Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Verwendung gemäß Patentanspruch 1.

Das Auffinden neuer Wirkstoffe wird heute in der Pharmain¬ dustrie unter anderem durch ein sogenanntes Hochdurchsatz- Screening (High-Through-Put-Screening) versucht. Dabei geht es insbesondere darum, Wirkungen von Substanzen möglichst schnell zu erkennen, um bei festgestellter Wirkung diese Substanzen näher untersuchen zu können. Da die klassischen Methoden zur Feststellung der Wirkungen bis hin zum Tierver¬ such zu zeit- und kostenintensiv sind, besteht das dringende Bedürfnis einfache aber trotzdem aussagekräftige Assays zu entwickeln. Dabei hat sich herausgestellt, daß Zellkulturen, an denen bestimmte Parameter gemessen werden können, grund¬ sätzlich geeignet sind, zum Wirkstoff Screening eingesetzt zu werden. Auch hierbei stellt sich das Problem, wie Wirkun¬ gen von Substanzen auf den Stoffwechsel der Zellkulturen in einfacher Weise beobachtet werden können.

Überraschenderweise wird dies möglich durch die Verwendung eines Trägermaterials, das in der PCT/EP 97/00405 näher erläutert wird. Die genannte Patentanmeldung betrifft ein Trägermaterial in Form eines Formkörpers, loser Schüttungen des Sorptionsmaterials in Partikelform, in Form eines Gels oder als Dispersion zur Vorbereitung von Proben, die mittels Zellkulturen untersucht werden, wobei das Trägermaterial mindestens eine Komponente zur Durchführung von Festphasen¬ assays trägt und für ein Fluidum durchlässig ist. Das Träger¬ material ist dadurch gekennzeichnet, daß es einen mittleren Porendurchmesser von 0,1 bis 100 μm aufweist, keine oder eine

97/49991 PC17EP97/03331

sehr niedrige unspezifische Sorptionsfähigkeit für Affini¬ tätsmaterialien hat. Ferner ist das Trägermaterial standar¬ disiert durch die Maßgabe, daß die auf einem bestimmten Einheitsvolumen des Trägermaterials befindliche Komponente zur Durchführung von Festphasenassays (Affinitätsmaterial) ihre komplementäre Komponente beim einmaligen homogenen Durchfluß einer bestimmten Menge einer verdünnten Lösung der komplementären Komponente in einer bestimmten Konzentration dieser komplementären Menge spezifisch in einer solchen Menge bindet, die zwischen mehreren statistisch relevanten Bela¬ dungsvorgängen um einen Beladungswert ± 40% schwankt und, daß die gebundene Menge bei mehreren anschließenden Durch¬ strömungsvorgängen geeigneter Flüssigkeiten an dem Träger¬ material, wie Blockierungen spezifischer oder unspezifischer Adsorptionsstellen, Waschungen des mit der Komponente zur Durchführung von Festphasenassays beladenen Trägermaterials sowie Zuführung von affinitätsreaktiven Materialien, in dem genannten Bereich konstant bleibt .

Das erfindungsgemäß zu verwendende Trägermaterial ist im einzelnen in der PCT/EP 97/00405 beschrieben, auf die hier ausdrücklich Bezug genommen wird.

Das erfindungsgemäß verwendbare Trägermaterial zur Durch¬ führung eines Festphasenassays kann in Form eines Formkör¬ pers, loser Schüttungen, eines Sorptionsmaterials in Par¬ tikelform, in Form eines Gels oder als Dispersion vorliegen. Das Trägermaterial trägt mindestens eine Komponente zur Durchführung von Festphasenassays und ist ebenfalls für ein Fluidum durchlässig. Das Trägermaterial weist einen mittleren Porendurchmesser von 0,1 bis 100 μm auf, wobei als Pore bei den entsprechenden Materialien der Zwischenraum zwischen partikelförmigen Teilchen verstanden wird und nicht die Porosität der Oberfläche des entsprechenden Partikels. Das Trägermaterial weist keine oder nur sehr geringe unspezifi¬ sche Sorptionsfähigkeit für Affinitätsmaterialien auf. Hingegen weist es eine hohe Affinität für bestimmte zu den

auf dem Trägermaterial angeordneten Affinitätsmaterial komplementäre Komponenten auf .

