CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención está relacionada con la técnica y principios empleados en la Biotecnología para el desarrollo de nuevos productos antibióticos, y mas particularmente, está relacionada con el uso del compuesto 4-2(2,3-dihidro-2-tiaxo-3- que tiene una actividad antibtótica y es útil para preparar un rnecfccamento para el tratamiento de enfermedades provocadas por bacterias gramnegativas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

Una de las dificultades principales para expandir el repertorio de agentes aritimicrobianos útiles radica en el número relativamente pequeño de macromolecutas que son el blanco de las terapias antibióticas actuales, las cuales están involucradas principalmente en pared o membrana celular, RNA (acrónimo en ingles de ácido ribonucleico) ribosomal o vias de síntesis proteica. Es importante desarrollar nuevos antibióticos con blancos moleculares altemos (Waldrop, 2009).

Entre las múltiples estructuras y funciones de las moléculas de RNA, tanto las ríbozimas como los complejos RNA-protefna, han sido propuestos como blancos adecuados debido a sus roles clave en la fisiología microbiana (Kawamoto ef al, 2008). La Ribonucleasa P (RNasa P) es una ríbozima esencial en bacteria (revisado en Kazantsev y Pace, 2006), lo que la convierte en un blanco potencial para el desanclo de fármacos (WiUkomm, et al., 2003). La RNasa P es un complejo ribonudeoprotélco que cataliza el rompimiento de la secuencia 5' -líder de los pre-tRNAs durante la maduración de tos tRNAs. Los intibidores de la RNasa P actuarán entonces por modo del bloqueo de la síntesis proteica. La RNasa P es, además del ribosoma, la única ribozima universal que se conoce (McClain, et al., 2010). El componente de RNA es el catalizador primario de la reacción (Guerrier-Takada et al, 1983). La función de la protefna P es la de unir el líder 5 ^* del sustrato pre-tRNA y asistir la salida del producto (Reiter, et a/., 2010).

En el ser humano, la RNasa P está compuesta de una molécula de RNA y al menos nueve proteínas diferentes, ninguna de las cuales tienen simiitudes con la proteína de bacteria. Estas diferencias radicales, aunado al hecho de que la protefna P sea esencial in vivo, hacen de esta sub-unidad un blanco adecuado para el desarrollo de nuevos antibióticos.

Adicionalmente, la protefna P está altamente conservada en bacteria y su tamaño es pequeño, lo que facilita la búsqueda de inhibidores de bajo peso molecular en la estructura tridimensional, asf como el manejo de la muestra y la reprodudbitidad de los experimentos.

Hasta el momento, no hay ningún inhibidor reportado y validado que irrteraccione de manera especifica con la protefna P, y existen algunos inhibidores no específicos dirigidos contra la subunidad de RNA:

De las estructuras anteriores:

A: Inhibidores anti-sentido. Dada la naturaleza de RNA como parte de la RNasa P. se ha explorado el desarrollo de olgonudeótidos anti-sentido. Sin embargo, la entrada de estos Inhibidores a la bacteria es aún ineficiente. B: Aminoglicósidos. Estos compuestos cargados pueden interactuar con la carga negativa de los grupos fosfato de los ácidos nucleicos. Son los Inhibidores mas eficientes que se han encontrado, con valores de ICn de 0.5 nM. Sin embargo, aún cuando este tipo de derivados podrían ser prometadores debido a su flexibilidad confbrmacional, carga positiva y versatilidad, el hecho de que tengan como blanco a la sub-unidad de RNA, con un centro catalítico que es universalmente conservado, hace que la

C: Otros inhibidores. Los bis-benzimidazoles y las porfirinas inhiben a la RNasa P uniéndose al pre-tRNA. Figura construida a partir de los datos de Wfllkomm, er al., 2010.

En el estado de la técnica se encuentran diversos documentos relacionados con la materia de la presente invención, siendo d más cercano la Patente Norteamericana Serie No. 9,233,095 que describe inhibidores de molécula pequeña de la ribonudeasa bacteriana (por ejemplo, RnpA) y métodos para su síntesis y uso. Los métodos de uso de los compuestos Incluyen el tratamiento y la prevención de las infecciones microbianas y la inhibición de la ribonudeasa bacteriana. También se describen métodos de identificación de compuestos para el tratamiento o prevención de una infección microbiana.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION

La presente invención se refiere al uso del compuesto

Benzoxazolimetlamino)-ácido saücflico (4-DTS) derivado del

como inhibidor (en el rango micromolar bajo) de la RNasa P bacteriana, específicamente inhibe el crecimiento de la bacteria Escherichia coli.

