène et un radical hydroxyle qui sont normalement produits en faibles quantités . Dans des conditions normales , les charognards de l' organisme comme la dismutase superoxydante et la catalase ont métabolisé ces radicaux libres . Avec la vie moderne, et dans certaines conditions physiopathologiques, les

radicaux libres augmentent les composants cellulaires nuisibles . Les acides gras polyinsaturés , les phospholipides, le cholestérol libre, l ' ADN et de petites molécules sont des cibles de cellules réduisant le nombre de radicaux libres . Selon un cinquième aspect , l' invention vise donc l' utilisation d' un extrait polyphénolique de cacao tel que décrit ci-dessus , pour la préparation d' un médicament destiné à prévenir et/ou traiter les troubles cognitifs . Ainsi , l' invention vise plus particulièrement l' utilisation telle que décrite ci-dessus pour améliorer les capacités d' apprentissage, de mémorisation et d' orientation dans l' espace d' un mammifère .

L' invention vise encore l' utilisation d' un extrait polyphénolique de cacao tel que décrit ci-dessus, pour la préparation d' un médicament destiné à prévenir la surproduction de radicaux libres consécutive à un coup de chaleur .

Pour les applications cognitives , le mode d' administration peut être systémique ou topique, de préférence par voie orale, parentérale (intraveineuse ou sous-cutanée) , rectale ou topique et se présenter par exemple sous la forme de comprimés simples ou dragéifiés, de gélules , de crèmes , pommades , suppositoires , inhalations, solutions inj ectables ou suspensions buvables . Les troubles cognitifs étant induits par une surproduction de radicaux libres , la prévention de la surproduction de radicaux libres permet donc de prévenir l ' apparition desdits troubles cognitifs .

A titre d' exemples de troubles cognitifs , on pourra notamment citer l' hypotension artérielle, l' ischémie cérébrale, les dommages neuronals...

Selon un mode de réalisation avantageux de l' invention, le médicament permettant la prévention de la surproduction de radicaux libres est administré à une dose de Img/kg/j à

lOOmg/kg/j , avant le coup de chaleur ou après le coup de chaleur .

Selon un sixième aspect, l' invention vise donc l ' utilisation de l' extrait polyphénolique de cacao selon l' invention pour stimuler la production de dopamine .

La dopamine est un neurotransmetteur appartenant aux catécholamines . Dans le système nerveux périphérique, elle j oue le rôle d' analeptique circulatoire ( stimulant des fonctions assurant la circulation sanguine) . Au niveau du système nerveux central , elle a un effet globalement stimulant . Elle est en particulier impliquée dans les phénomènes de dépendance, via le système de récompense, et dans le contrôle des fonctions motrices . La maladie de Parkinson est par exemple, un maladie dont la cause est la dégénérescence d' un groupe de neurones produisant la dopamine .

L' accroissement du niveau de dopamine permet de maintenir une pression artérielle déficiente, de conserver une diurèse par vasoconstriction des artères rénales et de traiter les symptômes de la maladie de Parkinson . L' exemple 11 démontre que l' administration par voie orale de 24mg/kg d' un extrait selon l' invention permet de tripler le niveau de dopamine chez les rats .

L' invention propose également des méthodes de traitement thérapeutique comportant l' administration à un patient d' une composition à base d' un extrait polyphénolique de cacao selon l' invention afin de stimuler la production de dopamine . L' administration de cette composition peut en particulier avoir pour obj ectif de prévenir/soulager les symptômes de la maladie de Parkinson, de maintenir une pression artérielle chez des patients présentant une déficience de ladite pression artérielle ou de conserver une diurèse chez des patients présentant des troubles de la diurèse .

Le médicament obtenu peut être administré seul ou en association avec un ou plusieurs autres médicaments . En

particulier, dans le cadre d' un traitement de la maladie de Parkinson, le médicament pourra avantageusement être administré en association avec la L-DOPA, des agonistes dopaminergigues ou des inhibiteurs de la Catéchol-O-Méthyl Transférase .

Le mode d' administration peut être systémique ou topique, de préférence par voie orale , rectale, parentérale (intraveineuse ou sous-cutanée) ou topique et se présenter sous la forme de comprimés simples ou dragéifiés , de gélules , de crèmes , pommades , suppositoires , inhalations , solutions inj ectables ou suspensions buvables .

La posologie est adaptable selon la nature et la sévérité de l' affection, le but thérapeutique recherché, la voie d' administration ainsi que le sexe et l' âge du patient . A titre d' exemple, le médicament peut être administré à une dose de 10 à 30 mg/kg/j our par voie orale . Ces posologies peuvent avantageusement être administrée en plusieurs prises .

Selon un dernier aspect , l' invention vise également l' utilisation de l ' extrait polyphénolique de cacao décrit ci- avant , pour prévenir le stress oxydatif (voir exemple 12 ) .

La présente invention sera plus complètement décrite à l' aide des exemples qui suivent , donnés à titre illustratif, avec référence aux figures : les figures 1 à 5 , relatives au traitement préventif de l' hyperplasie, représentent respectivement le déroulement de l' expérimentation ( fig . l ) , la prise de poids ( fig .2 ) , la prise alimentaire ( fig .3 ) et de boisson ( fig .4 ) et le poids des prostate ( fig .5 ) , les figures 6-11 relatives au traitement curatif de l' hyperplasie , représentent respectivement le déroulement de l' expérimentation ( fig . β) , la prise de poids ( fig .7 ) , la prise alimentaire (fig .8 ) et de boisson ( fig .9 ) et le poids des prostate ( fig .10-11 ) ,

les figures 12 et 13 sont des chromatogrammes d' extraits polyphénoliques de cacao provenant respectivement du Cameroun et de Côte d' Ivoire, les figures 14 à 27 , relatives à l' évaluation de la toxicité d' un extrait polyphénolique de cacao selon l' invention, représentent respectivement, la prise de poids des rats ( figures 14 et 15 ) et les résultats d' analyse réalisées sur les animaux (figures 16 à 27 ) , les figures 28 et 29 , relatives à la détermination de la DL _5O d' un extrait polyphénolique de cacao selon l' invention, représentent respectivement les courbes de poids chez les rats mâles et femelles , les figures 30 à 33 , relatives au cancer de la prostate sur les modèles cellulaires , représente la morphologie des trois lignées cellulaires RWEP-I , 22RvI et DU145 ( fig . 30 ) , la prolifération des cellules RWEP-I , 22RvI et DU145 en fonction de la dose et du temps ( fig . 31 à 33 ) , les figures 34 à 39, relatives au cancer de la prostate sur les modèles de co-cultures , présentent les cultures de lignée saine (RWEP-I ) ( fig . 34a à 34c) , de lignée tumorale ( 22RvI ) ( fig . 35a à 35c) , de co-culture des lignées saine et tumorale ( fig . 36a à 36c) , les résultats du test de prolifération par méthode de relargage du Rouge Neutre ( fig . 37a à 38f) , les résultats de l' immunomarquage sur co-culture après traitement ( fig . 39a à 39e ) , les figures 40 à 42 , relatives à l' effet chimiopréventif de l' extrait chez les rats , représentent les gains de poids corporel des rats ayant subi des traitements différents ( fig . 40 ) , la consommation d' aliments ( fig . 41 ) , la consommation d' eau ( fig . 42 ) , les figures 43 à 52 , relatives aux effets de l' extrait sur le développement des tumeurs chimio-induites , illustrent le changement de poids corporel des rats ( fig .

43 ) , la consommation de nourriture ( fig . 44 ) , consommation d' eau ( fig . 45 ) , l' activité des rats durant les tests TESLA ( fig . 46-50 ) , le test du labyrinthe aquatique de Morris ( fig . 51-52 ) , - les figures 53 à 62 , relatives aux effets de l' extrait sur le développement des tumeurs chimio-induites, illustrent le changement de poids corporel des rats ( fig . 53 ) , la consommation de nourriture (fig - 54 ) , consommation d' eau ( fig . 55 ) , l' activité des rats durant les tests TESLA ( fig . 56-58 ) , le test du labyrinthe aquatique de Morris ( fig . 59-60 ) , le dosage de la dopamine ( fig . 61 et 62 ) , et, les figures 63 à 66, relatives aux effets d' un extrait polyphénolique de cacao, en traitement préventif sur le développement de tumeurs prostatiques chimio-induites , sur les performances cognitives et sur la dopamine, présentent les résultats obtenus sur les tests de TESLA ( fig . 63 et 64 ) , de Morris (fig . 65 ) et le dosage de la dopamine ( fig . 66) . Exemple 1 : Evaluation des effets d' un extrait polyphénolique de cacao en traitement préventif sur le développement d' hyperplasie de la prostate

1. Matériels et méthodes Animaux : . 48 rats mâles Wistar-ϋnilever de 260-27Og en conditions contrôlées de température (22+/-2 °C) , d' humidité (50+/-10% ) , en cycle de lumière inversé de 12h ( lumière de 8h à 2Oh) , nourriture et boisson ad libi tum. Traitements : Utilisation d' un extrait polyphénolique de cacao (EPC) administré quotidiennement par voie orale aux doses de 24 ou 48 mg/kg pendant 5 semaines .

Déroulement de l' expérimentation (voir figure 1 ) :

L' hyperplasie bénigne de la prostate est induite par inj ection sous-cutanée quotidienne pendant 3 semaines (J14 à J35 ) de 2 mg/rat de propionate de testostérone (TP) en solution dans de l' huile de germe de maïs .

Le suivi des paramètres est effectué par le contrôle quotidien de la survie des animaux, la pesée des animaux 3 fois par semaine et le suivi quotidien des prises alimentaire et de boisson .

Le sacrifice des animaux est réalisé au bout de 5 semaines après le début des traitements avec l' EPC . La prostate est prélevée et pesée ( 3 pesées successives ) .

2. Résultats Poids des animaux ( Figure 2 )

Le traitement des rats avec l' EPC à 24 ou 48 mg/kg a permis de maintenir une prise de poids régulière tout au long de l' expérimentation . Cependant la dose de 48 mg/kg a limité de façon plus importante cette prise de poids . Prise alimentaire ( Figure 3 )

Le traitement des rats avec l' EPC à 24 ou 48 mg/kg a permis de maintenir une prise alimentaire comparable à celle du groupe "Contrôle/Véhicule" tout au long de l' expérimentation, limitant de ce fait la baisse de la prise alimentaire induite par l' induction de l' hyperplasie de la prostate observée pour le groupe "TP/Véhicule" . Prise de boisson ( Figure 4 )

Le traitement des rats avec l' EPC à 24 ou 48 mg/kg a permis de limiter l' augmentation de prise de boisson liée aux inj ections sous-cutanée de testostérone observée pour le

groupe "TP/Véhicule" , limitant de ce fait les effets de l' induction de l' hyperplasie- de la prostate . Poids des prostates ( Figure 5 )

Le traitement des rats avec l' EPC est dose dépendant : la dose de 24 mg/kg et surtout celle de 48 mg/kg ont permis de limiter l' augmentation de poids de la prostate constatée pour les rats du groupe "TP/Véhicule" qui est liée aux inj ections sous-cutanée de testostérone, limitant de ce fait très fortement les effets de l' induction de 1 ' hyperplasie de la prostate .

3. Conclusion

Le prétraitement des rats avec l' EPC à 24 ou 48 mg/kg a permis de limiter les effets de l' induction de l' hyperplasie de la prostate de manière dose dépendante . La meilleure efficacité observée dans les conditions de l' expérience correspond à la dose de 48 mg/kg .

Cette dose de 48 mg/kg semble cependant être relativement forte puisqu' elle a également limité la prise de poids des animaux à partir de la phase de prétraitement . Etant donné les effets observés sur la réduction du poids des prostates , cette dose est proche d' une dose thérapeutique .

Exemple 2 : Evaluation des effets d/ un extrait polyphénolique de cacao en traitement curatif sur le développement d' hyperplasie de la prostate 1. Matériels et méthodes Animaux :

48 rats mâles Wistar-Unilever de 280-30Og en conditions contrôlées de température (22+/-2 ⁰ C) , d' humidité ( 50+/-10% ) , en cycle de lumière inversé de 12h (lumière de 9h à 2Ih) , nourriture et boisson ad libi tum. Traitements :

Utilisation d' un extrait polyphénolique de cacao (EPC) administré quotidiennement par voie orale aux doses de 24 ou 48 mg/kg pendant 2 semaines (J22 à J36 ) .

Groupe Traitement Dose

Contrôle + véhicule Véhicule —

TP + véhicule Véhicule -

TP + EPC 24 EPC 24 mg/kg, P .0.

TP + EPC 48 EPC 48 mg/kg, P .0.

Déroulement de l ' expérimentation (voir figure 6) :

L' hyperplasie bénigne de la prostate est induite par inj ection sous-cutanée quotidienne pendant 3 semaines (J15 à J36) de 2 mg/rat de propionate de testostérone ( PT) en solution dans de l' huile de germe de maïs .

Le suivi des paramètres est effectué par le contrôle quotidien de la survie des animaux, la pesée des animaux 3 fois par semaine et le suivi quotidien des prises alimentaire et de boisson .

Le dosage de la DHT (dihydrotestostérone) est réalisé selon le protocole suivant :

Prélèvement de 7 à 8 ml de sang à l' aorte abdominale sur l' ensemble des animaux j uste avant le sacrifice à J36, - Récupération de 2 , 5 à 4 , 5 ml de sérum et congélation à -20 ⁰ C,

Dosages de DHT réalisés par l' I . R. E . M . à Paris . Le sacrifice des animaux est réalisé au bout de 2 semaines après le début des traitements avec l' EPC, immédiatement après le prélèvement de sang . La prostate est prélevée et pesée ( 3 pesées successives ) . 2. Résultats

Poids des animaux ( Figure 7 )

Le poids moyen des rats du groupe "Contrôle/Véhicule" a augmenté de façon régulière tout au long de l' expérimentation . Celui des rats du groupe "TP/Véhicule" a augmenté de façon régulière jusqu' au 20 ^eme j our de traitement puis il s' est stabilisé et a légèrement diminué pendant les 15 derniers jours de l' expérimentation . Le poids moyen des rats du groupe

"TP/EPC 24 mg/kg" a également augmenté de façon régulière j usqu' au 20 ^ème j our de traitement , puis il s ' est stabilisé et a légèrement diminué pendant les 15 derniers j ours de l ' expérimentation, mais moins que pour le groupe "TP/Véhicule" . Le poids moyen des rats du groupe "TP/EPC 48 mg/kg" a quant à lui augmenté de façon régulière jusqu' au 20 ^èrtιe j our de traitement puis il s' est stabilisé et il a augmenté de nouveau pendant les 10 derniers j ours de l' expérimentation . Le poids moyen des rats du groupe "TP/EPC 48 mg/kg" a plus augmenté que celui des rats du groupe "TP/EPC 24 mg/kg" .

Le traitement des rats avec l ' EPC à 48 mg/kg a permis de maintenir une prise de poids plus régulière tout au long de 1 ' expérimentation .

Prise alimentaire ( Figure 8 ) La prise alimentaire moyenne des 4 groupes de rats "Contrôle/Véhicule" , "TP/EPC 24 mg/kg" , "TP/EPC 48 mg/kg" et "TP/Véhicule" a été identique durant les 2 premières semaines de l' expérimentation, avant induction de l' hyperplasie bénigne de la prostate . La baisse observée est normale puisque les valeurs correspondent à la moyenne des rapports entre la prise alimentaire et le poids des animaux . Les animaux mangent à peu près la même quantité du régime, mais ils grossissent , d' où une baisse de ce ratio . La prise alimentaire moyenne des groupes "TP/EPC 24 mg/kg" , "TP/EPC 48 mg/kg" et "TP/Véhicule" a diminué de façon significative par rapport au groupe "Contrôle/Véhicule" après le début de l' induction de 1 ' hyperplasie de la prostate et a également diminué de façon significative pour l' ensemble des groupes après le début des traitements PO, principalement pour le groupe "TP/Véhicule" et moins fortement pour les 2 groupes "TP/EPC 24 mg/kg" et surtout "TP/EPC 48 mg/kg" . Durant la dernière semaine de traitement, la prise alimentaire moyenne du groupe "TP/EPC 48 mg/kg" a augmenté de façon plus importante que pour les 3

autres groupes . (Les traitements statistiques restent à faire) .

Le traitement des rats avec l' EPC à 48 mg/kg a permis de maintenir une prise alimentaire moyenne plus proche de celle du groupe "Contrôle/Véhicule" tout au long de l ' expérimentation, limitant de ce fait les effets induits par l' induction de l' hyperplasie de la prostate observés au niveau du groupe "TP/Véhicule" .

Prise de boisson ( Figure 9 ) La prise de boisson moyenne des 4 groupes de rats "Contrôle/Véhicule" , "TP/EPC 24 mg/kg" , "TP/EPC 48 mg/kg" et "TP/Véhicule" a été identique durant les 2 premières semaines de l' expérimentation, avant induction de l' hyperplasie bénigne de la prostate . Après le début de l' induction de l' hyperplasie de la prostate , la prise de boisson moyenne des groupes "TP/EPC 24 mg/kg" , "TP/EPC 48 mg/kg" et "TP/Véhicule" a augmenté de façon significative par rapport au groupe "Contrôle/Véhicule" . La prise de boisson moyenne des 2 groupes "TP/EPC 24 mg/kg" et surtout "TP/Véhicule" a continué d' augmenter durant les 3 semaines d' inj ection SC de testostérone et durant les 2 semaines de traitement PO avec l ' EPC ou le véhicule, alors qu' elle a diminué durant la dernière semaine de traitement PO pour le groupe "TP/EPC 48 mg/kg" pour se rapprocher de celle du groupe "Contrôle/Véhicule" . (Les traitements statistiques restent à faire) .

Le traitement des rats avec l' EPC à 48 mg/kg a permis de limiter l' augmentation de prise de boisson moyenne constatée pour les rats des groupes "TP/Véhicule" et "TP/EPC 24 mg/kg" liée aux inj ections sous-cutanées ( SC) de testostérone , limitant de ce fait les effets de l' induction de l' hyperplasie de la prostate .

Poids des prostates (Figures 10 et 11 )

Le poids moyen des prostates des rats du groupe

"TP/Véhicule" ( 2 , 26 g/kg poids corporel ) est significativement plus élevé que celui des rats des groupes "TP/EPC 24 mg/kg"

( 2 , 06 g/kg poids corporel ) , "TP/EPC 48 mg/kg" ( 1 , 55 g/kg poids corporel ) et "Contrôle/Véhicule" ( 1 , 31 g/kg poids corporel ) .

