SCHUBERT, Ulrich (Fraunhoferstrasse 7, Jena, 07743, DE)
| Patentansprüche
1. Mittel zur Behandlung oder Vorbeugung von akuten und chronischen Infektionen mit für Mensch und Tier pathogenen Viren, dadurch gekennzeichnet, dass sie als wirksame Komponente mindestens einen mit chemischen Schutzgruppen versehenen Inhibitor der Protease- und/oder Helikaseaktivität in einer pharmazeutischen Zubereitung enthalten, der die der Assemblierung und der Reifung von Virusstrukturproteinen hemmt.
2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als chemische Schutzgruppen Chloro- oder Fluoromethylketon-Gruppen verwendet werden.
3. Mittel nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Inhibitoren der Protease- und/oder Helikaseaktivität Inhibitoren der zellulären Protease, wie auch Substanzen, welche die Entwindung der DNA durch Einfluss auf die ATP-abhängige Helikase bewirken oder Inhibitoren der Transkription und/oder Proteinprozessierung, eingesetzt werden.
4. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass als mit chemischen Schutzgruppen versehene Inhibitoren der Protease- und/oder Helikaseaktivität eine oder mehrere der folgenden Substanzen eingesetzt wird: AAPFCMK, Z-VAD F MK, IETDFMK, AC- YVADCMK, VEIDFMK, VPFCMK, LLFCMK, AAFCMK, AAPYCMK und GGLCMK-
5. Verwendung von mit chemischen Schutzgruppen versehenen Inhibitoren der Protease- und/oder Helikaseaktivität zur Herstellung von anti-viralen Mitteln und / oder pharmazeutischen Zubereitungen mit anti-viraler Wirkung, welche die späten Prozesse des Replikationszyklus von Viren, also die Assemblierung, die Freisetzung, und die Reifung von infektiösen Nachkommenviren, und damit das Virusbudding von Viren blockieren, zur Behandlung von viralen Erkrankungen.
6. Verwendung von mit chemischen Schutzgruppen versehenen Inhibitoren der Protease- und/oder Helikaseaktivität, die die späten Prozesse des Replikationszyklus von Viren durch Beeinflussung von retroviralen Gag-Proteinen zur Herstellung von pharmazeutischen Zubereitungen zur Behandlung von viralen Erkrankungen.
7. Verwendung nach Anspruch 6 oder 7 zur Behandlung von Infektionserkrankungen wie AIDS (HIV-I und HIV-2), Hepatitis, hämorrhagisches Fieber, "Severe Acute Respiratory Syndrom" (SARS), Pocken, Masern, Polio, Filoviridae, Flaviviridae oder Grippe.
8. Verwendung nach einem der Ansprüche 5 bis 7 als Breitbandvirostatika zur Vorbeugung oder zur Therapie von unterschiedlichen Virusinfektionen.
9. Verwendung nach einem der Ansprüche 5 bis 8 zur Blockierung der Replikation und Reifung von unterschiedlichen Viren und damit der Produktion von infektiösen Nachkommen- Viren und der Ausbreitung einer systemischen Infektion im Organismus verhindern sowie weiterhin
- die Freisetzung von infektiösen Viren aus infizierten Zellen blockieren,
- die Ausbreitung einer Virus-Infektion im Organismus begrenzen,
- zur Verhinderung des Krankheitsausbruches und zur Reduzierung der Infektionsausbreitung im Organismus (Reduzierung von "viral load") von symptomlosen Virus-infizierten Personen beitragen,
- die Etablierung einer systemischen Virus-Infektion unmittelbar nach Kontakt mit infektiösen biologischen Proben, infizierten Personen oder deren näherer Umgebung verhindern,
- die Virämie sowohl bei einer Neuinfektion als auch bei chronischen Infektionen mit unterdrücken und den Erfolg einer Viruseliminierung durch das eigene Immunsystem und/oder durch bekannte Mittel, welche in Kombination mit den Inhibitoren der Helikase und/oder Proteaseaktivität mit ähnlicher oder anderer Wirkung erhöhen.
10. Verwendung nach einem der Ansprüche 5 bis 9 in Kombination mit anderen anti- Virus- Medikamenten und sonstigen Therapieschemata wie Interferon alpha/beta/gamma und Varianten hiervon (insbesondere pegylierte Interferone), Interleukine, Nukelosidanaloga (Lamivudine, Cidovir, Ribavirin und andere), Steroide, Thymidikinase-Hemmern (z.B. Ganzyklovir), Plasma- Austausch, Thymosin alpha 1, Impfstoffe, passive und aktive Vakzinierung, therapeutische und prophylaktische Vakzinierung, Glycyrrhizin, Stammzelltransplantation, Organtransplantationen, Nahrungstherapie, Immunsuppressiva, Cyclosporine und Derivate hiervon, Amanditin und Derivate, Interleukine und andere Cytokine, nicht Proteasom-selektive Protease-Inhibitoren, Azathioprin, Hämodialyse sowie hoch aktive antiretrovirale Therapie (highly active antiretroviral therapy, "HAART") oder bei Co-Infektionen von HCV und HIV.
11. Verwendung nach einem der Ansprüche 5 bis 10 nach den Mechanismen a) Blockierung/Reduktion der Assemblierung und Freisetzung von neuen Virionen, b) Blockierung/Reduktion der Infektiosität der freigesetzten Virionen, c) Blockierung/Reduktion der Infektionsausbreitung in kultivierten Zellen.
