USO DE COMPOSTO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA PARA O TRATAMENTO DE DISTÚRBIOS IMUNES OU METABÓLICOS, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA PARA O TRATAMENTO DE DOENÇAS CAUSADAS POR OU ASSOCIADAS A VÍRUS

Campo da Invenção

[0001] A presente invenção situa-se nos campos da Farmácia, Medicina, Biotecnologia e Imunologia. Mais especificamente, a presente invenção descreve o uso de um composto ou de uma combinação de compostos para a preparação de uma composição farmacêutica para reduzir os níveis de TNFa, IL-6, e/ou IL-1 [3. A invenção é útil para o tratamento de distúrbios imunes ou metabólicos associados a elevados níveis de TNFa, IL-6, IL-113, ou a elevados níveis de ACE2 e as respectivas consequências cardíacas, renais e de pressão arterial, incluindo também os problemas associados a terapias envolvendo anticorpos, como os monoclonais, ou terapias celulares, como a CAR-T, ou de condições como hipertensão, miocardite, pericardite, coagulopatias, eventos trombóticos, cardiovasculares ou renais, ou diabetes tipo 2, e doenças causadas por vírus como o da influenza ou coronavirus, incluindo a COVID-19. A administração in vivo da composição da invenção proporcionou resultados surpreendentes na modulação dos níveis de citocinas em mamíferos, citocinas estas que estão relacionadas a elevados níveis de ACE2, se mostraram correlacionadas à gravidade da doença associada ao SarsCov2 (COVID-19) e vêm sendo apontadas como marcadores indicativos do prognóstico de sua gravidade, e também são relacionadas à miocardite, pericardite, coagulopatias, eventos trombóticos ou cardiovasculares e distúrbios imunes ou metabólicos. É também revelada uma composição farmacêutica e um método terapêutico para o tratamento destas condições.

Antecedentes da Invenção [0002] O composto peptídico cujo uso é objeto da invenção é surpreendentemente estável em extremos de temperatura, não acarreta o problema da formação de fibrilas e proporciona facilitada manipulação na preparação de produtos de interesse farmacêutico, incluindo ligantes de interesse diagnóstico e composições farmacêuticas.

[0003] O composto peptídico usado na invenção é objeto do pedido de patente co-pendente BR 11 2019 002655 0 (Fase Nacional Brasileira do PCTBR2018 050156), incorporado aqui por referência e que constitui o prior art mais próximo. Referido composto é um peptídeo sintético que vem sendo estudado pelos presentes inventores no Brasil desde 2017. O estudo deriva de outro estudo relacionado à hemopressina (PVNFKFLSH), um nonapeptídeo descoberto por equipe brasileira, e que recebeu esse nome por ser derivado da hemoglobina e por ser hipotensor (“Novel Natural Peptide Substrates for Endopeptidase 24. 15 Neurolysin, and Angiotensin-converting Enzyme"; Vanessa Rioli, Fabio C. Gozzo, Andrea S. Heimann, Alessandra Linardi, José E. Krieger, Claudio S. Shida, Paulo C. Almeida, Stephen Hyslop, Marcos N. Eberlin, Emer S. Ferro; 7 de Março de 2003).

[0004] O composto peptídico cujo uso é objeto da invenção se mostrou, em pedidos de patente anteriores dos mesmos inventores (incluindo o WO 2018209415), como melhoria útil em relação à hemopressina, por ser surpreendentemente mais estável em extremos de temperatura e por não acarretar o problema da formação de fibrilas. Além disso, referido composto também se mostrou como um melhorado ligante de receptores canabinóides CB1 e CB2 quando comparado à hemopressina, com resultados comprovados in vivo, in vitro e in silico (de Araujo CB, Heimann AS, Remer RA, Russo LC, Colquhoun A, Forti FL, et al. Intracellular Peptides in Cell Biology and Pharmacology. Biomolecules 2019;9(4); WO 2018209415). Referido artigo não menciona nada sobre TNFa e não faz nenhuma menção ou sugestão do uso do referido composto para o tratamento de condições associadas a níveis elevados de citocinas. A presente invenção surpreendentemente proporciona esse novo e importante uso.

[0005] O composto peptídico cujo uso é objeto da presente invenção também mostrou resultados surpreendentemente contrastantes em relação à hemopressina: estudos científicos sugerem que a hemopressina não atravessa a barreira hematoencefálica, mas acarreta efeito ansiogênico (Pharmacol Biochem Behav, 2015 Feb;129:7-13 “Anxiogenic-like effects induced by hemopressin in rats”), provavelmente via fragmentos da mesma que atravessam a barreira hematoencefálica. Outro estudo (Pharmacol Rep. 2017 Dec;69(6):1247-1253, “Emotional disorders induced by Hemopressin and RVD- hemopressin(a) administration in rats”) demonstrou que a administração de hemopressina induziu comportamento ansiogênico e depressivo, redução dos níveis basais de monoamina no cortex prefrontal e aumentada expressão de genes envolvidos em seu catabolismo, em contraste à versão estendida conhecida como RVD-hemopressina, cuja administração induziu comportamento ansiolítico e antidepressivo. Os dados mostrados no presente pedido de patente mostram que a administração do composto da invenção não induz resposta indesejável do Sistema Nervoso Central, ou seja, não acarreta os efeitos centrais conhecidos em seus congêneres mais próximos. Esta importante vantagem técnica viabiliza, na prática, seu uso em uma gama mais ampla de condições.

[0006] Elevados níveis de citocinas pro-inflamatórias são associados a variadas condições ou disfunções em mamíferos, notadamente a síndrome de liberação de citocinas (cytokine release syndrome) ou tempestade de citocinas (cytokine storm).

[0007] Neste contexto, é bem conhecido o problema causado por algumas imunoterapias com anticorpos, como os monoclonais, e as terapias celulares, como CAR-T.

[0008] O ocorrido em 2006, durante os testes clínicos do anticorpo TGN-1412 (theralizumab) - que causou severas reações inflamatórias - provocou mudanças na abordagem de desenvolvimento e testagem de terapias com anticorpos, que passaram a incluir testes específicos de liberação de citocinas pró-inflamatórias que podem desencadear a chamada síndrome de liberação de citocinas.

[0009] Anticorpos e anticorpos monoclonais são amplamente usados em variados tratamentos. Apesar de efetivos, podem causar efeitos adversos relacionados à liberação de citocinas ou à síndrome de liberação de citocinas. A presente invenção proporciona uma alternativa para reduzir ou eliminar estes efeitos indesejáveis.

[0010] Uma abordagem comum para avaliar o risco da liberação de citocinas é incubar células com um indutor pro-inflamatório como o anticorpo anti-CD3. A presente invenção usa este indutor como modelo experimental e demonstra que a administração do composto da invenção reduz os níveis de citocinas inflamatórias mesmo quando o animal é estimulado com anti-CD3.

[0011] O artigo intitulado “CAR-T cell-induced cytokine release syndrome is mediated by macrophages and ablated by IL-1 blockade” (Nat. Med 2018 Jun 24(6):731 -738) mostra que a diminuição dos níveis de IL-1 minimiza o distúrbio imune associado à referida terapia.

[0012] Semelhante abordagem é revelada no artigo intitulado “Therapeutic potential of TNFoc and IL-1 B blockade for CRS/ICANS in CAR-T therapy via ameliorating endothelial activation” (Front. Immunol, 2021 May 19 (12)623610). Referido artigo mostra que que a diminuição dos níveis de TNFoc e IL-1 B minimiza o distúrbio imune associado à referida terapia. A presente invenção proporciona a diminuição dos níveis de TNFoc e IL-1 B.

[0013] Respostas imunes pulmonares aberrantes são associadas a várias infecções respiratórias, incluindo a Influenza, sendo frequente nestes casos a elevação dos níveis de citocinas associadas à tempestade de citocinas. Esta condição é de difícil tratamento, e o tratamento simples com corticosteróides em geral não é suficiente para tratar a patologia associada à Influenza e/ou a infecções por coronavirus. É bem conhecido nos casos severos ou letais de Influenza que os níveis de TNFa e IL-6 são bastante aumentados, e que reduzir os níveis destas citocinas é importante na redução da gravidade da doença (Seo, SH; Hoffmann, E.; Webster, RG. Nature Medicine, Vol 8 No. 9, 2002 Lethal H5N1 influenza viruses escape host anti-viral cytokine responses). A presente invenção proporciona a diminuição dos níveis destas e outras citocinas.

[0014] O artigo publicado na revista Biomedicines 2021 , 9, 1576, disponível em https://doi.org/10.3390/biomedicines9111576A é intitulado “Rapid and Simple Multiparameter Assay to Quantify Spike-Specific CD4 and CD8 T Cells after SARS-CoV-2 Vaccination: A Preliminary Report”. Referido artigo, foi publicado em 29Out2021 e revela que o TNF-a é a principal citocina produzida por células T de memória após estimulação in vitro com antígenos específicos da proteína Spike do coronavirus, sendo também um importante marcador de indução de células T mediante a vacinação. A presente invenção proporciona a diminuição dos níveis desta e outras citocinas.