Le poids moyen des prostates des rats des 2 groupes "TP/EPC 24 mg/kg" et "TP/EPC 48 mg/kg" est également significativement plus élevé que celui des rats du groupe "Contrôle/Véhicule" mais il est plus faible que celui des rats du groupe "TP/Véhicule" , surtout pour le groupe "TP/EPC 48 mg/kg" .

On observe également que le poids moyen des prostates des rats du groupe "TP/EPC 48 mg/kg" est significativement plus bas que celui des rats du groupe "TP/EPC 24 mg/kg" ( P < 0 , 0001 ) .

Le traitement des rats avec l ' EPC à la dose de 48 mg/kg a permis de limiter fortement l ' augmentation de prise de poids moyenne de la prostate constatée pour les rats du groupe "TP/Véhicule" qui est liée aux inj ections SC de testostérone , limitant de ce fait très fortement les effets de l ' induction de l ' hyperplasie de la prostate . 3. Conclusion

Le traitement de rats avec une hyperplasie de la prostate déj à présente avec l ' EPC à la dose de 48 mg/kg a permis de limiter les effets de cette pathologie .

Exemple 3 : Exemple d' extraits polyphénoliques de cacao Analyse extrait polyphénolique de cacao

Paramètres Unités Résultats Méthodes

Amidon % <0 , 5 Kit enzymatique

Caféine mg/lOOg 759 HPLC/UV

Cellulose % 0 , 2 WENDE

Cendres % 4 , 9 Arrêté du 16/10 /75

Fibres solubles et insolubles AOAC 985-29

Fibres solubles % 0 , 7

Fibres insolubles % 3, 3

Humidité % 3 , 7 Arrêté du 16/10 /75

Magnésium mg/lO Og 242 Ar .8 , 9 , 77 (MO0.147 )

Matières grasses totale % 13 , 9 Arrêté du 16/10 /75

Phosphore mg/lOOg 197 Arrêté du 08/09/77

Polyphénols totaux % 36 , 9 Méthode de Folin-Ciocalteu

Potassium mg/lOOg 1984 Ar .8.9.77 (MO0147 )

Protéines (Nx6 , 25 ) % 31 , 1 DUMAS

Sodium mg/lOOg 21 Ar .8.9.77 (MO0147 )

Substances pectiques

( en acide galacturonique ) % >1 , 5 NF V 05-128

Sucres HPLC/Réfractométrie

Fructose % 1 , 4

Glucose % 1 , 2

Saccharose % 10 , 4

Maltose % 0 , 6

Lactose % <0 , 5

Théobromine ( sur chocolat ) % 12 , 25 HPLC/UV

Vitamine A (Rétinol ) μg/lOOg <20 NF V18-401 ( 1987 )

Vitamine Bl

(Thiamine ) mg/lO Og <0 , 10 Arrêté du 12.01.99

Vitamine B12

( Cyanocobolamine ) μg/lOOg 0 , 6 AOAC 952-20 ( 1990 )

Vitamine B2

( Riboflavine ) mg/lOOg 0 , 4 Arrêté du 12.01.99

Vitamine B5 (Acide panthothénique) mg/lOOg 3, 2 AOAC 945-74 (1990)

Vitamine B6 ME 0099

( Pyridoxine ) mg/ lOOg <0 , l (HPLC/Fluorimétrie)

Vitamine C mg/lOOg <1 HPLC/UV

Vitamine D3 μg/lO Og <0 , 4 HPLC/UV

Vitamine E (dl alpha tocophérol ) mg/lOOg 1 , 9 NF V18-402 ( 87 )

Vitamine H (Biotine ) μg/lOOg <1 HPLC

Vitamine Kl μg/lOOg 6 , 58 HPLC

Paramètres Unités Résultats Méthodes

Vitamine K3 mg/100

(Ménadione ) g <0 , 40 CEE 5ème directive

Vitamine PP mg/100

(Niacine ) g 3 , 6 HPLC

Vitamine B9 totale μg/100

(Acide folique ) g 79 Pr EN14131

Hemicellulose % <0 , 2 Interne

Lignine % 1, 0 Interne

- METAUX mg/100

Calcium g 4 Ar .8.9.77 (MO0147 )

- MYCOTOXINES

Ochratoxine A μg/kg <l , 0 Mc 155 HPLC/FLUO

Composition d' un extrait polyphénolique du Cameroun

Humidité ( % en masse) 3.62 %

Supplémentation de l' alimentation à l ' aide d' un extrait selon l' invention

Composition polyphénolique moyenne d' extrait de cacao

Flavonoïdes 68%

Autres polyphénols 30%

Doses j ournalières recommandées en : ^op C 125mg/j our/personne Soit 1, 79 mg/j our/kg

Flavonoïdes 150mg/j our/personne Soit 2, 15 mg/jour/kg

OPC : Oligomère proanthocyanidine (à vérifier)

Les rats faisant en moyenne 350g, on doit donner à chaque rat :

OPC 0 , 63 mg/j our

Flavonoïdes 0 , 75 mg/j our

En tenant compte de la composition polyphénolique d' extrait de cacao :

- 2 , 10 mg de polyphénol pur pour atteindre la dose en OPC, recommandée,

1 , 10 mg de polyphénol pur pour atteindre la dose en épicatéchine recommandée .

Une quantité de 3mg/j our/rat de polyphénols purs peut être choisie afin de respecter la dose j ournalière recommandée pour chaque type de polyphénols . 2 Extraits spécifiques :

Extrait polyphénolique Côte d' Ivoire riche en β-sitostérol : 37 , 45% de polyphénols .

Extrait polyphénolique (Cameroun) : 35 , 5% de polyphénols . Dans le premier cas, il faut donner 8 mg/jour/rat de l' extrait Côte d' Ivoire . Dans le deuxième cas il faut donner 8 , 5 mg/jour/rat de l' extrait Cameroun .

Un chromâtogramme de chacun de ces deux extraits est donné en figures 12 et 13.

Analyse des polyphénols (oligomères)

Exemple 4 : Evaluation de la toxicité d' un extrait polyphénoloique de cacao (EPC) 1. Matériels et méthodes

Animaux :

30 rats adultes mâles et 30 rats femelles Wistar, 120-130 g, Conditions contrôlées de température ( 22+2 ⁰ C) , humidité ( 50+10% ) , cycle de lumière inversé de 12 h ( lumière de 8 h à 20 h) , nourriture et boisson ad libitum . Traitements :

Extrait polyphénolique de cacao (EPC) administré pendant 28 j ours par voie orale aux doses de 50 ( FaD) , 200 ( DI ) ou 800 ( FoD et Fod Sat ) mg/kg .

Traitement Rats mâles Rats femelles

Véhicule 6 rats 6 rats

EPC 50 mg/kg 6 rats 6 rats

EPC 200 mg/kg 6 rats 6 rats

EPC 800 mg/kg 12 rats 12 rats

Suivi des animaux :

Examen clinique quotidien de l' ensemble des animaux avant traitement ,

Contrôles quotidiens de la survie des animaux après traitement , Pesée des animaux 3 fois par semaine pendant 4 à 6 semaines .

Sacrifice, prélèvements et autopsie des animaux :

Sacrifice de la moitié des animaux après 28 j ours d' administration orale quotidienne d' EPC aux doses de 50 , 200 ou 8000 mk/kg et de l' autre moitié 15 j ours après la dernière administration d' EPC à ces mêmes doses ,

Prélèvements de sang pour analyses hématologiques et biochimiques ,

Autopsie complète de l' ensemble des animaux et prélèvements de 4 à 20 organes par rat pour analyses histopathologiques . 2.Résultats Mortalité des animaux . Aucune mortalité observée chez les rats mâles et chez les rats femelles après administrations orales répétées d' EPC aux doses de 50 , 200 et 800 mg/kg .

Poids des animaux ( figures 14 et 15 )

. Aucune perte de poids observée chez les rats mâles et chez les rats femelles après administrations orales répétées d' EPC aux doses de 50 , 200 et 800 mg/kg .

Comportement des animaux

. Aucun comportement étrange observé chez les rats mâles et chez les rats femelles après administrations orales répétées d' EPC aux doses de 50 , 200 et 800 mg/kg .

Autopsie des animaux ( figures 16 à 27 )

. Aucun signe de toxicité macroscopique observé chez les rats mâles et chez les rats femelles après administrations orales répétées d' EPC aux doses de 50 , 200 et 800 mg/kg . 3. Conclusion

=> Après 28 j ours d' administration orale d' EPC : - pas de toxicité pour les doses de 50 et 200 mg/kg dans les 2 sexes mais au contraire immunostimulation (augmentation du poids de la rate et du thymus ) , - effet toxiques pour la dose de 800 mg/kg dans les 2 sexes : augmentation du taux d' ASAT et diminution de l' ALAT et du poids du foie

=> 15 j ours après la dernière administration orale d' EPC : pas de toxicité pour les doses de 50 et 200 mg/kg dans les 2 sexes, plus de toxicité pour la dose de 500 mg/kg dans les 2 sexes = réversibilité des effets toxiques observés pour cette dose après 28 j ours d' administration orale d' EPC .

Exemple 5 : Détermination de la DL ₅₀ d' un extrait polyphénolique de cacao (EPC) chez des rats 1. Matériels et méthodes

Animaux : 18 rats adultes mâles et 18 rats femelles Wistar, 150-175 g,

Conditions contrôlées de température ( 22±2 °C) , humidité ( 50+10% ) , cycle de lumière inversé de 12 h (lumière de 8 h à 20 h) , nourriture et boisson ad libitum . Traitements : Extrait Polyphénolique de Cacao (EPC) administré par voie orale à la dose de 2g/kg = dose limite selon les normes OCDE .

Traitement Rats mâles Rats femelles

6 rats 6 rats

Véhicule 6 rats 6 rats EPC 2g/kg 6 rats 6 rats

Procédure expérimentale : Animaux placés à j eun la veille de l' administration d' EPC,

Animaux pesés j uste avant l' administration d' EPC,

Administration orale d' EPC à la dose de 2g/kg,

Animaux maintenus à j eun pendant 3 heures après administration orale d' EPC . Suivi des animaux :

Examen clinique quotidien de l' ensemble des animaux avant traitement,

Contrôles quotidiens de la survie des animaux après traitement, Pesée des animaux 3 fois par semaine pendant 2 semaines .

Sacrifice et autopsie des animaux :

Sacrifice des animaux 14 j ours après administration orale unique d' EPC à la dose de 2 g/kg ,

Autopsie complète de l ' ensemble des animaux .

2.Résultats

Mortalité des animaux

. Aucune mortalité observée chez les rats mâles et chez les femelles après administration orale unique d' EPC à la dose de 2 g/kg .

Poids des animaux

. Aucune perte de poids observée chez les rats mâles et chez les rats femelles après administration orale unique d' EPC à la dose de 2 g/kg . Autopsie des animaux

. Aucun signe de toxicité macroscopique observé chez les rats mâles et chez les rats femelles après administration orale unique d' EPC à la dose de 2 g/kg .

3. Conclusion ->La DL ₅₀ de l ' EPC ne peut donc pas être déterminée selon les normes de l' OCDE .

L' EPC en administration orale unique n' est donc pas toxique .

4. Matériels et méthodes Animaux :

. 6 rats mâles (290-300 g) et 6 rats femelles ( 200-210 g)

Wistar du groupe contrôle,

Conditions contrôlées de température ( 22±2 °C) , humidité

( 50+10% ) , cycle de lumière inversé de 12 h (lumière de 8 h à 20 h) , nourriture et boisson ad libitum .

Traitements :

Extrait Polyphénolique de Cacao (EPC) administré par voie orale à la dose de 4 g/kg = 2 fois la dose limite recommandée par l ' OCDE .

Traitements Rats mâles Rats femelles

EPC 4 g/kg 6 rats 6 rats

Procédure expérimentale :

. Animaux placés à j eun la veille de l' administration d' EPC,

. Animaux pesés j uste avant l' administration d' EPC,

. Administration orale d' EPC à la dose de 4 g/kg,

. Animaux maintenus à j eun pendant 3 heures après administration orale d' EPC .

Suivi des animaux :

. Examen clinique quotidien de l' ensemble des animaux avant traitement,

. Contrôles quotidiens de la survie des animaux après traitement,

. Pesée des animaux 3 fois par semaine pendant 2 semaines .

Sacrifice et autopsie des animaux :

. Sacrifice des animaux 14 j ours après administration orale unique d' EPC à la dose de 4 g/kg, . Autopsie complète de l' ensemble des animaux .

5. Résultats Mortalité des animaux :

Aucune mortalité observée chez les rats mâles, mais 67% ( 4 /6 ) de mortalité chez les rats femelles après administration orale unique d' EPC à la dose de 4 g/kg . Poids des animaux ( figures 28 et 29 )

. Légère perte de poids observée chez les rats mâles et chez les rats femelles survivants ( ~10 g en moyenne dans les 2 cas ) après administration orale unique d' EPC à la dose de 4g/kg . Comportement des animaux :

. Aucun comportement étrange observé chez les rats mâles et chez les rats femelles survivants après administrations orale unique d' EPC à la dose de 4g/kg . Autopsie des animaux : . Aucun signe de toxicité macroscopique observé chez les rats mâles et chez les rats femelles survivants après administration orale unique d' EPC à la dose de 4 g/kg .

6. Conclusion

7

La DL50 de l' EPC n' a pas été atteinte chez les rats mâles et est donc supérieure à 4 g/kg . L' EPC en administration orale unique n' est donc pas toxique chez le rat mâle j usqu' à la dose de 4 g/kg au moins . La DL ₅₀ de l' EPC a été atteinte et même dépassée chez les rats femelles et est donc comprise entre 2 et 4g/kg .

EXEMPLE 6 : Cancer de la prostate sur les modèles cellulaires

Effets in vi tro de polyphénols de cacao et de β-sitostérol sur la croissance de cellules prostatiques humaines cancéreuses et normales .

Les propriétés anti-prolifératives des polyphénols d ' extraits de cacao ont été étudiées sur des cellules du colon humaines cancéreuses , mais pas sur des cellules prostatiques humaines cancéreuses ou normales .

Les effets de différents extraits de polyphénols de cacao provenant de différents pays , tels que définis ci-dessus, ont donc été examinés , seuls ou combinés à du β-sitostérol, sur la croissance de cellules prostatiques humaines cancéreuses (cellules DU145 et 22RvI ) et normales (cellules RWEP-I ) .

Les résultats obtenus dans cette étude in vitro montrent que certains polyphénols provenant de pays spécifiques réduisent la prolifération cellulaire d ' une manière qui dépend de la dose et du temps , et que d ' autres polyphénols inhibent la croissance des cellules d ' une manière dose-dépendante .

L ' origine des polyphénols est un facteur important pour l ' efficacité de ces composés . En outre, les extraits de cacao testés sont plus efficaces sur les cellules sensibles aux androgènes (cellules 22RvI ) que sur les cellules non sensibles aux androgènes ( cellules DU145 ) . Il semble donc que des interactions existent entre les polyphénols et les récepteurs stéroïdiens intracellulaires .

Les résultats obtenus montrent que les polyphénols et le β-sitostérol ont un effet anti-prolifératif sur la croissance des cellules prostatiques cancéreuses .

L' effet des polyphénols et du β-sitostérol a été testé sur la croissance des cellules RWEP-I et 22RvI en fonction de la dose, et sur la croissance des cellules DU145 en fonction de la dose et du temps .

Chaque produit ( 1 à 5 ) a été appliqué pendant 1 à 72 heures , à différentes concentrations . Le nombre de cellules a été comparé à un témoin, à savoir des cellules cultivées en l ' absence du composé testé .

Le tableau 1 ci-dessous illustre la concentration finale d' extraits de cacao et de β-sitostérol pour chaque produit testé sur les cellules prostatiques DU145 , 22RvI et RWEP-I .

TABLEAU I.

Produit 1 Produit 2 Produit 3 Produit 4 Produit 5

[β-sitosterol]" Extrait' [β-sitosterol] Extrait [β-sitosterol] Extrait Extrait [β-sitosteiol]

2 10 ² 0,2 1,6 10-* 0,2 1 10 ^"1 0,2 0,2 I ₁ I O ^"1

1 10" 0,1 8 10° 0,1 0,5 10 ^"1 0,1 0,1 0,5 10 ^"1

5 10 ⁴ 0,05 4 10 ^" ' 0,05 2,5 10 ⁴ 0,05 0,05 2,5 10 ⁴

2,5 î O ^"4 0,025 2 I0- ¹ 0,025 1,2 10 ⁴ 0,025 0,025 1,2 10 ⁴

1,2 10 ⁴ 0,0125 1 10" 0,0125 0,6 10 ⁴ 0,0125 0,0125 0,6 10 ⁴

6,2 10 " 0,00625 5 10 ⁴¹ 0,00625 3 10 ^" ' 0,00625 0,00625 3 10 ^" '

3,1 10° 0,003125 2,5 10* 0,003125 1,5 10" 0,003125 0,003125 1,5 10 '

1,5 10" 0,001562 1 ,25 IQ- ⁶ 0,001562 7,5 IQ-* 0,001562 0,001562 7,5 î O* a valeurs en %

A) MATERIELS ET METHODES

Lignées cellulaires et conditions de culture

Les cellules humaines de carcinome prostatique DU145 et 22RvI ont été fournies par 1 ' American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, Maryland) . Les cellules DU145 proviennent d ' un site métastatique cérébral et elles ne sont pas sensibles aux androgènes . Les cellules 22RvI proviennent d' un carcinome prostatique et elles sont sensibles aux androgènes . Les cellules ont été maintenues sous la forme d ' une culture monocouche selon les techniques habituelles , dans des flacons

de 75 cm ³ (Corning) , à 37 ⁰ C, dans une atmosphère à 5% de CO ₂ et à 95% d ' humidité, dans un milieu RPMI-1640 exempt de rouge de phénol additionné de 10% de sérum de veau fœtal inactivé par chauffage et de 1% de L-glutamine . Le milieu RPMI-1640 , le sérum de veau fœtal et la L- glutamine ont été fournis par de Gibco BRL (Cergy Pontoise, France ) . Les cultures de cellules ont été repiquées tous les 5 j ours pour garantir une croissance exponentielle . Les cellules prostatiques humaines normales RWEP-I ont été fournies par 1 ' American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, Maryland) . Les cellules ont été maintenues sous la forme d ' une culture monocouche selon les techniques habituelles , dans des flacons de 75 cm ³ , à 37 ⁰ C, dans une atmosphère à 5% de CO ₂ et à 95% d ' humidité, dans un milieu exempt de sérum, de kératinocytes , additionné de 2 , 5 μg d ' EGF humain recombiné et de 25 mg d ' extrait pituitaire de veau . Le milieu a été fourni par Gibco BRL (Cergy Pontoise , France) .