12. Verwendung nach einem der Ansprüche 5 bis 11 zur Vorbeugung einer Hepatitis- Virusinfektion bei Personen mit hohem Risiko einer Neuinfektion, zum Beispiel bei ärzten und anderem Risiko-Personal, Drogenabhängigen, Reisenden in hochendemische Gebiete für Hepatitis- Viren, in der Krankenbehandlung oder für Familienangehörige von chronischen Virusträgern.
13. Verwendung nach einem der Ansprüche 5 bis 12 zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung und Prophylaxe von Hepatitiden.
14. Verwendung nach einem der Ansprüche 5 bis 13 zur Verringerung der Menge an infektiösen Virionen in einem mit Hepadnaviren infizierten Organismus oder zur Reduzierung der Zahl infizierter Produzentenzellen im Leberzellgewebe sowohl allein als auch in Kombination mit bereits in der anti-viralen Therapie von Hepadnaviren verwendeten Therapeutika.
15. Verwendung nach einem der Ansprüche 5 bis 14 zur Bekämpfung / Behandlung von Erkrankungen/pathologischen Erscheinungen, die durch Infektionen mit Retroviren verursacht wurden, insbesondere durch Infektionen mit Leukämieviren, humanen T-ZeIl- Leukämieviren HTLV-I und HTLV-II oder durch Infektionen mit Lentiviren.
16. Verwendung nach einem der Ansprüche 5 bis 15 zur Bekämpfung / Behandlung von AIDS, sowohl in der frühen symptomlosen als auch in der fortgeschrittenen Krankheitsphase, auch in Kombination mit anderen anti-retroviralen Medikamenten wie Blockern der Reversen Transkriptase oder in Kombination mit anti-retroviralen Therapien, basierend auf gentherapeutischen Interventionen.
17. Verwendung nach Anspruch 16 in Kombination mit intrazellulärer Immunisierung, wie dem Einbringen von anti-HIV- 1 /HI V-2 wirksamen Genen in Stammzellen und/oder in periphere CD4 + Lymphozyten.
18. Verwendung nach einem der Ansprüche 5 bis 17 zur Verhinderung des Krankheitsausbruches und einer Reduzierung der Infektionsausbreitung im Organismus (Reduzierung von "viral load") von symptomlosen HIV-l/HIV-2 seropositiven und HIV- l/HIV-2-infϊzierten Personen oder zur Behandlung / Bekämpfung / Verhinderung von HIV- induzierter Demenz, insbesondere zur Verhinderung der HIV-Infektion von Neuronen, Glia- und Endothelzellen in Kapillaren des Gehirns oder zur Verhinderung der Etablierung einer systemischen HIV-I /HI V-2-Infektion unmittelbar nach Kontakt mit infektiösem Virus (zum Beispiel bei Nadel-Stich- Verletzungen mit HlV-kontaminiertem Blut oder Blutprodukten).
19. Verwendung nach einem der Ansprüche 5 bis 18 nach den Mechanismen a) Blockierung/Reduktion der Transkription der viralen genetischen Information; b) Blockierung/Reduktion der proteolytischen Prozessierung der Gag-Polyproteine; c) Blockierung/Reduktion von Freisetzung und Budding von neuen Virionen an der Zellmembran; d) Blockierung/Reduktion der Infektiosität von freigesetzten Virionen; e) Blockierung/Reduktion der Infektionsausbreitung von HIV-I in Kultur CD4 + T-Zellen. |
Verwendung von Chloro- und Fluoromethylketon-Derivaten in der anti-viralen Therapie
Beschreibung
[0001] Die Erfindung betrifft Mittel zur Behandlung von akuten und chronischen Infektionen mit für Mensch und Tier pathogenen Viren, welche an der Zellmembran assemblieren und durch Knospung von der Zelloberfläche freigesetzt werden. Hierzu zählen insbesondere Erreger von Infektionserkrankungen wie AIDS, Hepatitis, hämorrhagisches Fieber, SARS, Pocken, Masern, Polio oder Grippe. Gegenstand der Erfindung sind Mittel, die als Wirkstoffe Inhibitoren der Protease- und/oder Helikaseaktivität enthalten. Hierzu zählen Inhibitoren der zellulären Protease, wie auch Substanzen, welche die Entwindung der DNA durch Einfluss auf die ATP-abhängige Helikase bewirken. Durch diese Mittel werden die hoch organisierten Prozesse der Virus- Replikation und folglich die Assemblierung von Virusstrukturproteinen gestört. Im Ergebnis dessen wird die Freisetzung und die Produktion von infektiösen Nachkommenviren unterbunden. Zum Schutz dieser Mittel werden diese mit Chloro- oder Fluoromethylketon-Gruppen versehen, welches ihre antivirale Wirksamkeit nicht beeinflusst. Diese Mittel besitzen ein breites Wirkspektrum und können daher als neuartige Breitbandvirostatika zur Vorbeugung, beziehungsweise zur Therapie von unterschiedlichen Virusinfektionen eingesetzt werden.