Se realizó un escrutinio del efecto de diversos compuestos sobre la Ribonudeasa P bacteriana, basados en una plataforma que induye: 1) uso de ibrerfas de compuestos de relevancia química y biológica para el diseño de fármacos basado en fragmentos; 2) cristalografía de rayos X, que permite visualizar sitios específicos de unión; 3) interferometría de biocapas, utilizada para el análisis de la unión y despegado de compuestos a macromoléculas; 4) un ensayo de actividad en tiempo real para cuantificar inhibición mediante un sustrato fluorescente; y, 5) ensayos de crecimiento en una cepa de Eacherichia cotí que permite monitorear la inhibición específica de la RNasa P.

OBJETOS DE LA INVENCION

Teniendo en cuenta los defectos de la técnica anterior, es un objeto de la presente invención proveer el uso del compuesto

como inhibidor contra bacterias patógenas, basándose en la tecnología de búsqueda de fragmentos.

Es un objeto más de la presente invención proveer el uso del compuesto 4-DTS ya que presenta una actividad como inhibidor de la Ribonudeasa P (RNasa P) bacteriana. Un objeto adicional de la presente invención es proveer el uso del compuesto 4-DTS para preparar un medicamento para el tratamiento de infecciones por bacterias gram negativas tal como la Eacherichia co/i.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Los aspectos novedosos que se consideran característicos de la presento invención, se establecerán con particularidad en las reivindicaciones anexas. Sin embargo, la invención misma, tanto por su organización, conjuntamente con otros objetos y ventajas de la misma, se comprenderán mejor en la siguiente descripción detallada de las modalidades de la presente invención, cuando se lea en relación con los dbujos que se acompañan, en los cuales:

La figura 1 es una gráfica que muestra tos resultados obtenidos de la unión dosis-dependiente del compuesto 4-(2,3-Dlhidro-2-Tloxo-3-Benz^

ácido salicílico (4-DTS) a la proteína P. La figura 2 es una gráfica que muestra los resultados obtenidos de la inhibición del compuesto 4-DTS a la reacción de la RNasa P en el rango micromolar bajo.

La figura 3 muestra una placa sobre la cual se crece un tapizado de bacterias. En la placa superior se muestra el crecimiento en presencia de 10 mM de arabinosa (expresión de RNA P); mientras que en la placa inferior se muestra el crecimiento en presencia de 10 mM glucosa (expresión de PRORP, una proteína con actividad de RNasa P).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES DE LA INVENCIÓN

En razón de los problemas encontrados en el estado de la técnica por la falta de compuestos químicos inhibidores y validados para interaccionar con la proteína P, se

encontrándose que dicho compuesto presenta actividad como inhibidor de la Rfconucleasa P (RNasa P) bacteriana.

La presente invención establece una plataforma general para el desarrollo de inhibidores contra la RNasa P. Para ello se montaron cuatro técnicas en un formato de alto rendimiento, a saber ensayo de visualizadón en 3D, ensayo de unión en solución, ensayo de actividad y ensayo de crecimiento, empleándose una metodología de medición de actividad y una aplicación para realizar ensayos in vivo de una cepa bacteriana.

A efecto de encontrar el compuesto con actividad inhibitoria de la protefna P se partió de la producción y purificación de la proteína P del modelo bacteriano Thermatoga marítima (TmP), la cual se realza de acuerdo a lo reportado por Krivenko, 2002. En base a estudios previos de Kazantsev ef. a/. (2003) sobre la cristalización de la protefna

P.