Préparation des milieux additionnés des produits testés Cinq produits ont été testés pour cette étude et ont été conservés à l ' abri de la lumière, à +4 ⁰ C . Le β-sitostérol (produit 1 ) , obtenu auprès de Sigma Chemicals , a d' abord été dissous dans de 1 ' éthanol absolu, j usqu ' à une concentration finale de 24 , 1 mM . Le produit 2 , fourni par Barry Callebaut , France , est un extrait dégraissé de cacao contenant 35 , 5% de polyphénols et 0 , 081% de β-sitostérol . Le produit 3 a été reconstitué à partir des produits 1 et 2 et contient 35, 5% de polyphénols et 0 , 72% de β-sitostérol . Les produits 4 et 5 ont été fabriqués par Barry Callebaut, France . La composition du produit 4 est inconnue et ne contient pas de β-sitostérol . Le produit 5 contient 35, 27% de polyphénols et 0 , 72% de β- sitostérol . Les produits 2 , 3 , 4 et 5 ont d' abord été dissous dans un milieu complet . En ce qui concerne les produits 2 , 4 et 5 , les polyphénols totaux des extraits de cacao proviennent de différents pays .

Juste avant utilisation, les concentrations finales de produits (tableau 1) utilisées sont préparées pour les différentes expériences à partir de solutions mères, en diluant la solution mère dans du milieu complet . 64 , 2 μM de β- sitostérol est la dose maximale utilisée dans cette gamme de solubilité et dans la gamme physiologique ( 4 à 70 μM) . L ' éthanol absolu est à une concentration constante de 0 , 26% dans le témoin à base de solvant, dans le témoin négatif et dans les huit concentrations testées . Les rapports du β- sitostérol et des polyphénols pour les produits 2 , 3 et 5 sont les suivants : Produit 2 : 2 : 1000 Produit 3 : 2 : 100 Produit 5 : 2 : 100 Essais de croissance et de viabilité cellulaire

Les cellules ont été ensemencées sur des plaques à 96 puits à une densité initiale de 15 000 cellules/puits pour DU145 , à une densité initiale de 30 000 cellules/puits pour 22RvI et à une densité initiale de 25 000 cellules/puits pour RWEP-I , avec 200 μL de milieu par puits . La densité cellulaire a été optimisée en fonction du temps nécessaire au doublement de la population de cellules , afin d' obtenir une mesure significative de la Densité Optique ( DO) et de pouvoir comparer les différentes lignées cellulaires . Au bout de 24 heures, afin de garantir une fixation uniforme des cellules dès le début des expériences, les produits ont été aj outés à la culture de cellules à différentes concentrations et à différents moments . Après incubation avec les produits , la croissance et la viabilité des cellules a été mesurée à l ' aide de Rouge Neutre (RN) et de Suiforhodamine B ( SRB) combinés ( In Cytotox, Vandoeuvre, France) . L ' absorption du colorant RN vital a été utilisée par les lysosomes/endosorαes et par les vacuoles des cellules vivantes en tant qu ' indication quantitative du nombre et de la viabilité des cellules après

traitement avec un test chimique . Le colorant SRB anionique a permis de quantifier les cellules viables par une mesure de la teneur en protéines des cellules .

La cytotoxicité a été évaluée à 1 , 3, 6, 24 , 48 et 72 heures après avoir incubé les cellules 22RvI , RWEP-I et DU145 avec les produits . Les cellules ont été lavées avec 200 μL de solution de lavage afin d' éliminer le milieu de culture additionné des produits . 200 μL de milieu à base de Rouge Neutre a été aj outé et incubé avec les cellules à 37 ⁰ C pendant 3 heures . Le milieu à base de Rouge Neutre a ensuite été éliminé et les cellules ont été lavées deux fois avec du sérum physiologique tamponné aux phosphates ( PBS) . Les cellules ont été fixées pendant 1 minute avec 200 μL de solution fixatrice . 200 μL d ' une solution de désorption a été aj outée pour extraire le Rouge Neutre des cellules . Après 15 minutes à température ambiante, la DO, qui reflète le nombre de cellules viables, a été déterminé à 540 nm avec un filtre de référence à 690 nm, en utilisant un lecteur de microplaques (Genios , Tecan SA, France ) . Ensuite, les cellules ont été lavées quatre fois avec du PBS . 50 μL de solution de SRB à 0 , 4% a été aj outé à la culture et, 1 heure plus tard, les monocouches ont été lavées avec 200 μL de solution de rinçage pour éliminer le colorant non lié . 200 μL de solution de solubilisation ont ensuite été incubées avec les cellules pour extraire la SRB des cellules . Après une nuit d ' incubation à température ambiante, les plaques ont été lues à 540 nm avec un filtre de référence à 690 nm. Chaque expérience a été réalisée trois fois afin d' obtenir 18 valeurs par condition d " essai . Morphologie

Pour documenter les changements de morphologie et de croissance des cellules observés pendant le traitement, les cellules additionnées des concentrations maximales de chaque produit ont été examinées ( grossissement x40 ) par microscopie

à contraste de phase (microscope Leica DM IL) et photographiées à l ' aide d ' un système photographique numérique

(Trinitron ® Color Video Monitor) . Les cellules RWEP-I, 22RvI et DU145 ont été examinées avec les milieux additionnés des produits après 48 heures d' incubation .

B) RESULTATS

Altérations morphologiques

L ' effet de chaque produit sur la morphologie des trois lignées cellulaires est illustré sur la Figure 30. Les cellules ont été traitées avec la concentration maximale de produit pendant une durée allant j usqu ' à 48 heures .

Un arrondissement des cellules 22RvI et l ' absence de cellules attachées ont suggéré l ' induction d ' une apoptose par l ' addition des produits 2 , 4 et 5. A priori, le produit 3 semble être moins efficace sur les cellules 22RvI . En effet, un plus petit nombre de cellules arrondies a été observé ainsi que des cellules attachées présentant une perte de morphologie . Aucune différence significative en termes de densité et de morphologie entre les cellules 22RvI traitées au β-sitostérol et les cellules non traitées n' a été observée . Toutefois , des cellules arrondies sur la monocouche ont été observées , ce qui suggère une très faible inhibition de la prolifération cellulaire .

Les cellules DU145 se sont révélées moins sensibles aux traitements aux produits 2 , 3 , 4 et 5 que les cellules 22RvI . En effet , aucune cellule arrondie n' a été observée , mais de nombreuses cellules attachées présentent une perte de morphologie . Toutefois, le nombre de cellules attachées est plus faible avec les produits 4 et 5 qu ' avec les produits 2 et 3. Les cellules DU145 semblent être plus sensibles aux produits 4 et 5. On n ' a pas observé de différence significative en termes de densité et de morphologie entre les cellules DU145 traitées au β-sitostérol et les cellules non traitées .

Pour les cellules prostatiques normales RWEP-I , aucune différence de morphologie significative n' a été observée entre les cellules traitées et les cellules non traitées pour chaque produit . Cependant , tous les produits se sont révélés suffisants pour réduire légèrement le nombre de cellules au j our 2. Aux concentrations maximales , les produits affectent la croissance des cellules prostatiques normales en ralentissant la prolifération cellulaire .

Inhibition de la croissance des cellules prostatiques en fonction de la dose et du temps

L ' effet sur la prolifération des cellules RWEP-I , 22RvI et DU145 a été étudié , en fonction de la dose et du temps , des produits à un pourcentage compris entre l , 56.10 ^~5 % et 2.10 ^~2 % pour le produit 1 et entre 0 , 2 et l , 562.10 ^~3 % pour les autres produits , après 1 , 3 , 6, 24 , 48 et 72 heures de traitement (Tableau 1 , Figures 31 , 32 et 33 ) .

Effet cytotoxique des produits sur la croissance des cellules RWEP-I .

La CI ₅₀ n' a j amais été atteinte en présence de β- sitostérol entre 1 et 72 heures de traitement . Le β-sitostérol n ' a ainsi aucun effet cytotoxique sur les cellules RWEP-I . De plus , après 48 heures de traitement et pour le dosage à la SRB, un effet inhibiteur dose-dépendant du β-sitostérol sur la lignée de cellules prostatiques normales a été observé . A ce stade, le traitement au β-sitostérol a provoqué une réduction significative de la synthèse des protéines dans les cellules RWEP-I ( Figure 31 ) . Pour les produits 2 , 3 , 4 et 5 , la CI ₅₀ après 24 heures de traitement n' a pas été atteinte . Cependant , une courbe diphasique a été observée après 48 et 72 heures de traitement . De façon générale, tous ces produits ont inhibé la prolifération cellulaire à des concentrations comprises entre 0 , 003125% et 0 , 025% d ' extrait ( Figure 31 ) . Il n ' a pas été observé de différence d ' inhibition significative entre les produits et les Clj. ₀₀ n ' ont j amais été atteintes (Tableau 3 ) .

Effet anticancéreux des produits sur la croissance des cellules 22RvI .

A l , 3 et β heures de traitement, le β-sitostérol n ' a pas inhibé l ' activité lysosonαiale, ni la synthèse des protéines dans les cellules 22RvI . En outre, la CI ₅₀ a été atteinte à 24 et 72 heures . Les cellules 22RvI sont la seule lignée de cellules cancéreuses pour laquelle des valeurs de CIs ₀ ont été atteintes avec le β-sitostérol . A 48 heures de traitement, un effet inhibiteur dose-dépendant a été induit par le β- sitostérol sur l ' activité de synthèse des protéines ( Figure 31 ) .

En outre, la lignée de cellules 22RvI a été la seule à présenter des CI ₅₀ lors du traitement de courte durée avec les produits 2 , 3 , 4 et 5 (Tableau 2 ) . Ainsi, cette lignée de cellules cancéreuses semble être la plus sensible aux extraits de cacao . Les CI ₅₀ à 24 , 48 et 72 heures de traitement avec tous les produits sont présentées dans le Tableau 3. L ' effet en fonction de la dose et du temps est représenté sur la Figure 33 pour permettre de comparer l ' activité anticancéreuse du produit 2 à celle du produit 3, et celle du produit 4 à celle du produit 5. Tous ces produits ont présenté un effet qui dépend de la dose et du temps .

TABLEAU 2

Heures Essai Produit 2 Produit 3 Produit 4 Produit 5

CI ₅₁₁ " CI ₃₁ , CI ₅₀ CI ₃₀

RN 0,049 0,060 0,029 0,031

SRB 0,052 0,061 0,076 0,069

RN 0,035 0,036 0,023 0,030

SRB 0,036 0,051 0,041 0,043

RN 0,034 0,034 0,025 0,026

SRB 0,030 0,024 0,032 0, 039

¹ Valem s de CIw exprimées en % d'extrait

TABLEAU 3.

Prodιut3 ^d Produit4' ¹

Lignée β-silosterol Pιoduit2 ^J Prodιπt5 ^u

1 leures Dosage cellulaire Inhibilion

Cl ₁₁ ,,, Clioo ma\ Ck, CIs,, CI ₅₀ CI ₅₁ , Clin,]

RWEPl RN I5°o" non non non non non non non non

SRB 9% non non non non non non non non

24 h 49% 0,0080 0,05

22RV1 RN 0,025 0,0169 0,0098 >0,l 0,0173 >o,ι

SRB 49° o 0,0085 0,025 0,0170 0,05 0,0098 >0,2 0,0152 >0,l

RN ll% 0,0535 >0,2 0,0835 >0,2

DU 145 0,1105 >0,2 0,0940 >0,2

SRB 42% 0,0478 > 0,2 0,0874 >0.2 0,0952 >0,2 0,0810 >0,2

0,021 0,021 0,022

RN 29% non non non 0,073 0,078 non 0,024 0,087 0,103

RWEPI

0,017 0,017

SRB 48% non non non 0,086 0,089 non 0,021 0,021 0,081 0,138

RN 16% 0,0080 0,025 0,0076 0,0125

22RV 1 0,0074 0,0125 0,0086 0,0125

SRB 47% 0,0078 0,025 0,0070 0,0125 0,0088 0,0125 0,0083 0,0125 ni ndç RN 21% 0,0507 ^; 0,2 0,0551 >0,l 0,084 >0,2 0,0350 >0,2

SRB 44% 0,0509 >0,2 0,0504 >0,2 0,062 >0,2 0,0353 >0,2

0,039 0,034 0,030

RN 11% 0,036 0,153 non non non non 0,081 0,096 0,104

RWEPI

0,03 0,024 0,021 0,021

SRB 26% non non non non 0,1 0,065 0,075 0,071

7211 RN CI,,,= I7,84 ^ι 0,0080 0,025 0,0061 0,025 0,0077

22RV I 0,025 0,0110 0,025

SRB CU =14,01 0,0078 0,025 0,0055 0,025 0,0062 0,025 0,0090 0,025

RN 0,0498 >0,2 0,0612 >0,2

DU145 42% 0,0594 >0,2 0,0310 >0,2

SRB 40% 0,0450 >0,2 0,0496 >0,2 0,0454 >0,2 0,0297 >0,2

¹ On a incube les cellules RWEP-I, 22RvI et DUI4 ₅ pendant I, 3, 6, 24, 48 et 72 heures en présence de diverses concentrations de β-sitosterol et d'extraits de cacao (Tableau I) Moyenne de trois expériences réalisées en trois exemplaires ^b Inhibition maximale exprimée en % , ^c Valeurs de CI« exprimées en μM , ^d Valeurs de CI ₅ O exprimées en % d'extrait ,non non obtenu

Effet anticancéreux des produits sur la croissance des cellules DU145.

Contrairement aux cellules 22RvI , le β-sitostérol n ' a pas induit de CI ₅₀ dans les cellules DU145 lors des traitements de courte et de longue durée . De plus , ce phytostérol a eu un effet inhibiteur dose-dépendant sur l ' activité de synthèse des protéines à 48 heures de traitement ( Figure 31 ) . En outre, aucune IC ₅₀ n' a été observée avec les produits 2 , 3 , 4 et 5 lors du traitement de courte durée . Les cellules DU145 semblent être plus résistantes aux extraits de cacao que les cellules 22RvI . Les CI ₅₀ de tous les produits à 24 , 48 et 72 heures de traitement sont présentées dans le Tableau 3. Les effets dépendants de la dose et du temps sont représentés sur la Figure 32 pour permettre de comparer l ' activité anticancéreuse du produit 2 à celle du produit 3 , et celle du produit 4 à celle du produit 5. Tous ces produits ont présenté

un effet dépendant de la dose et du temps , sauf le produit 2 , qui a présenté une activité constante aux trois moments du traitement .

C) DISCUSSION ET CONCLUSION Certains facteurs alimentaires peuvent influencer le développement du cancer en altérant les voies cellulaires de transmission de signaux . Depuis quelques années , l ' attention se focalise de plus en plus sur les polyphénols des fruits et des légumes en raison de leur puissant pouvoir antioxydant . De plus , le β-sitostérol peut j ouer un rôle protecteur dans le développement du cancer . Cette notion est étayée par des études in vivo et in vi tro.

Le but de la présente étude in vi tro était d ' analyser les effets des polyphénols de cacao présents dans l ' alimentation sur la croissance des cellules RWEP-I , 22RvI et DU145 , en fonction du temps et de la dose .

Les changements morphologiques et prolifératifs des trois lignées de cellules prostatiques humaines sont illustrés sur la Figure 30. Les résultats obtenus révèlent un effet inhibiteur direct des produits 2 , 3 , 4 et 5 sur la prolifération des lignées de cellules 22RvI et DU145. Les cellules 22RvI sensibles aux androgènes sont plus sensibles à l ' action des extraits de cacao que les cellules DU145 non sensibles aux androgènes . En effet , les cellules 22RvI n ' adhèrent pas et forment des agrégats en suspension, alors que les cellules DU145 sont bien attachées , bien que le nombre de cellules observé soit faible . Ces résultats laissent à penser que les récepteurs stéroïdiens sont impliqués dans l ' action des polyphénols . La présence d ' interactions entre les polyphénols et les récepteurs stéroïdiens (AR) peut expliquer une puissante inhibition des cellules 22RvI . A cet égard, il a été rapporté que certains polyphénols seraient des agonistes des récepteurs stéroïdiens . Les polyphénols de cacao peuvent

inhiber les cellules DU145 en altérant les voies cellulaires de transmission de signaux .

L' exemple présent démontre également que les trois lignées cellulaires réagissent différemment à chaque produit . En effet, pour les cellules RWEP-I , aucun effet cytotoxique n' est observé avant 48 heures de traitement avec tous les produits . Les résultats obtenus tentent de démontrer que la lignée de cellules normales RWEP-I est celle qui résiste le mieux à chaque effet dose/temps des produits . Cependant , à 48 et à 72 heures , les résultats obtenus forment une courbe diphasique pour les cellules RWEP-I incubées avec les extraits de cacao . Aux concentrations minimales des produits, il n ' y a aucune inhibition de la prolifération cellulaire . Plus la concentration des extraits augmente, plus l ' inhibition est forte, j usqu ' à 70% . Ensuite, le taux d ' inhibition diminue, même si la concentration des extraits augmente .

Pour la lignée cellulaire de carcinomes prostatiques 22RvI , les résultats obtenus à partir d ' expériences dépendant de la dose indiquent que ces cellules sont plus sensibles aux produits 3 et 4 et les produits 2 et 5 se sont révélés être les produits les plus efficaces pour l ' inhibition de la croissance des cellules DU145. La différence de sensibilité aux extraits de cacao des deux lignées de cellules tumorales peut s ' expliquer par les différentes origines des tumeurs . Les cellules 22RvI sont sensibles aux hormones et proviennent d ' un carcinome prostatique . Inversement, les cellules DU145 résistent aux hormones et sont des cellules métastatiques . Il est également apparu que les membranes des cellules métastatiques ont tendance à présenter une plus grande fluidité que les tumeurs non métastatiques . Etant donné que leurs propriétés sont différentes , on peut supposer que les mécanismes moléculaires d ' inhibition induits par les polyphénols ne sont pas les mêmes dans les deux lignées de cellules tumorales .

Pour expliquer les différents profils d ' inhibition des extraits , on peut émettre l ' hypothèse selon laquelle l ' origine des polyphénols est très importante - pour l ' efficacité des extraits de cacao . En effet , chaque extrait testé contient des polyphénols provenant de différents pays . En outre, l ' efficacité des propriétés anti-prolifératives et anti- tumorales des polyphénols est probablement liée à leur degré de polymérisation ^' . Il a été rapporté que le pouvoir antioxydant des flavonols et des procyanidines présents dans le cacao et dans le chocolat peut dépendre de la longueur de la chaîne oligomère .