[0015] O artigo de Hariharan A, Hakeem AR, Radhakrishnan S, Reddy MS, Rela M. “The Role and Therapeutic Potential of NF-kappa-B Pathway in Severe COVID-19 Patients”, revista Inflammopharmacology Feb;29(1 ) :91 -100, publicado em Fev2021 revela que a COVID-19 envolve superativação da via do NF-KB. Semelhante relato é feito por Kircheis R, Haasbach E, Lueftenegger D, Heyken WT, Ocker M, Planz O. NF-KB Pathway as a Potential Target for Treatment of Critical Stage COVID-19 Patients, Front Immunol. Publicado em Dez2020.

[0016] Neste contexto, a literatura também demonstrou que a proteína Spike do SarsCov-2 potencialmente induz a expressão da via do NF-KB e das citocinas inflamatórias, incluindo TNFa, IL-6, IL-1 B em macrófagos humanos e de camundongos (Khan S, Shafiei MS, Longoria C, Schoggins J, Savani RC, Zaki H. SARS-CoV-2 spike protein induces inflammation via TLR2-dependent activation of the NF-KB pathway, bioRxiv publicado em Mar2021 ).

[0017] A literatura mostra que não apenas o SarsCov-2 e a COVID-19 induz(em) a expressão de citocinas inflamatórias como TNFa, IL-6, IL-1 B. Também a proteína Spike sozinha tem capacidade de induzir significativamente a expressão destas citocinas. A presente invenção proporciona a diminuição dos níveis de TNFoc, IL-6 e IL-1 B.

[0018] Conforme demonstram os resultados de pesquisa clínica com a vacina de proteína recombinante Spike, os níveis de TNFoc foram muito aumentados após imunização. A pesquisa foi publicada no New England Journal of Medicine em Set2020 (A/ Engl J Med 2020;383:2320-32), o artigo sendo intitulado “Phase 1-2 Trial of a SARS-CoV-2 Recombinant Spike Protein Nanoparticle Vaccine”.

[0019] O artigo intitulado “The SARS-CoV-2 Spike protein disrupts human cardiac pericytes function through CD147-receptor-mediated signalling: a potential non-infective mechanism of COVID-19 microvascular disease” é urn preprint da bioRxiv (doi: https://doi.org/10.1 101/2020.12.21.423721 ) disponibilizado em 20Jul2021 . Referido artigo revela em detalhes a relação dos pericitos (células perivasculares essenciais na manutenção das funções metabólicas, mecânicas e de sinalização nos microvasos) com o SarsCov-2 e com a proteína Spike do referido vírus. O artigo demonstra que o vírus não infecta pericitos in vitro, mas que a proteína Spike sozinha (recombinante) acarreta profundas alterações nos pericitos, incluindo aumentada migração, redução da habilidade de suportar a formação de matrizes/redes no endotélio, aumentada secreção de citocinas inflamatórias típicas da tempestade de citocinas (cytokine storm) e produção de fatores pro-apoptóticos responsáveis pela morte de células endoteliais. O referido artigo mostra que os níveis de TNFoc e IL-6 aumentam substancialmente com a presença da proteína Spike sozinha.

[0020] No artigo publicado pelos presentes inventores (“NFKF is a synthetic fragment derived from rat hemopressin that protects from neurodegeneration” Neuroscience Letters 721 (2020) 134765), foi demonstrado que o composto peptídico usado na presente invenção é um bom candidato a neuroprotetor de uso oral, tendo mostrado excelentes resultados de neuroproteção in vivo. Além de ser publicação não-prejudicial nos termos da lei, referido artigo não revela qualquer informação sobre a modulação de TNFoc e não contempla qualquer menção ou sugestão ao uso no tratamento de doenças a associadas a vírus ou coronavirus, à modulação da ACE2, dentre outros.

[0021] O TNF-a e a IL-6 têm se mostrado nos últimos meses como importantes marcadores do grau de severidade da COVID-19. Neste contexto, em outubro de 2020 foi publicado o artigo intitulado “An inflammatory citokine signature predicts COVID-19 severity and survival” (Nature Medicine, vol 26 pag. 1636- 1643, Oct2020). Referido artigo mostra que os níveis séricos de IL-6 e TNF-a são preditores significativos da severidade da doença e do perfil de sobrevivência: quanto mais elevados os níveis destas citocinas, pior o prognóstico e maior a severidade da doença. Consequentemente, encontrar alternativas terapêuticas que atuem vantajosamente para diminuir o nível de uma e/ou outra, ou ainda melhor, de ambas de tais citocinas é muito útil no contexto do combate à severidade da COVID-19, tanto para o potencial tratamento de doentes em estado grave, quanto para o potencial tratamento precoce ou profilaxia. A presente invenção proporciona uma alternativa terapêutica vantajosa, que ademais pode ser administrada oralmente, entre outras vias.

[0022] Estudos de mais de uma década atrás (J Interferon Cytokine Res. 2011 Oct; 31 (10): 705-710. Critical Cytokine Pathways to Cardiac Inflammation) demonstraram que eventos de miocardite são claramente associados à elevação dos níveis de IL-113 e TNF-a, indicando que a elevação do nível destas citocinas é necessária e suficiente para induzir a ocorrência de doenças autoimunes especificamente no coração. Além disso, o referido artigo mostrou que a severidade da miocardite é também relacionada ao perfil destas citocinas.

[0023] Coerentemente com o achado referido acima, mais recentemente, no contexto da COVID-19, foi relatado que o estado grave de COVID-19 apresentando quadro de cytokine storm foi tratado com sucesso com Anakinra (um antagonista recombinante do receptor de IL-1 ) com dexametasona (CJC Open, Volume 3, Issue 2, February 2021 , Pages 210-213; Rapid Response to Cytokine Storm Inhibition Using Anakinra in a Patient With COVID-19 Myocarditis). A paciente, de 62 anos de idade e com histórico de Esclerose Múltipla primária progressiva, foi diagnosticada com COVID-19 e apresentava alteração aguda de consciência, hipóxia e choque. O referido tratamento teve como resultado a rápida melhora clínica e redução dos níveis séricos dos marcadores inflamatórios (TNFoc, IL-6, IL-1 ), bem como marcante recuperação do coração conforme avaliação por ressonância magnética nuclear. A paciente teve alta hospitalar após o tratamento.

[0024] No artigo intitulado “The Relationship between Inflammatory Cytokines and Coagulopathy in Patients with COVID-19”, publicado em 09Mai2021 no J. Clin. Med. 2021 , 10, 2020. https://doi.org/ 10.3390/jcm10092020, é demonstrada a correlação entre o elevado perfil de citocinas TNFoc, IL-6 com um aumentado risco de desenvolvimento de coagulopatias, eventos trombóticos e mortes durante o curso da COVID-19. Sugere também que a medição precoce e rápida administração de antiinflamatórios com anticoagulantes pode diminuir a incidência de eventos trombóticos e suas consequências fatais. Os resultados apresentados no presente relatório mostram que a presente invenção proporciona uma alternativa terapêutica útil para tratamento preventivo, profilático, precoce ou curativo de coagulopatias, eventos trombóticos e/ou cardiovasculares.

[0025] O artigo publicado na revista Diabetes, Vol 64, issue 4, 01Apr2015: 1273- 1283, “Angiotensin II Induces lnterleukin-1 [3-Mediated Islet Inflammation and [3- Cell Dysfunction Independently of Vasoconstrictive Effects”, revela que a ativação patológica do sistema renina-angiotensina é associada à síndrome metabólica, e que a inibição do sistema renina-angiotensina pode retardar o surgimento de diabetes tipo 2. O referido artigo indica que a modulação do sistema renina-angiotensina, notadamente através da inibição da citocina IL-113, é uma potencial abordagem terapêutica para o tratamento de pacientes com diabetes tipo 2. A presente invenção, ao proporcionar a substantial redução dos níveis de IL-1 [3, é uma alternativa terapêutica para o tratamento preventivo, profilático ou curativo da diabetes tipo 2. [0026] As citocinas TNFa, IL-6 e IL-1 [3, além de todas as implicações indicadas acima, têm também um papel importante na regulação do complexo sistema renina-angiotensina e nas enzimas conversoras da angiotensina ACE e ACE2, o que tem importantes impactos em diversas condições, como a hipertensão, eventos cardiovasculares e renais diversos, bem como na COVID-19, uma vez que ACE2 tem reconhecido papel no processo de infecção pelo respectivo vírus. [0027] De um lado, é sabido que o TNFa sozinho (Hypertension, 2008 May 51 (5): 1345-51 , Involvement of tumor necrosis factor-alpha in angiotensin Il- mediated effects on salt appetite, hypertension, and cardiac hyperthrophy), bem como a IL-6 sozinha (The Journal of Rheumatology doi: 10.3899/jrheum.200547 “Angiotensin-converting enzyme 2, a SarsCov-2 receptor, is upregulated by interlekin-6 via STAT3 signalling in rheumatoid synovium”), são capazes de aumentar a expressão de ACE2. Logo, disponibilizar uma abordagem terapêutica que concomitantemente diminua os níveis de TNFa e IL-6 é altamente desejável para reduzir a expressão de ACE2. A redução da expressão de ACE2 tem variadas aplicações terapêuticas, incluindo o tratamento da hipertensão, de eventos cardiovasculares ou renais, bem como para potencialmente limitar a progressão da infecção pelo SarsCov-2.