1. Charakteristik des bekannten Standes
1.1 Prinzipien der Virusassemblierung
[0002] Die sogenannten späten Prozesse einer Virusreplikation beinhalten die Neusynthese von Virusproteinen, wobei in der Regel die Virusstrukturproteine zuerst nach Aktivierung der viralen Genexpression exprimiert werden. Diese Strukturproteine werden sodann in den Prozess der Assemblierung und der Formierung von viralen Unterstrukturen eingehen. Bei umhüllten Viren erfolgt in der Regel dieser Prozess an zellulären Membranen, meist an der Innenseite der Zellmembran. Alternativ besteht aber auch die Möglichkeit, dass Virusproteine zuerst im Zytosol der Zelle oder auch dem Zellkern in Virus-ähnliche Partikel assemblieren und später diese Virionen mit Prozessen der Freisetzung von der Zellmembran mit einer Lipidmembran umhüllt werden. Viren, welche an der Zellmembran assemblieren, werden in der Regel durch aktive Knospung (engl.: budding) von der Zellmembran freigesetzt. Dabei kommt es zur Formierung einer Virus-Knospe (engl: bud), welche aktiv von der Zellmembran ausgestülpt und dann
letztendlich durch Abschnürung von der Zelloberfläche in Form eines Nachkommenvirus freigesetzt wird.
1.1.1 Darstellung der Assemblierung, Freisetzung und Reifung von Viren am Beispiel von Humanen Immundefizienzviren (HIV)
[0003] Die Prinzipien der späten Prozesse der Virusreplikation sollen am Beispiel von HIV dargestellt werden. Hauptkomponenten der HIV-Strukturproteine werden in Form von drei Polyproteinen translatiert: Gag und Gag-Pol für die inneren Core-Proteine und viralen Enzyme sowie Env für die viralen Hüllproteine. Membran-targeting- Signale in der NH2-terminalen Domäne von Gag sind für den Transport von Gag an die Zellmembran jedoch entscheidend. Im Falle von HIV-I resultiert die vollständige proteolytische Prozessierung des Gag Polyproteins Pr55 in der Formierung des Matrix (MA), des Capsid (CA) sowie des Nucleocapsids (NC) und des COOH-terminalen p6 gag Proteins. HIV- Virionen werden generell als unreife nicht-infektiöse Viruspartikel von der Plasmamembran abgeschnürt; dieser Prozess wird als Virusbudding bezeichnet. Unmittelbar nach oder auch während des Buddings beginnt mit der Aktivierung der viralen Protease (PR) die proteolytische Prozessierung von Gag und Gag-Pol-Polyproteinen. Die proteolytische Reifung der Virionen geht einher mit morphologischen Veränderungen. Charakteristisch dabei ist die Kondensierung des inneren Cores, welche in der Formierung eines für das reife Virus typischen kegelförmigen Core-Zylinders resultiert (zusammengefasst in Kräusslich and Welker, 1996; Swanstrom and Wills, 1997).
1.2. Einflussnahme auf die Virusreplikation
1.2.1. Chloro- und Fluoromethylketone
Die dem Inhibitor zugrunde liegende Sequenz wurde durch 2.2 A Kristallstrukturanalyse der humanen Chymase (HC), einer chymotrypsin-ähnlichen Serin-Protease, exprimiert in Mastzellen, bestimmt (Pereira et al. 1999). Hierbei bindet der Peptidyl-CMK-Inhibitor spezifisch und kovalent an die Aminosäuren Serl95 und His57 (Pereira et al. 1999).
1.2.2. Helikase- und Protease-Inhibitoren
[0004] Es ist bekannt, dass AAPF CMK in mit humanem Papilloma- Virus (HPV) infizierten Zellen, in einer noch nicht geklärten Art und Weise, eine Wachstumshemmung der infizierten Zellen zur Folge hat. AAPF CMK , dessen offensichtliches Target eine Protease im Zellkern
scheint, beeinflusst jedoch deren erhöhte Aktivität in virusinfϊzierten Zellen nicht (Drubin et al.
2006).
[0005] Weitere Inhibitoren mit Chloromethylketon bzw. Fluoromethylketon-Schutzgruppen zur selektiven Hemmung der Protease oder Caspase sind Z-VAD F MK, IETDFMK, AC-YVAD C MK,
VEIDFMK, VPFCMK, LLFCMK, AAFCMK, AAPYCMK und GGLCMK-
2. Das Wesen der Erfindung
[0006] Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Mittel zur Verfügung zu stellen, die zur Behandlung von akuten und chronischen Infektionen mit für Mensch und Tier pathogenen Viren geeignet sind. Diesen Viren ist zu eigen, dass sie in der Zelle, vorzugsweise an der Zellmembran, assemblieren und durch Knospung von der Zelloberfläche freigesetzt werden. Hierzu zählen insbesondere Erreger von Infektionserkrankungen, wie AIDS, Hepatitis, hämorrhagisches Fieber, SARS, Pocken, Masern, Polio, Herpesvirusinfektionen oder Grippe. Gegenstand der Erfindung sind Mittel, die als Wirkstoffe Inhibitoren der Virusreplikation enthalten. Hierzu zählen Inhibitoren von zellulären Helikasen wie auch Proteasen, die mit chemischen Schutzgruppen versehen sind. Durch diese Mittel werden die hoch organisierten Prozesse der Replikation, Assemblierung und der proteolytischen Reifung von Virusstrukturproteinen gestört, in deren Ergebnis die Freisetzung und die Produktion von infektiösen Nachkommenviren unterbunden wird. Diese Mittel besitzen ein breites Wirkspektrum und können daher als neuartige Breitbandvirostatika zur Vorbeugung, beziehungsweise zur Therapie von unterschiedlichen Virusinfektionen eingesetzt werden.