Con el objeto de poder visualizar en 3D a la protelna P en presencia de un compuesto inhibidor, se realizó una búsqueda de las condiciones idóneas de cristalización mediante el método de difusión de vapor en modalidad de gota sedente. Las soluciones, concentraciones, asi como los rangos de porcentaje y de pH, fueron las siguientes: 100 mM, Acetato de Sodio (NaOAc), pH = 4.8 - 5.2, Polietilenglicol (PEQ) 1000 - 12-18%, 200 mM Sulfato de Potasio 00804), Protefna « 2 - 14 mg/mL

La búsqueda de las condiciones ideales de cristalización dentro de estos rangos se realizó en placas de cristalización Swisscí™ de 06 pocilios. Se colocó una gota con 1 \iL de proteína a 3 mg/mL y 1 pL de solución madre añadiendo 40 pL de la misma en el reservorio y fue sellado con una película plástica (HR3-609, Crystal Ciear SeaNng Film). En esta configuración los experimentos se llevaron a cabo a 23°C. Los cristales crecieron dentro de una semana hasta alcanzar dimensiones aproximadas de 300 pm x 200 pm x 90 pm. Previo al sobreenfriamiento en nitrógeno liquido, los cristales se sumergieron por un minuto en una solución crioprotectora que contenía el loor madre con 35% de PEG 1000. Los experimentos de se llevaron a cabo colocando 1 pL de protelna a de solución madre que ademas contenía

un coctel de 4 fragmentos a 20 mM (5 mM por fragmento), sellando con una película plástica y dejando a 21°C.

Una vez que se observaron cristales crecidos mecíante co-cristelización, estos se sometieron a experimentos de remojado en coctel de fragmentos de la siguiente manera:

1. Se tomaron loa cristales crecidos por co-cristalización y se colocaron en un cubreobjetos de vidrio añadiendo 2 pL de solución madre para evitar daño al cristal;

Z Se añadió 1 μL de solución crioprotectora adicionada con fragmentos (9 pL de solución crioprotectora más 1 μL de coctel de 4 fragmentos a 20 mM, por lo que la concentración final de cada fragmento fue de 5 mM) y se incubó por 4 minutos; al cabo de ese tiempo, se tomó el cristal e inmediatamente se sumergieron y almacenaron en nitrógeno liquido hasta su uso.

Una ventaja técnica notable es que el PEG-1000 tuvo una triple fundón en los experimentos de cristalización y en la búsqueda de fragmentos, pues ae utilizó como agente precipitante durante la cristalogénesis (PEG-1000 12%), funcionando como solvente de los compuestos de la biblioteca Zenobia ⁷¹¹ (PEG-400 50%), asi como crioprotector de los cristales (PEG-1000 35%). De tal manera que el daño al cristal fue mínimo al estar siempre en contacto con el mismo agente precipitante.

Los juegos de datos fueron colectados a partir de monocristales a temperatura criogénica (100 K) en el sector LS-CAT, linea 21-iD-G (energía de 12.7 keV) en el sincrotrón Advanced Photon Source (APS) del laboratorio nacional Argonne en lünoia, USA. Las reflexiones se indexaron con el programa MOSFLM (Lesle er a/, 2007), se integraron con el programa XDS (Kabech, 2010) y se escalaron con SCALA (Evans, 2005). La estructura de la proteína P fue determinada por el método de reemplazo molecular con el uso del programa PHASER de CCP4 (McCoy er al, 2007). El modelo estructural de la subunídad proteica de la RMasa P de T. marítima fue usada como modelo de búsqueda (PDB ID: 1NZ0; Kazantsev ef. al., 2003). Las mejores soluciones del reemplazo molecular fueron obtenidas con el grupo espacial moncdinico primitivo P 2i y dimensiones de celda unitaria a=56.8 A, 0=64.8 A, c=68.5 A y ángulos £=101.5°, σ=ν=90.0°. El modelo inicial fue sujeto a vanas rondas de inspección manual con Coot (Emsley and Cowtan, 2004) y el afinamiento cristalográfico con REFMAC5 (Murshudov et al, 1997). El afinamiento final fue hecho con el programa PHENIX (Adame ef al, 2010). La estructura final fue determinada a una resolución de 1.5 A. El modelo final tuvo valores Ξ modelo resutante se caracteriza por tener buenos parámetros estereoquimicos y ningún aminoácido se encontró en regiones prohibidas del mapa de Raniachandran. La búsqueda de fragmentos se realizó con el programa UgandRt de PHENIX. Los cristales con fragmentos deberían de ser isomorfbs con el nativo, por lo que la celda unitaria debía variar menos de 1 Á en sus dimensiones. Después, se llevó a cabo el análisis de denos mapas con el fin de localizar picos de densidad electrónica que sobresalieran en el mapa de diferencia isomorfo y que pudieran pertenecer a algún fragmento. Sólo se consideraron como positivos los hKs cuyos modelos de fragmentos se ajustarán al menos en un 75% de coeficiente de correlación a la densidad electrónica del mapa de diferencia isomorfo.