[0028] Por outro lado, a ACE2 aumenta a expressão de IL-6 e IL1 -B, provocando um feedback positivo (aumento da ACE2 devido ao IL-6) que pode ser um dos responsáveis pela tempestade de citocinas ou eventos assemelhados e que tem relação com a gravidade da doença COVID-19. Consequentemente, a presente invenção proporciona uma alternativa terapêutica que pode contribuir para o combate contra a COVID-19 por mais de um mecanismo diferente: contribuir para minimizar ou evitar a replicação virai mediante a redução da expressão de ACE2; e contribuir para minimizar o quadro grave da doença associado à tempestade de citocinas.

[0029] Além disso, IL1 -B e TNFa aumentam de forma aditiva (ou seja, inibir só uma pode não ser suficiente em abordagens terapêuticas) a expressão do receptor de angiotensina II tipo AT1 em fibroblastos cardíacos (Journal of Molecular and Cellular Cardiology 2005 Mar; 38(3):505-1 ; “IL-1 beta and TNF- alpha upregulate angiotensin II type 1 (AT(1 )) receptors on cardiac fibroblasts and are associated with increased AT(1 ) density in the post-MI heart”).

[0030] Logo, disponibilizar uma abordagem terapêutica que concomitantemente diminua os níveis de IL1 -B e TNFoc é altamente desejável para reduzir a expressão do receptor de angiotensina II tipo AT1 em fibroblastos cardíacos.

[0031] Por fim, sabe-se que ACE regula a expressão de ACE2, e que a hemopressina, um potente hipotensor, provavelmente é um inibidor da ACE, dada a constante de inibição Ki (1866 pM) observada pela presente co-inventora em artigo publicado em 2003 (J Biol Chemistry Vol 278 No 10, 2003 pp 8547- 8555; “Novel natural peptide substrates for endopeptidase 24.15, neurolysin, and angiotensin-converting enzyme*”).

[0032] A partir do que ensina a mais recente literatura, disponibilizar uma composição farmacêutica que seja útil na redução dos níveis de TNFoc, IL-6 e/ou IL-1 p é altamente desejável no contexto do combate aos efeitos de diversas condições associadas a elevados níveis de citocinas inflamatórias. Exemplos incluem: tratamentos com anticorpos; terapias celulares como CAR-T; infecções virais com influenza ou coronavirus, como a COVID-19; miocardite; pericardite; coagulopatias; hipertensão, eventos trombóticos, cardiovasculares ou renais; distúrbios associados à proteína Spike, a vírus e/ou a vetores vacinais e diabetes tipo 2. A presente invenção faz exatamente isso. Os resultados apresentados no presente pedido de patente também dão suporte à afirmação de que a administração da composição da invenção pode interferir na expressão de ACE2, modular o sistema renina-angiotensina e/ou modular o equilíbrio ACE/ACE2.

[0033] Do que se depreende da literatura pesquisada, não foram encontrados documentos antecipando ou sugerindo os ensinamentos da presente invenção, muito menos seus surpreendentes efeitos técnicos, de forma que a solução aqui proposta, aos olhos dos inventores, possui novidade e atividade inventiva frente ao estado da técnica. Sumário da Invenção

[0034] A presente invenção proporciona uma nova alternativa terapêutica para reduzir substancialmente os níveis de: fator de necrose tumoral alfa (TNFa), interleucina 6 (IL-6) e/ou interleucina 1 beta (IL-113) em mamíferos. Portanto, a presente invenção proporciona uma nova alternativa terapêutica para o tratamento de distúrbios imunes ou metabólicos associados a elevados níveis de uma ou mais destas citocinas.

[0035] A presente invenção proporciona também uma nova alternativa terapêutica para reduzir a expressão de ACE2 e/ou modular o equilíbrio ACE/ACE2 sendo, portanto, útil no tratamento de hipertensão, de eventos cardiovasculares ou renais e potencialmente para reduzir o processo de infecção virai pelo SarsCov-2.

[0036] A presente invenção proporciona também uma nova alternativa terapêutica para reduzir ou eliminar os problemas associados a terapias envolvendo anticorpos, como os monoclonais, ou terapias celulares, como a CAR-T, ou de condições associadas às mesmas.

[0037] A presente invenção proporciona também uma nova alternativa terapêutica para o tratamento de infecções ou doenças causadas por ou associadas a vírus, como o da influenza, coronavirus, como o SarsCov-2, e a COVID-19, ou de condições associadas a estes vírus ou partes dos mesmos.

[0038] É um objeto da invenção o uso de um composto peptídico para preparar um medicamento para reduzir substancialmente os níveis de TNFa, IL-6 e/ou IL- 1 [3 em mamíferos, como nova alternativa terapêutica para o tratamento de distúrbios imunes ou metabólicos associados a elevados níveis de uma ou mais destas citocinas. Referido composto peptídico é selecionado dentre NFKF, NFKL, e/ou formas modificadas, cíclicas dos mesmos, versões amidadas, alquiladas, alcoxiladas, halogenadas, hidroxiladas, PEGiladas, modificadas com outros grupos funcionais, bem como com um aminoácido não natural como as formas d-aminoácido, seus sais; e/ou combinações dos mesmos. [0039] É um outro objeto da invenção o uso do referido composto peptídico para preparar um medicamento preventivo, curativo ou profilático de infecções ou doenças causadas por ou associadas a vírus como a influenza, coronavirus, como o SarsCov-2, e a COVID-19, ou de condições associadas a estes vírus ou partes dos mesmos.

[0040] É um outro objeto da invenção uma composição farmacêutica para o tratamento preventivo, curativo ou profilático de infecções ou doenças causadas por ou associadas a vírus, como a influenza, coronavirus, como o SarsCov-2, e a COVID-19 ou de condições associadas a estes vírus ou partes dos mesmos.

[0041] É um outro objeto da invenção uma composição farmacêutica para o tratamento preventivo, curativo ou profilático de distúrbios imunes ou distúrbios metabólicos associados a elevados níveis de TNFa, IL-6 e/ou IL-1 |3 em mamíferos.

[0042] É um outro objeto da invenção proporcionar uma composição farmacêutica para o tratamento preventivo, curativo ou profilático de hipertensão, miocardite e/ou pericardite.

[0043] É um outro objeto da invenção proporcionar uma composição farmacêutica para o tratamento preventivo, curativo ou profilático de coagulopatias, eventos trombóticos, cardiovasculares ou renais, e diabetes tipo 2.

[0044] É um outro objeto da invenção proporcionar uma composição farmacêutica alternativa aos anticorpos monoclonais em testes e/ou usados para reduzir os níveis de TNFa, IL-6 e/ou IL-113 no tratamento da COVID-19 ou de efeitos colaterais associados ao vírus ou à proteína Spike.

[0045] A composição farmacêutica da invenção compreende o referido composto peptídico e um veículo farmaceuticamente aceitável, podendo se apresentar na forma de tablete, comprimido, gel, líquido oral ou xarope, cápsula, supositório, solução injetável ou formas inaláveis ou em adesivo, podendo opcionalmente compreender outros princípios ativos. [0046] É um outro objeto da invenção prover um método terapêutico para o tratamento das condições indicadas neste relatório.

[0047] Estes e outros objetos do presente pedido de patente serão imediatamente valorizados pelos versados na arte e pelas empresas com interesses no segmento, e serão descritos em detalhes suficientes para sua reprodução na descrição a seguir.

Breve Descrição das Figuras

[0048] A descrição detalhada a seguir e as figuras em anexo ilustram as principais características e concretizações da presente invenção, apresentadas detalhadamente para dar melhor suporte ao técnico no assunto e para que o mesmo possa entender e reproduzir o conceito inventivo da invenção em qualquer concretização. Tais detalhes ou figuras não devem ser entendidos de forma limitativa e servem somente para ilustrar algumas das concretizações da presente invenção.

[0049] A figura 1 mostra os resultados de testes para a avaliação dos níveis de TNFa e sua modulação em modelo experimental estabelecido, no qual animais (camundongos) C57BL6 fêmeas, de 8 a 10 de semanas de idade, foram submetidos a um protocolo de indução de Encefalomielite Autoimune Experimental (EAE). No eixo y são mostradas as concentrações de TNFa em unidades arbitrárias, em diferentes condições-teste conforme indicado, nas quais 10pL de plasma foram usados para quantificação por ELISA de acordo com as especificações do fabricante (R&D Systems). Os resultados são expressos como a média ± desvio padrão. As análises estatísticas foram feitas usando o teste One-way ANOVA, n = 4. # p<0, 1 vs MOG.