Das Trägermaterial gemäß der Erfindung ist standardisiert durch die Maßgabe, daß die auf einem bestimmten Einheits¬ volumen des Trägermaterials befindliche Komponente zur Durchführung von Festphasenassays (Affinitätsmaterial) ihre komplementäre Komponente, bei einmaligem homogenen Durchfluß einer bestimmten Menge einer bestimmten Lösung dieser kom¬ plementären Komponente in einer bestimmten Konzentration dieser komplementären Komponente, spezifisch in einer solchen Menge bindet, daß diese zwischen mehreren statistisch rele¬ vanten Beladungsvorgängen um einen mittleren Beladungswert um höchstens + 40% schwankt. Die Schwankung beträgt insbeson¬ dere nicht mehr als ± 30%, vorzugsweise ± 20% und insbesonde¬ re bevorzugt nicht mehr als ± 10%. Die gebundene Menge bleibt auch bei mehreren anschließenden Durchströmungsvorgängen geeigneter anderer Flüssigkeiten an dem Trägermaterial in dem genannten Bereich konstant. Nicht geeignet sind wiederum eluierende Flüssigkeiten.

Als weitere Durchströmungsvorgänge kommen insbesondere Blockierungsschritte spezifischer oder unspezifischer Adsorptionsstellen, insbesondere Waschungen des mit der Komponente zur Durchführung von Festphasenassays beladenen Trägermaterials, weitere Affinitätsbindungsschritte zur Markierung und/oder Verstärkung etc. in Betracht.

Das erfindungsgemäße Trägermaterial ist vorteilhaft, da es relativ einfach ohne großen Zeit- und apparativen Aufwand und insbesondere auch leicht beim Anwender selbst hergestellt werden kann, aus leicht zur Verfügung zu stellenden Komponen¬ ten, nämlich zum einen einem Sorptionsmittel, das in der PCT/EP 97/00405 näher erläutert ist, sowie dem oder den Affinitätsmaterialien, die zur Durchführung eines Festphasen¬ assays benötigt werden sowie einem Durchflußgefäß. Darüber hinaus können auch Pufferlösungen mit angeboten werden, die

zur Beladung des Trägermaterials verwendet werden können. Das erfindungsgemäße Trägermaterial ist erhältlich durch Beladen des erfindungsgemäßen Trägermaterials im einmaligen Durchfluß einer bestimmten Menge von mindestens einer Lösung mit einer bestimmten Konzentration mindestens einer Kom¬ ponente zur Durchführung von Festphasenassays. Weiterhin ist bevorzugt, daß das Trägermaterial mindestens eine Komponente für die Durchführung von Festphasenassays deutlich unter der maximalen Sorptionskapazität des Trägermaterials trägt und freie unspezifische Sorptionsstellen des Trägermaterials blockiert sind.

Das erfindungsgemäße Trägermaterial trägt insbesondere ein Affinitätsmaterial aus Molekülen, Molekülgruppen oder Teilchen mit affinen Eigenschaften zu anderen Substanzen. Das Affinitätsmaterial ist insbesondere ausgewählt aus der Gruppe der Enzyme, mit Enzymen in Wechselwirkung tretenden Substraten, Antikörpern, Antigenen, wie hochmolekularen Substanzen oder Pollen oder anderen Allergenen, Haptenen, Biotin oder Streptavidin, Nucleinsäuren vom RNA- oder DNA- Typ, insbesondere solche, die hybridisierbar mit anderen Nucleinsäuren sind, Rezeptor oder Liganden eines Rezeptors, Viren, Bakterien, Zellen, Zeilorganeilen, Blutkörperchen, Teilchen, wie kolloidalen Teilchen von Metallen, Metall¬ oxiden, Polymeren oder Kombinationen der genannten Affini¬ tätsmaterialien. Das erfindungsgemäß zu verwendende Trägerma¬ terial kann aus Sorptionsmaterial gemäß PCT/EP 97/00405 auch dadurch hergestellt werden, daß der oder die Analyten mit dem Trägermaterial in Kontakt gebracht werden, ohne daß eine vorherige Modifikation mit nicht spezifischem Material erfolgt .