A partir de la estructura cristalográfica a 1.7 A de resolución de la protefna P en complejo con un compuesto de encorrtrándose

que dicho compuesto se une en una cavidad muy cerca de la zona de interacción con el sustrato de la holoenzima afectando su actividad, por lo que representó un excelente punto de partida para el desarrollo del nuevo uso del compuesto 4-DTS como inhibidor.

El análisis del mapa de densidad electrónica indtoó que el átomo de cloro del CMBX podría no estar presente en la estructura debido a su baja ocupación, valores B muy altos y densidad electrónica discontinua del aniso benceno al átomo putativo de doro.

Por otro lado, la presencia de azufre en el compuesto CMBX es dará y evidente por mapas de diferencia anómalos. Debido a elo, se decidió realzar la optimización con un compuesto 2-mercaptobenzoxazol (MBX). Los ensayos de unión en interferornetria de bíocapas mostraron que el MBX se une a la protefna P con muy baja afinidad, con un valor de Ko de alrededor 5 mM, de tal manera que se deckfó crecer la estructura del MBX añadiendo grupos funcionales derivados del nitrógeno en la posición 3 del ando

Los compuestos que resultaron unirse a la proteína P fueron el 4-DTS y el 5- DTS, ios cuales, en las estructuras químicas anteriores se encuentran marcados con círculos.

Se realizaron ensayos de unión del compuesto 4-DTS a la proteína P en solución por interferometría de biocapas (BLI). Esta técnica provee una caracterización cinética y termodinámica de interacciones moleculares de manera clara y cuantitativa a través de constantes de equilibrio de disociación (Ko) y velocidades de unión y despegado. Los compuestos mencionados anteriormente se probaron en intarferometría de biocapae a una concentración inicial de 200 mM, de acuerdo a lo recomendado por Wartchow at al., 2011, obteniendo unión para los compuestos 4-(2,3-Dlhldro-2-Thioxo-

En la tabla I se resume la evolución en loe fragmentos obtenida a partir de los ensayos de interferometrfa de biocapas:

salicflioo. El ácido sallcflico no mostró unión a la proteina P. lo cual es indicativo de la necesidad de tener el MBX fusionado para que exista un evento de pegado. Ξ compuesto 4-DTS tiene el mismo rango de afinidad que la ICn del aminoglicósido NeoR6 (0.1 mM), el mejor inhibidor no especifico reportado hasta ahora para la RNasa

P.

Una vez que se logró ta unión del compuesto 4-DTS con la proteina P se llevaron a cabo los ensayos para determinar la actividad inhibitoria de dicho compuesto 4-DTS hacia la RNasa P. La subunidad P RNA de Thermotoga marítima (TmR), de 338 nucleótidos (110 kDa), se prepara con transcripción in viro con el método reportado por Reiter (2010) usando protocolos estándar de T7 RNA poümerasa, de tal manera que al combinar dichas proteina P purificada y subunidad P RNA se obtiene una hotoenzirna que servirá para determinar la actividad inhibitoria del compuesto 4-DTS.

Para llevar a cabo la combinación y obtener la hotoenzima, se mezcla a una concentración de -300 nM la subunidad de P RNA con la proteina P en proporción de 1:1.1 en bufferTH 1x (Tris pH 7.433 mM, HEPES 66 mM) y acetato de amonio 400 mM. Se calienta la mezcla a 94°C por 2 minutos, se enfría a 0°C por 2 minutos y se agrega MgCk 100 mM. Se almacena en refrigeración para uso próximo o se congela a -20*C.

Los compuestos ensayados se probaron en cocteles de hasta ocho miembros para minimizar el número de ensayos, y de aquellos que resulten inhibitorios se obtiene el que produce el efecto por un proceso de deconvoludón.

Mediante una técnica de inhibición de actividad de la RNasa P descrita en el ejemplo 2, fue posible determinar que los compuestos 5-OTS y 4-DTS inhben a la RNasa P en el mismo orden en el que se observó la unión a la protelna P (mayor inhibición observada para el compuesto 4-DTS (ICeo=4.8 μΜ).