[0050] A figura 2 mostra os resultados de testes para a avaliação do nível de IL- 6 e a modulação do mesmo em modelo experimental estabelecido, no qual com animais (camundongos) C57BL6 fêmeas, de 8 a 10 de semanas de idade, os quais foram submetidos a um protocolo de indução de Encefalomielite Autoimune Experimental (EAE). Oito dias após a indução de EAE, os animais foram anestesiados com ketamina (90mg/kg) e xylazina (10mg/kg). Após dissecção do baço e dos linfonodos inguinais, foi feita a extração de leucócitos. As células foram estimuladas com Anti-CD3 (1 pg/mL) e MOG (100pg/mL) com ou sem o referido composto peptídico na concretização NFKF (100pg/mL) por 72 horas. Em seguida, 50pL de meio foram utilizados para quantificação de citocina IL-6 por ELISA. Em A é mostrada a IL-6 mediante quantificação por ELISA nas células leucocitárias de baço. Em B é IL-6 mediante quantificação por ELISA nas células leucocitárias de linfonodos inguinais. Os resultados são expressos como a média ± desvio padrão. As análises estatísticas foram feitas usando o teste One-way ANOVA, n = 4. * p<0, 1 vs PBS; # p<0, 1 vs CD3/MOG. [0051] A figura 3 mostra os resultados de testes para a avaliação do nível de IL- 1 B e a modulação do mesmo em modelo experimental estabelecido, no qual com animais (camundongos) C57BL6 fêmeas, de 8 a 10 de semanas de idade, os quais foram submetidos a um protocolo de indução de Encefalomielite Autoimune Experimental (EAE). Oito dias após a indução de EAE, os animais foram anestesiados com ketamina (90mg/kg) e xylazina (10mg/kg). Após dissecção do baço e dos linfonodos inguinais, foi feita a extração de leucócitos. As células foram estimuladas com Anti-CD3 (1 pg/mL) e MOG (100pg/mL) com ou sem o referido composto peptídico na concretização NFKF (100pg/mL) por 72 horas. Em seguida, 50pL de meio foram utilizados para quantificação de citocina IL-1 B por ELISA. Em A é mostrada a IL-1 B mediante quantificação por ELISA nas células leucocitárias de baço. Em B é IL-1 B mediante quantificação por ELISA nas células leucocitárias de linfonodos inguinais. Os resultados são expressos como a média ± desvio padrão. As análises estatísticas foram feitas usando o teste One-way ANOVA, n = 4. *** p<0,001 vs PBS; ### p<0,001 vs CD3/MOG.

[0052] A figura 4 mostra os resultados do teste do labirinto em cruz elevado (LCE), sendo usada a solução salina (Veh) como controle negativo, o composto Win 55212-2 (WIN), um conhecido agonista do receptor canabinóide 1 , como controle positivo e NFKF nas concentrações indicadas, todos administrados via oral (por gavagem) em camundongos C57B6, em um total de 7 animais. Em A) é mostrada a variação de temperatura em ^S C (delta ^S C); em B) é mostrado o tempo de catalepsia em segundos após administração; em C) é mostrada a distância em metros de caminhada no teste de caminhada em campo aberto; em

D) é mostrado o % de MPE (maximal possible effect) no teste de hot plate; em

E) é mostrado o % de entradas nos braços abertos no teste LCE (labirinto em cruz elevado); em F) é mostrado o % do tempo de permanência nos braços aberto no teste LCE. Os resultados são expressos como a média ± desvio padrão. As análises estatísticas foram feitas usando o teste One-way ANOVA, n=7. * P<0,05.

Descrição Detalhada da Invenção

[0053] A invenção proporciona um novo uso do composto peptídico selecionado dentre NFKF, NFKL, e/ou formas modificadas, cíclicas dos mesmos, versões amidadas, alquiladas, alcoxiladas, halogenadas, hidroxiladas, PEGiladas, modificadas com outros grupos funcionais, bem como com um aminoácido não natural como as formas d-aminoácido, seus sais; e/ou combinações dos mesmos.

[0054] Na presente invenção, o referido composto é usado para a preparação de um medicamento útil para reduzir os níveis de citocinas como o fator de necrose tumoral alfa (TNFa), a interleucina 6 (I L-6) e/ou a interleucina 1 beta (IL- 1 P) em mamíferos.

[0055] Na presente invenção, o referido composto é útil para a preparação de um medicamento preventivo, curativo ou profilático de distúrbios imunes ou distúrbios metabólicos associados a elevados níveis de TNFa, IL-6 e/ou IL-1 p em mamíferos. Exemplos incluem os problemas associados a terapias envolvendo anticorpos, como os monoclonais, ou terapias celulares, como a CAR-T, ou de condições associadas à elevação de tais citocinas, como miocardite, pericardite, coagulopatias, eventos trombóticos e/ou cardiovasculares, e diabetes tipo 2. [0056] Na presente invenção, o referido composto é útil para a preparação de um medicamento preventivo, curativo ou profilático de infecções ou doenças causadas por ou associadas a vírus, como a influenza, coronavirus, como o SarsCov2, e a COVID-19.

[0057] Na presente invenção, o referido composto é útil para a preparação de um medicamento para reduzir a expressão de ACE2 e/ou modular o equilíbrio ACE/ACE2 sendo, portanto, útil no tratamento de hipertensão, de eventos cardiovasculares ou renais e potencialmente para reduzir o processo de infecção virai pelo SarsCov-2.

[0058] O composto usado na invenção é sintético. Referido composto peptídico tem estabilidade surpreendentemente elevada em extremos de temperatura, além de facilidade de manipulação, sendo particularmente útil em preparações farmacêuticas e de medicamentos. O composto peptídico cujo uso é objeto da invenção proporciona, entre outras, vantagens na administração, na biodisponibilização e/ou na ação terapêutica em um mamífero, quando comparado a outros agentes terapêuticos de mesma finalidade ou finalidade semelhante.

[0059] A invenção é uma alternativa muito útil como adjuvante de terapias com anticorpos, anticorpos monoclonais ou terapias celulares, para reduzir ou eliminar os problemas associados a estas terapias.

[0060] A invenção é também uma alternativa muito útil para terapia adjuvante de ou substituta de anticorpos monoclonais usados para reduzir os níveis de TNFa, IL-6 e/ou IL-113, que são injetáveis e/ou pouco acessíveis, mas que têm demonstrado importantes resultados no tratamento da COVID-19 ou a efeitos tardios ou colaterais associados. Exemplos de tais anticorpos monoclonais incluem adalimumab, infliximab, golilumab, certolizumab, sarilumab e tocilizumab.

[0061] Nos exemplos mostrados ao longo do presente pedido de patente, são apresentados dados e resultados de experimentos que comprovam que a administração oral da composição farmacêutica contendo o referido composto peptídico proporcionou substancial e vigorosa redução dos níveis de TNFa, IL-6 e IL-1 p em mamíferos.

[0062] Para fins da presente invenção as seguintes definições são utilizadas:

[0063] Produto de interesse farmacêutico

[0064] No contexto do presente pedido de patente, deve-se entender “composto de interesse farmacêutico” qualquer entidade molecular que compreenda o composto cujo uso é o conceito inventivo comum ao presente pedido de patente, incluindo também entidades moleculares obtidas mediante modificação/derivatização química do mesmo, com a inclusão de outros grupos funcionais, cadeias laterais lineares ou ramificadas, alteração de hidrofilicidade ou hidrofobicidade, entre outras, desde que compreendam como núcleo a entidade NFKF, NFKL ou variantes dos mesmos conforme definido acima, excetuando-se as entidades naturais e já conhecidas.

[0065] Composição farmacêutica

[0066] No contexto do presente pedido de patente, deve-se entender “composição farmacêutica” como toda e qualquer composição que contenha um princípio ativo, com fins profiláticos, paliativos e/ou curativos, atuando de forma a manter e/ou restaurar a homeostase, podendo ser administrada de forma oral, tópica, parenteral, enteral, intratecal, intranasal e/ou pulmonar.

[0067] Formulação farmaceuticamente aceitável

[0068] No contexto do presente pedido de patente, deve-se entender “formulação farmaceuticamente aceitável” uma formulação contendo excipientes e carreadores farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos por técnicos no assunto, como é o desenvolvimento de doses e tratamentos convenientes para uso em composições particulares que podem ser descritas em uma série de regimes de tratamento, incluindo oral, parenteral, intravenoso, intranasal, pulmonar, intravítreo e intramuscular, intracerebral, intracerebroventricular e intraocular e sua administração e/ou formulação.

