Uso de Composto, Intermediário de Síntese, Composição Farmacêutica e

Método terapêutico neuromodulador

Campo da Invenção

[0001] A presente invenção situa-se nos campos da farmácia, medicina, química e biotecnologia. Mais especificamente, a presente invenção descreve um composto e seu uso para preparar um ligante de interesse diagnóstico e/ou terapêutico, um intermediário de síntese na preparação de compostos de interesse farmacêutico, o uso de um composto para preparar um medicamento modulador de receptores canabinoides e/ou muscarínicos, uma composição farmacêutica contendo o referido composto e um método terapêutico. A composição farmacêutica da invenção compreende um composto peptídico e é particularmente útil para a modulação de função metabólica ou neuromodulação e pode ser administrada por via oral. Em uma concretização, a administração oral da composição da invenção demonstrou importantes e surpreendentes resultados no tratamento curativo ou profilático de convulsões. Resultados de testes indicam que o composto da invenção interage com e/ou modula a atividade de receptores canabinoides (CB), especialmente CB1 e/ou CB2, a composição farmacêutica da invenção sendo uma promissora alternativa à administração de compostos canabinoides atualmente conhecidos como anticonvulsivantes, como, por exemplo, o canabidiol.

Antecedentes da Invenção

[0002] A presente invenção descreve um composto e seu uso para a preparação de composições farmacêuticas úteis para um variado conjunto de condições médicas. Em uma concretização, a composição farmacêutica da invenção é útil em condições médicas relacionadas ao sistema nervoso central. Surpreendentemente, embora a composição da invenção compreenda um ativo peptídico, a administração oral proporcionou efeitos cerebrais em animais. [0003] Em uma concretização, testes in vivo com a composição da invenção demonstraram resultados surpreendentes quanto à sua atividade neuromoduladora. A composição farmacêutica da invenção, quando administrada previamente a animais, proporcionou surpreendente, potente e longa proteção contra danos decorrentes da subsequente administração de substâncias sabidamente danosas aos neurónios. Assim sendo, a neuromodulação ou neuroproteção proporcionada pelo composto da invenção é particularmente útil como alternativa terapêutica para diversas condições médicas, incluindo aquelas relacionadas a distúrbios de excitabilidade neuronal.

[0004] Em várias concretizações, testes in vivo com o composto da invenção demonstraram resultados surpreendentes quanto à sua atividade anticonvulsivante. O composto da invenção, quando usado como anticonvulsivante, adicionalmente proporciona a vantagem de ser um bom candidato a substituto dos compostos canabinoides conhecidos por sua atuação como anticonvulsivantes, como é o caso o Canabidiol. O Canabidiol, apesar de seus efeitos comprovados como anticonvulsivante, tem enfrentando problemas regulatorios devido à sua origem, a planta Cannabis sativa. A presente invenção proporciona uma adicional abordagem terapêutica para os pacientes que sofrem de convulsões e que têm dificuldade de obter medicamentos, sendo baseada em um peptídeo e não usa derivados da Cannabis sativa. Além disso, os resultados mostraram que o composto da invenção, quando usado como anticonvulsivante, proporciona outras surpreendentes vantagens técnicas no uso, incluindo maior efeito terapêutico, uso oral, menor dosagem, menor ocorrência de efeitos colaterais como a prostração e sangramento nasal, dentre outras vantagens técnicas.

[0005] A pilocarpina (comumente chamada "Pilo") é um alcalóide extraído das folhas da planta jaborandi {Pilocarpus jaborandí), planta usada há séculos pelos índios Tupi-Guarani que habitam o Brasil e tiram proveito de suas propriedades de produzir suor e saliva. A pilocarpina é um agonista muscarínico não específico, lentamente degradado e sem efeitos sobre os receptores nicotínicos e foi introduzida na prática clínica pelo médico brasileiro Sifrônio Coutinho, em 1874, através de extratos da folha do jaborandí para obter efeito diaforético (produção de suor) e silagogo (produção de saliva).

