USO DE COMPOSICIONES QUE CONTIENEN MENADIONA Y/O ALGUNO (S) DE SUS DERIVADOS HIDROSOLUBLES A FIN DE INDUCIR EN LOS CULTIVOS TRATADOS UNA MEJORA DE SUS FRUTOS A LA MANIPULACIóN Y AL TRANSPORTE

SECTOR DE LA TéCNICA

Bioestimulación de los mecanismos naturales de las plantas. Mecanismos naturales de absorción y transporte del Ca2+ por Ia planta. Mejora características tecnológicas de frutas. Resistencia a Ia manipulación y transporte. Tratamientos postcosecha.

ESTADO DE LA TéCNICA

Las fisiopatías que afectan a los frutos de los principales cultivos así como los problemas asociados a los mismos en Ia post-cosecha disminuyen Ia calidad de Ia cosecha al mismo tiempo que representan un problema para

Ia manipulación, transporte de los frutos y vegetales cosechados. El fenómeno del pardeamiento de frutos y vegetales durante el crecimiento, recogida y almacenamiento, así como de sus derivados y productos procesados, tales como zumos, extractos, etc, constituyen un problema de primera magnitud para Ia industria agroalimentaria. En general, este fenómeno se reconoce como una de las principales causas de pérdida de calidad y valor comercial. Este pardeamiento puede producir cambios importantes tanto en Ia apariencia (coloración oscura) como en las propiedades organolépticas de vegetales comestibles, además de ir acompañado de olores y del deterioro del valor nutricional.

Diferentes fisiopatías que afectan al tomate (Blosson-end rot) o al manzano (Bitter- pit) han sido objeto de numerosos estudios dada Ia elevada repercusión económica que tendría su reducción. Ambas fisiopatías se atribuyen a alteraciones en los procesos de absorción y

transporte de calcio desde las raíces a los frutos, concretamente a Ia parte distal. Este hecho se ha podido demostrar induciendo Ia aparición de esta fisiopatía mediante Ia restricción del contenido de las sales de calcio en Ia disolución nutritiva del suelo o bien mediante experimentos realizados en cultivo hidropónico. También se ha podido correlacionar una mayor incidencia con otros factores que afectan directa o indirectamente a Ia absorción y transporte de calcio en Ia planta, como son el incremento de Ia salinidad en el suelo, condiciones de estrés hídrico, falta de aireación de las raíces, entre otros factores abióticos.

El porcentaje de frutos afectados por este tipo de fisiopatías se intensifica en condiciones de invernadero, donde los requerimientos de calcio por parte de los frutos, como principales sumideros de elementos nutricionales durante Ia etapa de crecimiento celular rápido, aumentan por unidad de área y tiempo. Situaciones de déficit de calcio provocan una pérdida de integridad de las membranas y paredes celulares que conforman el tejido de los frutos. Este hecho provoca Ia rotura de las paredes celulares de las células de los tejidos e induce una mezcla de los componentes del citoplasma y de los contenidos de los diferentes compartimentos celulares. En el tomate, por ejemplo, estos procesos a nivel celular se traducen a nivel macroscópico en una pérdida de turgencia en las partes apicales de los frutos que avanza en forma de círculos concéntricos sobre todo en Ia etapa de crecimiento rápido de las células que componen los tejidos de los frutos de tomate jóvenes, seguido de un ennegrecimiento (necrosis) de los tejidos afectados. La aparición de estos síntomas constituye Ia fisiopatía que se denomina podredumbre apical. Los síntomas típicos de esta fisiopatía son el pardeamiento y necrosis de los frutos.

El aumento de Ia demanda de calcio para Ia síntesis de Ia pared celular, como resultado de una rápida expansión celular debida a un importe elevado de sacarosa al fruto, parece inducir el desarrollo de podredumbre

apical en frutos de tomate. La aparición de esta fisiopatía en el tomate tiene además un componente genético. La eficiencia en Ia distribución o transporte de calcio varía con Ia línea genética existiendo variedades con un mayor o menor grado de susceptibilidad.