Die erfindungsgemäße Verwendung erfolgt insbesondere in einer Vorrichtung, die vorzugsweise ein Hohlkörper ist, in dessen Lumen eines oder mehrere der erfindungsgemäßen Trägermateria¬ lien und/oder Trägermaterialien angeordnet ist. Sind ein oder mehrere Trägermaterialien mit unterschiedlichen Komponenten

für Festphasenassays in der Vorrichtung angeordnet, so erfolgt dies in der Weise, daß ein homogenes Durchströmen des Hohlkörpers, insbesondere der Bereiche mit Trägermateri¬ al, gewährleistet ist. Es sollen also insbesondere keine Randeffekte auftreten oder andere Bereiche gebildet werden, in denen der Durchfluß schneller oder langsamer ist, als an anderen Stellen. Diese Eigenschaft ist im wesentlichen durch die Standardisierung des Trägermaterials bestimmt. Außerdem ist ein exaktes Einpassen des Sorptions- bzw. Trägermaterials mit möglichst exakter geometrischer Form (Zylinder mit Querschnitt entsprechend dem Querschnitt des Durchflußgefä¬ ßes) erfindungsgemäß wichtig. Die Sorptions- und/oder Träger¬ materialien können in Form loser Schüttungen oder Gele mittels im Lumen des Hohlkörpers angeordneten Einrichtungen fixiert sein. Diese Einrichtungen weisen vorzugsweise ein homogenes Durchströmverhalten für ein Fluidum, insbesondere Lösungen mit Analyten auf, desweiteren haben die Einrichtun¬ gen insbesondere ein nur geringes eigenes oder vorzugsweise kein unspezifisches Sorptionsvermögen für Affinitätsmateria¬ lien.

Die Zellkulturen können einerseits getrennt von den Vor¬ richtungen angezüchtet werden und nach Kontaktieren der Zellen mit der zu analysierenden Substanz können die Zell- kulturüberstände durch die Vorrichtung geführt werden. Müssen die Zellen aufgeschlossen werden, kann der Zellaufschluß ebenfalls durch die Vorrichtung geführt werden. Die ent¬ sprechende Führung kann mittels Schwerkraft bewirkt werden etwa indem die Zellkultur auf das in der Vorrichtung befind¬ liche Trägermaterial gegeben wird und im Sinne einer Säulen¬ chromatographie durch das Trägermaterial tritt . Es ist ebenfalls möglich, das erfindungsgemäß zu verwendende Träger¬ material in dem Hohlkörper, beispielsweise einer Spritze, anzuordnen und durch Kolbenzug die Zellkulturflüssigkeit oder den Zellaufschluß durch das erfindungsgemäß zu verwendende Trägermaterial zu bewegen.

Ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Träger¬ materials geht davon aus, daß das erfindungsgemäße Trägerma¬ terial mit einem oder mehreren Affinitätsmaterialien jeweils im wesentlichen in Lösung mit bestimmter Konzentration in einer bestimmten Flüssigkeitsmenge behandelt wird. Dies kann zum einen im Batch-Verfahren erfolgen, andererseits und bevorzugt jedoch im homogenen Durchfluß in einem Hohlkörper mit Ein- und Auslaßöffnung, in dem das Trägermaterial an¬ geordnet ist. Letztere Vorgehensweise hat den Vorteil, daß in sehr kurzer Zeit und ohne apparativen Aufwand ein standar¬ disiertes Trägermaterial mit im Verhältnis zur eingesetzten Konzentration hoher, gleichmäßiger Beladung erhalten wird. Eine vergleichbare Beladung im Batch-Verfahren dauert sehr lange, da zunächst nur äußere Bereiche des Sorptionsmittels beladen werden im Unterschied zum Durchflußverfahren, bei dem das gesamte Material, d.h. auch die innere Oberfläche, schnell mit dem Affinitätsmaterial in Berührung kommt. Außerdem ermöglicht letztere Vorgehensweise, daß die Her¬ stellung des Trägermaterials in einfacher Weise beim Anwender direkt erfolgen kann. Ist dies jedoch nicht erwünscht, kann das entsprechende Trägermaterial auch in größeren Ansätzen hergestellt werden und dann in Vorrichtungen zur Durchführung von Festphasenassays verbracht werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung des erfindungsgemäßen Träger¬ materials sind freie Sorptionsstellen des Trägermaterials mit entsprechenden Substanzen, die sich im durchzuführenden Festphasenassay inert verhalten, blockiert. Gegebenenfalls wird das Trägermaterial ein oder mehrmals gewaschen.