[0006] A despeito de suas propriedades farmacêuticas, a pilocarpina em elevadas concentrações induz a ocorrência de convulsões, sendo usada como um modelo experimental para tanto. As convulsões induzidas pela pilocarpina levam à neurotoxicidade em nível celular e podem ser relacionadas ao aumento do estresse oxidativo cerebral e das alterações na concentração de certos aminoácidos (Santos et al, 201 1 ).

[0007] A administração de pilocarpina neste modelo experimental leva a lesões encefálicas severas, neurotoxicidade e normalmente culmina na morte dos animais. Entretanto, antes deste desfecho, a pilocarpina acarreta alterações colinérgicas capazes de induzir o status epilepticus (SE) associado a movimentos estereotipados convulsivos. A Pilo é capaz de induzir status epilepticus tanto administrada diretamente no encéfalo como por via intraperitoneal. Esta substância foi usada em alguns experimentos descritos neste pedido de patente, seus efeitos neuronais/encefálicos danosos tendo sido inibidos pela composição da presente invenção: a vasta maioria dos animais submetidos a estes experimentos não apresentou sintomas relacionados às lesões cerebrais e sobreviveu sem danos aparentes, em contraste aos grupos de animais tratados com outras substâncias conhecidas.

[0008] Grande parte do entendimento sobre os mecanismos das epilepsias vem de estudos em modelos experimentais animais, principalmente em ratos e camundongos. Neste contexto, a administração de pilocarpina em roedores mimetiza a epilepsia (ELT) de humanos e recebe geralmente o nome de "modelo da pilocarpina". Esse modelo foi desenvolvido em 1983 por Turski e colaboradores, e é hoje um dos mais utilizados modelos de epilepsia, tendo em vista que suas características histológicas, bioquímicas, farmacológicas, eletrofisiológicas e comportamentais (Turski et al., 1983) reproduzem similarmente as encontradas em humanos portadores de ELT. [0009] O modelo da pilocarpina também é útil para evidenciar alterações nos receptores muscarínicos, como é o caso da salivação. A acetilcolina, através de seu receptor muscarínico (mAChRs) desempenha um papel importante nas funções cognitivas, tais como a aprendizagem e memória. Os mAChRs são receptores que formam complexos proteína-receptor G nas membranas celulares de certos neurónios e outras células. Eles desempenham vários papéis, incluindo atuar como o principal receptor final estimulado pela acetilcolina liberada a partir de fibras pós-ganglionares no sistema nervoso parassimpático.

[0010] Os receptores muscarínicos são assim chamados porque são mais sensíveis à muscarina do que à nicotina. Suas contrapartes são receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChRs), canais de íons receptores que também são importantes no sistema nervoso autónomo. Muitas drogas e outras substâncias (por exemplo, pilocarpina e escopolamina) manipulam estes dois receptores distintos atuando como agonistas ou antagonistas seletivos.

[0011] Os mAChRs estão entre os mais bem caracterizados dentre os receptores transmembranares (7TM), sendo amplamente expressos no sistema nervoso central (SNC). Cinco subtipos mAChR foram clonados (M1 , M2, M3, M4 e M5) e geralmente são divididos em duas classes distintas com base na transdução de sinal. mAChR M1 , M3 e M5 são subtipos que sinalizam através de proteínas Gq/1 1 e ativam a fosfolipase-C e mobilizam cálcio intracelular. Os mAChR M2 e M4, no entanto, predominam através de proteínas Gi/o inibindo a adenilato ciclase e reduzindo a concentração intracelular de AMPc. O mAChR predominante no SNC é o subtipo M1 , que está localizado no córtex, hipocampo, estriado e tálamo, onde é encontrado pós-sináptico. Os mAChR M2 estão localizados predominantemente no tronco encefálico e no tálamo, embora também no córtex, hipocampo e estriado, onde controlam a liberação de acetilcolina. Os MAChR de M3 e M5 são expressos em níveis muito mais baixos do que MAChRs M1 ou M2 no SNC, mas M3 MAChRs são encontrados no córtex e hipocampo, enquanto que M5 mAChRs têm uma localização muito discreta na substância negra. Os MAChR M4 são encontrados em muitas regiões do cérebro, incluindo o córtex e o hipocampo, mas são mais proeminentes no estriado, onde se pensa que eles desempenham um papel no controle da liberação de dopamina e modulem a atividade locomotora.