[0069] Peptídeo modificado [0070] No contexto do presente pedido de patente, deve-se entender “peptídeo modificado” como um peptídeo não natural, modificado artificialmente ou obtido por síntese, incluindo os haletos, os ciclizados, amidados, alquilados, alcoxilados, hidroxilados, PEGilados, outros grupos funcionais em qualquer aminoácido, ou suas formas de sal, bem como contendo um aminoácido não natural como as formas d-aminoácido. O composto peptídico pode ser peguilado utilizando as técnicas conhecidas pelos versados na arte, como, por exemplo, a peguilação com reagentes contendo o grupamento succinimidil, os quais reagem preferencialmente com aminas primárias presentes na região N-terminal do peptídeo. O composto peptídico da invenção pode ser alquilado em qualquer aminoácido utilizando técnicas conhecidas pelos versados na arte, incluindo, por exemplo, a reação de Mitsunobu descrita no artigo de Reichwein & Liskamp (Reichwein JF & Liskamp RMJ. “Site-specific A/-alkylation of peptides on the solid phase”, Tetrahedron Letters, Volume 39, Issue 10, 5 March 1998, Pages 1243- 1246). Referido artigo descreve a introdução de qualquer grupo alquila em uma função amida específica de um peptídeo. O composto peptídico da invenção pode ser alcoxilado, substituído com halogênios, hidróxi ou outros grupos funcionais em qualquer aminoácido utilizando técnicas conhecidas pelos versados na arte, incluindo, por exemplo, aquelas descritas no livro/publicação Special Periodic Reports, Aminoacids, Peptides and Proteins: Volume 42, Royal Society of Chemistry, 2013. O composto peptídico da invenção pode ser modificado com outras espécies moleculares úteis em aplicações diagnósticas e/ou terapêuticas, como é o caso da Biotina, utilizando técnicas conhecidas pelos versados na arte.

[0071] Peptídeo cíclico ou circular

[0072] No contexto do presente pedido de patente, deve-se entender “peptídeo cíclico, ciclizado ou circular” como um peptídeo que tem uma ligação covalente entre duas regiões diferentes de uma molécula linear de peptídeo, através de qualquer método conhecido da técnica, particularmente pela atividade de enzimas. O peptídeo cíclico pode ser utilizado em substituição ao peptídeo linear devido ao fato de ser mais difícil de ser degradado, já que suas extremidades ou zonas de ataque por enzimas hidrolisantes não estão tão expostas quanto em um peptídeo linear.

[0073] Dose Equivalente em Humanos

[0074] Na presente invenção, o conceito de “dose equivalente em humanos” é a dose na qual, em humanos, se espera a mesma magnitude de efeitos observada em animais numa dada dose, conforme preconiza o “Guidance for Industry Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers" publicado pelo U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration Center for Drug Evaluation and Research (CDER), July 2005 Pharmacology and Toxicology. No referido guia, a conversão de dose observada em animais (mg/kg) para Dose Equivalente em Humanos (mg/kg) implica na divisão do resultado obtido em ratos por 6,2 e do resultado obtido em camundongos por 12,3. Esses valores são aplicáveis a um humano com 60 kg de peso padrão. Para outras espécies ou para pesos fora das faixas de peso padrão, a Dose Equivalente em Humanos (DEH) pode ser calculada pela fórmula: DEH = dose no animal em mg/kg x (peso do animal em kg/peso do humano em kg) ^{0 33} . O referido Guidance considera adequada uma faixa de segurança de 10 vezes os limites de concentração testados.

[0075] No presente pedido de patente é demonstrado que o uso do referido composto peptídico proporciona a diminuição dos níveis de citocinas como o TNFa, a IL-6 e/ou a IL-1 [3 em mamíferos, com a adicional vantagem de o ser por administração oral. Qualquer indicação terapêutica relacionada a estes alvos pode se beneficiar da presente invenção, sendo este particularmente o caso da COVID-19 e/ou das disfunções imunes/metabólicas associadas aos efeitos da proteína Spike, dentre outras condições.

[0076] A presente invenção é também definida pelas seguintes cláusulas.

[0077] Uso do composto peptídico consistindo essencialmente de NFKF, NFKL, e/ou um sal do mesmo, em que um ou mais dos referidos aminoácidos pode ser uma forma d-aminoácido, modificada ou cíclica, pode ser uma versão amidada, alquilada, alcoxilada, halogenada, hidroxilada, PEGilada; e/ou combinações dos mesmos, para a preparação de um medicamento preventivo, curativo ou profilático de distúrbios imunes ou distúrbios metabólicos associados a elevados níveis de TNFa, IL-6 e/ou IL-113 em mamíferos.

[0078] Uso do composto peptídico descrito acima para a preparação de um medicamento para reduzir a expressão de ACE2 e/ou modular o equilíbrio ACE/ACE2, para o tratamento de hipertensão, de eventos cardiovasculares ou renais, de diabetes tipo 2, e para reduzir o processo de infecção virai pelo SarsCov-2.

[0079] Uso do composto peptídico descrito acima para a preparação de um medicamento preventivo, curativo ou profilático de doenças causadas por ou associadas a vírus, como a influenza, coronavirus, incluindo a COVID-19, ou de condições associadas a estes vírus ou partes dos mesmos, em um mamífero.

[0080] Uso do composto peptídico descrito acima para a preparação de um medicamento preventivo, curativo ou profilático de miocardite e/ou pericardite em um mamífero.

[0081] Uso do composto peptídico descrito acima para a preparação de um medicamento preventivo, curativo ou profilático de coagulopatias, eventos trombóticos e/ou cardiovasculares, ou diabetes tipo 2 em um mamífero.

[0082] Uso do composto peptídico descrito acima para a preparação de um medicamento combinado com ou como adjuvante a um anticorpo monoclonal e/ou uma terapia celular.

[0083] Uso do composto peptídico descrito acima para a preparação de um medicamento combinado com ou em substituição a um ou mais dentre adalimumab, infliximab, golilumab, certolizumab, sarilumab, tocilizumab, ou combinações dos mesmos.

[0084] Composição farmacêutica moduladora dos níveis de citocinas em um mamífero compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável; e, como princípio ativo, o composto descrito acima. [0085] Composição farmacêutica para o tratamento preventivo, curativo ou profilático de distúrbios imunes ou distúrbios metabólicos associados a elevados níveis de TNFa, IL-6 e/ou IL-1 |3 em mamíferos, compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável; e, como princípio ativo, o composto descrito acima. [0086] Composição farmacêutica moduladora da expressão de ACE2 e/ou do equilíbrio ACE/ACE2 em um mamífero compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável; e, como princípio ativo, o composto descrito acima. [0087] Composição farmacêutica para o tratamento preventivo, curativo ou profilático de doenças causadas por ou associadas a vírus, incluindo a influenza, coronavirus, incluindo a COVID-19, em um mamífero, compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável; e, como princípio ativo, o composto descrito acima.

[0088] Composição farmacêutica para o tratamento preventivo, curativo ou profilático de miocardite e/ou pericardite em um mamífero, compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável; e, como princípio ativo, o composto descrito acima.

[0089] Composição farmacêutica para o tratamento preventivo, curativo ou profilático de hipertensão, coagulopatias, eventos trombóticos, cardiovasculares e/ou renais em um mamífero, compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável; e, como princípio ativo, o composto descrito acima.

[0090] Composição farmacêutica para uso no tratamento preventivo, curativo ou profilático de distúrbios imunes ou distúrbios metabólicos associados a elevados níveis de TNFa, IL-6 e/ou IL-113 em um mamífero, compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável; e, como princípio ativo, o composto descrito acima na forma de um tablete, gel, líquido, xarope, cápsula, na forma oral, inalável ou em adesivo.

[0091] Composição farmacêutica para reduzir ou eliminar os efeitos colaterais de terapias com anticorpos, anticorpos monoclonais ou terapias celulares em um mamífero, compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável; e, como princípio ativo, o composto descrito acima na forma de um tablete, gel, líquido, xarope, cápsula, na forma oral, inalável ou em adesivo.

[0092] Composição farmacêutica para uso no tratamento preventivo, curativo ou profilático de doenças causadas por ou associadas vírus, incluindo a influenza, a coronavirus, incluindo a COVID-19, em um mamífero, compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável; e, como princípio ativo, o composto descrito acima na forma de um tablete, gel, líquido, xarope, cápsula, na forma oral, inalável ou em adesivo.

[0093] Composição farmacêutica para uso no tratamento preventivo, curativo ou profilático de miocardite e/ou pericardite em um mamífero, compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável; e, como princípio ativo, o composto descrito acima na forma de um tablete, gel, líquido, xarope, cápsula, na forma oral, inalável ou em adesivo.

[0094] Composição farmacêutica para uso no tratamento preventivo, curativo ou profilático de hipertensão, coagulopatias, eventos trombóticos, cardiovasculares ou renais, ou diabetes tipo 2 em um mamífero, compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável; e, como princípio ativo, o composto descrito acima na forma de um tablete, gel, líquido, xarope, cápsula, na forma oral, inalável ou em adesivo.

[0095] Método para o tratamento de distúrbios imunes ou distúrbios metabólicos associados a elevados níveis de TNFa, IL-6 e/ou IL-113 em um sujeito em necessidade do mesmo, compreendendo a administração ao sujeito de uma composição farmacêutica compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável e um princípio ativo consistindo essencialmente do composto descrito acima.

[0096] Método para o tratamento de distúrbios imunes ou distúrbios metabólicos associados a elevados níveis de TNFa, IL-6 e/ou IL-113 em um sujeito em necessidade do mesmo, compreendendo a administração ao sujeito de uma composição farmacêutica compreendendo o peptídeo descrito acima combinado com uma terapia compreendendo um ou mais anticorpos, anticorpos monoclonais ou uma terapia celular; ou a administração combinada com ou em substituição a um ou mais dentre adalimumab, infliximab, golilumab, certolizumab, sarilumab, tocilizumab, ou combinações dos mesmos.