Conclusion :

Pour chaque extrait de cacao et à la concentration maximale, la croissance des cellules 22RvI et DU145 est complètement inhibée alors que celle des cellules RWEP-I n ' est pas inhibée . De plus , les cellules 22RvI sont plus sensibles aux extraits de cacao que les cellules DU145. Ces résultats démontrent que les polyphénols d ' extrait de cacao présentent une activité anticancéreuse spécifique contre les cellules métastatiques et les carcinomes prostatiques . En outre, ces résultats sont les premiers à décrire un puissant effet anti-prolifératif des polyphénols de cacao sur les cellules prostatiques humaines cancéreuses . Tous les extraits de cacao, aux concentrations maximales , induisent une inhibition totale des cellules tumorales sans aucun effet sur les cellules RWEP-I . Les extraits de cacao sont plus efficaces sur les cellules non métastatiques que sur les tumeurs métastatiques . Il est probable que l ' inhibition de la croissance cellulaire induite par les récepteurs stéroïdiens ne soit pas un mécanisme général , mais plutôt un élément de l ' action des polyphénols .

EXEMPLE 7 : Cancer de la prostate sur les modèles de cocultures

Dans cet exemple les effets biologiques de l' extrait polyphénolique de cacao (EPC) et du β-sitostérol sont étudiés

sur une co-culture de cellules humaines prostatiques saines et cancéreuses .

Les effets de l ' EPC et du phytostérol de référence sont visualisés par une technique d' immunomarquage proposée par BlOaternatives grâce à l' expression de la glycoprotéine galectine 8 au niveau d' une co-culture de lignées cellulaires humaines cancéreuse et saine de prostate, soit respectivement les cellules 22RvI et RWEP-I .

1) MATERIELS ET METHODES a) Cellules et milieux de cultures testés

Cellules épithéliales saines de prostate humaine (RWEP-I , ATCC n° CRL-11609)

- Carcinome de prostate humain (22RvI, ATCC n" CRL-2505 ) Culture :

37 ⁰ C, 5% CO ₂ , 95% d' humidité

Milieux testés : Milieu Ml = Milieu préconisé pour les cellules saines (RWEP-

D : Milieu Kératinocyte-Serum Free (KSFM) ( Invitrogen, 17005-042 )

Epidermal Growth Factor, 5 ng/ml (Invitrogen, 10450-013)

Extrai t pitui taire bovin, 0, 05 mg/ml (Invi trogen, 13028-014)

Pénicilline 50 Ul/ml-Streptomycine 50 μg/ml 1 % (v/v,

Invitrogen 15070-063) Milieu M2 = Milieu préconisé pour les cellules tumorales

( 22RvI ) :

Milieu RPMI 1640 ( Invitrogen, 31870-025 )

Sérum de Veau Fœtal décomplémenté, 10% (v/v Invi trogen 10270-

098) L-Glutamine, 1 % (v/v Invi trogen 25030-024)

Pénicilline 50 Ul/ml-Streptomycine 50 μg/ml 1 % (v/v,

Invi trogen 15070-063)

Milieu M3 = Milieu mixte :

Milieu Keratinocyte-Serum Free complet, 50% (v/v)

Milieu RPMI 1640 complet, 50% (v/v) b) Produits à l ' essai et de référence

c) Anticorps primaire utilisé Les galectines appartiennent à la famille des lectines . Ce sont des glycoprotéines dépourvues d ' activité enzymatique, de poids moléculaire variable, pouvant fixer spécifiquement des ligands oligosaccharidiques .

Le premier groupe est constitué de protéines formées de deux domaines lectine en tandem situés en C- et N-terminal , reliés par une séquence peptidique de taille variable appelée peptide de liaison ou peptide linker. Les galectines 4 , 6, 8 et 9 appartiennent à cette catégorie .

La galectine 8 , absente généralement dans la prostate saine, est retrouvée dans les carcinomes prostatiques à un taux significativement plus élevé que dans les adénomes . De ce fait , un anticorps monoclonal humain anti-galectine 8 (R&D Systems , Réf : MAB1305 ) a été sélectionné pour marquer spécifiquement par fluorescence la lignée cellulaire tumorale prostatique humaine . d) Sélection du milieu de co-culture → Par immunomarquage

La sélection du milieu de co-culture a été réalisée en deux

étapes :

- marquage des deux lignées cellulaires ensemencées de façon indépendante pour déterminer la concentration de l' anticorps primaire anti-galectine 8 permettant un marquage spécifique des cellules tumorales (22RvI ) sans bruit de fond sur les cellules saines (RWEP-I) ,

- marquage des deux lignées cellulaires en co-culture pour déterminer si le marquage des cellules tumorales ( 22RvI ) est identique à celui obtenu en culture seule , même en présence des cellules saines (RWEP-I ) .

Les cellules prostatiques saine et tumorale ont été ensemencées , de façon indépendante ou en co-culture, dans des microplaques 96 puits , à raison de 30 000 cellules par puits dans chaque milieu de culture (Ml , M2 ou M3 ) . Après 48 heures de culture dans une étuve à 37 °C et 5% CO ₂ saturée en humidité, les tapis cellulaires ont été fixés en alcool/acide acétique puis marqués par l' anticorps monoclonal humain anti-galectine 8 pendant 1 heure . L' anticorps primaire a été ensuite révélé par un conjugué anticorps de chèvre anti- immunoglobuline de souris , Alexia Fluor 488 ( Interchim, Réf : A-11029 ) . Les concentrations d' anticorps primaire et secondaire ont été rigoureusement identiques pour les cultures réalisées de façon indépendante et pour la co-culture . Après des lavages extensifs en PBS , les tapis cellulaires marqués ont été observés à l ' aide d' une caméra Nikon DXM1200F pilotée par un logiciel LUCIA 6.0. Toutes les images ont été effectuées dans les mêmes conditions et avec des réglages de la caméra identiques .

→ Par un test de prolifération cellulaire : méthode de relargage du Rouge Neutre

La méthode de relargage du Rouge Neutre a permis de déterminer :

- le milieu de culture permettant d' obtenir des IC ₅₀ proches de celles obtenues précédemment (Laboratoire IN CYTOTOX,

Vandoeuvre-Lès-Nancy) pour les deux lignées cellulaires prostatiques cultivées de façon indépendante, deux concentrations de β-sitostérol et d' extrait polyphénolique de cacao appliquées sur les cellules prostatiques saines et tumorales pour l' étape finale d' immunomarquage en co-culture .

Les cellules prostatiques saines et tumorales ont été ensemencées , de façon indépendante, en microplaques 96 puits , à raison de 30 000 cellules par puits dans chaque milieu de culture (Ml , M2 ou M3 ) et incubées pendant 24 heures dans une étuve à 37 ⁰ C et 5% CO ₂ saturée en humidité .

Après 24 heures de croissance, les lignées cellulaires saine et tumorale ont été incubées en présence du β-sitostérol (produit référence ) à 8 concentrations (voir paragraphe b) ci- dessus ) ou de l' EPC à 8 concentrations (voir paragraphe b) ci- dessus ) . Chaque concentration testée a été réalisée dans 6 puits . L' incubation des cellules saines et tumorales avec les produits est de 24 heures . A la fin du temps d' incubation avec les produits , les tapis cellulaires ont été soumis au test de relargage du Rouge Neutre . Le rouge neutre est un colorant vital, ayant la capacité de pénétrer passivement dans les lysosomes, à un pH physiologique . Lors d' une détérioration de la membrane , le rouge neutre sort du cytoplasme . La quantité de colorant incorporée dans les cellules est donc proportionnelle au nombre de cellules possédant encore une membrane intègre . La quantité de colorant incorporée dans les cellules se mesure par une lecture spectrophotométrique à 540 nm et est directement proportionnelle au nombre de cellules vivantes . Les résultats ont été exprimés en pourcentage d' inhibition par rapport au témoin non traité . e ) Traitement par les produits à l' essai et immunomarquage de la co-culture

Les cellules saines et tumorales ont été ensemencées en co-culture, à raison de 30 000 cellules par puits pour chaque

lignée cellulaire, dans le milieu sélectionné permettant d' obtenir un marquage homogène et spécifique des cellules tumorales .

Après 24 heures dans une étuve à 37 ⁰ C et 5% CO ₂ saturée en humidité, la co-culture a été incubée en présence du β- sitostérol à deux concentrations et de l' EPC également à deux concentrations .

A la fin du temps d' incubation avec les produits, les tapis cellulaires ont été fixés en alcool/acide acétique puis marqués par l ' anticorps monoclonal humain anti-galectine 8 pendant 1 heure . L' anticorps primaire a été ensuite révélé par un conjugué anticorps de chèvre anti-immunoglobuline de souris , Alexia Fluor 488 ( Interchim, Réf : A-11029 ) . Après des lavages extensifs en PBS, les tapis cellulaires marqués ont été observés à l' aide d' une caméra Nikon DXM1200F pilotée par un logiciel LUCIA 6.0. Toutes les images ont été saisies dans les mêmes conditions et avec des réglages de la caméra identiques . Pour cette expérience , afin d' améliorer l' intensité de cet immunomarquage et pour une meilleure qualité de rendu visuel, la concentration de l ' anticorps primaire anti-galectine 8 a ème ème été augmentée du 1/50 au 1/20 . De plus, cet anticorps primaire a été incubé pendant toute une nuit à + 4 °C pour une meilleure fixation de l' anticorps et donc pour une meilleure intensité de marquage .

2) RESULTATS a) Sélection du milieu de co-culture → Par immunomarquage

Les résultats de l' immunomarquage sur les lignées cellulaires humaines saine et tumorale de prostate cultivées de façon indépendante sont présentés sur les figures 34a, 34b, 34c et 35a, 35b, 35c .

Les figures 34a, 34b et 34c représentent la lignée saine (RWEP-I ) cultivée respectivement dans le milieu Ml ( fig . 34a ) ,

^

M2 ( fig . 34b) et M3 ( fig . 34c) .

Les figures 35a, 35b et 35c représentent la lignée tumorale (22RvI ) cultivée respectivement dans le milieu Ml ( fig . 35a) , M2 ( fig . 35b) et M3 ( fig . 35c) . Les résultats de l' immunomarquage sur les lignées cellulaires humaines saine et tumorale de prostate cultivées en co-culture, sont respectivement présentés sur les figures 36a, 36b et 36c .

Les figures 36a, 36b et 36c représentent respectivement la co-culture des lignées saine et tumorale dans le milieu Ml (fig . 36a) , M2 ( fig . 36b) et M3 ( fig . 36c) .

Pour les cellules prostatiques cultivées de façon indépendante (Fig . 34a-c et 35a-c) , la lignée cellulaire saine

(RWEP-I ) , cultivée dans les trois milieux Ml, M2 ou M3 n' a pas été pas marquée par l ' anticorps primaire anti-galectine 8 et par l ' anticorps secondaire Alexia Fluor 488. Par ailleurs , la lignée cellulaire tumorale (22RvI ) a été spécifiquement reconnue par l' anticorps anti-galectine 8 dont le marquage était plus homogène et plus intense dans les conditions de culture du milieu M3.

Les résultats obtenus pour l ' immunomarquage des cellules en co-culture ( Fig . 36a-c) confirment ceux obtenus pour les cellules cultivées de façon indépendante . En effet, le marquage des cellules tumorales (22RvI ) est plus homogène dans les conditions de culture du milieu M3. Dans les milieux Ml et M2 , un marquage hétérogène a été observé au niveau de la co- culture variant de faible à intense .

Ainsi, le milieu M3 a permis une observation précise et spécifique des cellules tumorales (22RvI ) sans marquage des cellules saines (RWEP-I ) .

→ Par un test de prolifération cellulaire : méthode de relargage du Rouge Neutre

Les résultats du test de prolifération par méthode de relargage du Rouge Neutre sont présentés dans les figures 37a,

37b, 37c, 37d, 37e , 37f et 38a, 38b, 38c, 38d, 38e, 38f . Ce test a été réalisé sur les lignées cellulaires saine et tumorale cultivées de façon indépendante pour déterminer le pourcentage d' inhibition de prolifération induit sur chaque lignée cellulaire par les produits .

Les figures 37a à 37f représentent les effets du β- sitostérol sur les lignées cellulaires humaines saine et cancéreuse de prostate cultivées de façon indépendante dans les milieux Ml , M2 ou M3. Les figures 37a et 37b représentent les effets du β- sitostérol sur les lignées cellulaires humaines de prostate saine (fig. 37a ) et cancéreuses (fig . 37b) cultivées en milieu Ml .

Les figures 37c et 37d représentent les effets du β- sitostérol sur les lignées cellulaires humaines de prostate saine ( fig . 37c) et cancéreuses ( fig . 37d) cultivées en milieu M2.

Les figures 37e et 37f représentent les effets du β- sitostérol sur les lignées cellulaires humaines de prostate saine ( fig . 37e) et cancéreuses ( fig . 37f) cultivées en milieu M3.

D' après les résultats obtenus aux figures 37a à 37f, le β- sitostérol induit une faible inhibition de la prolifération des lignées cellulaires saine (RWEP-I) et tumorale (22RvI) cultivées dans les trois milieux de culture Ml , M2 ou M3. Les points rouges représentés sur les figures 37a à 37f correspondent aux concentrations sélectionnées pour 1 ' immunomarquage sur co-culture traitée par le β-sitostérol , à

-4 -4 savoir 2 , 5.10 % et 1 , 2.10 % . Les figures 38a à 38f représentent les effets de l' EPC sur les lignées cellulaires humaines saine et cancéreuses de prostate cultivées de façon indépendante dans les milieux Ml , M2 ou M3.

Les figures 38a et 38b représentent les effets de l' EPC

sur les lignées cellulaires humaines de prostate saine (fig . 38a) et cancéreuses ( fig . 38b) cultivées en milieu Ml .

Les figures 38c et 38d représentent les effets de l' EPC sur les lignées cellulaires humaines de prostate saine ( fig . 38c) et cancéreuses ( fig . 38d) cultivées en milieu M2.

Les figures 38e et 38f représentent les effets de l' EPC sur les lignées cellulaires humaines de prostate saine ( fig . 38e) et cancéreuses ( fig . 38f) cultivées en milieu M3.

D' après les résultats obtenus aux figures 38a à 38f, un effet dose-dépendant de l' EPC a été observé . De plus , l' inhibition complète de la prolifération des cellules tumorales par cet EPC a été observée pour les conditions de culture en milieu M2 et M3. Cet effet inhibiteur a été induit aux plus faibles concentrations de l ' EPC, à savoir 0 , 025% et 0 , 0125% . A ces mêmes concentrations , l' EPC a induit une faible inhibition de prolifération des cellules saines (RWEP-I ) en milieu M2 et aucune inhibition en milieu M3. Le milieu M3 a donc été retenu pour tester les effets de l' EPC en immunomarquage . Ainsi , d' après les résultats de ce test de prolifération par méthode de relargage du Rouge Neutre, le milieu M3 a été sélectionné pour l' immunomarquage sur la co-culture . En effet, ce milieu mixte permet d' obtenir les mêmes effets inhibiteurs que ceux observés dans l' étude précédente : - l' EPC a induit une inhibition complète de la prolifération cellulaire tumorale et n' a pas présenté d' effet sur la lignée cellulaire saine ;

- le β-sitostérol a induit une inhibition modérée de la prolifération cellulaire à la fois sur les lignées cellulaires saine et tumorale . b) Immunomarquage de la co-culture après traitement Les résultats de l' immunomarquage sur co-culture après traitement du produit de référence ( β-sitostérol) et du produit à l' essai (EPC) sont présentés aux figures 39a à 39e .

Les figures 39a à 39e représentent la co-culture des lignées cellulaires tumorale et saine de prostate traitées par du β-sitostérol ou par l ' EPC dans du milieu M3.

La figure 39a représente la co-culture non traitée (= témoin de prolifération) (X 20 ) .

La figure 39b représente la co-culture traitée par le β- sitostérol (2 , 5.10 ^~3 % ) (X 20 ) .

La figure 39c représente la co-culture traitée par l ' EPC ( 0 , 025% ) (X 20 ) . La figure 39d représente la co-culture traitée par le β- sitostérol ( 1 , 2. 10 ^~3 % ) (X 20 ) .

La figure 39e représente la co-culture traitée par l' EPC ( 0 , 0125% ) (X 20 ) .

Lors du marquage, le colorant Hoechst a été également utilisé afin de mettre en évidence les noyaux des cellules prostatiques saines et tumorales . Les cellules tumorales ont été marquées par l' anticorps anti-galectine 8 (en vert ) et le

Hoechst ; les cellules saines ont été marquées par du Hoechst

(en bleu) .

-4 Aux deux concentrations de β-sitostérol testées ( 2 , 5.10 %

-4 et 1 , 2.10 % ) , la surface de marquage révélée par immunomarquage et par le Hoechst , est équivalente à celle du témoin de prolifération non traité . Cette absence de différence significative de marquage est due à un effet inhibiteur modéré du β-sitostérol sur les lignées cellulaires tumorale et saine .

Aux deux concentrations testées de l' EPC ( 0 , 025% et 0 , 0125% ) , un phénomène d' agrégation des cellules tumorales est observé, diminuant fortement la surface de marquage . Cette agrégation cellulaire pourrait expliquer une intensité de marquage plus importante liée essentiellement à l' accumulation de l ' anticorps primaire au niveau du site antigénique galectine 8 des cellules tumorales . Ce phénomène d' agrégation est dose-dépendant puisque la densité d' agrégation et la

surface de marquage est moins importante à 0 , 025% d' EPC qu' à 0 , 0125% . La prolifération de la lignée cellulaire tumorale est effectivement inhibée (voir paragraphe ci-dessus sur la méthode de relargage du Rouge Neutre) mais présente touj ours l' antigène dans son intégrité puisqu' il y a eu marquage de cette lignée cellulaire . 3) CONCLUSION

Les deux concentrations d' EPC testées ( 0 , 025% et 0 , 0125% ) induisent une inhibition de la prolifération cellulaire d' environ 90% sans inhiber les cellules saines et permettent également une diminution de l' adhésion des cellules tumorales et de la surface totale du tapis cellulaire tumoral . Ce pourcentage élevé d' inhibition de la prolifération et cette capacité à limiter l' adhésion des cellules tumorales ne sont pas observés pour le produit de référence, le β-sitostérol . La différence d' effet biologique entre la β-sitostérol et l' EPC est nettement visualisée en fluorescence, par immunomarquage . Ainsi , par l' observation de ces clichés , l' EPC, en plus de sa capacité à inhiber la prolifération des cellules tumorales , permet de diminuer l' adhésion de ces cellules .