[0012] Dado o amplo e variado perfil de expressão dos mAChRs no SNC, não é surpreendente que todos os subtipos tenham sido avaliados como potenciais alvos de fármacos. Alguns desses alvos são bem aceitos na literatura, como o envolvimento do M1 na doença de Alzheimer, enquanto outros são relativamente novos, como o M5 que tem sido correlacionado à dependência e ao vício de drogas de abuso.

[0013] Os resultados dos testes apresentados no presente pedido de patente indicam que a composição da invenção interage com receptores canabinoides e/ou receptores muscarínicos. Os resultados mostram que o composto da invenção modula a ação de neurónios, sendo também neuroprotetor e anticonvulsivante.

[0014] Dados experimentais indicam que o composto da invenção interage com e/ou modula a atividade de receptores canabinoides (CB). O sistema canabinóide, que compreende os receptores CB1 e CB2 e seus ligantes endógenos, atua em diversas funções metabólicas, incluindo o controle de ingestão de alimentos, o metabolismo de energia e/ou de lipídeos, na regulação da motilidade intestinal, no sistema imune, no equilíbrio do ciclo do cálcio, entre outros. Os receptores canabinoides são amplamente expressos no cérebro, incluindo córtex, hipocampo, amígdala, pituitário e hipotálamo. Os receptores CB, particularmente CB1 , já foram identificados em inúmeros órgãos periféricos e tecidos, incluindo glândula tiroidal, glândula adrenal, órgãos reprodutivos, tecido adiposo, fígado, músculos e trato gastrointestinal.

[0015] Diversos compostos já foram detectados na técnica possuindo atividade de modulação desses receptores. Entre estes, alguns têm como alvo o desenvolvimento de fármacos para redução de peso e afinamento da cintura, como o rimonabanto. Entretanto, esse composto foi subsequentemente associado ao aumento da ocorrência de doenças psiquiátricas em humanos e foi removido do mercado mundial. [0016] As buscas de antecedentes revelaram documentos apenas parcialmente relevantes para a presente invenção. Tais documentos serão descritos abaixo, sendo os mesmos colocados aqui unicamente com o objetivo de servir de base ao estado da técnica atual, uma vez que nenhum deles antecipa ou sequer sugere qualquer dos objetos da presente invenção.

[0017] O documento US 2007/213302 apresenta compostos de interação com o receptor CB1 , consistindo de pirazóis e seus sais farmaceuticamente aceitáveis que atuam como antagonistas ou agonistas inversos do receptor CB1 . A presente invenção difere do referido documento, dentre outros motivos, por apresentar um composto que compreende um peptídeo, que não compreende pirazóis ou seus sais, e cujos resultados mostram-se surpreendentes, especialmente em relação à neuromodulação, neuroproteção e à inibição da ocorrência de convulsões, fatos não descritos e nem sugeridos no referido documento.

[0018] Alguns estudos apresentados por um dos presentes inventores em "Novel Natural Peptide Substrates for Endopeptidase 24.15 Neurolysin, and Angiotensin-converting Enzyme" (Vanessa Rioli, Fabio C. Gozzo, Andrea S. Heimann, Alessandra Linardi, José E. Krieger, Cláudio S. Shida, Paulo C. Almeida, Stephen Hyslop, Marcos N. Eberlin, Emer S. Ferro; 7 de Março de 2003) demonstram uma técnica eficaz de "triagem" de novos peptídeos. A presente invenção difere desse documento, dentre outras razões, por apresentar uma nova abordagem terapêutica para a neuromodulação, neuroproteção e/ou para as convulsões, cujos resultados mostraram-se surpreendentes.

[0019] O documento WO 2014/008567, de um dos presentes inventores, revela compostos e composições úteis para o tratamento desordens metabólicas compreendendo obesidade, diabetes, hipertensão arterial sistémica (ou doença, estado relacionado e/ou comorbidades associadas); prevenção de sobrepeso; regulação do apetite; indução de saciedade; prevenção de ganho de peso após perda de peso com sucesso; aumento do consumo de energia; redução de peso estética; ou bulimia. Nenhum relato ou sugestão de uso do composto da invenção como neuromodulador, neuroprotetor ou como anticonvulsivante é feito no referido documento, até porque esta abordagem não havia sido imaginada pelos inventores nem era óbvia do estado da técnica.