Die erfindungsgemäße Verwendung des Trägermaterials ermög¬ licht in einfacher Weise ein Wirkstoff-Screening.

Das Wirkstoff-Screening kann in der Pharmaforschung, unter anderem mit dem Ziel der Einschränkung und Vermeidung von Tierversuchen, eingesetzt werden. Desweiteren kann insbeson-

dere das Cytostatika-Screening an Tumorzellen für eine patientenorientierte individuelle Therapiekontrolle bei der Chemotherapie eingesetzt werden. Auch der Nachweis von allergischen Reaktionen des zellulären Immunsystems bei Allergien, die nicht antikörpervermittelt sind, wie bei¬ spielsweise bei der Quecksilberallergie, wird ermöglicht, wie auch der Nachweis und Funktionsprüfung der zellulären Immunantwort. Auch ein Schnelltest von Verträglichkeiten der Organe bei Transplantationen ist ein mögliches Anwendungs¬ gebiet .

In der Pharmaforschung kann beispielsweise das erfindungs¬ gemäße Verfahren bei der Entwicklung von Wirkstoffen, wie beispielsweise Cytostatika, eingesetzt werden. Das Absterben von Zellkulturen ist oft an das Ausscheiden von Apoptose- faktoren, die den induzierten Zelltod anzeigen und als Analyten in Immunassays nachweisbar sind, gekoppelt. Die entsprechenden Antikörper zum Nachweis von Apoptosefaktoren stehen zur Verfügung. Sind auf den erfindungsgemäßen Materia¬ lien beispielsweise Antikörper gegen Apoptosefaktoren adsor¬ biert, kann vorzugsweise in einer Vorrichtung, die das erfindungsgemäß zu verwendende Trägermaterial enthält, über der entsprechenden Reaktionszone eine ausgewählte Zellinie für das entsprechende Screening von Wirkstoffen eingebracht werden. In einer anderen Variante könnten beispielsweise dem Patienten entnommene, individuelle Tumorzellen eingebracht werden im Sinne eines individuellen Cytostatika-Screenings. Nach der Kultivierung der entsprechenden biologischen Mate¬ rialien wird das Material mit dem zu untersuchenden Wirkstoff bzw. dem Cytostatikum behandelt. Die bei positivem Ansprechen der Zellkultur abgegebenen Apoptosefaktoren werden an die immobilisierten Antikörper gebunden und im nächsten Analyse¬ schritt nachgewiesen. Neben der qualitativen Analyse ist eine quantitative Abschätzung der Effekte möglich, da die Menge der gebundenen Apoptosefaktoren ein direktes Maß für die zelltötende Wirkung des Wirkstoffes ist .

Im Wirkstoff-Screening weist beispielsweise eine zeiltötende Wirkung auf Nebenwirkungen des eingesetzten Stoffes hin. Tierversuche können vermieden werden. Bei individuellem Cyto- statika-Screening weist eine zeiltötende Wirkung auf die Wirksamkeit des Cytostatikums gegen den Tumor des Patienten hin. Die Therapie kann entsprechend ausgerichtet werden, Verabreichungspegel können optimiert und somit Nebenwirkungen minimiert werden.

Beim zellulären Test für Allergien oder Infektionen wird analog vorgegangen, indem die entsprechenden Zellkulturen zwar nicht abgetötet oder geschädigt werden, sondern durch das Allergen zur Abgabe von bestimmten Stoffen stimuliert werden. In diesem Fall können beispielsweise Mastzellen durch Abgabe bestimmter Stoffe, die wiederum im Immunoassay nach¬ weisbar sind, in ihrem Stimulationsverhalten genau untersucht werden. Als Alternative kann die Stimulierung des zellulären Immunsystems in Form von Lymphozyten durch Konfrontation mit einem infektiösen Agens erfolgen. In dieser Konfiguration der Assays, unter erfindungsgemäßer Verwendung des Trägermat¬ erials, wird gegen eine Kontrolle, bestehend aus nicht stimulierten Zellen, gemessen. In der ersten Alternative kann beispielsweise auf das Vorhandensein von Histamin getestet werden.