[0007] Die Aufgabe der Erfindung wurde unter anderem durch den Einsatz von mit chemischen Schutzgruppen versehenen Inhibitoren der Serin-Proteasen gelöst.
[0008] Es sind erfmdungsgemäß Mittel zur Behandlung von unterschiedlichen Virus-Infektionen entwickelt worden, die als wirksame Komponenten mit chemischen Schutzgruppen versehene Inhibitoren enthalten, welche einen Einfluss auf Helikasen und SAP-Domänen-Proteine besitzen. Hierzu zählen Substanzen wie zum Beispiel: AAPFCMK, Z-VADFMK, IETDFMK, AC-YVAD CMK, VEIDFMK, VPFCMK, LLFCMK, AAFCMK, AAPYCMK und GGL C MK-
[0009] Das Wesen der Erfindung geht auch aus den Patentansprüchen hervor.
[0010] Allen späten Prozessen der Virusreplikation, wie Assemblierung, Knospung, proteolytische Reifung und Virusfreisetzung ist gemeinsam, dass die Virusstrukturproteine in der Regel als Vorläuferproteine in Form von Polyproteinen gebildet werden, die dann durch die Aktivität von Proteasen, welche entweder von der Wirtszelle stammen, meist aber mindestens eine viral kodierte Protease darstellen, in die sogenannten reifen Virusstrukturproteine gespalteten werden. Dieser Prozess wird allgemein als Virusreifung bezeichnet. Die geordneten und fein aufeinander abgestimmten Prozesse der Assemblierung, der Reifung, der Knospung und der Freisetzung sind entscheidende Voraussetzung für die erfolgreiche Bildung von infektiösen Nachkommenviren. Die geringste Störung dieser vielschichtigen Prozesse kann die Infektiosität und/oder die Freisetzung von Nachkommenviren wesentlich stören. Alle diese Prozesse haben eines gemeinsam: Sie beinhalten vielfältige und aufeinander abgestimmte Prozesse.
[0011] Alle Methoden, welche die Replikation, das heißt die Vervielfältigung der viralen genetischen Information stören, werden daher auch die Formierung von infektiösen Nachkommenviren verhindern. Dies kann entweder indirekt durch Beeinflussung von Helikasen, welche direkt die Entwindung der genetischen Information regulieren, erfolgen. Direkte Einflüsse auf die Proteinfaltung kann durch Substanzen oder physikalische Einflüssen ausgelöst werden, welche die Proteinkonformation regulieren. Diese sogenannten chemischen Chaperone sind in der Regel niedermolekulare Verbindungen, welche die Menge des strukturgebundenen Wassers an der Oberfläche von Proteinmolekülen regulieren und dadurch die Stabilität der Sekundär strukturen beeinflussen.
[0012] Anwendungsgebiete sind sowohl die Behandlung als auch die Vorbeugung von viralen Infektionen. Es sind erfindungsgemäß Mittel zur Behandlung von unterschiedlichen Virusinfektionen entwickelt worden, die als wirksame Inhibitoren der Protease- und/oder Helikaseaktivität mit chemischen Schutzgruppen versehen sind. Die erfmdungsgemäßen neuartigen Mittel eignen sich zur Behandlung, Therapie und Hemmung von Infektionen mit unterschiedlichen humanpathogenen oder auch tierpathogenen Viren. Im Vordergrund stehen Erreger von chronischen Infektionserkrankungen, wie zum Beispiel AIDS (HIV-I und HIV-2), von Hepatitis (HCV und HBV), von dem Erreger des "Severe Acute Respiratory Syndrom" (SARS), dem SARS-CoV (Coronavirus); von Pockenviren, von Erregern des viralen hämorrhagisches Fiebers (VHF), wie zum Beispiel den Ebola- Viren als Vertreter der Familie der Filoviridae; von Grippe-Erregern, wie zum Beispiel dem Influenza- A- Virus.
[0013] Gemäß einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung können in infizierten Zellen verschiedene anti-virale Wirkungen ausgelöst werden. Diese betreffen zum Beispiel die Hemmung der Replikation viraler genetische Informationen durch Beeinflussung der Helikaseaktivität. Gleichzeitig werden durch Inhibierung der Replikaseaktivität die weitere Prozessierung eventueller viraler Vorläuferproteine, also die Reifung von Virusproteinen und folglich die Freisetzung und die Produktion von infektiösen Nachkommenviren gestört. In der Gesamtsumme dieser Wirkung kann eine therapeutische Wirkung durch Blockade der Virusreplikation im Organismus bewirkt werden.
[0014] Die Aufgaben der Erfindung werden durch den Einsatz von mindestens einem Inhibitor der Helikase- und/oder Proteaseaktivität gelöst, der mit chemischen Schutzgruppen versehen ist. Es sind erfindungsgemäß Mittel zur Behandlung von Virus-Infektionen entwickelt worden, die als eine wirksame Komponente mit chemischen Schutzgruppen versehene Inhibitoren der Transkription und/oder Proteinprozessierung in pharmazeutischen Zubereitungen enthalten.