[0020] O documento WO 201 1 /01 1847 revela o uso da hemopressina para o tratamento da obesidade em um indivíduo e adicionalmente revela que hemopressina é um composto que se liga eficazmente ao receptor CB1 . A presente invenção difere do referido documento, dentre outros motivos, por proporcionar uma composição para outros usos terapêuticos, além de revelar outros compostos com atividade surpreendente. Além disso, os resultados de testes realizados pelos inventores mostraram-se surpreendentes, especialmente em relação à neuromodulação, neuroproteção e à inibição da ocorrência de convulsões, fatos não descritos e nem sugeridos no referido documento.

[0021] O documento WO 2013/021 196 revela o uso da hemopressina como agente que interfere na diferenciação de oligodentritos, sendo útil como agente anti-desmielinizante. A presente invenção difere do referido documento, dentre outros motivos, por proporcionar revelar outros compostos, outros usos e por proporcionar benefícios quando em comparação à hemopressina, incluindo mais facilidade de preparo, maior estabilidade e atividade, entre outras vantagens. Além disso, os resultados de testes realizados pelos inventores mostraram-se surpreendentes, especialmente em relação à neuromodulação, neuroproteção e/ou à inibição da ocorrência de convulsões com os compostos da invenção, que não são descritos nem sugeridos no referido documento.

[0022] Outras referências de literatura científica que circunscrevem a invenção, porém sem antecipá-la ou sugeri-la, incluem os seguintes documentos.

[0023] ASPRONI, B. et al. Novel pyrrolocycloalkylpyrazole analogues as CB1 ligands. Chemical Biology and Drug Design, p. 1 -13, 2017.

[0024] HILDEBRANDT, A. K. et al. Efficient computation of root mean square deviations under rigid transformations. Journal of Computational Chemistry, v. 35, p. 765-771 , 2014. [0025] HUA T. et al. Crystal structure of the human cannabinoid receptor CB1 . Celi, v. 167, p. 750-762, 2016.

[0026] MAIOROV, V. N.; CRIPPEN, G. M. Significance of root-mean-square deviation in comparing three-dimensional structures of globular proteins. Journal of Molecular Biology, v. 235, p. 625-634, 1994.

[0027] MORGAN, C. A.; HURLEY, T. D. Characterization of two distinct structural classes of selective aldehyde dehydrogenase 1 A1 inhibitors. Journal of Medicinal Chemistry, v. 58, p. 1964-1975, 2015.

[0028] PERTWEE, R. G. The diverse CB1 and CB2 receptor pharmacology of three plant cannabinoids: A9-tetrahydrocannabinol, cannabidiol and Δ9 - tetrahydrocannabivarin. British Journal of Pharmacology, v. 153, p. 199-215, 2008.

[0029] RAMACHANDRAN, G. N.; RAMAKRISHNAN, C; SASISEKHARAN, V. Stereochemistry of polypeptide chain configurations. Journal of Molecular Biology, v. 7, p. 95-99, 1963.

[0030] SANTOS, P. S. et al. Efeitos do ácido lipóico nas concentrações de glutamato e taurina no hipocampo de ratos após convulsões induzidas por pilocarpina. Arq. Neuro-Psiquiatr. [online]. 201 1 , vol.69, n.2b, pp.360-364. .

[0031] MUNRO et al. Nature 365:61 -65, 1993.

[0032] RINALDI-CARMONA M. et al. J. Pharmacol. Exp. Ther. 278:871 -878, 1996.

[0033] Langmead CJ1 , Watson J, Reavill C. Muscarinic acetylcholine receptors as CNS drug targets. Pharmacol Ther. 2008 Feb;1 17(2):232-43. Epub 2007 Dec 20.