Vorzugsweise werden Zellen in Kontakt mit einem mikroporösen Träger angezüchtet. Dies ist vorteilhaft, weil die Zellen dann nicht gezwungen sind in einer mehr oder weniger zweidi- mensional angeordneten Zellkultur zu wachsen, sondern einen dreidimensionalen Zellverband ausbilden können. Die angezüch¬ teten Zellen werden danach zur Untersuchung mit den zu analy¬ sierenden Substanzen in Kontakt gebracht. Die Zellen scheiden dann entweder Substanzen, die auf eine Wechselwirkung mit den zu untersuchenden Substanzen zurückgehen, aus oder akkumulieren solche Stoffe im Zellinnern. Im ersten Fall können die ausgeschleusten Verbindungen mit dem erfindungsge¬ mäß zu verwendenden Sorptionsmittel behandelt werden. Im

zweiten Fall müssen die Zellen erst aufgeschlossen werden, um dann mit dem erfindungsgemäßen zu verwendenden Sorptions- mittel behandelt werden zu können.

Die Verbindungen, die als Antwort der Zellen au ^' f die Behand¬ lung der zu analysierenden Substanzen gebildet werden, werden an dem Trägermaterial über Affinitätsmaterial adsorbiert und danach detektiert. Die Detektion kann nach Elution der gebildeten Verbindungen von dem Trägermaterial oder auf dem Trägermaterial direkt erfolgen.

Die Detektion erfolgt beispielsweise durch Sekundärreaktio¬ nen, die in der Affinitätsreinigungstechnologie, insbesondere der Immunoaffinitätsreinigung und Durchführung von Immunoas- says an sich bekannt sind. So können Sekundärantikörper, die mit Farbstoffen, Metallen oder Enzymen, die mit entsprechen¬ den Substraten eine Färbung hervorrufen können, markiert sind, die gesuchten Substanzen, die über an dem Trägermate¬ rial immobilisierte Affinitätskomponenten an dem Träger¬ material gebunden sind, anzeigen. Farbstoffe, mit denen Anfärbungsreaktionen in besonders bevorzugter Weise durch¬ geführt werden können, sind in der WO 97/19354 beschrieben. Insbesondere der Einsatz von ABION-RED hat sich bewährt .

Eine Vorrichtung, in der der Reaktionsraum der Zellkultur über einem Hohlkörper mit dem erfindungsgemäßen Trägermate¬ rial vorliegt, erspart vorteilhafterweise Pipettierschritte. Durch Öffnen des unteren Verschlusses des Hohlkörpers beginnt der Durchfluß der zu testenden Zellkulturflüssigkeit durch das Trägermaterial.

Vorteilhaft ist auch eine Vorrichtung, bei der der Reak¬ tionsraum der Zellkultur und der Hohlkörper mit dem Träger- material trennbar bzw. zusammensetzbar vorliegen. Dadurch lassen sich entweder vor dem Nachweis die Zellkulturreak¬ tionen getrennt vom Trägermaterial durchführen. Der Durchfluß kann beim Zusammenstecken durch mechanische Vorrichtungen

oder Öffnen ausgelöst werden und/oder der Reaktionsraum der Zellkultur läßt sich nach dem Durchfluß der zu testenden Zellkulturflüssigkeit abtrennen, so daß die nachfolgend aufgebrachten Reagenzien nicht durch die Zellkultur laufen müssen.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird der Durch¬ fluß durch das erfindungsgemäße Trägermaterial durch Diffu¬ sion ersetzt . Wegen der langen Kulturzeit von Zellkulturen steht für die Diffusion von nachzuweisenden Substanzen genügend Zeit zur Verfügung. Die Zellkultur, mi.t bevorzugtem Wachstum in einem porösen Träger, befindet sich dabei in einem geschlossenen System über zwei Schichten des erfin¬ dungsgemäßen Trägermaterials. Beide Schichten enthalten einen affinen Reaktionspartner der gesuchten oder zu bestimmenden Substanz mit hoher Affinität, z.B. einen Antikörper.