[0015] In allen bevorzugten Anwendungen der Erfindung werden diese Inhibitoren und Substanzen von Zellen höherer Eukaryonten aufgenommen und nach Zellaufnahme entweder indirekt die Aktivitäten von Helikasen der Wirtszellen blockieren oder in Form von Proteasehemmern direkt die Prozessierung von Virusproteinen stören.
[0016] Erfindungsgemäß werden als Inhibitoren der Helikase- und/oder Proteaseaktivität Substanzen eingesetzt, die in verschiedenen Formen in vivo oral, intravenös, intramuskulär, subkutan, in verkapselter Form mit oder ohne Zellspezifität-tragende Veränderungen oder anderweitig verabreicht werden und die aufgrund der Anwendung eines bestimmten Applikations- und Dosis-Regimes eine geringe Zytotoxizität und/oder hohe Selektivität für bestimmte Zellen und Organe aufweisen, keine oder unbedeutende Nebenwirkungen auslösen, eine relativ hohe metabolische Halbwertszeit und eine relativ geringe Clearence-Rate im Organismus aufweisen.
[0017] Als Inhibitoren der Helikase und/oder Proteaseaktivität werden des weiteren Substanzen eingesetzt, die total-synthetisch hergestellt, durch gentherapeutische Verfahren in vivo synthetisiert, durch gentechnische Verfahren in vitro oder in Mikroorganismen hergestellt, und durch chemische Modifikationen vor Degradationsprozessen geschützt werden. Eine Isolierung
in natürlicher Form aus Mikroorganismen oder anderen natürlichen Quellen kann ebenso durchgeführt werden.
[0018] Mit den Inhibitoren der Helikase- und/oder Proteaseaktivität, die mit chemischen Schutzgruppen versehen sind, werden erfindungsgemäß Mittel zur Verfügung gestellt, die überraschenderweise durch die Blockierung der Replikation und Reifung von unterschiedlichen Viren die Produktion von infektiösen Nachkommen- Viren beeinträchtigen und damit die Ausbreitung einer systemischen Infektion im Organismus verhindern sowie weiterhin die Freisetzung von infektiösen Viren aus infizierten Zellen blockieren, die Ausbreitung einer Virus-Infektion im Organismus begrenzen, zur Verhinderung des Krankheitsausbruches und zur Reduzierung der Infektionsausbreitung im Organismus (Reduzierung von "viral load") von symptomlosen Virus-infizierten Personen beitragen, die Etablierung einer systemischen Virus-Infektion unmittelbar nach Kontakt mit infektiösen biologischen Proben, infizierten Personen oder deren näherer Umgebung verhindern, die Virämie sowohl bei einer Neuinfektion als auch bei chronischen Infektionen mit unterdrücken und den Erfolg einer Viruseliminierung durch das eigene Immunsystem und/oder durch bekannte Mittel, welche in Kombination mit den Inhibitoren der Helikase und/oder Proteaseaktivität mit ähnlicher oder anderer Wirkung erhöhen.
[0019] Die mit Schutzgruppen versehenen Inhibitoren der Helikase und/oder Proteaseaktivität können auch in Kombination mit anderen anti- Virus-Medikamenten und sonstigen Therapieschemata eingesetzt werden, z.B. Interferon alpha/beta/gamma und Varianten hiervon (zum Beispiel pegylierte Interferone), Interleukine, Nukelosidanaloga (Lamivudine, Cidovir, Ribavirin und andere), Steroide, Thymidikinase-Hemmern (z.B. Ganzyklovir), Plasma- Austausch, Thymosin alpha 1, Impfstoffe, passive und aktive Vakzinierung, therapeutische und prophylaktische Vakzinierung, Glycyrrhizin, Stammzelltransplantation, Organtransplantationen, Nahrungstherapie, Immunsuppressiva, Cyclo sporine und Derivate hiervon, Amanditin und Derivate, Interleukine und andere Cytokine, nicht Proteasom-selektive Protease-Inhibitoren, Azathioprin, Hämodialyse sowie hoch aktive antiretrovirale Therapie (highly active antiretroviral therapy, "HAART") bei Co -Infektionen von HCV und HIV. Da diese Inhibitoren auch antivirale Wirkung auf HIV ausüben, ist eine Behandlung von HC V/HI V-Ko infektionen,
insbesondere in Kombination mit HAART-Therapie, ein Anwendungsschwerpunkt der Erfindung.
[0020] Die Merkmale der Erfindung gehen aus den Elementen der Ansprüche und aus der Beschreibung hervor, wobei sowohl einzelne Merkmale als auch mehrere in Form von Kombinationen vorteilhafte Ausführungen darstellen, für die mit dieser Schrift Schutz beantragt wird. Die Erfindung liegt auch in einem kombinierten Einsatz von bekannten und neuen Elementen, den Inhibitoren der Helikaseaktivität einerseits sowie der Proteaseaktivität andererseits. Weiterhin können diese neuen Mittel, welche die Transkription und Prozessierung von Virusproteinen beeinflussen, auch in Kombination mit anderen, bereits bekannten antiviralen Chemotherpeutika angewendet werden.
[0021] Erfindungsgemäß findet die Hemmung der Helikase- und/oder Proteaseaktivität Verwendung zur Herstellung von Mitteln zur Bekämpfung / Behandlung und Vorbeugung von Erkrankungen sowie von pathologischen Erscheinungen, welche die durch SARS-CoV und verwandten Coronaviren verursacht werden, die durch virale hämorrhagische Fieber (VHF) in Menschen und Tieren, insbesondere in non- humanen Primaten (Affen) und ihre verwandten Tieren ausgelöst werden, wie zum Beispiel Infektionen mit den Vertretern der Filoviren, dem Ebolavirus und Marburgvirus oder die durch Infektionen mit Lassa- Virus oder Krim/Kongo-hämorrhagischem-Fieber- Virus verursacht werden.