Para realizar la inhibición in vivo monitoreada por crecimiento bacteriano en una cepa con interruptor molecular para RNasa P, se utitizó la cepa de Escherichia ooH BW(AtPRORP1), cuyo crecimiento depende estrictamente de arabinosa debido a que el gen cromosoma! mpB que codifica para la ribozima endógena RNasa P, se encuentra bajo el control de un promotor de este monosacárido (Wescheid and Hartmam, 2008). Dicha cepa tiene insertado en el cromosoma un gen de resistencia a dorenfenicol. En la ausencia de arabinosa y presencia de glucosa, la expresión del gen mpB se apaga por completo y la vida de la cepa depende de algún otro gen con actividad de RNasa P. Por ello, se introdujo el plasmido pDG148(S/X)-PRORP1 con resistencia a ampidlina y que contiene el gen PRORP1 (Proteinaceous RNase P) de Arabidopsis thaliana que codifica para una proteína con actividad de Ribonueleasa P, sin relación alguna con la RNasa P bacteriana (Gobert et al, 2010). Los estudios se llevaron a cabo haciendo crecer las cepas en condiciones permisivas (10 mM arabinosB/25ug/ml doranfenicol/100 ug/ml ampidlina) y no permisivas (10 mM glucosa/ 25 ug/ml chloranfenlcol / 100 ug/ml ampidlina). La técnica de cultivo para los ensayos de difusión en disco se realizó de acuerdo a lo revisado en Driscoll, ef al., 2012. Loe ensayos de difusión en placa mostraron una inhibición diferencial, con un claro efecto del compuesto 4-DTS y un ligero efecto del 5-DTS sólo en las condiciones en las que la ribozima RNasa P es expresada en la figura 3 de los dibujos que se acompañan. Es notable que la inhibición por el 4-DTS (25 mM) se da en el rango de concentración aproximado para la kanamioina (10 mM).

La presente invención será mejor entendida a partir de los siguientes ejemplos, los cuales se presentan únicamente con fines ilustrativos más no limitativos, de tal manera que permitan la cabal comprensión de las modalidades de la presente invención, sin que ello implique que no existen otras modalidades no descritas aquí que puedan llevarse a la practica con base en la descripción detalada arriba realizada:

Eiemlpo1

Ensayos d» unión del 4-DTS a la aubunUad proteica bacteriana de te

Ribonucleas P

Con el fin de demostrar el potencial de unión del compuesto 4-DTS a una molécula esencial para la sobrevivencia de bacterias, se realizaron ensayos de unión a la proteina P de la RNasa P por interferometrta de biocapas.

Los experimentos por interferometría de biocapas se llevaron a cabo usando un sistema Octet Red 96 (ForteBio, PALL Ufe Sciences). El ligando, la proteina P de T. marítima (14 kDa, 100% puro basado en SDS-PAGE) fue inrrrovizado en biosensores de Ni-NTA usando una etiqueta de 6 histidinas como fusión a la proteina P. La concentración del ligando fue de 0.1 mg/mL en buffer PBS 1X, 5%DMSO pH 7.4. Se usaron placas de 96 pocilios de fondo negro. Los parámetros en los cuales el ensayo se llevó a cabo fueron con una agitación de 1000 rpm, una temperatura de 25° C, volumen de 200 pL y una duración aproximada de 25 min. Los pasos y sus respectivos tiempos fueron con un pre-chequeo 120 s, cargado del ligando 500 a, lavado 200 s, linea base 100 s, unión 300 s, disociación 300 s. El amortiguador de ensayo fue el PBS 1X. Los compuestos optimizados a partir del CMBX como tos derivados 5-DTS y 4-DTS se usaron a concentraciones de 200 μΜ en ensayos iniciales y finalmente a 25 y 50 μΜ en ensayos de optimización. Para colectar los datos de cinética de unión se usó el software Octet Data Acquisition 8.1. Los datos fueron ajustados a un modelo de interacción simple 1:1 usando la opción de análisis global de datos disponible dentro del software Data Anatysis 8.1

En la figura 1 de los dibujos que se acompañan se muestran los resutados del experimento de unión del compuesto 4-DTS a la protefna P. Unión dosis-dependiente

a la protefna P. Sensograma de la unión del compuesto 4-DTS a la protolna P ajustado a un modelo de unión 1:1. El eje y representa el desplazamiento en nanómetros en la longitud de onda que resulta de la unión o disociación del ligando a lo largo del tiempo en el eje x. En azul se representan las curvas experimentales y en rojo el ajuste al modelo.