En los últimos años se ha suscitado un enorme interés por el papel del calcio (Ca ²⁺ ) en las células vegetales, ya que, entre otras funciones, es el único elemento químico reconocido que actúa como mensajero en plantas. Es un hecho conocido que los iones Ca ²⁺ una vez liberados por el retículo endoplasmático al citoplasma son atrapados por unas proteínas denominadas calmodulinas, presentes en todas las células eucariotas. Recientemente se ha demostrado que se producen cambios en Ia ruta biosintética de Ca ²⁺ -calmodulina y proteínas similares como consecuencia de señales externas. Asimismo, se han identificado canales de Ca ²⁺ y se han caracterizado, a escala bioquímica y molecular, quinasas dependientes de calcio.

Numerosos estudios han señalado Ia importancia que tienen dos importantes mecanismos de transporte de calcio al fruto: las auxinas y flujo de transpiración. Las auxinas han sido implicadas en Ia activación de Ia transcripción de genes que codifican Ia síntesis de calmodulina, Ia cual es capaz de unirse a los iones de Ca ²⁺ y de movilizarlo dentro de Ia célula, incrementando de esta forma Ia plasticidad de las paredes celulares, factor esencial necesario para Ia expansión celular asociada al crecimiento vegetal.

Los reguladores del crecimiento en general tienen Ia capacidad de modular a través del metabolismo de las auxinas el desarrollo y crecimiento de los plantas. En los últimos 25 años hemos venido investigando sobre el efecto que los reguladores del crecimiento de las plantas podrían producir en el

reforzamiento de los mecanismos naturales de defensa de las plantas y, como consecuencia, en Ia inducción de resistencia a patógenos y plagas en las plantas tratadas con dichos reguladores. En estas investigaciones hemos observado como un determinado tipo de reguladores del crecimiento de las plantas, los derivados hidrosolubles de Ia Vitamina K, eran capaces de estimular los mecanismos naturales de defensa de las plantas tratadas y consecuentemente de inducir resistencia frente a los ataques de patógenos y plagas: ["Compositions for inducing resistance to tracheomycosis in plants ". Patente: WO 95 / 03702, publicada: 09.02.95] ;[ "Uso de composiciones que contienen menadiona, para bioestimular el metabolismo de plantas a fin de inducir su resistencia a patógenos y plagas ". Patente: 95ES - 9500522, publicada: 16.04.99]

La bibliografía sobre los reguladores del crecimiento de las plantas basados en Ia Vitamina K y sus derivados solubles en agua es muy reducida, apareciendo Ia primera referencia como Patente, en 1985 ["Plant growth regulator — contg. menadione bisulphite — giving cold resistance to rice, vegetables, flowers and fruti trees " . 83JP -179430, publicada: 24.04.85.], y seguida cronológicamente por las siguientes Patentes: [ "Citrus fruit quality improving agent — contains water - soluble Vitamin K deriv. As active component "85JP - 055993, publicada: 25.09.86]; [ "Plant growth regulator promoting increase in harvest yield - contains water - soluble Vitamin K other than menadione bisulphite adduct ". 85JP - 054297, 25.09.86] ; [ "Agent for promoting maturity crops - contains water - soluble Vitamin-K deriv. e.g. menadiol dinicotinate " .86JP - 028878 , publicada : 20.08.87 ] ; [ "Additive for rice seedlings cultivating mat — contains water sol. Vitamin-K deriv. as active component " .86JP - 030770 , publicada : 20.08.87 ] ;[ "Fatigue of strawberry root preventing agent — contains water soluble Vitamin-K deriv. as active component " .86JP - 032021 , publicada : 22.08.87 ] ; [ "Plant growth accelerator compsn. based on Vitamin-K, contg. menadione and menadiol cpds. With aromatic

amine salts and a carrier". 85ES-542475, publicada: 16.06.88]; ["Plant growth regulation ". 76US - 4764201 , publicada: 16.08.88]; ["Seed treatment compsn. contg .water - sol. Vitamin-K deriv. of álcali metal, alkaline earth metal, etc. ". 89JP - 040255, publicada: 04.09.90] ; [ "Plant growth regulator for increase yield and quality - — Vitamin-K3 and choline salt as active components ". 89JP - 155629, publicada: 01.02.91]; ["Plant growth promotion - with menadione bisulphite adducts of vitamin (s) or aminoacid (s) ". 90IT - 020777, publicada: 15.01.92]; [ "Growth activator contg. Vitamin-K derives - for agricultural or horticultural crop plant alleviating of chemical injury caused herbicide". 90JP - 153870, publicada:

16.01.92].