[0022] Für die bevorzugte Anwendung der erfindungsgemäß neuartigen antiviralen Mittel bei der Behandlung von viralen Hepatiden wird festgestellt, dass die erfindungsgemäße Verwendung von mit Schutzgruppen versehenen Inhibitoren der Helikase und/oder Proteaseaktivität in der Hemmung der Transkription, Assemblierung, Reifung und Freisetzung von Nachkommenviren besteht. Die Verwendung zur Hemmung der Vermehrung von Flaviviridae erfolgt nach den Mechanismen a) Blockierung/Reduktion der Assemblierung und Freisetzung von neuen Virionen, b) Blockierung/Reduktion der Infektiosität der freigesetzten Virionen, c) Blockierung/Reduktion der Infektionsausbreitung in kultivierten Zellen.
[0023] Dies impliziert, dass die neuartigen Chloro- und Fluoromethylketon-Derivate der o.g. Inhibitoren die Ausbreitung von Nachkommenviren in infizierten Organen unterdrücken.
[0024] Eine weitere Verwendung von mit Schutzgruppen versehenen Inhibitoren der Helikase- und/oder Proteaseaktivität ist die Vorbeugung einer Hepatitis- Virusinfektion bei Personen mit hohem Risiko einer Neuinfektion, zum Beispiel bei ärzten und anderem Risiko-Personal, Drogenabhängigen, Reisenden in hochendemische Gebiete für Hepatitis- Viren, in der Krankenbehandlung oder für Familienangehörige von chronischen Virusträgern.
[0025] Eine wesentliche Anwendung besteht in der Verwendung von Inhibitoren der Helikase- und/oder Proteaseaktivität zur Herstellung von Mitteln bzw. pharmazeutischen Zubereitungen zur Hemmung der Transkription, Freisetzung, Reifung und Replikation von Hepatitisviren sowie zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung und Prophylaxe von Hepatitiden.
[0026] In der Summe dieser neuartigen Mechanismen lässt sich feststellen, dass die verminderte Freisetzung von noch dazu wenigen oder gar nicht infektiösen Viruspartikeln im Netto-Effekt bei gleichzeitigem Zelltod von Virus-produzierenden Karzinomzellen im Falle einer in vivo Anwendung von Helikase- und/oder Proteaseinhibitoren die Menge an infektiösen Virionen in einem mit Hepadnaviren infizierten Organismus verringert. Somit wird insgesamt die Zahl infizierter Produzentenzellen im Leberzellgewebe reduziert. Dies macht die Anwendung von Chloro- und Fluoromethylketon-Derivaten der o.g. Inhibitoren allein oder in Kombination mit bereits in der anti- viralen Therapie von Hepadnaviren verwendeten Therapeutika attraktiv.
[0027] Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls die Verwendung von mit Schutzgruppen versehenen Helikase- und/oder Proteaseinhibitoren für die Bekämpfung / Behandlung von Erkrankungen/pathologischen Erscheinungen, die durch Infektionen mit Retroviren verursacht wurden. Die Erkrankungen/pathologischen Erscheinungen können durch Infektionen mit Leukämieviren, humanen T-Zell-Leukämieviren HTLV-I und HTLV-II oder durch Infektionen mit Lentiviren verursacht werden.
[0028] Ein weiteres Anwendungsgebiet der Erfindung ist die Bekämpfung / Behandlung von AIDS, sowohl in der frühen symptomlosen als auch in der fortgeschrittenen Krankheitsphase, mittels Inhibitoren der Helikase- und/oder Proteaseaktivität. Diese Substanzen können auch in Kombination mit anderen anti-retro viralen Medikamenten eingesetzt werden, z.B. mit Blockern der Reversen Transkriptase. Auch die Kombination mit anti-retroviralen Therapien basierend auf gentherapeutischen Interventionen ist möglich.
[0029] Eine weitere Verwendung ergibt sich durch die Kombination mit intrazellulärer Immunisierung, wie z.B. dem Einbringen von anti-HIV- 1 /HI V-2 wirksamen Genen in Stammzellen und/oder in periphere CD4 + Lymphozyten.
[0030] Eine Verhinderung des Krankheitsausbruches und eine Reduzierung der Infektionsausbreitung im Organismus (Reduzierung von "viral load") von symptomlosen HIV- 1 /HI V-2 seropositiven und HIV-I /HI V-2-infϊzierten Personen ist erfindungsgemäß ebenfalls möglich. Weiterhin können die erfindungsgemäßen Inhibitoren der Helikase- und/oder Proteaseaktivität zur Behandlung / Bekämpfung / Verhinderung von HIV-induzierter Demenz, insbesondere zur Verhinderung der HIV-Infektion von Neuronen, Glia- und Endothelzellen in Kapillaren des Gehirns eingesetzt werden. Eine weitere Verwendung ist die Verhinderung der Etablierung einer systemischen HIV-I /HI V-2-Infektion unmittelbar nach Kontakt mit infektiösem Virus (zum Beispiel bei Nadel-Stich- Verletzungen mit HIV-kontaminiertem Blut oder Blutprodukten).