Exemple 8 : Effet chimiopréventif de l' extrait polyphénolique de cacao (EPC) selon l' invention chez les rats

Le modèle de carcinogenèse de la prostate utilisant le carcinogène chimique à action directe, à savoir la N- méthylnitrosourée (MNU) , puis une stimulation par androgène chronique avec de la testostérone chez le rat Wistar-Unilever, a été utilisé dans plusieurs études de chimioprévention récentes . Il s' agit d' un modèle pertinent du point de vue anatomique et physiologique pour l' évaluation préclinique des substances dont on suppose qu' elles inhibent ou renforcent la carcinogenèse de la prostate chez l' homme .

Dans cet exemple, on a évalué les effets chimiopréventifs de l' extrait polyphénolique de cacao (EPC) , administré par voie orale chez le rat Wistar-Unilever à des doses de 24 et de

^

48 mg/kg, contre des tumeurs de la prostate induites chimiquement .

Le traitement des rats avec l' EPC administré à une dose de 24 mg/kg a inhibé le développement des tumeurs de la prostate avec des caractéristiques histologiques similaires à celles du cancer humain clinique de la prostate . 2. MATERIELS ET METHODES Substances chimiques Le carcinogène MNU (N-méthylnitrosourée) et une hormone androgène, le propionate de testostérone ( PT) (CAS n° 57-85-2 ) , ont été obtenus auprès de Sigma-Aldrich (Saint-Quentin Fallavier, France) .

L' EPC dépourvu de solvant a été fourni par Barry Callebaut France (Louviers , France) . Il a été isolé à partir de fèves de cacao de Côte d' Ivoire par extraction, filtration et séchage . La composition de polyphénols totale de cet extrait est de 88 , 5 % de procyanidines et de 11 , 5 % de catéchine, d' épicatéchine et de gallate d' épicatéchine . Animaux Soixante-quinze rats mâles Wistar-Unilever (HsdCpb : WU) , dont le poids est de 250 à 275 g au début de l' expérience, ont été obtenus auprès de Harlan Nederland (Horst, Pays-Bas ) et ont été répartis dans 5 groupes de 15 rats chacun . Ils ont été logés dans des cages en polypropylène (3 rats par cage) équipées pour leur fournir aliments et eau . Les animaux ont été maintenus dans un local climatisé dans des conditions de température contrôlées (22 ± 2 ° C) , d' humidité relative ( 50 ± 10 % ) , avec un cycle diurne/nocturne de 12 heures inversé (extinction de la lumière à 8 heures du matin) . Ils avaient accès à un régime alimentaire M20 standard (Dietex, France) et avaient à disposition de l' eau du robinet ad libi tum. L' animalerie possède les autorisations délivrées par les Ministères français de l' Agriculture et de la Recherche et les expériences sur les animaux ont été pratiquées conformément

aux recommandations européennes en matière d' expérimentation animale (Directive du Conseil des Communautés européennes n° 86/609, 1986) et les lignes directrices anglaises en matière de bien-être des animaux dans le cadre de néoplasie expérimentale .

Induction des tumeurs de la prostate

L' induction des tumeurs de la prostate a été effectuée en deux phases . Pour la phase d' initiation, les rats ont reçu une seule inj ection intraveineuse, dans la veine caudale , de carcinogène MNU à raison de 35 mg/kg de poids corporel préparé avec une solution saline stérile immédiatement avant l ' inj ection . Les témoins n' ont reçu qu' une seule inj ection intraveineuse de solution saline stérile . Pour la phase de développement , une semaine après l' administration de MNU, les rats ont reçu une implantation sous-cutanée d' un tube silastique ( Sani-Tech ¹⁰ 50 , Saint-Gobain Performance Plastics , Tauton, MA, Etats-Unis ) de 2 cm de long rempli avec 40 mg de PT et fermé hermétiquement avec une colle adhésive médicale (3M Vetbond ^™ , St . Paul , MN, Etats-Unis ) . Le tube silastique a été mis en place en pratiquant une petite incision dans l' espace sous-cutané à l' intérieur de la zone de la paroi ventrale abdominale des rats sous anesthésie à l' acépromazine (2 mg/kg de Calmivet, Vetoquinol, Lure, France) à la kétamine (50 mg/kg de Kétamine 1000 , Virbac, Carros, France) . Le tube silastique a été remplacé tous les deux mois au cours des six premiers mois de l' expérience . Sur les témoins, on a implanté des tubes silastiques vides fermés hermétiquement . Traitements Après une période d' acclimatation de sept j ours à compter de leur arrivée, les 75 rats mâles Wistar-Unilever ont été randomisés en 5 groupes de 15 rats chacun en fonction de leur poids corporel .

Un groupe témoin a été induit chimiquement et n' a pas été traité (groupe « Sans traitement ») .

Un autre groupe témoin a reçu une inj ection intraveineuse de solution saline stérile, des implants sous-cutanés de tubes silastiques vides et a été traité au moyen d' un véhicule (eau de source) (groupe « Sans induction + véhicule ») . Les trois autres groupes de rats ont été soumis à une induction de tumeurs de la prostate conformément au protocole décrit ci-dessus et ont été traités avec de l' EPC à raison de 24 ou de 48 mg/kg de poids corporel (Groupes « Chimio-induit + CPE 24 » et « Chimio-induit + CPE 48 », respectivement ) ou avec un véhicule (Groupe « Chimio-induit + véhicule ») . Les traitements avec l ' EPC et le véhicule ont débuté 2 semaines avant l' administration de MNU . L' EPC était dissous dans le véhicule chaque j our avant d' être administré aux animaux . L' EPC et le véhicule étaient administrés par voie orale en fonction du poids corporel des rats , toutes les semaines du lundi au vendredi , pendant toute la durée de l' expérience . Surveillance des animaux et autopsie

La viabilité, le comportement et le poids corporel des rats ont été enregistrés trois fois par semaine pendant toute la durée de l' expérience . Les consommations d' aliments et d' eau ont été enregistrées chaque semaine, du lundi au vendredi, pour chaque cage afin d' estimer la quantité d' aliments et d' eau ingérée par les rats logés dans les cages . Au cours de l' expérience, des animaux ont été euthanasiés sous anesthésie s ' ils présentaient des signes de souffrance (cachexie, faiblesse , difficultés pour se déplacer ou s ' alimenter) , de toxicité liée aux composés (gibbosité, convulsions ) , une perte de poids corporel de 25 % pendant trois j ours consécutifs . Une autopsie a été réalisée dans chaque cas .

Neuf mois après l' induction des tumeurs de la prostate, six rats de chaque groupe ont été euthanasiés sous anesthésie afin d' effectuer une évaluation histopathologique . Les neuf

rats restants dans chaque groupe ont été maintenus dans une étude de survie et ont été traités comme décrit ci-dessus .

évaluation histopathologique

Lors de l' autopsie, toutes les lésions marquées ont été excisées . Les glandes sexuelles annexes et la vessie urinaire ont été soigneusement retirées en bloc chez chaque rat et fixées dans une solution de formaline à 4 % (Roti ^® -Histofix

4 % , Cari Roth GmbH & Co, Allemagne) . Après fixation, les glandes sexuelles annexes ont été noyées dans de la paraffine et des coupes fines ( 5 , 0 μm d' épaisseur) ont été préparées à partir de tous les blocs et colorées à l' hématoxyline et à l' éosine pour une évaluation histopathologique . Les coupes ont été évaluées en aveugle et de manière indépendante deux fois par le même chercheur afin de classer les lésions . Les lésions de la prostate et des vésicules séminales ont été cataloguées en tant qu' inflammation, hyperplasie ( focale ou diffuse) , adénocarcinome et lymphome .

Analyse statistique

On a utilisé l' analyse de variance (ANOVA) pour comparer le changement de poids corporel moyen (MBWC) et les consommations d' aliments et d' eau des cinq groupes de rats . Lorsqu' un fait significatif était observé, l' analyse de variance (ANOVA) était suivie d' un test post hoc de Scheffé afin de comparer les groupes chimio-induits aux groupes témoins . Les résultats étaient exprimés sous forme de calcul d' erreur type ± sur la moyenne ( SEM) . Pour toutes les comparaisons , les différences étaient considérées comme significatives au niveau de P < 0 , 05. Toutes les analyses statistiques ont été réalisées en utilisant le logiciel de statistiques StatView ^® 5 ( SAS, Institute, Inc . , Cary, NC, Etats- Unis ) .

2. RéSULTATS

Changement de poids corporel moyen des rats

Tous les animaux sont restés en bonne santé pendant toute la durée de la période expérimentale .

Comme représenté sur la Figure 40 , les gains de poids corporel des cinq groupes de rats n' étaient pas différents sur le plan des statistiques pendant les deux premières semaines des traitements , avant l' induction des tumeurs de la prostate (entre J5 et J19 ) . Après l' induction des tumeurs de la prostate (entre J19 et J278 ) , le gain de poids corporel des groupes « Sans traitement » (+ 249, 9 ± 27 , 0 g) et « Sans induction + véhicule » ( + 250 , 6 ± 28 , 7 g) étaient considérablement plus élevés que ceux des groupes « Chimio- induit + véhicule » (+ 116, 1 ± 23 , 1 g) , « Chimio-induit + CPE 24 » (+ 140 , 3 ± 17 , 6 g) et « Chimio-induit + CPE 48 » (+ 147 , 1 ± 50 , 3 g) ( P < 0 , 0001 dans tous les cas ) . Cette différence de gain de poids corporel est due aux traitements combinés de MNU et de PT . Aucune différence statistique dans les gains de poids corporel n' a été observée entre les groupes « Sans traitement » et « Sans induction + véhicule » ou entre les groupes « Chimio-induit + véhicule », « Chimio-induit + CPE 24 » et « Chimio-induit + CPE 48 » pendant la même période . Toutefois, les gains de poids corporel des groupes « Chimio- induit + CPE 24 » et « Chimio-induit + CPE 48 » étaient plus importants que ceux du groupe « Chimio-induit + véhicule » . Consommation d' aliments et d' eau des rats Comme représenté sur la Figure 41 , la consommation d' aliments du groupe « Chimio-induit + véhicule » ( 50 , 0 ± 0 , 5 g/kg/j our) était significativement plus élevée que celle des groupes « Sans traitement » ( 46, 8 ± 0 , 9 g/kg/j our) et « Sans induction + véhicule » ( 46, 1 ± 1 , 2 g/kg/j our) ( P = 0 , 019 et P = 0 , 003 , respectivement ) . La consommation moyenne d' aliments du groupe « Chimio-induit + CPE 24 » ( 49, 5 ± 1 , 3 g/kg/j our) était significativement plus élevée que celle du groupe « Sans induction + véhicule » (P = 0 , 011 ) . La consommation moyenne d' aliments du groupe « Chimio-induit +

CPE 48 » (51 , 4 ± 1 , 0 g/kg/jour) était significativement plus élevée que celle des groupes « Sans traitement » et « Sans induction + véhicule » (P = 0 , 0007 et P = 0 , 0001 , respectivement ) . Aucune différence significative n' a été observée dans la consommation moyenne d' aliments entre les groupes « Sans traitement » et « Sans induction + véhicule » et entre celle des groupes « Chimio-induit + véhicule », « Chimio-induit + CPE 24 » et « Chimio-induit + CPE 48 » .

Comme indiqué dans la Figure 42 , la consommation moyenne d' eau du groupe « Chimio-induit + véhicule » ( 117 , 2 ± 12 , 9 g/kg/j our) était significativement plus élevée que celle des groupes « Chimio-induit + CPE 24 » ( 83 , 4 ± 16, 2 g/kg/jour) , « Sans traitement » ( 66, 8 ± 3, 3 g/kg/j our) et « Sans induction + véhicule » ( 64 , 4 ± 6, 9 g/kg/j our) (P = 0 , 028 , P = 0 , 0007 et P = 0 , 0004 , respectivement) . Aucune différence significative n' a été observée dans la consommation d' eau entre les groupes

« Chimio-induit + véhicule » et « Chimio-induit + CPE 48 »

( 93 , 3 ± 13 , 3 g/kg/j our) . Aucune différence statistique dans la consommation moyenne d' eau n' a été observée entre les groupes « Chimio-induit + CPE 24 », « Chimio-induit + CPE 48 », « Sans traitement » et « Sans induction + véhicule » .

Incidence des lésions prostatiques

Tableau 4 : Incidence des lésions prostatiques après neuf mois .

Traitement Nombre Inflammation Hyperplasie Hyperplasie Adenocarcinome Lymphome de rats focale diffuse examiné ______ g ^ J _{3 2 2} induit + véhicule

Chimio- 6 2 1 2 0 0 induit +

EPC 24

Chimio- 6 4 1 3 1 1

induit +

EPC 48

Non induit 6 1 1 1 0 0

Sans 6 0 1 1 0 0 traitement

Le Tableau 4 ci-dessus résume les données sur l' incidence des lésions prostatiques observées neuf mois après le début des traitements avec le véhicule ou le CPE à raison de 24 ou 48 mg/kg et l ' induction des tumeurs de la prostate avec du MNU et du PT . L' incidence la plus élevée de néoplasie prostatique a été observée dans le groupe « Chimio-induit + véhicule » où deux des six rats présentaient des adénocarcinomes et deux autres rats avaient des lymphomes d' origine prostatique . Quatre inflammations de la prostate et trois hyperplasies diffuses ont également été observées dans ce groupe . Les lésions induites par les traitements combinés de MNU et PT semblent survenir dans la prostate dorsolatérale et/ou antérieure . Une réduction de l' incidence de la néoplasie prostatique a été observée dans le groupe « Chimio-induit + CPE 48 » où un adénocarcinome et un lymphome ont été observés au niveau de la prostate dorsolatérale et/ou antérieure chez deux rats . Le même nombre d' inflammations de la prostate et d' hyperplasies diffuses (quatre et trois , respectivement) a été observé dans ce groupe, comme pour le groupe « Chimio- induit + véhicule » . Aucun adénocarcinome et aucun lymphome n' ont été observés dans le groupe « Chimio-induit + CPE 24 », comme pour les deux groupes « Sans traitement » et « Sans induction + véhicule » . Seulement deux inflammations de la prostate et deux hyperplasies diffuses ont été observées dans le groupe « Chimio-induit + CPE 24 » tandis qu' une seule inflammation de la prostate a été observée dans le groupe « Sans induction + véhicule » et une hyperplasie diffuse a été observée à la fois dans les groupes « Sans traitement » et « Sans induction + véhicule » . Une hyperplasie focale a été

observée dans les cinq groupes de rats . Aucune tumeur n' a été observée dans les vésicules séminales ou dans les tissus autres que les glandes sexuelles annexes dans tous les groupes de rats , neuf mois après l' induction des tumeurs de la prostate .

3. CONCLUSION

—»L' EPC de l' invention, administré par voie orale chez les rats avant l' induction d' une carcinogenèse de la prostate et pendant les neuf mois qui suivent, réduit de manière significative l' incidence des lésions de la prostate, particulièrement à la faible dose de 24 mg/kg .

C' est la première fois , à la connaissance des Inventeurs, qu' il a été montré qu' un EPC exerce des effets inhibiteurs sur la carcinogenèse de la prostate induite chimiquement chez les rats .

Les traitements avec l' EPC, aux doses de 24 et de 48 mg/kg, ont accru le gain de poids corporel des rats par comparaison avec les traitements au moyen d' un véhicule mais avec un gain de poids corporel significativement plus faible ^• par comparaison avec les groupes témoins .

Les traitements avec l ' EPC ont également entraîné une réduction de la consommation d' aliments et d' eau des rats après induction des tumeurs de la prostate par comparaison avec les traitements au moyen d' un véhicule . Toutefois, il n' a pas été observé un effet lié à la dose du traitement avec l' EPC dans le nombre des lésions de la prostate, neuf mois après l' induction des tumeurs de la prostate . On a observé un plus grand nombre de tumeurs au niveau de la prostate dorsolatérale et/ou antérieure des rats traités avec l' EPC à raison de 48 mg/kg par dose que dans le groupe traité à raison de 24 mg/kg.

Les effets de la diffusion du PT par le biais des tubes silastiques et son activité dans l ' organisme des rats doivent impérativement être limités par l' action de faibles doses de

l' EPC . I/ EPC administré à raison de 24 mg/kg peut inhiber une 5α-réductase, limitant ainsi la conversion de la testostérone en dihydrotestostérone, comme rapporté par Willis et Wians en 2003 , et peut ainsi ralentir le développement des tumeurs de la prostate qui sont androgéno-dépendantes pendant les premiers mois . Une dose plus élevée de l' EPC, à savoir 48 mg/kg, peut impliquer un mécanisme de régulation tel qu' un retour négatif susceptible de ralentir au fil du temps l ' activité inhibitrice de l' EPC sur une 5α-réductase, et avec la combinaison du MNU carcinogène, risque d' accroître le développement des tumeurs de la prostate au lieu de les inhiber . Ces observations peuvent expliquer le fait que les consommations d' aliments et d' eau des rats du groupe traité au moyen de l' EPC 48 sont plus élevées que celles du groupe traité au moyen de l' EPC 24 et plus proches de celles du groupe traité avec un véhicule pendant les huit premiers mois .

Dans cet exemple, l' efficacité de l ' EPC semble être inversement liée à la dose bien que l' on puisse supposer que sa biodisponibilité est dépendante de la dose . II a été indiqué, dans une étude antérieure, que la biodisponibilité de l' épicatéchine présentait une dépendance envers la dose dans la plage des doses examinées ( 1 à 10 mg/kg de poids corporel ) . 30 à 50 % d' épicatéchine administrés par voie orale ont été absorbés par le tube digestif et répartis dans le sang sous forme conjuguée et possédaient une activité antioxydante dans le sang des rats .

La même observation a été faite, dans une étude encore plus antérieure, chez des humains après la forte consommation de différentes quantités d' un chocolat riche en procyanidines . En 2003 , il a été montré par Record et al . _r que la consommation de chocolat comprenant soit 200 mg de flavonoïdes soit des procyanidines apparentées, réduisait la production de radicaux libres dans l' eau fécale, ce qui suggérait

l' efficacité des polyphénols dérivés du chocolat sur la santé de l' intestin .

L' effet anti-prolifératif puissant des flavonoïdes et des procyanidines du cacao sur les cellules cancéreuses du colon humain a également été décrit . L' efficacité des propriétés anti-prolifératives et anti-tumorales des flavonoïdes et des procyanidines est vraisemblablement lié à leur degré de polymérisation . On a rapporté que les propriétés antioxydantes de ces composés présents dans le cacao et le chocolat peuvent être affectées par la longueur de la chaîne oligomérique .