[0097] Método para o tratamento de miocardite e/ou pericardite em um sujeito em necessidade do mesmo, compreendendo a administração ao sujeito de uma composição farmacêutica compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável e um princípio ativo consistindo essencialmente do composto descrito acima.

[0098] Método para o tratamento de hipertensão, coagulopatias, eventos trombóticos, cardiovasculares ou renais em um sujeito em necessidade do mesmo, compreendendo a administração ao sujeito de uma composição farmacêutica compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável e um princípio ativo consistindo essencialmente do composto descrito acima.

[0099] Método para o tratamento de doenças causadas por ou associadas a vírus, incluindo a influenza, a coronavirus, incluindo a COVID-19 em um sujeito em necessidade do mesmo, compreendendo a administração ao sujeito de uma composição farmacêutica compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável e um princípio ativo consistindo essencialmente do composto descrito acima.

[0100] Método conforme descrito acima, em que o princípio ativo é formulado na forma de um tablete, gel, líquido, xarope, cápsula, inalável ou em adesivo.

[0101] Método conforme indicado acima, em que o composto é administrado na faixa de dosagem de 4 a 400 pg do princípio ativo por dia por kg de um paciente humano.

[0102] Independentemente do mecanismo de ação, o qual não é objeto do presente pedido de patente, o fato de o referido composto ter proporcionado importante ação moduladora dos níveis de citocinas em mamíferos, mostra com clareza a surpreendente magnitude e relevância dos problemas técnicos resolvidos. [0103] A composição farmacêutica da invenção pode ser administrada na forma de tablete, gel, cápsula, cápsula de instilação nasal ou pulmonar, líquido oral ou xarope, supositório, solução injetável ou outras formas de administração adequadas para fins farmacêuticos e médicos.

[0104] Os exemplos a seguir mostrados têm o intuito somente de exemplificar algumas das diversas maneiras de se concretizar a invenção, contudo, sem limitar o escopo da mesma.

[0105] Exemplos

[0106] Exemplo 1. Uso do composto NFKF para a preparação de composição farmacêutica

[0107] Nesta concretização, o tetrapeptídeo NFKF foi sintetizado por síntese química, usando a química Fmoc (N-(9-fluorenil) metoxicarbonil), sendo subsequentemente purificados por HPLC até pureza >95% (Proteimax Biotecnologia Ltda, São Paulo, SP), semelhantemente ao protocolo previamente descrito em Ferrante C et al., 2017; Leone S et al., 2017.

[0108] Referido peptídeo foi utilizado na preparação de uma composição farmacêutica líquida de uso oral compreendendo entre 2,7x10’ ⁴ Molar do referido peptídeo e um veículo farmaceuticamente aceitável. Nesta concretização, o referido veículo é solução salina, a composição farmacêutica sendo uma solução de uso oral. Referida composição foi utilizada para a administração oral in vivo a mamíferos conforme descrito a seguir a seguir.

[0109] Em outras concretizações, a composição farmacêutica se apresenta na forma de tablete, gel, líquido oral ou xarope, cápsula, supositório, solução injetável ou formas inaláveis ou em adesivo, opcionalmente compreendendo outros princípios ativos.

[0110] Exemplo 2. Composição farmacêutica compreendendo NFKF para reduzir níveis de TNFa

[0111] No presente exemplo, experimentos foram conduzidos para demonstrar a capacidade da composição da invenção em reduzir substancialmente in vivo os níveis da TNFa. Como modelo experimental, foi utilizada a indução encefalomielite aguda experimenta (EAE) conforme descrito na literatura (Basso AS et al., 2008; Santos NBD et al., 2019).

[0112] A composição farmacêutica conforme descrita no exemplo 1 foi administrada a camundongas fêmeas C57BL/6J do tipo selvagem. Todos os experimentos com animais foram conduzidos com duplo-cego até a conclusão do experimento (Sjoberg EA, 2017). Os animais tiveram livre acesso a água e alimentação em um ambiente de temperatura controlada (Sjoberg EA, 2017) entre 22 e 23°C e com 12h de ciclo claro/escuro, as luzes sendo ligadas às 6:30 am. Os animais foram mantidos e usados de acordo com as recomendações do Conselho Nacional para controle de experimentação animal (CONCEA), seguindo normas internacionais de cuidado e manutenção animal.

[0113] A indução de EAE foi feita conforme descrito (Basso AS et al., 2008; Santos NBD et al., 2019). Resumidamente, 24h antes da imunização 20 pL de sangue foram coletados da cauda do animal e diluídos em 1 ml_ de tampão fosfato salina, pH 7,5 (PBS), e imediatamente foi feita a leitura em um analisador BC2800 vet analyzer (BioBrasil, São Paulo, SP, Brazil) para quantificar leucócitos. No dia da imunização (dia 0), mediante anestesia inalada (isoflurane 1 ,5% em oxigênio), fêmeas WT receberam injeção subcutânea com 200 pg de MOG (myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55; Proteimax Biotecnologia Ltda, São Paulo, SP), emulsificada em 100 pL de adjuvante de Freund completo contendo 4 mg/mL de Mycobacterium tuberculosis termoinativada. Além disso, 300 ng de toxina de Bordetella pertussis foram administrados intraperitonealmente (I.P.) duas vezes, a 0 e 48h após a imunização. Animais controle foram tratados com veículo (adjuvante de Freund completo, subcutâneo; toxina pertussis, intraperitoneal). O composto peptídico NFKF (0,5 mg/kg por dia) ou 0,9% de NaCI/salina (Sal) foi administrado oralmente por gavage a partir do dia 1. Os animais (n = 9-10) foram avaliados diariamente com base em escores clínicos.

[0114] Neste regime de dosagem em camundongos, ao se aplicar conversão para a Dosagem Equivalente em Humanos, tem-se que um método terapêutico no qual o composto é administrado na faixa de dosagem de 4 a 400 pg do princípio ativo por dia por kg de um paciente humano.

[0115] A figura 1 mostra os resultados de testes com animais (camundongos) C57BL6 fêmeas, de 8 a 10 de semanas de idade, os quais foram submetidos a um protocolo de indução de Encefalomielite Autoimune Experimental (EAE). No eixo y são mostradas as concentrações de TNFa em unidades arbitrárias, em diferentes condições-teste conforme indicado, nas quais 10pL de plasma foram usados para quantificação por ELISA de acordo com as especificações do fabricante (R&D Systems). Os resultados da figura 1 mostram substancial e significativa redução da concentração de TNFa mediante a administração de NFKF aos animais.

[0116] O TNFa é uma citocina inflamatória envolvida na função imune, e tem sido relatada como também sendo relacionada a distúrbios metabólicos e/ou coagulopatias. Neste contexto, numerosos artigos científicos recém publicados iluminam o papel da proteína Spike do coronavirus na ativação da via do NF-KB e/ou do TNFa.

[0117] É agora sabido que a COVID-19 envolve superativação da via do NF-KB (Hariharan A, Hakeem AR, Radhakrishnan S, Reddy MS, Rela M. The Role and Therapeutic Potential of NF-kappa-B Pathway in Severe COVID-19 Patients. Inflammopharmacology. 2021 Feb;29(1 ):91 -100. doi: 10.1007/s10787-020- 00773-9. 38. Kircheis R, Haasbach E, Lueftenegger D, Heyken WT, Ocker M, Planz O. NF-KB Pathway as a Potential Target for Treatment of Critical Stage COVID-19 Patients. Front Immunol. 2020 Dec 10;11 :598444. doi: 10.3389/fimmu.2020.598444). Neste contexto, a literatura demonstrou que a proteína Spike do SarsCov-2 potencialmente induz a expressão da via do NF-KB e das citocinas inflamatórias, incluindo IL-6, IL-1 B, TNFa, além de CXCL1 , CXCL2, e CCL2 (mas não IFNs) em macrófagos humanos e de camundongos (Khan S, Shafiei MS, Longoria C, Schoggins J, Savani RC, Zaki H. SARS-CoV- 2 spike protein induces inflammation via TLR2-dependent activation of the NF- KB pathway. bioRxiv [Preprint]. 2021 Mar 17:2021.03.16.435700. doi: 10.1 101/2021 .03.16.435700). Além disso, o envolvimento da via do NF-KB OU do TNFa em coagulopatias é descrito na literatura, de modo que dispor de uma abordagem terapêutica oral que modula a concentração de TNFa é potencialmente útil no contexto das complicações associadas à proteína Spike ou à COVID-19.

[0118] Exemplo 3. Composição farmacêutica compreendendo NFKF para reduzir níveis de IL-6

[0119] No presente exemplo, experimentos foram conduzidos para demonstrar a capacidade da composição da invenção em reduzir substancialmente in vivo os níveis da citocina IL-6. Como modelo experimental, foi utilizada a indução encefalomielite aguda experimenta (EAE) conforme descrito na literatura (Basso AS et al., 2008; Santos NBD et al., 2019).