[0031] Die Prinzip-Lösung der Aufgabe wird am Beispiel von HIV-I und HIV-2 gezeigt. Es wird dargestellt, dass unmittelbar nach Zugabe von verschiedenen Substanzklassen von mit Schutzgruppen versehenen Inhibitoren der Helikase- und/oder Proteaseaktivität im Folgenden die Produktion von infektiösen Viruspartikeln gehemmt wird.
[0032] Erfindungsgemäß wird dieses Phänomen in HIV-I infizierten permanenten Kulturen von CD4 + humanen T-Zellen transfiziert mit infektiöser proviraler DNA HIV-I beobachtet und hier näher beschrieben. Aufgrund dieser neuartigen Aktivitäten der erfindungsgemäßen Inhibitoren der viralen Transkription und Prozessierung ist davon auszugehen, dass die Applikation von in vivo verträglichen mit Schutzgruppen versehenen Inhibitoren der Helikase- und/oder Proteaseaktivität die Infektionsausbreitung von HIV im Organismus unterdrücken oder vollständig eliminieren kann.
[0033] Erfindungsgemäß wird gezeigt, dass der hemmende Effekt von Inhibitoren der Helikase- und/oder Proteaseaktivität durch Chloro- und/oder Fluoromethylketone auf die HIV-Replikation folgende Mechanismen beinhaltet:
1. Blockierung/Reduktion der Transkription der viralen genetischen Information;
2. Blockierung/Reduktion der proteolytischen Prozessierung der Gag-Polyproteine;
3. Blockierung/Reduktion von Freisetzung und Budding von neuen Virionen an der Zellmembran;
4. Blockierung/Reduktion der Infektiosität von freigesetzten Virionen;
5. Blockierung/Reduktion der Infektionsausbreitung von HIV-I in Kultur CD4 + T-Zellen.
[0034] Zur Lösung der Aufgabe wurden im Rahmen der Erfindung verschiedene proteinchemische, molekular- viro logische und morphologische Studien an HIV-I durchgeführt. Erfindungsgemäß wird der durch mit Schutzgruppen versehenen Inhibitoren der Helikase- und/oder Proteaseaktivität ausgelöste Defekt in der Prozessierung der viralen Vorläuferproteine mittels biochemischer Methoden dargestellt. Durch den Einfluss von den erfindungsgemäßen Chloro- und/oder Fluoromethylketonen im, mit humanem Immundefizienzvirus (HIV) infizierten, humanen Lymphozyten-System konnte eine dosisabhängige Replikationshemmung gezeigt werden.
[0035] Erfindungsgemäß wird dargestellt, dass die hemmende Wirkung von Inhibitoren, die mit der Chloro- und/oder Fluoromethylketon-Schutzgruppen versehen wurden, auf die HIV- Replikation, Assemblierung und Freisetzung nicht aber die enzymatische Aktivität der HIV-I PR (Protease ?) trifft. Durch in vitro Prozessierungsstudien an isolierten Gag- und PR-Mo lekülen von HIV-I wird gezeigt, dass verschiedene Substanzklassen von Inhibitoren Helikaseinhibitoren keinerlei Einfluss auf die PR- Aktivität ausüben.
[0036] Erfindungsgemäß wird der inhibitorische Effekt der erfindungsgemäßen Inhibitoren der Helikase- und/oder Proteaseaktivität auf die Virusreplikation in Kulturen HIV-I -infizierter CD4 + T-Zellen demonstriert. Die Zugabe von nanoM-Konzentrationen an verschiedenen Substanzklassen der erfindungsgemäßen Inhibitoren der Helikase- und/oder Proteaseaktivität verhindert die Infektionsausbreitung und bewirkt das Ausbleiben einer produktiven Virusreplikation.
[0037] Das in der Erfindungsbeschreibung dargestellte Prinzip der Verwendung der erfindungsgemäßen Inhibitoren der Helikase- und/oder Proteaseaktivität zur Blockierung einer HIV-Infektion ist neuartig in Hinsicht auf die Verwendung einer bereits bekannten Substanzklasse (mit chemischen Schutzgruppen versehene Helikase- und/oder Proteasehemmer) für eine neue Aktivität (der Blockierung von Gag-Prozessierung und Freisetzung von Retroviren).
[0038] Weiterhin ist neu, dass die Verwendung der erfindungsgemäßen Inhibitoren der Helikase- und/oder Proteaseaktivität zur Blockierung von HIV und anderen Retroviren nicht das Virus selber, sondern Mechanismen beeinflusst, die in allen Wirtszellen des Virus konserviert sind. Im Vergleich zu bisherigen anti-retroviralen Methoden, die essentielle Komponenten des Virus selber treffen, ist die Wahrscheinlichkeit der Entstehung von Resistenzmechanismen bei Applikation von mit Schutzgruppen versehenen Inhibitoren der Helikase um Größenordnung geringer. Die Neuartigkeit dieses Wirkprinzips der erfindungsgemäßen Inhibitoren der Helikase- und/oder Proteaseaktivität zeigt sich auch in der Tatsache, dass diese Inhibitoren ein breites Wirkungsspektrum gegenüber unterschiedlichen Isolaten von HIV-I besitzen. Der inhibitorische Effekt wurde im Rahmen der Erfindung mit gleicher Intensität bei verschiedenen primären als auch Zellkultur-adaptierten T-Zelltrophen und Makrophagen-trophen HIV-Isolaten beobachtet.