Dans d' autres études, on a montré que les polyphénols de la liqueur de cacao inhibent le développement des tumeurs induite par du 12-0-tétradecanoylphorbol-13-acétate suggérant ainsi des mécanismes anti-prolifératifs et anti- inflammatoires . Le fait de soumettre des rats mâles à un régime alimentaire contenant des polyphénols de la liqueur de cacao a été associé à une inhibition significative de la carcinogenèse du poumon et à une tendance en faveur d' une inhibition de la carcinogenèse de la thyroïde . Compte tenu des résultats du présent exemple et de ceux des autres études , il apparaît que la consommation quotidienne de petites quantités de flavonoïdes et de procyanidines provenant du cacao ou du chocolat, conj ointement à une prise habituelle de flavonoïdes provenant d' autres sources alimentaires , est susceptible de contribuer à la protection contre une carcinogenèse dans divers organes y compris dans la prostate .

En conclusion, les traitements à l' EPC à raison de 24 mg/kg par dose protège les rats contre les tumeurs de la prostate chimio-induites lorsqu' ils sont administrés avant la phase d' initiation de l' induction .

Exemple 9 : Effets des extraits polyphénoliques de cacao (EPC) sur les performances σognitives des rats après un coup de chaleur .

L' obj ectif de cet exemple est d' évaluer les effets antioxydants préventifs de deux extraits phénoliques du cacao (EPCl et EPC2 ) sur l ' augmentation des radicaux libres en circulation après un coup de chaleur chez des rats Wistar mâles et leurs effets protecteurs sur les performances cognitives .

Plusieurs auteurs ont observé qu' un coup de chaleur prolongé chez les rats induit une ischémie cérébrale, incluant des lésions dans le cervelet , le cortex, le striatum et le thalamus et un stress oxydant avec une surproduction de radicaux libres en circulation sous forme d' oxydant nitrique .

De grandes quantités d' espèces oxydantes réactives provoquent des dommages sur le cerveau et les rats ont des difficultés à apprendre et à mémoriser . Le test d' extinction de la lumière est utilisé pour évaluer l' aptitude des rats à faire la distinction entre un levier actif et un levier inactif dans une situation de conditionnement opérant . Le test du labyrinthe d' eau est utilisé pour déterminer la mémorisation spatiale à court terme et à long terme chez les rats . Des rats comportant de grandes quantités de radicaux libres en circulation sont incapables de passer ce test avec succès en un temps court et de le mémoriser correctement .

Pour évaluer les effets préventifs des polyphénols du cacao sur la production de radicaux libres après un coup de chaleur, des rats sont traités quotidiennement par voie orale avec deux EPC (EPC 1 et EPC 2 ) pendant 14 jours avant l' exposition à un coup de chaleur ( 40 ⁰ C, 120 min) . Deux tests d' apprentissage sont utilisés pour évaluer les effets préventifs des produits sur la déficience cognitive : le test d' extinction de la lumière et le test du labyrinthe d' eau de Morris . Les radicaux libres sont déterminés dans le sérum après un coup de chaleur et des rats sont testés dans les tests cognitifs pour évaluer leurs performances en comparaison avec deux groupes témoins (traités avec un véhicule, avec ou

6(J sans coup de chaleur) . La vitamine E (α-tocophérol) administré quotidiennement par voie orale à raison de 200 mg/kg de poids corporel/j our est utilisée comme agent antioxydant de référence . II a été observé que la teneur en radicaux libres dans le sang chez des rats traités avec de l' EPCl, de l' EPC 2 ou de la vitamine E puis exposés à un coup de chaleur est nettement plus faible que chez des rats témoins . Les rats traités avec de l' EPCl ou de 1 εPC2 présentent un faible nombre de pressages de levier totaux dans le test de l ' extinction de lumière . De plus , les rats traités avec de l' EPCl ont fait la distinction entre le levier actif et le levier inactif . Dans le labyrinthe d' eau de Morris , la latence pour atteindre la plate-forme des rats traités avec de l' EPCl et de 1εPC2 diminue au cours des essais .

Ainsi, l' administration quotidienne par voie orale et à titre préventif de l' EPCl , de 1εPC2 ou de vitamine E pendant 14 j ours protège les rats contre une surproduction de radicaux libres après un coup de chaleur et les préserve de déficiences cognitives .

1) Matériels et méthodes Animaux

Huit rats mâles de souche Wistar/Han IGS (Charles River Laboratories , 69-St-Germain sur l 'Arbresle - France) , pesant de 300 à 320 g sont utilisés . Lors de la réception, les rats sont logés, à raison de quatre par cage, dans des cages de polycarbonate de 48 x 27 x 20 cm (ϋ.A. R. , 91 - Epinay-Sur-Orge, France) dans un environnement régulé (humidité 50 ± 5% ; température 22 ± 1 °C; lumière de 2OhOO à 08h00, soit un cycle inversé lumière/obscurité : 12h/12h) . Les rats peuvent accéder librement à une alimentation standard (Granulés M20 , Dietex, 95 - Saint Gratien, France ) et à l' eau du robinet jusqu' au moment de l' expérience .

Après une période d' acclimatation de 7 j ours à partir de leur arrivée, les rats sont pesés et répartis aléatoirement en cinq groupes en fonction du traitement et de l' exposition à un coup de chaleur (n = 16) : véhicule sans coup de chaleur (eau de source) , véhicule/coup de chaleur (eau de source) , vitamine E/coup de chaleur (200 mg/kg de poids corporel/j vitamine E dans de l' huile d' olive, Xinchang Pharmaceuticals Factory, France) ; EPCl/coup de chaleur (22 , 9 mg/kg de poids corporel/j d' EPCl dans de l' eau de source, Barry Callebaut, France) , EPC2/coup de chaleur (24 , 3 mg/kg de poids corporel/j d' EPC2 dans de l' eau de source, Barry Callebaut , France) . Ainsi , la vitamine E est dissoute dans de l' huile d' olive contrairement à l' EPCl et à l ' EPc2 qui sont dissous dans de l' eau, et ceci dans un souci d' augmentation d' apport d' énergie . Tous les rats ayant reçu de l' EPCl, de 1εPC2 ou de la vitamine E sont exposés à un coup de chaleur .

Les rats sont pesés chaque j our pendant les quatorze j ours du traitement afin de déterminer la variation de leur poids' corporel . Les tests ont effectués en double aveugle et les comportements enregistrés sont évalués par les expérimentateurs sans qu' ils connaissent les produits administrés . Les rats utilisés dans la présente étude sont traités conformément aux règles établies par l' ASAB Ethical Committe (1993 ) et le Canadian Council on Animal Care ( 1993 ) . Toutes les procédures opératoires standard utilisées par ETAP étaient conformes au European Communities Council Directive . Produits Les EPCl et EPC2 sont des produits libres de solvants et contiennent respectivement 37 , 45% et 35, 40% de polyphénols totaux .

L' EPCl , 1εPC2 , la vitamine E ou le véhicule sont administrés par voie orale chez des rats pendant 14 j ours successifs (Jl à J14 ) . Après chaque administration quotidienne

du produit, les rats peuvent accéder librement à des granulés alimentaires standard .

Exposition à un coup de chaleur

Le 16 ^eme j our, après un j eun d' une nuit, les rats éveillés des différents groupes , à l' exception de ceux du groupe avec véhicule, sont exposés à un coup de chaleur en les plaçant dans une chambre commandée en température à 40 ⁰ C avec une humidité relative de 50% pendant 120 minutes . Les rats ont pu exprimer leur comportement thermorégulateur normal . Immédiatement après le coup de chaleur, les rats ayant une température rectale comprise entre 41 , 5 °C et 42 ⁰ C sont inclus dans l' étude . Les rats ont pu récupérer leur cage à 22 ⁰ C .

Radicaux libres dans le plasma du sang

Le 16 ^eme j our, 500 μl d' échantillons sanguins sont prélevés sur la veine de queue de 12 rats de chaque groupe dans des tubes contenant de l' héparine pour vérifier l' augmentation des radicaux libres après l' exposition au coup de chaleur . En se fondant sur la chimiluminescence de la pholasine, une photoprotéine du mollusque marin Pholas dactylus , la production de radicaux libres de leucocytes a été mesurée au moyen d' un kit (Knight Scientific, CeIl Activation Test Kits for Whole Blood with Adj uvant-K) par l' activation du complexe oxydase NADPH dans du sang dilué ( In CytoTox laboratory,

Nancy, France) . Performances cognitives

Test d' extinction de la lumière (test d' évitement d' un stimulus lumineux aversif )

Trois j ours après l' exposition au coup de chaleur, au j our 18 (J18 ) , les rats sont testés pour les effets antioxydants préventifs des deux EPC sur les performances d' apprentissage, en utilisant le test d' extinction de la lumière . Le dispositif expérimental consiste en une cage fortement éclairée ( 50 x 40 x 37 cm) . Le niveau de lumière dans la cage de test est de 1200 lux . Deux leviers sont inclus dans le dispositif :

W

un levier actif qui permet d' accéder à une période d' obscurité de 30 secondes lorsqu' il est pressé et un levier inactif . Pendant l' obscurité, le fait de presser sur le levier actif ne prolonge pas la période d' obscurité . Pendant la session de test, les rats sont placés individuellement dans la cage pendant 20 minutes pour apprendre à contrôler l' environnement lumineux. Le nombre de pressages de levier actif et de levier inactif est enregistré tout comme l' aptitude des rats à faire la distinction entre les deux leviers .

Test du labyrinthe d' eau de Morris (test du labyrinthe aquatique)

Le labyrinthe d ' eau de Morris ( 1984 ) permet de tester l ' aptitude à s ' orienter dans l ' espace, les processus d ' apprentissage et de mémorisation . Les 20 ^e et 21 ^e j ours (J20 et J21 ) , les rats sont testés dans le dispositif de labyrinthe d ' eau pour évaluer les performances d ' apprentissage spatial et leur mémoire à long terme . La procédure expérimentale consiste à entraîner des rats , le 20 ^e j our, à trouver une plate-forme cachée ( 10 mm au-dessous de la surface de l ' eau) à un emplacement fixe dans le réservoir d ' eau ( 150 cm de diamètre) dans une série de cinq essais à partir de la même position de départ .

Lors du premier essai , la plate-forme est placée contre la paroi du réservoir . Lors du deuxième essai la plate-forme est placée à 5 cm de la paroi du réservoir pour permettre aux rats de trouver facilement la plate-forme . Pendant les trois essais suivants , la plate-forme est placée à 10 cm de la paroi du réservoir . Chaque essai est suivi d ' une période de repos de 30 secondes sur la plate-forme .

Le 21e j our, la plate-forme est placée à distance de la paroi du réservoir au même emplacement que lors de la session du 20 ^e j our et la mémoire à long terme des rats est testée en un seul essai .

o4

La variable enregistrée dans le réservoir d ' eau est le temps de latence requis pour sortir de l ' eau et atteindre la plate-forme servant de refuge aménagé dans le bassin .

Statistiques L ' analyse de la variance (ANOVA) est utilisée pour comparer les cinq groupes . Lorsque l ' on observe un résultat significatif, l' ANOVA est suivie du test t de Dunnett pour comparer les groupes traités aux groupes témoins . En ce qui concerne les mesures répétées, un test t apparié (bilatéral ) est utilisé dans chaque groupe . Les résultats sont exprimés sous la forme d ' une moyenne ± écart type (SEM) . Toutes les analyses statistiques sont effectuées en utilisant le progiciel de statistiques StatView®5 ( SAS, Inc . , USA) . En ce qui concerne toutes les comparaisons, les différences sont considérées comme étant significative au niveau P <0 , 05.

2) Résultats

Variation de poids

Comme représenté dans le tableau 5 ci-dessous , aucune différence significative n ' a été observée pendant la période de traitement de 14 j ours dans les poids corporels des rats des 5 groupes .

Tableau 5

Variation du poids corporel (g) (Moyenne ± SEM)

Jour 1 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

-π m Véhicule 328.9 336.8 339.8 342.8 346.9 349.2 352.3 356.3 359.7 363.3 366.9 371.0 373.9

C ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ι- 13.6 13.6 12.8 13.5 13.8 13.6 13.8 13.8 13.3 12.6 12.9 13.1 11.8 m Véhicule/HS 322.2 329.3 331.9 334.6 339.3 342.4 345.3 348.9 352.8 355.5 359.0 363.2 368.1

D m ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±

TJ 13.8 13.4 13.0 12.5 12.5 13.6 14.2 14.0 14.0 13.9 14.8 15.4 15.2 m - CPE 1/HS 325.8 333.4 336.1 340.0 344.0 346.8 350.6 354.1 358.2 361.4 363.6 368.4 371.8

≤^

± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±

Ys 8.8 1 1.1 10.6 11.1 11.6 11.0 11.5 12.6 12.6 11.9 12.6 12.7 12.6

O CPE 2/HS 325.1 332.5 335.6 340.0 344.2 346.9 349.0 352.8 355.5 358.6 361.9 366.3 368.8 m ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± m 12.1 12.3 1 1.6 10.9 9.7 11.0 11.1 11.1 10.0 9.9 11.0 10.9 11.2

Z H Vitamine E/HS 320.9 328.9 330.6 333.9 336.6 339.4 342.1 344.3 348.7 351.6 354.6 357.6 361.0

± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± m 15.4 15.8 15.7 16.5 15.9 17.3 17.2 15.6 17.8 18.0 18.8 19.4 18.4

O ANOVA m F(4,75) 0.64 0.62 0.84 0.93 1.1 1 0.91 0.93 1.26 1.06 1.22 1.10 1.34 1.27 ro σ> Caractère NS NS NS NS NS NS NS NS NS NS NS NS NS significatif

En conséquence, les produits n ' ont pas induit d' effets toxicologiques après l' administration sub-chronique de 14 j ours .

Coup de chaleur et teneurs en radicaux libres dans le plasma

Le lβ ^eme j our, l ' analyse de la variance montre une importante hétérogénéité dans les teneurs en radicaux libres dans les cinq groupes .

Comme représenté dans le tableau 6 ci-dessous , les rats « véhicule/coup de chaleur » présentent une importante quantité de radicaux libres en circulation par rapport à ceux des autres groupes .

Tableau 6 Teneur en radicaux libres dans le plasma le 16 ^e jour (m V)

(Moyenne ± SEM)

Groupes (*) Véhicle/HS > Véhicule CPE 1/HS CPE 2/HS Vitamine

E/HS

(n = 13) (π = 14) (n = 14) (n = 14)

(n = 13)

Teneur en radicaux 1257.46 ± 163 .79 310.07 ± 300.79 ± 281.68 ± 44.84 31 1.15 ± 20.56 libres 19.55 1 1.31

ANOVA: F _(4j5 3) = 421.66; p < 0.001

Test t de Dunett

(vs. Véhicule/HS) - t = 21.51 t = 21.83 t = 21.47 t - 20.67

Caractère p < 0.001 p < 0.001 p < 0.001 p < 0.001 significatif

(*) Certains échantillons ont été hémolyses et n'ont pas pu être analysés.

Après le coup de chaleur, les radicaux libres en circulation chez les rats Véhicule/coup de chaleur augmente de façon significative en comparaison avec ceux des rats Véhicule, ce qui indique la capacité du coup de chaleur à induire un stress oxydant important .

Les teneurs en radicaux libres chez les rats EPCl/coup de chaleur, EPC2/coup de chaleur et Vitamine E/coup de chaleur sont nettement inférieures à celles des rats Véhicule/coup de chaleur, ce qui montre une protection de l ' organisme contre la production de radicaux libres après une administration subchronique de l' EPCl, 1εPC2 ou de la vitamine E . La différence de teneurs en radicaux libres entre le groupe Véhicule/coup de chaleur et Vitamine E/coup de chaleur ou entre les groupes EPCl/coup de chaleur ou EPC2/coup de chaleur doit être due aux effets antioxydants de la vitamine E, de l' EPCl ou de 1 εPC2 eux-mêmes .

Performances cognitives Test d' extinction de la lumière Nombre total de pressages de levier : Comme représenté dans le tableau 7 ci-dessous , aucune différence significative n' a été observée dans le nombre total de pressages de levier pour les rats des cinq groupes .

Tableau 7

Nombre total de pressages de levier (Moyenne ± SEM)

Groupes Véhicule Véhicule/HS CPE 1/HS CPE 2/HS Vitamine E/HS (n = 16 / group)

Pressages totaux 32.88 ± 6.34 42.75 ± 5.84 26.81 ± 4.52 24.69 ± 4.71 42.38 ± 5.76 de levier

ANOVA: F,4. ₇₅ ) = 2.39; NS

Test t non appairé (vs. Véhicule) t = 1.15 t = 0.78 t = 1.04 t = 1.11

Caractère significatif NS NS NS NS

Test t non appairé (vs. Véhicule/HS) t = 2.16 t = 2.41 t = 0.05 Caractère significatif p < 0.05 p < 0.05 NS

Discrimination des leviers :

Comme représenté dans le tableau 8 , les rats des groupes

Véhicule, Vitamine E/coup de chaleur et EPCl/coup de chaleur ont pressé davantage le levier actif que le levier inactif .

Les rats du groupe EPC2/coup de chaleur ont seulement tenté de

faire la distinction entre le levier actif et le levier inactif . Les rats Véhicule/coup de chaleur n ' ont fait aucune distinction entre les deux leviers .

Tableau 8

Distinction entre leviers

Nombre de pressages de levier actif (ALP) vs. Nombre de pressages de levier inactif

(ILP) (moyenne ± SEM)

Groupes Véhicule Véhicule/HS VitamineE/HS CPE 1/HS CPE 2/HS

(n = 16 / group) #

ALP 20.38 ± 3.96 23.19 ± 3.35 27.28 ± 3.54 15.63 ± 2.82 14. 19 ± 2.76

ILP 12.50 ± 3.13 19.56 ± 2.93 17.60 ± 2.47 11.19 ± 1.87 10.: 50 ± 2.41

Test t appairé t = 2.40 t = 1.55 t = 3.81 t = 2.85 t = 1.71

(ALP vs. ILP) p < 0.05 NS p < 0.005 P < 0.05 P = 0.10

# un rat a été écarté de l'analyse statistique car il n'avait pas pressé le levier inactif pendant le test (VitamineE/HS : n = 15)

Lors du test d ' extinction de la lumière, le nombre total de pressages de levier pour les rats des cinq groupes n ' indique aucune différence significative . Les rats des groupes Véhicule, Vitamine E/coup de chaleur et EPCl/coup de chaleur pressent davantage le levier actif que le levier inactif . Les rats traités avec EPC2/coup de chaleur ont seulement tendance à presser le levier actif plus que le levier inactif, tandis que ceux traités avec du Véhicule/coup de chaleur ne font aucune distinction entre le levier actif et le levier inactif .