Hasta Ia publicación (16.04.99) de nuestra Patente: 95ES-9500522, antes señalada, no aparecen en Ia bibliografía referencias que relacionaran este tipo específico de reguladores del crecimiento de las plantas, Ia Vitamina-K y sus derivados hidrosolubles, con Ia inducción de resistencia a patógenos y plagas en las plantas tratadas con dicho tipo de reguladores. Hemos seguido investigando, especialmente, en el cultivo de platanera (banana) y observamos como un derivado hidrosoluble de Ia Vitamina K3, Ia menadiona sodio bisulfito ó MSB, estimulaba el adelanto de Ia floración de las plantas tratadas, frente a las no-tratadas. Consecuencia de estas investigaciones fue Ia publicación de las dos Patentes siguientes:[ "Uso de composiciones que contienen menadiona, para bioestimular el metabolismo de las plantas a fin de adelantar Ia floración en los cultivos de plátanos ". 95ES-9500523, publicada: 01.10.98]; ["Utilization of compositions which contain menadione for the biostimulation of plant metabolism in order to induce their resistance to pathogens and pests and /or accelerate their blooming". WO 96/28026].

Hemos demostrado que las plantas tratadas con derivados hidrosolubles de Ia Vitamina K3, especialmente con el MSB, no solamente inducen

resistencia a patógenos y plagas [Patentes: WO 95 / 03702 ; 95ES - 9500522 ; WO 96 / 28026 ], sino que además originan el desarrollo de propiedades antialimentarias frente a los ataques de patógenos y plagas, en las plantas tratadas [Patente ES-200601179]

Hemos seguido investigando sobre las propiedades del MSB en relación a las fisiopatías que afectan a numerosos cultivos, asociadas a una deficiente absorción y transporte del calcio a los frutos y, sorprendentemente, hemos observado un efecto positivo frente a Ia aparición de las mismas en las plantas tratadas con MSB. Ninguna referencia ha aparecido hasta Ia fecha en Ia bibliografía que relacione Ia vitamina K3 y/o alguno de sus derivados hidrosolubles con Ia inducción de una mayor resistencia a Ia manipulación y transporte de los frutos en aquellas plantas tratadas con alguno de los citados componentes activos.

DESCRIPCIóN DE LA INVENCIóN

Breve descripción de Ia invención

Esta invención está relacionada con el tema general de las fisiopatías que afectan a los cultivos y con Ia posibilidad que existe de inducir una mayor resistencia a las mismas mediante el uso de composiciones que contienen menadiona (vitamina K ₃ ). La aplicación a las plantas de composiciones que contienen menadiona y/o alguno de sus derivados hidrosolubles, principalmente menadiona sodio bisulfito (MSB), es capaz de inducir a través de Ia bioestimulación de Ia absorción y transporte del calcio por Ia planta, una mayor resistencia a las fisiopatías causadas por deficiencias en el metabolismo de este elemento. De esta forma el tratamiento con MSB, por un lado, contrarresta en parte Ia incidencia de este tipo de fisiopatías disminuyendo los costes debidos a las mermas en Ia producción por este concepto, y por otro, a través de un aumento de Ia dureza de los frutos, mejora Ia manipulación y el transporte de los mismos.

Descripción detallada

Esta invención está relacionada con el uso de composiciones que contienen menadiona y/o alguno (s) de sus derivados hidrosolubles que cuando son aplicadas a las plantas son capaces de bioestimular los mecanismos naturales de absorción y transporte del calcio de Ia planta, a fin de inducir en los cultivos tratados una mejora de sus frutos a Ia manipulación y al transporte.