[0039] Neuartig ist weiterhin das Prinzip der Wirkung der erfindungsgemäßen Inhibitoren der Helikase- und/oder Proteaseaktivität, die zwar nicht den Viruseintritt, wohl aber die Produktion von infektiösen Viruspartikeln von bereits infizierten Zellen verhindern. Dadurch sollte wesentlich die Menge an infektiösen Virionen (Viruslast) und somit die Infektionsausbreitung in vivo reduziert werden können. Die mittlere überlebenszeit einer akut HlV-infizierten T-Zelle beträgt wenige Tage. Zudem ist bekannt, dass die Hemmung der Virusfreisetzung und die damit verbundene Akkumulation von zum Teil toxischen HIV-Proteinen (insbesondere den Env- Hüllproteinen) zu einem verstärkten zytopathischen Effekt und dadurch zum schnelleren Absterben der infizierten Zelle führt. Neben der Neuinfektion sollte die Wirkung der erfindungsgemäßen Inhibitoren der Helikase- und/oder Proteaseaktivität auch zu einem schnelleren Absterben von bereits infizierten Zellen führen.
[0040] In der Summe dieser neuartigen Mechanismen lässt sich feststellen, dass die verminderte Freisetzung von noch dazu wenigen oder gar nicht infektiösen Viruspartikeln im Netto-Effekt bei gleichzeitigem Zelltod der Virus-produzierenden Zellen im Falle einer in vivo Anwendung der erfindungsgemäßen Inhibitoren der Helikase- und/oder Proteaseaktivität die Menge an infektiösen Virionen im peripheren Blut und gleichzeitig die Zahl infizierter Produzentenzellen von HIV im Gesamt-Organismus reduziert. Dies macht die Anwendung der erfindungsgemäßen Inhibitoren der Helikase- und/oder Proteaseaktivität allein oder in Kombination mit bereits in der anti-retroviralen Therapie verwendeten Enzymhemmern attraktiv.
[0041] Die Prinzip-Lösung der Aufgabe wird an den Beispielen von HIV- Viren gezeigt. In Kontrollversuchen wurde zunächst dargestellt, dass eine Vorbehandlung der Target-Zellen (CD4 + T-Zellen) mit nicht-zytotoxischen Konzentrationen verschiedener Substanzklassen von Inhibitoren der Helikase- und/oder Proteaseaktivität keinen Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Wirtszelle ausübt.
[0042] Die Erfindung soll anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden, ohne auf diese Beispiele beschränkt zu sein.
Ausführungsbeispiele
Beispiel 1 :
[0043] Die Behandlung von humanen HlV-infϊzierten Zellkulturen mit moderaten Konzentrationen von potentiellen Inhibitoren der Protease reduziert drastisch das Wachstum infizierter Zellen. Hierbei zeigt sich keine unspezifische Zell-Toxizität.
Die Inhibition der HIV-Replikation im HLT-System zeigt Figur 1 :
Die humane Tonsille wurde nach der Ektomie in 3-5mm große Blöcke geschnitten und je 9 dieser Blöcke auf Gelschwämme zur weiteren Kultivierung gegeben. Jeder Block wurde mit 10ng HIV für 24h infiziert bei gleichzeitiger Gabe von 50μM AAPFcmk. Es wurde pro Ansatz eine 3fach Bestimmung durchgeführt. Nach 24h wurde das Virus rausgewaschen und die Blöcke für weitere 15 Tage in RPMI-Medium kultiviert. Alle 3 Tage wurden überstände für die RT- Aktivitätsbestimmung genommen und neues Kulturmedium dazugegeben.
Beispiel 2:
[0044] Die Behandlung von Methylprednisolon-behandelten Thymozyten mit Chloromethylketonen verhindert Lamin-Breakdown, Chromatinfragmentation und apoptotisch bedingte morphologische Veränderungen.
Beispiel 3 :
[0045] Chloromethylketone besitzen ein sehr starkes, Dosis-abhängiges Potential zur Wachstumshemmung ras-transformierter Zellen.
Beispiel 4:
[0046] Erste Experimente weisen auf eine AAPFc M κ/Chloromethylketon-bedingten Verminderung der Replikation von HI-Viren im humanen lymphatischen System hin.
Literatur:
Clawson et al. 1993. An inhibitor of nuclear scaffold protease blocks chemical transformation of fibroblasts. Cell Growth Differ. 4(7):589-94.
Clawson et al. 1995. Nuclear scaffold-associated protease: in situ nuclear localization and effects of a proteasome inhibitor on growth and morphology of a ras-transformed hepatocyte cell line. Hepatology 22(4 Pt l):1230-5.
Drubin et al. 2006. A Protease Inhibitor Specifically Inhibits Growth of HPV-Infected Keratinocytes. Molecular Therapie 13(6): 1142-8.
Drubin et al. 2004. Spontaneous transformation of an immortalized hepatocyte cell line: potential role of a nuclear protease. Cancer Letters 213: 39-48.
Pereira et al. 1999. The 2.2 A crystal structure of human chymase in complex with succinyl-Ala- Ala-Pro-Phe-chloromethylketone: structural explanation for its dipeptidyl carboxypeptidase specificity. J Mol Biol. 286(1): 163-73.
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