[0120] A composição farmacêutica conforme descrita no exemplo 1 foi administrada a camundongas fêmeas C57BL/6J do tipo selvagem. Todos os experimentos com animais foram conduzidos com duplo-cego até a conclusão do experimento (Sjoberg EA, 2017). Os animais tiveram livre acesso a água e alimentação em um ambiente de temperatura controlada (Sjoberg EA, 2017) entre 22 e 23°C e com 12h de ciclo claro/escuro, as luzes sendo ligadas às 6:30 am. Os animais foram mantidos e usados de acordo com as recomendações do Conselho Nacional para controle de experimentação animal (CONCEA), seguindo normas internacionais de cuidado e manutenção animal.

[0121] A indução de EAE foi feita conforme descrito (Basso AS et al., 2008; Santos NBD et al., 2019). Resumidamente, 24h antes da imunização 20 pL de sangue foram coletados da cauda do animal e diluídos em 1 ml_ de tampão fosfato salina, pH 7,5 (PBS), e imediatamente foi feita a leitura em um analisador BC2800 vet analyzer (BioBrasil, São Paulo, SP, Brazil) para quantificar leucócitos. No dia da imunização (dia 0), mediante anestesia inalada (isoflurane 1 ,5% em oxigênio), fêmeas WT receberam injeção subcutânea com 200 pg de MOG (myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55; Proteimax Biotecnologia Ltda, São Paulo, SP), emulsificada em 100 pL de adjuvante de Freund completo contendo 4 mg/mL de Mycobacterium tuberculosis termoinativada. Além disso, 300 ng de toxina de Bordetella pertussis foram administrados intraperitonealmente (I.P.) duas vezes, a 0 e 48h após a imunização. Animais controle foram tratados com veículo (adjuvante de Freund completo, subcutâneo; toxina pertussis, intraperitoneal). O composto peptídico NFKF (0,5 mg/kg por dia) ou 0,9% de NaCI/salina (Sal) foi administrado oralmente por gavage a partir do dia 1. Os animais (n = 9-10) foram avaliados diariamente com base em escores clínicos.

[0122] A figura 2 mostra os resultados de testes para a avaliação do nível de IL- 6 e a modulação do mesmo em modelo experimental estabelecido, no qual com animais (camundongos) C57BL6 fêmeas, de 8 a 10 de semanas de idade, os quais foram submetidos a um protocolo de indução de Encefalomielite Autoimune Experimental (EAE). Oito dias após a indução de EAE, os animais foram anestesiados com ketamina (90mg/kg) e xylazina (10mg/kg). Após dissecção do baço e dos linfonodos inguinais, foi feita a extração de leucócitos. As células foram estimuladas com Anti-CD3 (1 pg/mL) e MOG (100pg/mL) com ou sem o referido composto peptídico na concretização NFKF (100pg/mL) por 72 horas. Em seguida, 50pL de meio foram utilizados para quantificação de citocina IL-6 por ELISA. Em A é mostrada a IL-6 mediante quantificação por ELISA nas células leucocitárias de baço. Em B é IL-6 mediante quantificação por ELISA nas células leucocitárias de linfonodos inguinais. Os resultados são expressos como a média ± desvio padrão. As análises estatísticas foram feitas usando o teste One-way ANOVA, n = 4.

[0123] Como os escores clínicos observados no experimento foram claramente melhores no grupo tratado com NFKF, outra série de experimentos foi conduzida para avaliar o impacto sobre os níveis de citocinas nos animais de ambos os grupos. Amostras de leucócitos do baço e de linfonodos inguinais foram analisadas para a quantificação dos níveis extraídos de IL-6. Após extração com tampão hipotônico, as células foram analisadas com um citômetro de fluxo Acuri flow (BD Biosciences, NJ, USA) para a contagem de células totais. Em seguida, um milhão de células de baço e de linfonodos inguinais de animais com EAE foram plaqueados em placas ELISA de 96 poços, estimuladas com anti-CD3 (1 pg/mL) e MOG (100 pg/mL), e tratadas com salina (controles) ou NFKF (100 pg/mL) por 72 hours. Em seguida, 50 pL de meio foram usados para a quantificação da citocina IL-6 por ensaios Elisa seguindo as especificações do fabricante (R&D Systems).

[0124] Os resultados da figura 2 mostram que a administração de NFKF reduziu significativa e substancialmente os níveis de IL-6 nos leucócitos do baço dos animais nos quais a EAE foi induzida, tanto com a estimulação ou não com anti- CD3/MOG.

[0125] Exemplo 4. Composição farmacêutica compreendendo NFKF para reduzir níveis de IL-1B

[0126] No presente exemplo, experimentos foram conduzidos para demonstrar a capacidade da composição da invenção em reduzir substancialmente in vivo os níveis da citocina IL-113. Como modelo experimental, foi utilizada a indução encefalomielite aguda experimenta (EAE) conforme descrito na literatura (Basso AS et al., 2008; Santos NBD et al., 2019).

[0127] A composição farmacêutica conforme descrita no exemplo 1 foi administrada a camundongas fêmeas C57BL/6J do tipo selvagem. Todos os experimentos com animais foram conduzidos com duplo-cego até a conclusão do experimento (Sjoberg EA, 2017). Os animais tiveram livre acesso à água e alimentação em um ambiente de temperatura controlada (Sjoberg EA, 2017) entre 22 e 23°C e com 12h de ciclo claro/escuro, as luzes sendo ligadas às 6:30 am. Os animais foram mantidos e usados de acordo com as recomendações do Conselho Nacional para controle de experimentação animal (CONCEA), seguindo normas internacionais de cuidado e manutenção animal.

[0128] A indução de EAE foi feita conforme descrito (Basso AS et al., 2008; Santos NBD et al., 2019). Resumidamente, 24h antes da imunização 20 pL de sangue foram coletados da cauda do animal e diluídos em 1 mL de tampão fosfato salina, pH 7,5 (PBS), e imediatamente foi feita a leitura em um analisador BC2800 vet analyzer (BioBrasil, São Paulo, SP, Brazil) para quantificar leucócitos. No dia da imunização (dia 0), mediante anestesia inalada (isoflurane 1 ,5% em oxigênio), fêmeas WT receberam injeção subcutânea com 200 pg de MOG (myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55; Proteimax Biotecnologia Ltda, São Paulo, SP), emulsificada em 100 pL de adjuvante de Freund completo contendo 4 mg/mL de Mycobacterium tuberculosis termoinativada. Além disso, 300 ng de toxina de Bordetella pertussis foram administrados intraperitonealmente (I.P.) duas vezes, a 0 e 48h após a imunização. Animais controle foram tratados com veículo (adjuvante de Freund completo, subcutâneo; toxina pertussis, intraperitoneal). O composto peptídico NFKF (0,5 mg/kg por dia) ou 0,9% de NaCI/salina (Sal) foi administrado oralmente por gavage a partir do dia 1. Os animais (n = 9-10) foram avaliados diariamente com base em escores clínicos.

[0129] A figura 3 mostra os resultados de testes para a avaliação do nível de IL- 1 P e a modulação do mesmo em modelo experimental estabelecido, no qual com animais (camundongos) C57BL6 fêmeas, de 8 a 10 de semanas de idade, os quais foram submetidos a um protocolo de indução de Encefalomielite Autoimune Experimental (EAE). Oito dias após a indução de EAE, os animais foram anestesiados com ketamina (90mg/kg) e xylazina (10mg/kg). Após dissecção do baço e dos linfonodos inguinais, foi feita a extração de leucócitos. As células foram estimuladas com Anti-CD3 (1 pg/mL) e MOG (100pg/ml_) com ou sem o referido composto peptídico na concretização NFKF (100pg/ml_) por 72 horas. Em seguida, 50pL de meio foram utilizados para quantificação de citocina IL-113 por ELISA. Em A é mostrada a IL-113 mediante quantificação por ELISA nas células leucocitárias de baço. Em B é IL-1 p mediante quantificação por ELISA nas células leucocitárias de linfonodos inguinais. Os resultados são expressos como a média ± desvio padrão. As análises estatísticas foram feitas usando o teste One-way ANOVA, n = 4.

[0130] Como os escores clínicos observados no experimento foram claramente melhores no grupo tratado com NFKF, outra série de experimentos foi conduzida para avaliar o impacto sobre os níveis de citocinas nos animais de ambos os grupos. Amostras de leucócitos do baço e de linfonodos inguinais foram analisadas para a quantificação dos níveis extraídos de IL-1 (3. Após extração com tampão hipotônico, as células foram analisadas com um citômetro de fluxo Acuri flow (BD Biosciences, NJ, USA) para a contagem de células totais. Em seguida, um milhão de células de baço e de linfonodos inguinais de animais com EAE foram plaqueados em placas ELISA de 96 poços, estimuladas com anti- CD3 (1 pg/mL) e MOG (100 pg/mL), e tratadas com salina (controles) ou NFKF (100 pg/mL) por 72 hours. Em seguida, 50 pL de meio foram usados para a quantificação da citocina IL-1 [3 por ensaios Elisa seguindo as especificações do fabricante (R&D Systems).