Esta invención describe el uso de una clase de compuestos que son sistémicos, biodegradables, no pesticidas, no tóxicos e inocuos desde el punto de vista medioambiental, y que no son peligrosos para las plantas, los animales y las personas. Dichos compuestos, que originan el desarrollo de propiedades que afectan positivamente al transporte de calcio en Ia planta induciendo en los cultivos tratados una mejora de Ia manipulación y del transporte de los frutos cosechados, son:

La menadiona o Vitamina K3 (2-metil -1 ,4-naftalendiona ó 2-metil-1 ,4- naftoquinona) , Merk índex = 5714 , C.A.R.N.=[ 58 -27 - 5] y sus derivados solubles en agua {preferentemente los diferentes compuestos de adición formados con bisulfito sódico ( menadiona sodio bisulfito ó MSB, M. I. = 5716, C.A.R.N.= [ 130-37-0], o con bisulfito potásico, o con bisulfito amónico, o con bisulfito magnésico}, y otros derivados de Ia Vitamina K3 de bajo nivel de solubilidad en agua {preferentemente menadiona nicotinamida bisulfito o MNB, menadiona ácido p- aminobenzoico bisulfito menadiona histidina bisulfito, menadiona adenina bisulfito, menadiona ácido nicotínico bisulfito y menadiona triptofano bisulfito}.

Las composiciones que originan el desarrollo de propiedades que afectan positivamente al transporte de calcio en las plantas tratadas, induciendo en

los cultivos tratados una mejora de Ia manipulación y transporte de los frutos cosechados, contienen:

Vitamina K3 y/o al menos uno de sus derivados solubles en agua [preferentemente el menadiona sodio bisulfito o MSB] y/o al menos uno de sus derivados de bajo nivel de solubilidad en agua [preferentemente el menadiona nicotinamida bisulfito o MNB].

La aplicación a Ia superficie de Ia planta de una de las composiciones anteriormente señaladas, conteniendo una cantidad efectiva de uno o más de los compuestos descritos, origina una respuesta protectora frente a las fisiopatías originadas por las deficiencias de calcio en el fruto.

La forma recomendada para aplicar las diferentes composiciones es Ia pulverización de Ia parte aérea de Ia planta, Io que no excluye, por ejemplo, inyección en el tallo , aplicación directa al suelo u otro medio de crecimiento de Ia planta, o indirectamente a través del agua de riego (o solución de cultivo), o por inmersión en las composiciones del sistema radicular o de Ia totalidad de Ia planta.

La efectividad de los componentes activos de las composiciones, referida a Vitamina K3 , MSB y MNB puede esperarse a las siguientes concentraciones : Vitamina K3 entre 0.0001 y 200 p.p.m. ; MSB entre 0.001 y 10000 p.m.m. ; MNB entre 0.001 y 10000 p.p.m. ; preferentemente Vitamina K3 entre 0.001 y 100 p.p.m., MSB entre 0.01 y 5000 p.p.m., MNB entre 0.01 y 5000 p.p.m.

La concentración de los componentes activos de las composiciones dependerá del tipo de planta, fase de desarrollo de Ia misma, así como de Ia frecuencia y forma de aplicación de las composiciones.

Asimismo, dichas composiciones se pueden mezclar con varios aditivos, por ejemplo: fertilizantes orgánicos e inorgánicos, insecticidas, nematocidas, fungicidas, bactericidas, herbicidas.

Descripción del contenido de las figuras

Figura 1. Expresión del gen calmodulina en las hojas de tomate 6 días post-tratamiento

EJEMPLOS Ejemplo 1:

Descripción del experimento: Se tomaron hojas de tomate (3 réplicas/trat/día) de 8 semanas correspondientes a los diferentes tratamientos ensayados (MSB 60 p.p.m., Control agua destilada) a los 3 y 6 días posteriores al tratamiento (pulverización foliar de 200 ml/planta). Una vez cortadas las hojas fueron convenientemente etiquetadas guardadas en bolsas plásticas y conservadas a - 8O ⁰ C hasta su procesamiento. Para medir Ia expresión del gen objetivo se utilizó Ia técnica conocida como relativa- cuantitativa RT-PCR (retrotranscripción acoplada a una reacción en cadena de Ia polimerasa de ADN). En primer lugar se procedió a Ia extracción del RNA total. Una vez aislado el RNA se partió de 1 μg del mismo para sintetizar Ia primera hebra de complementario de ADN. Para el análisis del gen en cuestión, calmodulina, se llevaron a cabo reacciones multiplex RT-PCR consistentes en Ia amplificación simultánea de transcriptos del gen de Ia calmodulina (GenBank Accession number M67472) y de un gen constitutivamente expresado (estándar interno). Las reacciones de de PCR fueron llevadas a cabo en un volumen total de 15 μl con 1.5 μl de buffer 5X, 0.3 μl de dNTP mix, 1.2 μl de cada cebador de calmodulina (5 μM de cada cebador: Izdo: 5 ^' - GAG GAG CAG ATC GCT GAG TT-3 ^' ; dcho: 5 ^' - CAC TTG GCA AGC ATC ATA CG -3 ^' , cebador derecho e izquierdo respectivamente), 1.2 μl de 18S:Competimers Kit de Ambion ^® (ratio 2:8), 0.06 μl de Taq

polimerasa, 0.75 μl MgCI2 y 8.5 μl de agua. Condiciones PCR: desnaturalización inicial de 94 ⁰ C 2 min. seguido de 35 ciclos de 94 ⁰ C 30 sea, 6O ⁰ C 30 sea, 72 ⁰ C 30 sea y una extensión final a 72 ⁰ C durante 5 min.

Para el análisis de los geles de agarosa tras Ia electroforesis se utilizó el Kodak 1 D Image Analysis Software. En el tratamiento Control no fue detectada ninguna expresión de este gen, a los 3 y 6 días posteriores al tratamiento (dpt), en cambio, tanto a los 3 como a los 6 dpt se pudo observar expresión del gen de Ia calmodulina (en Ia figura 1 sólo se muestra Ia expresión a los 6 dpt)

El gen que codifica para Ia síntesis de Ia proteína calmodulina no es un gen constitutivo de Ia planta sino que es inducible. Los resultados obtenidos muestran claramente que el tratamiento con MSB de las plantas de tomate indujo Ia expresión de este gen, Io que implica una relación entre el tratamiento de las plantas con MSB y Ia movilización de cationes calcio en Ia planta a través de su unión específica con Ia calmodulina.

Ejemplo 2:

Descripción del experimento: Se ensayó en una parcela de un cultivo de fresón Ia eficacia del tratamiento con MSB sobre el grado de dureza del fruto. La determinación del grado de dureza se realizó tanto en Ia parcela tratada (tratamiento MSB) como en otra parcela no tratada con MSB del mismo cultivo de fresón (tratamiento Control). Las plantas fueron tratadas foliarmente (con 60 p.p.m. de MSB o solo con agua) cada 15 días a partir del transplante hasta 2 semanas antes de Ia recolección. Se recolectaron nueve frutos al azar por cada tratamiento. Se dejaron los frutos dos días en una cámara a 2 ^o C. Para Ia determinación de Ia dureza de Ia fruta se utilizó un penetrómetro (0-5 Kg-fuerza/cm ² ), haciéndose varias medidas para cada fruto. La determinación fue realizada a 2O ⁰ C.

Tabla 1

1 Valor medio en Ia dureza de al menos 3 medidas por fruto.

² Las medias de Ia dureza son significativamente diferentes ( p = 0.001 ) según el t-test de Student para comparación de medias.

Estos resultados muestran claramente que el tratamiento con MSB de las plantas de fresón aumenta significativamente Ia dureza de Ia fruta recolectada, Io que implica por una parte, una mayor resistencia a Ia manipulación y al transporte de los frutos, y por otra, que éstos como consecuencia sean más durables.

El tratamiento con estas composiciones, por un lado, contrarresta en parte Ia incidencia de este tipo de fisiopatías disminuyendo los costes debidos a las mermas en Ia producción por este concepto, y por otro, a través de un

aumento de Ia dureza de los frutos, mejora Ia manipulación y transporte de los mismos.