[0034] Do que se depreende da literatura pesquisada, não foram encontrados documentos antecipando ou sugerindo os ensinamentos da presente invenção, muito menos seus surpreendentes efeitos técnicos, de forma que a solução aqui proposta, aos olhos dos inventores, possui novidade e atividade inventiva frente ao estado da técnica. Sumário da Invenção

[0035] A presente invenção vem resolver uma série de problemas conhecidos do estado da técnica como, por exemplo, proporcionar: um composto peptídico estável, um intermediário de síntese na preparação de compostos de interesse farmacêutico, uso do composto para preparar um ligante de interesse diagnóstico e/ou terapêutico, o uso para preparar um medicamento modulador do sistema canabinoide e/ou muscarínico, uma composição farmacêutica moduladora de funções metabólicas e/ou neuromoduladora contendo o referido composto; o uso do composto peptídico para a preparação de um medicamento para o tratamento curativo ou profilático de convulsões; uma entidade molecular que proporciona estes e/ou outros efeitos técnicos sem os inconvenientes decorrentes do uso das substâncias canabinoides como a prostração e sangramento nasal, dentre outros; uma composição farmacêutica útil como alternativa terapêutica para neuromodulação e/ou para prevenir ou tratar convulsões; um método terapêutico.

[0036] É, portanto, um dos objetos da presente invenção um composto peptídico com até 6 aminoácidos de fórmula:

R ₁ -N-AA ₁ -K-AA ₂ -R ₂

onde:

AA é um aminoácido selecionado do grupo que consiste de F, W, L, I, V, P, G; AA ₂ é hidrogénio ou um aminoácido selecionado do grupo que consiste de F, W, L, I, V, P, G;

Ri é hidrogénio, o aminoácido V, ou dipeptídeo PV; e

R ₂ é ausente quando AA ₂ é hidrogénio ou é hidrogénio, o aminoácido L, ou o dipeptídeo LS quando Ri é hidrogénio,

e/ou formas modificadas, cíclicas dos mesmos, versões amidadas, metiladas,

PEGiladas, seus sais; e/ou combinações dos mesmos.

[0037] Em uma concretização, AA é F, W ou L.

[0038] Em uma concretização, Ri e R ₂ são ambos hidrogénio.

[0039] Concretizações do composto peptídico da invenção úteis em seus vários objetos incluem um ou mais peptídeos selecionados do grupo que consiste de: NFK, NWK, NLK, NFKF, NWKF, NLKF, NFKW, NWKW, NLKW, NFKL, NWKL, NLKL, VNFK, VNWK, VNLK, NFKFL, NWKFL, NLKFL, NFKWL, NWKWL, NLKWL, NFKLL, NWKLL, NLKLL, VNFKF, VNWKW, VNLKL, VNFKFL, VNWKWL, VNLKLL, PVNFKF, PVNWKW, PVNLKL, NFKFLS, NWKWLS, NLKLLS, bem como formas modificadas, cíclicas, amidadas, metiladas, PEGiladas dos mesmos; seus sais ou combinações dos mesmos.

[0040] Em uma concretização, o composto peptídico da invenção é selecionado do grupo que compreende o tripeptídeo, NFK, o tetrapeptídeo NFKF, tetrapeptídeo NFKL, ou combinações dos mesmos.

[0041] O composto da invenção proporciona melhor estabilidade e/ou facilidade de manipulação, sendo particularmente útil em preparações farmacêuticas e de medicamentos.

[0042] O composto da invenção proporciona também a administração oral a um animal mamífero.

[0043] O composto da invenção, entre outras, proporciona vantagens na administração, biodisponibilização e/ou ação terapêutica em um animal quando comparado a outros peptídeos, como por exemplo a hemopressina e variantes conhecidos, usualmente de maior tamanho.

[0044] É um outro objeto da invenção proporcionar um composto substituto ao canabidiol e que proporciona vantagens na produção, manipulação, uso e segurança, podendo substituí-lo em todas ou quase todas as aplicações já descritas para o mesmo.

[0045] É um outro objeto da invenção proporcionar um composto útil para modular receptores muscarínicos e/ou o sistema canabinóide, seja pela modulação do receptor CB1 , do receptor CB2, de ambos concomitantemente, pela modulação da ligação ou da ação de outras substâncias que interagem no sistema canabinóide, pela modulação de proteases ou peptidases que levam à geração ou degradação de peptídeos ativos no sistema canabinóide, ou combinações dos mesmos.