In der oberen Schicht ist dieser affine Reaktionspartner mit einer markierten Variante der gesuchten oder zu bestimmenden Substanz oder einer anderen um die affinen Bindungsstellen konkurrierenden Verbindung abgesättigt. Als Markierung ist auch hier ABION RED ^® besonders bevorzugt. Entsteht nun in der Zellkultur die gesuchte oder zu bestimmende Substanz, diffundiert sie in die oberen Schicht des erfindungsgemäßen Trägermaterials und verdrängt die konkurrierende markierte Verbindung. Diese wiederum diffundiert in die zweite Schicht und färbt (markiert) diese. Mit dieser während der Kulturzeit entstehenden Färbung läßt sich der Zeitverlauf der Bildung der gesuchten Komponente qualitativ und/oder quantitativ verfolgen, quantitativ z.B. über quantitative Bestimmungen der Färbung im Hohlkörper, ohne die Zellkultur dabei zu unterbrechen.

Erfindungsgemäß lassen sich in vorteilhafter Weise Verfahren im Bereich der Zellkulturanalytik durchführen bzw. verein¬ fachen.

Die Erfindung wird im folgenden näher erläutert .

Beispiel

Einfluß des bakteriellen Mitogens Lipopolysaccharid auf die Antikörperproduktion von Mäusemilzzellkulturen

a) Vorrichtung: Wie in Beispiel 1 der PCT/EP 97/00405 wurden 20 dort beschriebene Durchflußgefäße in einem Trägergestell mit je 750 μl einer Lösung von 5 μg/ml polyklonalem Kaninchen-anti-Maus-IgG in Kopplungspuffer im Durchfluß beladen, die freien unspezifischen Ad- sorptionsstellen mit Blockierungspuffer abgeblockt und die Durchflußgefäße unten verschlossen.

Danach wurden in jeden 0,25 g offenporige Glasschwamm- Kugeln (Schott) und 200 μl einer Zellsuspension von 10 ⁷ Zellen/ml Mäusemilzzellen in RPMI-1640 Medium, versetzt mit 3,3% inaktiviertem fötalem Kälberserum und Glutamin (2 mmol/1) , gegeben, gefolgt von je 50 μl von Lösungen von Lipopolysaccharid (LPS) in RPMI-Medium, und zwar in je 4 Gefäße mit 0, 6, 25, 50 und 100 μg/ml LPS. Danach wurden die Gefäße oben verschlossen und 96 Stunden bei 37°C inkubiert.

Die Gefäße wurden dann geöffnet und entleert . Dabei wurde vom Trägermaterial definiert das in der Zellkul¬ tur gebundene Maus-IgG gebunden. Nachdem mit je 750 μl Waschpuffer gewachen wurde, wurden je 250 μl einer Lösung von 6 μg/ml anti-Maus-IgG-Biotin in Waschpuffer aufgegeben, gefolgt von je 250 μl einer Suspension von ABION RED ^® -Streptavidin (verdünnt in Waschpuffer 1:21) . Nach Waschen mit je 750 μl Waschpuffer wurden alle Gefäße mit je 300 μl Ethanol in eine Mikrotiterplatte eluiert und die optischen Dichten im ELISA-Reader gemessen. Die relativen Mittelwerte waren:

LPS rel . opt . Dichte

100 μg/ml 100

50 μg/ml 91

25 μg/ml 86

6 μg/ml 58

0 μg/ml 7

In 20 andere Vorrichtungen wie unter a) beschrieben wurde nach dem unteren Verschließen je eine zweite Fritte direkt über der ersten eingesetzt, die in ande¬ ren Durchflußgefäßen genauso mit anit-Maus-IgG beladen worden war, deren spezifische Bindungsstellen mit einer Suspension von anti-Maus-IgG-ABION RED ^® abgesättigt wurden.

In diesen Gefäßen mit zwei erfindungsgemäßen Träger¬ materialien wurden wie oben Lösungen von Mäusemilzzel- len und 100 bzw. 0 μg/ml LPS gegeben. Bei den Gefäßen ohne LPS war nach 96 Stunden keine Rotfärbung im unte¬ ren Trägermaterial zu sehen, während die Rotfärbung im untern Trägermaterial 100 μg/ml schon nach 36 Stunden deutlich zu sehen war und danach noch zunahm. Diese Anordnung, eventuell mit einer entsprechend gefärbten Kontrollzone, ermöglicht also eine zumindest semiquan¬ titative Auswertung des Verlaufs der Zellkulturreaktion ohne deren Unterbrechung.