[0131] Os resultados da figura 3 mostram que a administração de NFKF reduziu significativa e substancialmente os níveis de IL-113 nos leucócitos do baço dos animais nos quais a EAE foi induzida, tanto com a estimulação ou não com anti- CD3/MOG. Semelhantemente, nos linfonodos inguinais houve significativa e substancial redução dos níveis de IL-1 [3 mediante a administração de NFKF, independente do uso ou não de estimulação com anti-CD3/MOG.

[0132] Relatos anteriores sugerem que IL-1 [3 acarreta a neuroinflamação em modelo de EAE em camundongos (Levesque SA et al., 2016). Este experimento mostrou que NFKF reduziu amplamente os níveis de IL-1 Í3 em camundongos no modelo EAE, sendo ou não sendo estimulados com anti-CD3/MOG. A magnitude da redução de IL-1 [3, tanto no baço quanto nos linfonodos inguinais, tanto com ou sem estimulação com agente inflamatório (anti-CD3/MOG), é surpreendente e aponta para importantes aplicações terapêuticas.

[0133] Adicionalmente à excitotoxicidade de neurotransmissor, a IL-1 [3 reconhecidamente desempenha importante papel na EAE. A EAE clínica é significativamente atenuada em camundongos deficientes em receptores IL-1 e deficientes em IL-1 [3, sendo a IL-1 [3 encontrada no sangue, fluido cerebroespinhal e em lesões do SNC de pacientes com Esclerose Múltipla/MS. [0134] Os resultados apresentados nestes exemplos são prova de conceito da redução dos níveis da citocina IL-1 [3, indicando que a invenção é uma alternativa terapêutica para o tratamento de pacientes com diabetes tipo 2. A presente invenção, ao proporcionar a substantial redução dos níveis de IL-113, é uma alternativa terapêutica para o tratamento preventivo, profilático ou curativo da diabetes tipo 2.

[0135] Importante ressaltar que recentemente foram relatados casos anedóticos de pessoas que tiveram casos de inflamação cardíaca, do sistema nervoso periférico, no cérebro e na medula espinhal, possivelmente associados a vacinas de mRNA, conforme publicado no Journal of Neurology em 03Set2021 (Journal of Neurology https://doi.org/10.1007/s00415-021 -10780-7; COVID-19 mRNA vaccination leading to CNS inflammation: a case series). No caso específico de pacientes com Esclerose Múltipla (MS), foram relatados sintomas neurológicos (e achados de imagens por ressonância magnética nuclear) consistentes com desmielinização ativa do nervo ótico, cérebro ou medula espinhal. Portanto, os modelos experimentais de MS podem ser muito úteis no contexto da avaliação de abordagens terapêuticas para o tratamento de COVID-19 ou de efeitos colaterais associados à proteína Spike, a vírus ou vetores vacinais e/ou aos protocolos de vacinação.

[0136] A redução significativa in vivo dos níveis de TNFa, IL-6 e/ou IL-1 [3 é também prova de conceito da aplicabilidade da invenção em métodos de tratamento para as condições indicadas no presente relatório. É também prova de conceito de sua utilidade na preparação de um medicamento combinado com ou como adjuvante a terapias com anticorpo monoclonais ou terapias celulares, e também de um medicamento combinado com ou em substituição a um ou mais dentre adalimumab, infliximab, golilumab, certolizumab, sarilumab, tocilizumab, ou combinações dos mesmos.

[0137] Os resultados dos testes mostrados nos exemplos 2, 3 e 4 acima suportam também importante papel na regulação do complexo sistema das angiotensinas ACE e ACE2, o que tem importantes impactos em diversas condições, como a hipertensão, eventos cardiovasculares e renais diversos, bem como na COVID-19, uma vez que ACE2 tem reconhecido papel no processo de infecção pelo respectivo vírus.

[0138] Como a administração da composição da invenção acarretou demonstrada e concomitante diminuição dos níveis de TNFoc e IL-6, isso é prova de conceito de uma nova abordagem terapêutica para reduzir a expressão de ACE2, uma vez que esta tem expressão aumentada por TNFoc sozinho e IL-6 sozinho. A redução da expressão de ACE2 tem variadas aplicações terapêuticas, incluindo o tratamento da hipertensão, de eventos cardiovasculares ou renais, bem como para potencialmente limitar a progressão da infecção pelo SarsCov-2.

[0139] A redução do efeito de feedback positivo (aumento a expressão de IL-6 e IL1 -B quando os níveis de ACE2 são elevados e aumento da expressão de ACE2 quando aumentam os níveis de IL-6 e TNFa), o que pode redundar na tempestade de citocinas e tem relação com a gravidade da doença COVID-19 é outro potencial terapêutico demonstrado na presente invenção. Consequentemente, a presente invenção proporciona uma alternativa terapêutica que pode contribuir para o combate contra a COVID-19 por mais de um mecanismo: contribuir para minimizar ou evitar a replicação virai mediante a redução da expressão de ACE2; e contribuir para minimizar o quadro grave da doença associado à tempestade de citocinas.

[0140] Exemplo 5. Não detecção de efeitos centrais indesejáveis mediante administração in vivo de composição compreendendo NFKF.

[0141] Testes in vivo foram realizados para avaliar eventual efeito central indesejável, como é conhecido para as entidades moleculares mais próximas, hemopressina e RVD-hemopressina.

[0142] A figura 4 mostra os resultados de testes in vivo para avaliar eventual efeito indesejável no sistema nervoso central, mediante uso do teste do labirinto em cruz elevado (LCE), um teste para medir a ansiedade em animais de laboratório e para avaliar compostos ansiolíticos ou ansiogênicos. Os resultados demonstram que a administração de NFKF não acarreta tais efeitos centrais indesejáveis, Os resultados da figura 4 demonstram que a administração de NFKF não acarreta efeitos centrais. Foi usada solução salina (Veh) como controle negativo, o composto Win 55212-2 (WIN), um conhecido agonista do receptor canabinóide 1 , como controle positivo e NFKF nas concentrações indicadas, todos administrados via oral por gavagem em camundongos C57B6, em um total de 7 animais. Em A) é mostrada a variação de temperatura em ^S C (delta ^S C); em B) é mostrado o tempo de catalepsia em segundos após administração; em C) é mostrada a distância em metros de caminhada no teste de caminhada em campo aberto; em D) é mostrado o % de MPE (maximal possible effect) no teste de hot plate; em E) é mostrado o % de entradas nos braços abertos no teste LCE (labirinto em cruz elevado); em F) é mostrado o % do tempo de permanência nos braços abertos no teste LCE.

[0143] O fato do tratamento com NFKF não induzir comportamento depressivo/ansiogênico mostra a especificidade de ação no sistema nervoso central. Atingindo núcleos específicos que conferem a capacidade neuro- protetora do NFKF (objeto do pedido internacional de patente co-pendente publicado como WO 2018209415) e não causando uma modulação generalizada que pode gerar um desequilíbrio, manifestando-se com mudanças comportamentais.

[0144] Os resultados da figura 4 mostram que a administração da composição contendo NFKF proporcionou resultados surpreendentemente contrastantes quando comparados aos efeitos centrais conhecidos da hemopressina e da RVD-hemopressina, esta indutora de comportamento ansiolítico e antidepressivo e aquela indutora de comportamento ansiogênico e depressivo, além de redução dos níveis basais de monoamina no cortex prefrontal e aumentada expressão de genes envolvidos em seu catabolismo. A administração de NFKF não alterou nenhum tipo de comportamento dos animais nos testes realizados, conforme evidenciado nos painéis A-F da figura 4. Os dados mostram que a administração do composto da invenção não induz efeito central indesejável, ou seja, não acarreta os efeitos centrais conhecidos em seus congêneres mais próximos. Esta importante vantagem técnica viabiliza, na prática, seu uso em uma gama mais ampla de condições.

[0145] O conceito inventivo ora revelado e exemplificado de uma ou mais formas foi tratado como segredo industrial e não foi previamente revelado até o momento do depósito deste pedido de patente ou de sua prioridade. Este segredo industrial é ativo imaterial do depositante. A eventual futura publicação do pedido de patente não constitui, em si, autorização de uso por terceiros, servindo apenas como: (i) cientificação a terceiros da existência do referido segredo industrial na data do depósito; (ii) indicação inequívoca de seu detentor; e (iii) estímulo ao desenvolvimento de novas melhorias a partir do conceito ora revelado, para evitar o reinvestimento no desenvolvimento do mesmo bem já detido pelo depositante.

[0146] Desde logo se adverte que eventual uso comercial requer autorização do detentor e que o uso não autorizado enseja sanções previstas em Lei. Neste contexto, se esclarece que a partir da revelação do presente conceito inventivo, os versados na arte poderão considerar outras formas de concretizar a invenção não idênticas às meramente exemplificadas acima, mas que na hipótese de pretensão de uso comercial tais formas poderão ser consideradas como estando dentro do escopo das reivindicações anexas.