[0046] É outro dos objetos da presente invenção um intermediário de síntese na preparação de compostos de interesse farmacêutico que compreendem o composto descrito acima e podem incluir modificações químicas, substituições, inclusão de outros grupos funcionais.

[0047] É outro dos objetos da presente invenção o uso do composto descrito acima para a preparação de outros compostos de interesse farmacêutico, referidos compostos compreendendo o composto descrito acima e modificações químicas, substituições, outros grupos funcionais.

[0048] É outro dos objetos da presente invenção o uso do composto definido acima para a preparação de uma composição farmacêutica moduladora de receptores canabinóides, sendo útil na modulação de funções metabólicas de um mamífero.

[0049] É um outro objeto da presente invenção o uso do composto definido acima para a preparação de um medicamento neuromodulador, neuroprotetor e/ou para o tratamento curativo ou profilático de convulsões em um mamífero.

[0050] A administração do composto da invenção a um mamífero proporciona atividade neuromoduladora, neuroprotetora e/ou anticonvulsivante; viabiliza administração oral em animais; não tem ou acarreta os inconvenientes decorrentes da produção, armazenamento, transporte e uso de substâncias canabinóides, além de proporcionar adicionais vantagens na preparação de produtos terapêuticos para mamíferos, em sua administração e/ou efeitos.

[0051] Além disso, a administração do composto da invenção a um animal proporciona importantes e surpreendentes vantagens técnicas, incluindo superior atividade anticonvulsivante em relação à hemopressina, cujo uso como anticonvulsivante é objeto do pedido de patente co-pendente dos mesmos inventores.

[0052] É um outro objeto da presente invenção um método terapêutico para modulação metabólica e/ou neuromodulação compreendendo a administração a um animal do peptídeo descrito acima.

[0053] É um outro objeto da invenção uma composição farmacêutica neuromoduladora, neuroprotetora e/ou para o tratamento curativo ou profilático de convulsões em um mamífero, referida composição compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável; e, como princípio ativo, o composto descrito acima.

[0054] Em uma concretização, a composição farmacêutica se apresenta na forma de tablete, comprimido, gel, líquido oral ou xarope, cápsula, supositório, solução injetável ou formas inaláveis ou em adesivo, podendo opcionalmente compreender outros princípios ativos.

[0055] Estes e outros objetos do presente pedido de patente serão imediatamente valorizados pelos versados na arte e pelas empresas com interesses no segmento, e serão descritos em detalhes suficientes para sua reprodução na descrição a seguir.

Breve Descrição das Figuras

[0056] A descrição detalhada a seguir e as figuras em anexo ilustram as principais características e concretizações da presente invenção, apresentadas detalhadamente para dar melhor suporte ao técnico no assunto e para que o mesmo possa entender e reproduzir o conceito inventivo da invenção em qualquer de suas concretizações. Tais detalhes ou figuras não devem ser entendidos de forma limitativa e servem somente para ilustrar algumas das concretizações da presente invenção.

[0057] A figura 1 mostra os resultados de testes comparativos de estabilidade do composto da invenção vs Hp (PVNFKFLSH). Os dados do gráfico mostram os resultados da medida de concentração de cada um destes ativos por HPLC, após congelamento por 24h ou, separadamente, após aquecimento a 100 ^° C por 10 minutos (n=2). Os dados de significância estatística são também mostrados, os asteriscos indicando: ( ^* ) P<0.05 vs Controle ( ^*** ) P<0.005 vs Controle; ( ^**** ) P<0.0001 vs Controle.