En la Tabla II se muestra el ajuste de los datos cinéticos, constante de disociación y respuesta de cada concentración.

Eiemplo 2

Ensayo» oto Inhiboin de/ 4-DTS efe la hohmdnm Ribonuchna P bacteriana in vitro

Con el fin de demostrar el potencial de inhibición de la actividad por el compuesto

4-DTS a una molécula esencial para la sobrevivencia de bacterias, se realzaron ensayos de inhibición de la RNasa P a través de fluorescencia.

En fecha anterior a la presente invención, para el monitoreo de la catálisis de RNasa P, se marcaba radioactivamente el sustrato con "P para detectar específicamente esta secuencia con una mínima cantidad de material. La reacción se detiene con urea 8M y las secuencias riudeotkfcas se separan en geles de poliacrilamida de entre 6-18% y se revela la radoactividad de las sondas mencionadas (GoUringer, 2012).

Hoy en día no existen reportes de mediciones en tiempo real para la determinación de la actividad de la RNasa P (GoBnnger, 2012), lo cual impide la optimización y el escalamiento de dicho procedimiento en alto rendimiento. Por esta razón y dado el interés de la RNasa P como blanco farmacológico, uno de los objetivos de la presente invención es el planteamiento, diseño y optimización de un ensayo de actividad sensible y en alto rendimiento para RNasa P. El ensayo se realiza con un sustrato fluorescente, en placas de poiiestireno negro de 96 pozos de 0.4ml, fondo plano negro, de baja fluorescencia, sin tratamiento de superficie (Nunc Thermo Sctentrfto, Cal 265301). El ensayo de reacción para ia RNasa P hoioenzima reconstituida se lleva a cabo a 45° C en buffer de actividad ΤΉ 1x (Trie pH7.4 33 mM, HEPES 66 mM). Se optimizaron las cantidades de hoioenzima y sustrato para el ensayo de actividad, siendo 20.5 nM de hoioenzima (concentración del stock recomendada: 400 nM) y 210 nM de sustrato (concentración recomendada del stock: 4 μΜ) las concentraciones mínimas para detectar actividad de RNasa P en un volumen de 60 μΙ. Esta conceritración está en concordancia con Thakur (2005), quien recomienda que las concentraciones finales para las sondas FRET estén entre 50 y 500 nM para obtener buenas proporciones senal- ruido por espectrofluorornetrfa. Los fragmentos a probar se adicionaron en una coiKentración de prueba de entre 10-50 μΜ de cada uno, esto es, a aproximadamente 20,000-30,000x sobre la concentración de RNasa P para poder distinguir efectos en la actividad. La ejecución de los ensayos de actividad se realiza agregando el buffer de actividad y la RNasa P holoenzima, o la subunidad de RMA según el experimento a ejecutar, con el fragmento a probar. Se incuba el fragmento y holoenzima por 5 min a 37º C con agitación orbital moderada durante 2 segundos cada 2.5 minutos, y se mide la fluorescencia basal de cada mezcla de reacción. Se inicia la reacción agregando el sustrato minihóiice fluorescente - disenado y presentado en este trabajo - y tomando una lectura de fluorescencia inicial. El equipo utilizado para los ensayos es un espectrofluorórnetro para placas muttipozo Varioskan Flash (Thermo SdentJfic). Los parámetros a ajusfar en el equipo son: Excitación (nM): 485. Detección de emisión (nM): 535; lectura superior de la fluorescencia de cada pozo, detectada en modo Cinético, sin agitación intermedia, con lecturas cada 3-5 segundos. De las curvas cinéticas obtenidas de Unidades Relativas de Ruorescencia (RFU, por sus siglas en inglés) vs. tiempo, se calculan las pendientes promedio por un método de regresión lineal con el software del equipo. Posteriormente, en una hoja de cálculo electrónica se realza la trensformadón manual y el análisis de las pendientes a unidades nanomoiares de sustrato por minuto con una calibración de RFU vs. corieentración de sustrato hkJrolizado para obtener una medida de actividad enzimática relativa. Se comparan los valores de velocidad para detectar cambios en la actividad contra controles sin inhibidores analizados en el mismo lote de ensayos.