Test du labyrinthe d ' eau de Morris

Dans l ' essai 1 , l ' analyse de la variance montre une différence significative dans le temps de latence pour atteindre la plate-forme chez les cinq groupes de traitement . Le test t de Dunnett montre que la latence pour atteindre la plate-forme chez les rats Véhicule/coup de chaleur est nettement inférieure à celle des autres rats .

Dans les autres essais, l ' analyse de la variance ne montre aucune hétérogénéité significative de la latence dans le temps pour atteindre la plate-forme chez les cinq groupes .

Tableau 9

Test du labyrinthe d' eau de Morris Latence pour atteindre la plate-forme :s) (Moyenne ± SEM)

Jour 20 Jour 21

Group es Essai 1 Essai 2 Essai 3 Essai 4 Essai 5 Essai 6

(n = 16 /groupe)

Véhicule 48.81 29.56 27.38 18.50 14.38 12.12

± ± ± ± ± ±

7.43 5.41 4.45 2.94 3.04 2.25

29.69 35.56 21.00 13.94 14.19 12.50

VéhicuIe/HS ± ± ± ± ± ±

2.73 7.55 4.62 1.32 2.05 1.71

43.81 38.88 22.81 17.50 11.94 10.19

CPE 1/HS ± ± ± ± ± ±

5.52 7.29 4.45 3.78 1.70 1.28

54.88 25.25 17.63 12.25 8.63 12.69

CPE 2/HS ± ± ± ± ± ±

6.37 4.89 2.73 1.49 1.07 2.66

51.75 25.38 26.44 17.75 13.56 14.69

VitamineE/HS ± ± ± ± ± ±

6.45 4.94 5.20 2.44 1.37 2.22

ANOVA F ₍ 4,75) — 2.78 -(4,75)= 1-00 F, (4.75) = 0.84 F _(4,75) =1.14 F ₍₄ ,75)=1.47 F ₍₄ , ₇₅ ) = 0.60

Caractère p < 0.05 NS NS NS NS NS significatif

L' essai 3 est l ' essai de référence car la plate-forme a été écartée de la paroi du labyrinthe d ' eau de sorte que les rats ne l' atteignent pas par hasard .

Le test t apparié montre que les rats du groupe Véhicule ont amélioré de façon significative leur latence à atteindre la plate-forme entre l ' essai 3 et les essais 4 , 5 et 6. Les rats du groupe Véhicule/coup de chaleur n ' ont pas amélioré leur latence entre l ' essai 3 et les essais 4 , 5 et 6. Les rats du groupe Vitamine E/coup de chaleur n ' ont pas amélioré leur latence entre l' essai 3 et l' essai 4 et l' ont amélioré de façon significative entre l' essai 3 et l' essai 5 et ont

tendance à l' améliorer entre l' essai 3 et l' essai 6. Les rats du groupe EPCl/coup de chaleur n ' ont pas amélioré leur latence entre l' essai 3 et l' essai 4 et l' ont amélioré de façon significative entre l' essai 3 et les essais 5 et β . Les rats du groupe EPC2/coup de chaleur ont tendance à améliorer leur latence entre l ' essai 3 et l' essai 4 , à l ' améliorer de façon significative entre l' essai 3 et l' essai 5 et ont tendance à l ' améliorer entre l ' essai 3 et l' essai 6.

Les rats du groupe Véhicule/coup de chaleur ne présentent aucune amélioration significative dans tout le test .

Tableau 10

Test du labyrinthe d'eau de Morris : comparaison des essais entre eux

Groupes

Essai 3 vs. Essai 4 Essai 3 vs. Essai 5 Essai 3 vs. Essai 6

(n = 16 /group)

Véhicule t = 2.26 t = 2.54 t = 3.27 p < 0.05 p < 0.05 p < 0.01

Véhicule/HS t ≈ 1.52 t= 1.38 t= 1.75

NS NS NS

CPE 1/HS t = 1.15 t = 2.46 t = 2.72

NS p < 0.05 p < 0.05

CPE 2/HS t = 1.95 t = 3.86 t = 2.08 p < 0.08 p < 0.005 p < 0.06

VitamineE/HS t= 1.57 t = 2.34 t = 2.11

NS p < 0.05 p < 0.06

3) Discussion et conclusion

Plusieurs études ont montré l ' activité anti-oxydante des flavonoïdes chez les êtres humains par absorption rapide d' épicatéchines dans le sérum après consommation de chocolat ou infusion de thé vert . En présence des polyphénols de cacao, l ' oxydation des lipoprotéines de faible densité diminue . Il a également été relaté que la catéchine et l' épicatéchine ont été absorbés de façon compétitive dans le tractus gastrointestinal des rats . Une importante variation de la teneur totale en phénols dans chaque type de chocolat et de cacao a aussi été décrite .

_ _

71

C ' est la raison pour laquelle il a semblé important d ' étudier l ' activité antioxydante de chaque extrait spécifique en fonction du processus de production et de l ' origine du cacao . Les effets antioxydants préventifs des deux EPC, administrés par voie orale pendant 14 j ours , ont été évalués en se fondant sur la surproduction de radicaux libres et sur les déficiences cognitives après exposition à un coup de chaleur chez des rats Wistar mâles . Les teneurs en radicaux libres dans le plasma et les effets antioxydants des deux produits ont été déterminés in vi tro après le coup de chaleur le 16 ^e j our . Le test d ' extinction de la lumière a été effectué le 18 ^e j our et le test de labyrinthe d' eau de Morris a été effectué le 20 ^e j our et le 21 ^e j our . Ces tests cognitifs ont été utilisés pour évaluer les effets préventifs des extraits de cacao sur les déficiences cognitives induites par une surproduction de radicaux libres à la suite de l ' exposition à un coup de chaleur . Conclusion : Ces résultats suggèrent que la vitamine E (200 mg/kg poids corporel/jour) , l' EPCl (22 , 9 mg/kg poids corporel/j our) et 1εPC2 (24 , 3 mg/kg poids corporel/j our) , administrés par voie orale pendant 14 j ours successifs , protègent les rats des déficiences cognitives induites par le coup de chaleur (c ' est- à-dire la discrimination d ' apprentissage dans le test d ' extinction et l ' apprentissage spatial dans le test du labyrinthe d ' eau de Morris ) .

Pour utiliser de façon profitable ces deux riches sources polyphénoliques , il est nécessaire d' enrichir la poudre de cacao ou d' autres produits à base de chocolat avec des EPC . Les propriétés anti-oxydantes des EPC seront évaluées après leur incorporation dans des produits alimentaires .

Exemple 10 Evaluation des effets préventifs d' un extrait polyphénolique de cacao administré par voie orale à 2 doses sur le développement de tumeurs de la prostate chimio induites chez le rat mâle adulte de souche Wistar Unilever . A) Rapport d' étude n° l

Le but de l ' étude n° l ci-après est d' évaluer les effets préventifs d' un EPC administré quotidiennement par voie orale à la dose de 24 mg/kg de poids corporel ou de 48 mg/kg de poids corporel sur le développement de tumeurs de la prostate chimio-induites et d' évaluer les effets de l' EPC sur les performances cognitives chez des rats mâles de souche Wistar Unilever .

1. Protocole Animaux 75 rats mâles de souche Wistar Unilever pesant de 250 à 275 g sont utilisés .

Conditions d' élevage

Température : 22 + 1 ⁰ C, hygrométrie : 50 + 10 % , cycle inversé lumière/obscurité : 12h/12 h . Groupes de traitement

5 groupes de 15 rats sont utilisés : groupe « témoin » : pas de chimio-induction ni de traitement ;

- groupe « Véhicule » : pas de chimio-induction et traitement par le véhicule servant de placebo ; groupe « Chimio-induction contrôle » : traitement par le placebo ;

- groupe « Chimio-induction + EPC 24 » : traitement par l' EPC à 24 mg/kg ; - groupe « Chimio-induction + EPC 48 » : traitement par l' EPC à 48 mg/kg.

Randomisation des animaux

En fonction du poids corporel au j our JO .

Induction des tumeurs de la prostate

^

L' induction se fait en 2 étapes :

- étape d' initiation = inj ection intraveineuse unique de MNU à la dose de 35 mg/kg ;

- étape d' activation = une semaine plus tard, implantation sous-cutanée d' un tube en silastique de 2 cm de long bouché à une extrémité par une colle biologique et contenant 40 mg de propionate de testostérone (PT) .

L' étape d' activation a été répétée 3 fois à 2 mois d' intervalle . Substances étudiées

Extrait polyphénolique de cacao (EPC) à deux doses : 24 mg/kg de poids corporel et 48 mg/kg de poids corporel .

Voie d' administration

Gavage par voie orale . Durée du traitement

Pendant 38 semaines , du lundi au vendredi, avec une pause le samedi et dimanche .

Début du traitement

2 semaines après l ' induction de tumeurs de la prostate . Critères d' évaluation

Poids corporel, consommation de nourriture et d' eau, examens histopathologiques de la prostate .

Tests cognitifs

Test d' évitement d' un stimulus lumineux aversif (TESLA) effectué 2, 4 , 6 et 8 mois après l' induction de tumeurs de la prostate et épreuve du labyrinthe aquatique de Morris effectuée 5 et 8 mois après l' induction de tumeurs de la prostate .

Sacrifice des animaux Six des animaux de chaque groupe sont sacrifiés 9 mois après l' induction de tumeurs de la prostate pour effectuer des examens histopathologiques .

Analyses statistiques

Analyse de variance suivie par un test t non apparié

(bilatéral ) pour les comparaisons des poids corporels des animaux ; test de Kruskal-Wallis suivi d' un test Mann-

Whitney ϋ pour les comparaisons de la consommation de nourriture et d' eau et des performances aux tests cognitifs .

2. Résultats

Durant les 9 mois de l' expérience, le gain de poids corporel a été significativement plus élevé chez les animaux des groupes « Témoin » et « Véhicule » que chez ceux soumis à une chimio-induction traités par voie orale par le véhicule ou l' EPC à 24 ou 48 mg/kg (voir figure 43 ) .

En ce qui concerne le gain de poids corporel , aucune différence significative n' a été observée entre les groupes « Témoin » et « Véhicule » . De même, aucune différence significative n' a été observée entre les animaux des groupes soumis à une chimio-induction traités par voie orale par le véhicule ou par l' EPC à 24 ou 48 mg/kg ( figure 43 ) .

Entre la semaine 1 et la semaine 14 , aucune différence significative n' a été détectée entre les 5 groupes en ce qui concerne la consommation de nourriture ( figure 44 ) .

Entre la Semaine 15 et la Semaine 39, la consommation de nourriture a été significativement plus élevée chez les animaux des groupes soumis à une chimio-induction traités par voie orale par le placebo ou par l' EPC à 24 ou 48 mg/kg que chez ceux des groupes « Témoin » et « Véhicule . »

Entre la Semaine 1 et la Semaine 5 , aucune différence significative n' a été détectée entre les 5 groupes en ce qui concerne la consommation d' eau ( figure 45 ) .

Entre la Semaine 5 et la Semaine 39 , la consommation d' eau a été significativement plus élevée chez les animaux des groupes soumis à une chimio-induction traités par voie orale par le placebo ou par l' EPC à 24 ou 48 mg/kg que chez ceux des groupes « Témoin » et « Véhicule . »

Entre la Semaine 16 et la Semaine 39, la consommation

^

d' eau des groupes soumis à une chimio-induction et un traitement par voie orale a été significativement plus élevée chez les animaux exposés au placebo que chez ceux qui recevaient l' EPC à 24 ou 48 mg/kg . Au test TESLA et dans l' ensemble (c' est à dire durant les 4 sessions de tests et répétitions du test) , le nombre total moyen d' appuis sur les leviers a été invariablement plus élevé chez les animaux des groupes soumis à une chimio-induction traités par voie orale par l' EPC à 24 ou 48 mg/kg (figure 46) . Le nombre total moyen d' appuis sur les leviers les plus bas a été enregistré chez les animaux soumis à une chimio-induction traités par voie orale par le placebo .

Aux premier, deuxième et troisième tests TESLA et aux répétitions du test effectuées 2 ( figure 47 ) , 4 ( figure 48 ) et 6 mois (figure 49) après l' induction de tumeurs de la prostate , les nombres d' appuis sur le levier actif les plus élevés ont été mesurés chez les animaux des groupes soumis à une chimio-induction traités par voie orale par l' EPC à 24 ou 48 mg/kg et ceux des groupes « Témoin » et « Véhicule . » Dans tous les cas, les nombres d' appuis sur le levier actif ont été significativement plus élevés dans les groupes soumis à une chimio-induction traités par voie orale par l' EPC à 24 ou 48 mg/kg que dans les autres groupes, et une discrimination entre le levier actif et le levier inactif a été rapportée chez ces animaux .

Au quatrième test TESLA et aux répétitions du test effectuées 8 mois après l' induction de tumeurs de la prostate, les animaux (figure 50 ) des groupes soumis à une chimio- induction traités par voie orale par l' EPC à 24 ou 48 mg/kg et ceux des groupes « Témoin » et « Véhicule » ont appuyé plus souvent sur le levier actif que sur le levier inactif . Les nombres d' appuis sur le levier actif ont été significativement plus élevés dans le groupe soumis à une chimio-induction traité par voie orale par l' EPC à 24 mg/kg que dans les autres

groupes . Le nombre d' appuis sur le levier inactif le plus élevé a été enregistré dans le groupe d' animaux soumis à une chimio-induction traités par le placebo .

à la première épreuve du labyrinthe aquatique de Morris effectuée 5 mois après l' induction de tumeurs de la prostate, les courbes ont été similaires dans les groupes soumis à une chimio-induction traités par voie orale par l' EPC à 24 ou

48 mg/kg et dans les groupes « Témoin » et « Véhicule » durant les 5 essais de la session d' apprentissage . Le temps de latence moyen a été significativement plus élevé chez les animaux soumis à une chimio-induction traités par le placebo que chez ceux des autres groupes . à la session test , les temps de latence moyens ont été significativement plus longs chez les animaux des groupes soumis à une chimio-induction traités par le placebo ou l' EPC à 24 ou 48 mg/kg que chez ceux des groupes « Témoin » ou « Véhicule . » (figure 51 ) .

à la deuxième épreuve du labyrinthe aquatique de Morris effectuée 8 mois après l' induction de tumeurs de la prostate, les courbes ont été similaires dans les groupes soumis à une chimio-induction traités par voie orale par l' EPC à 24 mg/kg et dans les groupes « Témoin » et « Véhicule » durant les

5 essais de la session d' apprentissage et à la session de test . Les temps de latence moyens ont été significativement plus élevés chez les animaux soumis à une chimio-induction traités par le placebo ou l' EPC à 48 mg/kg que chez ceux des autres groupes , et le temps de latence moyen a été significativement plus long chez les animaux du groupe soumis à une chimio-induction traités par le placebo que chez ceux du groupe soumis à une chimio-induction recevant l' EPC à 48 mg/kg ( figure 52 ) .

Les observations qui suivent ont été rapportées aux examens histopathologiques de la prostate effectués chez 6 des animaux de chaque groupe sacrifiés 9 mois après l' induction de tumeurs de la prostate . Il a été observé :

1 hyperplasie focale dans les 5 groupes de rats ;

1 hyperplasie diffuse dans les groupes « Témoin » et

« Véhicule », 2 dans le groupe soumis à une chimio-induction traité par voie orale par l' EPC à 24 mg/kg et 3 dans les groupes soumis à une chimio-induction traités par voie orale par le placebo ou l' EPC à 48 mg/kg ;

1 adénome prostatique dans le groupe soumis à une chimio- induction traité par voie orale par l' EPC à 48 mg/kg et 2 dans le groupe soumis à une chimio-induction traité par voie orale par le placebo ;

1 lymphome prostatique dans le groupe soumis à une chimio- induction traité par voie orale par l' EPC à 48 mg/kg et 2 dans le groupe soumis à une chimio-induction traité par voie orale par le placebo . Aucun adénome ni lymphome prostatique n' a été détecté dans le groupe soumis à une chimio-induction traité par l' EPC à 24 mg/kg ou dans les groupes « Témoin » et « Véhicule » .

3. Conclusion

Aucune différence significative n' a été détectée en ce qui concerne les gains de poids corporel entre les groupes soumis à une chimio-induction traités par voie orale par le placebo ou l' EPC à 24 ou 48 mg/kg . Les gains de poids corporel ont été significativement plus élevés dans les groupes « Témoin » et

« Véhicule » que dans ceux soumis à une chimio-induction traités par voie orale par le placebo ou l' EPC à 24 ou

48 mg/kg.

La consommation de nourriture a été significativement plus élevée entre la semaine 15 et la semaine 39 dans les groupes soumis à une chimio-induction traités par voie orale par le placebo ou l' EPC à 24 ou 48 mg/kg que dans les groupes

« Témoin » et « Véhicule . »

La consommation d' eau a été significativement plus élevée entre la semaine 5 et la semaine 39 dans les groupes soumis à une chimio-induction traités par voie orale par le placebo ou

l' EPC à 24 ou 48 mg/kg que dans les groupes « Témoin » et « Véhicule . » Entre la semaine 15 et la semaine 39 , la consommation d' eau a été significativement plus élevée dans le groupe soumis à une chimio-induction traité par voie orale par le placebo que dans les deux autres groupes soumis à une chimio-induction traités par voie orale par l' EPC à 24 ou 48 mg/kg .

Dans le test d' évitement d' un stimulus lumineux aversif (TESLA) , les performances d' apprentissage et de mémorisation des rats des groupes soumis à une chimio-induction traités par voie orale par l' EPC à 24 ou 48 mg/kg ont été significativement meilleures que celles des animaux des autres groupes .

Dans l' épreuve du labyrinthe aquatique de Morris , les performances d' apprentissage et de mémorisation des rats des groupes soumis à une chimio-induction traités par voie orale par l' EPC à 24 ou 48 mg/kg ont été significativement meilleures que celles des animaux du groupe soumis à une chimio-induction traités par voie orale par le placebo . Les performances de mémorisation des rats du groupe soumis à une chimio-induction traités par voie orale par l' EPC à 24 mg/kg ont été comparables à celles des animaux des groupes « Témoin » et « Véhicule . »

Les lésions les plus importantes détectées 9 mois après l' induction de tumeurs de la prostate, c' est-à-dire un adénome ou un lymphome prostatiques, ont été rapportées uniquement dans les groupes soumis à une chimio-induction traités par voie orale par le placebo ou par l' EPC à 48 mg/kg . Des lésions de ce type n' ont pas été observées dans le groupe soumis à une chimio-induction traité par l' EPC à 24 mg/kg ni dans les groupes « Témoin » et « Véhicule » .