En la figura 2 de los dibujos que se acompañan se muestra un ejemplo de una curva de inhibición de actividad con concentraciones crecientes de 4-DTS. B compuesto 4-DTS inhibe la reacción de la RNasa P en el rango mtaromotar bajo. Curvas de actividad de RNasa P con concentraciones crecientes de 4-DTS (concentración en μΜ indicada para cada curva. Cont corresponde a la curva control en ausencia tanto de RNasa P como de compuesto). Las rartcentraciones utilizadas del resto de los reactivos fueron: 100 nM hotoenzima, 400 nM minihélice, 200 mM acetato de amonio, 100 mM MgCh, en amortiguador TH 1x. La cantidad de DMSO presente en el ensayo fue del 20%. Centro. Gráfica de las pendientes de las curvas de la figura de ta izquierda, a partir de la cual se estimó el valor de la ICn(4.8 μΜ).

En la Tabla III se muestran los valores estimados a partir de la gráfica de inhibición (con triplicado técnico) del centro.

Eiemplo 3

Ensayo* da Inhibición da crscJmfento bacteriano por al 4-DTS da manara aapacmca a travaa da la Kbonuciwne P

Con el fin de demostrar el potencial de inhibición de crecimiento bacteriano debido al efecto del compuesto 4-DTS a una molécula esencial para la sobrevivencia de bacterias, se verificó la inhibición h vivo en una cepa de E. co// ^' que cuenta con un interruptor molecular que permite monitorear el crecimiento en condiciones en donde ei único cambio inicial en el metabolismo de la bacteria es promovido por la presencia ya sea de la RNasa P endógena (RNA P) o por una proteína con actividad de RNasa P (PRORP).

En la figura 3 de tos dibujos que se acompañan se muestra un ejemplo de inhibición de crecimiento por la presencia del compuesto 4-DTS. El compuesto 4-DTS inhibe el crecimiento de la bacteria gram negativa Escharichia coü a través de la unión a la ribozima RNasa P. Ensayos de difusión de disco en donde las placas se dividieron en 6 cuadrantes con papel filtro embebido en 10 μΙ de los siguientes compuestos: 4-DTS (25 mM), 5-DTS (5K2,3^hidro-2-Tk>XD-3-Ber^ salicílico, 100 mM), MBX (2-mercaptobezoxazol, 50 mM), ácido saücflico (10 mM), kanamicina (control positivo, 10 mM), DMSO (control negativo). El MBX y el ácido salteflico se probaron por ser precursores de tos inhibidores desarrollados. En la parte superior de la dicha figura 4 se muestra el crecimiento en presencia de 10 mM de arabtnosa (expresión de RNA P); mientras que en la parte inferior se muestra el crecimiento en presencia de 10 mM glucosa (expresión de PRORP, una proteína con actividad de RNasa P).

En un aspecto adicional de la presente invención, se provee el uso del compuesto 4-DTS para preparar un medicamento antibiótico para el ti atamiento de enfermedades provocadas por bacterias gramnegatívas tales como enfermedades respiratorias, enfermedades urinarias y enfermedades gastrointestinales, y más preferiblemente para tratar enfermedades infecciosas provocadas por Eacharichia coii. Aun cuando en la anterior descripción se ha hecho referencia a algunas modalidades del uso del compuesto 4-DTS como inhibidor de la RNasa P bacteriana de la presente invención, es posible que, basándose en la descripción arriba realizada, así como en los dibujos anexos, se puedan desarrollar otras modaldades que no fueron aquf descritas detalladamente. Por lo tanto, debe hacerse hincapié en que son posibles numerosas modificaciones a dichas ciertas modalidades, pero sin apartarse del verdadero alcance de la presente invención, tales como la manera en que es mon ¡toreada la inhibición de la actividad o de crecimiento bacteriano, las concentraciones utilizadas de compuesto 4-DTS, entre muchas otras nraofficaciones. Por lo tanto, la presente invención no debe ser restringida excepto por lo establecido en el estado de la técnica, asi como por las reivindicaciones anexas.