Administré à la dose de 24 mg/kg, l' EPC confère une protection contre les tumeurs de la prostate chimio-induites chez le rat .

Rapport d' étude n°2 : Poursuite du rapport d' étude n° l pendant 6 mois

Le but de l ' étude n°2 ci-après est de prolonger l ' étude n° l ci-dessus décrite et d' évaluer les effets préventifs d' un EPC administré quotidiennement à la dose de 24 mg/kg de poids corporel ou de 48 mg/kg de poids corporel sur le développement de tumeurs de la prostate chimio-induites et d' évaluer les effets de l' EPC sur les performances cognitives chez des rats mâles de souche Wistar Unilever . 1. Protocole Animaux

45 rats mâles de souche Wistar Unilever pesant de 250 à 275 g au début de l' expérience sont utilisés .

Conditions d' élevage Température : 22 ± 2 °C, hygrométrie : 50 + 10 % , cycle inversé lumière/obscurité : 12h/12 h .

Groupes de traitement 5 groupes de 9 rats sont utilisés : groupe « témoin » : pas de chimio-induction ni de traitement ;

- groupe « Véhicule » : pas de chimio-induction et traitement par le véhicule servant de placebo ; groupe « Chimio-induction contrôle » : traitement par le placebo ; - groupe « Chimio-induction + EPC 24 » : traitement par l' EPC à 24 mg/kg ;

- groupe « Chimio-induction + EPC 48 » : traitement par l' EPC à 48 mg/kg .

Induction des tumeurs de la prostate L' induction se fait en 2 étapes pendant 9 mois avant la réalisation de la présente étude :

- étape d' initiation = inj ection intraveineuse unique de MNU à la dose de 35 mg/kg ;

- étape d' activation = une semaine plus tard, implantation sous-cutanée d' un tube en silastique de 2 cm de long bouché à une extrémité par une colle biologique et contenant 40 mg de propionate de testostérone ( PT) . L' étape d' activation a été répétée 3 fois à 2 mois d' intervalle .

Substances étudiées ,

Extrait polyphénolique de cacao (EPC) à deux doses : 24 mg/kg de poids corporel et 48 mg/kg de poids corporel . Voie d' administration

Gavage par voie orale .

Durée du traitement

Pendant 26 semaines , du lundi au vendredi , avec une pause le samedi et dimanche . Début du traitement

2 semaines après l' induction de tumeurs de la prostate .

Critères d' évaluation

Poids corporel , consommation de nourriture et d' eau, niveaux de dopamine, de catécholamines et de créatinines dans les urines , examens histopathologiques de la prostate .

Tests cognitifs

Test d' évitement d' un stimulus lumineux aversif (TESLA) et test du labyrinthe aquatique de Morris effectué 11 et 13 mois après l' induction de tumeurs de la prostate . Analyses statistiques

Analyse de variance suivie par un test t non apparié

(bilatéral ) pour les comparaisons des poids corporels des rats ; test de Kruskal-Wallis suivi d' un test Mann-Whitney U pour les comparaisons de la consommation de nourriture et d' eau et des performances aux tests cognitifs .

2. Résultats

Durant les 4 premiers mois de l' expérience, le gain de poids corporel des groupes « Témoin » et « Véhicule » a été significativement plus élevé que chez ceux des trois groupes

soumis à une chimio-induction traités par voie orale avec le groupe véhicule ou l' EPC à 24 ou 48 rαg/kg (voir figure 53 ) .

En ce qui concerne le gain de poids corporel, aucune différence significative n' a été observée entre les groupes « Témoin » et « Véhicule » . De même, aucune différence significative n' a été observée entre les animaux des groupes soumis à une chimio-induction traités par voie orale par le véhicule ou par l' EPC à 24 ou 48 mg/kg ( figure 53 ) .

La consommation de nourriture des groupes chimio-induits , traités par voie orale avec le véhicule ou avec l' EPC à 24 ou 48 mg/kg, est significativement plus importante que celles des groupes « témoin » et « véhicule » ( figure 54 ) .

La consommation d' eau chez les animaux des groupes soumis à une chimio-induction traités par voie orale par l' EPC à 24 ou 48 mg/kg, n' est pas différente de celles des groupes « Témoin » et « Véhicule » . La consommation d' eau chez les animaux des groupes soumis à une chimio-induction traités par voie orale avec le véhicule est significativement plus importante que celles des animaux des groupes soumis à une chimio-induction traités par voie orale par l' EPC à 24 ou 48 mg/kg et les groupes « Témoin » et « Véhicule » (figure 55 ) .

Au test TESLA et répétitions de tests , réalisés 11 mois après l' induction de tumeurs de prostate, les animaux des groupes soumis à une chimio-induction traités par voie orale par l' EPC à 24 ou 48 mg/kg et les groupes « témoin » et « véhicule » présentent le niveau d' activité le plus élevé en terme d' appuis de leviers et un nombre d' appuis sur le levier actif plus élevé que sur le levier inactif . Les nombres d' appuis totaux des rats sur les leviers ont été plus importants dans les groupes soumis à une chimio-induction traités par voie orale par l' EPC à 24 mg/kg et ont été plus faibles dans les groupes soumis à une chimio-induction traités par voie orale par un véhicule . Les groupes soumis à une

OZ

chimio-induction traité par voie orale par l' EPC à 24 mg/kg présentent un nombre d' appuis sur les leviers actifs plus élevé que sur les leviers inactifs et les groupes d' animaux soumis à une chimio-induction traités par voie orale par le véhicule présentent un nombre d' appuis plus important sur les leviers inactifs .

Au test TESLA et répétitions de tests , réalisés 13 mois après l' induction de tumeurs de prostate, les animaux des groupes soumis à une chimio-induction traités par voie orale par l ' EPC à 24 ou 48 mg/kg et les groupes « témoin » et « véhicule » présentent le niveau d' activité le plus élevé en terme d' appuis de leviers et un nombre d' appuis sur le levier actif plus élevé que sur le levier inactif . Dans tous les cas , les animaux des groupes soumis à une chimio-induction traités par voie orale par l' EPC à 24 mg/kg ou 48 mg/kg, présentent un nombre d' appuis significativement plus élevé sur les leviers actifs que les animaux des autres groupes et ils font une différence entre le levier actif et inactif . Les groupes soumis à une chimio-induction traités par voie orale par le véhicule présentent un nombre d' appuis plus important sur les leviers inactifs .

Pour l ' épreuve du labyrinthe aquatique de Morris effectuée 11 mois après l ' induction de tumeurs de la prostate, les courbes ont été similaires dans les groupes soumis à une chimio-induction traités par voie orale par l' EPC à 24 mg/kg et dans les groupes « Témoin » et « Véhicule » durant les

5 essais de la session d' apprentissage et de la session test

( figure 59) . Le temps de latence moyen a été significativement plus élevé chez les animaux soumis à une chimio-induction traités par voie orale par l' EPC à 48 mg/kg que chez ceux des autres groupes . Les temps de latence moyens ont été significativement plus longs chez les animaux des groupes soumis à une chimio-induction traités par voie orale par le véhicule que chez ceux des groupes soumis à une chimio-

OJ

induction traités par voie orale par l' EPC à 48 mg/kg ( figure 59) .

à la deuxième épreuve du labyrinthe aquatique de Morris effectuée 13 mois après l' induction de tumeurs de la prostate, les courbes ont été similaires dans les groupes soumis à une chimio-induction traités par voie orale par l' EPC à 24 mg/kg et dans _' les groupes « Témoin » et « Véhicule » durant les 5 essais de la session d' apprentissage et de la session de test . Les temps de latence moyens ont été significativement plus élevés chez les animaux soumis à une chimio-induction traités par voie orale par le véhicule ou l' EPC à 48 mg/kg que chez ceux des autres groupes . Aucune différence n' a été observée entre les temps de latence moyens chez les animaux du groupe soumis à une chimio-induction traités par voie orale par le véhicule ou par l' EPC à 48 mg/kg ( figure 60 ) .

Pour les deux mesures du niveau de dopamine, de catecholamines et de créatinine dans les urines , effectuées à 9 et 12 mois après induction de tumeurs de la prostate, les groupes d' animaux chimio-induits traités par voie orale par l' EPC à 24 ou 48 mg/kg ont présentés des niveaux de dopamine similaires à ceux des groupes « témoin » et « véhicule » . Les groupes chimio-induits traités par voie orale par le véhicule présentent des niveaux de dopamine significativement plus bas (figures 61 et 62 ) . 3. Conclusion

Aucune différence significative n' a été détectée, durant les 4 premiers mois de l' expérience, en ce qui concerne les gains de poids corporel entre les groupes soumis à une chimio- induction traités par voie orale par le véhicule ou l' EPC à 24 ou 48 mg/kg . Cependant , les gains de poids corporel ont été significativement plus élevés dans les groupes « Témoin » et « Véhicule » que dans ceux soumis à une chimio-induction traités par voie orale par le véhicule ou l' EPC à 24 ou 48 mg/kg .

Durant les 4 premiers mois de l' expérience , la consommation de nourriture a été significativement plus élevée dans les groupes soumis à une chimio-induction traités par voie orale par le véhicule ou l' EPC à 24 ou 48 mg/kg que dans les groupes « Témoin » et « Véhicule» .

Durant les 4 premiers mois de l' expérience, aucune différence significative n' a été relevée en ce qui concerne la consommation d' eau chez les rats entre les groupes soumis à une chimio-induction traités par voie orale par l' EPC à 24 ou 48 mg/kg et les groupes « Témoin » et « Véhicule » . La consommation d' eau a été significativement plus élevée dans le groupe soumis à une chimio-induction traité par voie orale par le véhicule que dans les autres groupes soumis à une chimio- induction traités par voie orale par l' EPC à 24 ou 48 mg/kg et les groupes « Témoin » et « Véhicule » durant le même période .

Dans les deux tests d' évitement d' un stimulus lumineux aversif (TESLA) , les performances d' apprentissage et de mémorisation des rats des groupes soumis à une chimio- induction traités par voie orale par l' EPC à 24 ou 48 mg/kg ont été significativement meilleures que celles des animaux des autres groupes .

Dans les deux épreuves du labyrinthe aquatique de Morris, les performances d' apprentissage et de mémorisation des rats des groupes soumis à une chimio-induction traités par voie orale par l' EPC à 24 mg/kg ont été significativement meilleures que celles des animaux des groupes soumis à une chimio-induction traités par voie orale par le véhicule ou l' EPC à 48 mg/kg .

Les niveaux de dopamine, de catecholamines et de créatinine dans les urines des rats des groupes chimio-induits traités par voie orale par l' EPC à 24 ou 48 mg/kg, sont comparables à ceux observés dans les groupes « témoin » et « véhicule » .

Exemple 11 : Effets d' un extrait polyphénolique de cacao (EPC) , en traitement préventif sur le développement de tumeurs prostatiques chimio-induites , sur les performances cognitives et sur la dopamine , chez le rat

1 .Matériels et méthodes

Animaux :

45 rats mâles Wistar-Unilever, 250-275 g,

Conditions contrôlées de température (22±2 °C) , humidité ( 50±10% ) , cycle de lumière inversé de 12 h ( lumière de 9 h à 21 h) , nourriture et boisson ad libitum. Traitements :

Extrait Polyphénique de Cacao (EPC) administré quotidiennement par voie orale aux doses de 24 ou 48 mg/kg depuis 10 mois* ou 23 mois** , du lundi au vendredi .

Groupe Traitement Dose

Non induit et non traité - -

Non induit - EPC 24* EPC* 24 mg/kg, P .0. *

Chimio-induit + véhicule Véhicule -

Chimio-induit + EPC 24** EPC** 24 mg/kg, P . 0. **

Chimio-induit + EPC 48 ** EPC** 48 mg/kg, P . 0. **

Suivi des paramètres :

- Contrôle quotidien de la survie des animaux,

- Pesée des animaux 3 fois par semaine,

- Suivi toutes les 2 semaines des prises alimentaires et de boisson,

- Prélèvement urinaire pour le dosage de dopamine réalisé 21 mois après l' induction de tumeurs prostatiques .

Tests cognitifs :

TESLA : réalisé 21 mois après l' induction de tumeurs prostatiques ,

Piscine de Morris : réalisé 21 mois après l' induction de tumeurs prostatiques . Sacrifice des animaux :

Sacrifice de l' ensemble des animaux survivants dès qu' il y en aura moins .de 5 pour l' ensemble des groupes de traitement . 2 .Résultats

La survie des animaux est très différente selon les groupes 23 mois après l' induction de tumeurs prostatiques ou constate groupe « non induit et non traité» : 6 rats survivants sur 9, groupe « non induit + EPC 24» : 7 rats survivants sur 9, groupe « chimio-induit + véhicule» : 1 rat sur 9, - groupe « chimio-induit + EPC 24» : 4 rats survivants sur 9 , groupe « chimio-induit + EPC 48» : 1 rat survivants sur 9,

Concernant la prise de poids , pas de différence entre les différents groupes , n' est pas relevée . De même pour la prises alimentaire et de boisson .

3 . Conclusions Survie des animaux :

Le taux de survie des animaux du groupe « chimio-induit + EPC 24 » est plus élevé que celui des animaux des 2 autres groupes des rats chimio-induits mais il est plus faible que celui des 2 groupes de rats non induits ,

. Le taux de survie des animaux du groupe « non induit + EPC 24 » est légèrement plus élevé que celui des animaux du groupe « non induit et non traité » .

L' EPC administré à la dose de 24 mg/kg avant ou non induction de tumeurs prostatiques permet d' augmenter le temps de survie des rats .

TESLA (voir figures 63 et 64 )

. Les rats des groupes chimio-induits ou non et traités avec l' EPC à 24 ou 48 mg/kg présentent une plus grande activité sur les leviers que les rats des 2 groupes « chimio-induit + véhicule » et « non induit et non traité » et une discrimination positive entre le levier actif et le levier inactif pour les 2 sessions de test et de retest, . Les rats du groupe « chimio-induit + véhicule » présentent l' activité la plus faible et une discrimination négative entre le levier actif et le levier inactif . Les rats des groupes chimio-induits ou non et traités avec l' EPC présentent de meilleures capacités d' apprentissage et de mémorisation que les rats des autres groupes .

Morris (coir figure 65 ) Les rats des groupes chimio-induits ou non traités avec l' EPC à 24mg/kg apprennent et mémorisent mieux que les rats des autres groupes ,

. Les rats des groupes « chimio-induit + véhicule » et « non induit et non traité » présentent une grande difficulté d' apprentissage et de mémorisation spatiale . L' apprentissage et la mémorisation spatiale des rats des groupes chimio-induits ou non et traités avec l' EPC à 24 ou 48 mg/kg est meilleure que celle des rats des groupes « chimio- induit + véhicule » et « non induit et non traité» . Dosage de dopamine (voir figure 66 ) . Le niveau urinaire de dopamine des rats des groupes « chimio-induit + EPC 24 » et « chimio-induit + EPC 48 » est plus élevé que celui des rats des groupes « chimio-induit + véhicule » et « non induit et non traité » et il est comparable à celui observé pour le groupe de rats « non induit + EPC 24 ) ,

Le niveau urinaire de dopamine des rats du groupes « non induit et non traité » diminue progressivement au cours du temps et il se rapproche de celui des rats du groupe « chimio- induit + véhicule » .

OO

L' EPC administré à 24 ou 48 mg/kg permet de maintenir un niveau de dopamine urinaire élevé chez les rats soumis ou non à l' induction de tumeurs de prostate, niveau qui est supérieur à celui des rats non induits et non traités .

Bilan global analyses anatomopathologiques réalisées - Groupe 1 ( chimio-induit + véhicule) : 10 tumeurs sur 13 prélèvements analysés => 76, 9 % d' incidence tumorale

Groupe 2 ( chimio-induit + EPC 24 ) : 0 tumeur sur 6 prélèvements analysés => 0 , 0 % d' incidence tumorale

Groupe 3 (chimio-induit + EPC 48 ) : 5 tumeurs sur 12 prélèvements analysés => 41 , 7 % d' incidence tumorale

Groupe 4 (non induit + véhicule) : 0 tumeur sur 4 prélèvements analysés => 0 , 0 % d' incidence tumorale - Groupe 5 (non induit et non traité) : 0 tumeur sur 6 prélèvements analysés => 0 , 0 % d' incidence tumorale

Exemple 12 : Activité antioxydante de l' extrait selon 1' invention

L' obj ectif de cette étude est d' évaluer les effets antioxydant du chocolat noir enrichi avec un extrait polyphénolique de cacao, administré quotidiennement durant 4 semaines à des suj ets sains j eunes ( 18-30 ans )

Protocole :

Suj ets : Les suj ets sont des volontaires sains , j eunes et sportifs de type caucasien, pratiquant 4 à 6 heures de sport par semaine, âgés de 18 à 30 ans , et pesant entre 60 et 80 Kg .

Leurs habitudes alimentaires restent inchangées . Ils sont par ailleurs non fumeurs et ne présentent pas d' antécédents de type maladies cardiovasculaires , respiratoires , neuromusculaires ou troubles articulaires . Les volontaires tiennent un carnet indiquant les aliments consommés durant

1' étude .

Produits :

chocolat noir en tant que placebo (pâte de cacao origine Côte d' Ivoire 64% , sucre 26, 5%, beurre de cacao 9% , émulsifiant : lecithine de soj a, matière grasse totale : 43% ) - chocolat noir (pâte de cacao origine Côte d' Ivoire 64% ) , enrichi avec 102 , 10 mg de vitamine E . chocolat noir (pâte de cacao origine Tanzanie 67 , 5% , sucre 23 , 5% , beurre de cacao 9% , vanille naturelle, matière grasse totale : 43% ) , enrichi avec 47 , 93mg d' extrait polyphénolique de cacao .

Dose : une barre de chocolat à midi, à la fin du repas .

Résultat : Le groupe ayant ingéré le chocolat noir supplément en extrait polyphénolique présente une augmentation significative du cholestérol total , du cholestérol LDL et du beta-carotène, tandis que la vitamine E et le malondialdéhyde ont significativement diminué entre le j our 0 et le j our 28 , après 4 semaines de traitement par administration orale .

Ce résultat indique une activité antioxydante significative du chocolat noir enrichi en extrait polyphénolique, en comparaison avec le chocolat noir non enrichi .