[0058] A figura 2 apresenta os resultados de testes de neuroproteção com o com o composto da invenção NFKF no modelo de pilocarpina, sendo indicado o perfil de sobrevivência/morte dos animais mediante a administração do peptídeo da invenção. Em A) é mostrado o perfil de sobrevivência dos animais aos quais foi administrado o controle (apenas salina); Em B) é mostrado o perfil de sobrevivência dos animais aos quais foi administrado o canabidiol 30mg/kg; Em C) é mostrado o perfil de sobrevivência dos animais aos quais foi administrado o composto da invenção NFKF 50C^g/kg; Em D) são mostrados todos os perfis em um só gráfico. Interessante notar que no grupo tratado com o neuromodulador da invenção NFKF 500 μg/kg apenas dois animais que morreram. Os demais animais do grupo tratado com o peptídeo da invenção, no total de 3, seguiram vivos por mais de uma semana, enquanto praticamente todos os demais morreram em menos de 30 minutos. Consequentemente, o tempo médio de sobrevida para este grupo é significativamente diferente e muito maior do que o dos demais. Ademais, quando se compara o grupo ao qual foi administrado o composto invenção NFKF (500 μg/kg) com o grupo ao qual foi administrado o canabidiol (30mg/kg) destaca-se que a sobrevivência é três vezes maior no primeiro grupo, ou seja, no grupo ao qual foi administrado o composto invenção NFKF 500 μg/kg, mesmo usando uma concentração relativa de composto 60 vezes menor.

[0059] A figura 3 apresenta os resultados de testes do composto da invenção NFKF no modelo de pilocarpina, sendo indicado o tempo para a ocorrência da primeira salivação com a administração de controle, canabidiol (30mg/kg), ou o composto da invenção NFKF (500μg/kg). Os dados entre controle e demais compostos teste não apresentem significância estatística entre si nas condições testadas.

[0060] A figura 4 apresenta os resultados de testes do composto da invenção NFKF como anticonvulsivante no modelo de pilocarpina, sendo indicado o tempo para a ocorrência da primeira convulsão com a administração de canabidiol (30mg/kg) ou o peptídeo da invenção NFKF (500μg/kg). Os asteriscos indicam a significância estatística: ( ^** ) P<0.02 vs Controle; ( ^*** ) P<0.002 vs Controle.

[0061] A figura 5 apresenta os resultados de testes do composto da invenção NFKF comparativamente aos resultados de testes da hemopressina, ambos no modelo de pilocarpina. São apresentados os tempos para a ocorrência da primeira salivação com a administração das seguintes doses de tratamento: o controle (salina); hemopressina (Hp ou PVNFKFLSH, 0,551334 μιηοΙ/kg); hemopressina (0,91889 μιηοΙ/kg); o composto da invenção NFKF (0,540882 μηποΙ/kg); NFKF (0,901469 μηποΙ/kg); o composto PEP-19 (DIIADDEPLT, 0,9081 17 μιηοΙ/kg). Os asteriscos indicam a significância estatística: ( ^* ) P<0.05 vs Controle; ( ^** ) P<0.01 vs Controle; o sinal + indica P<0.05 vs Hp 0,91889 μιηοΙ/kg.

[0062] A figura 6 apresenta os resultados de testes do composto da invenção NFKF como anticonvulsivante comparativamente aos resultados de testes da hemopressina como anticonvulsivante, ambos no modelo de pilocarpina. São apresentados os porcentuais do tempo (em relação ao controle) para a ocorrência da primeira convulsão com a administração das seguintes doses de tratamento: o controle (salina); hemopressina (Hp ou PVNFKFLSH, 0,551334 μιηοΙ/kg); hemopressina (0,91889 μιηοΙ/kg); o composto da invenção NFKF (0,540882 μη-iol/kg); NFKF (0,901469 μη-ιοΙ/kg); o composto PEP-19 (DIIADDEPLT, 0,9081 17 μιηοΙ/kg). Os asteriscos indicam a significância estatística: ( ^* ) P<0.05 vs Controle; ( ^** ) P<0.01 vs Controle; o sinal + indica P<0.05 vs Hp 0,91889 μη-ιοΙ/kg.

[0063] A figura 7 apresenta uma visão geral da estrutura tridimensional de um GPCR, neste caso, o receptor canabinóide do subtipo 1 . Em destaque as sete hélices transmembranares (l-VII), as alças intracelulares (ICL1 e ICL2) e, as alças extracelulares (ECL2 e ECL3).

[0064] A figura 8 mostra a sobreposição da estrutura de AM6538 da estrutura cristalográfica (PDB 5TGZ), e o resultado obtido após a validação pela função Goldscore (quando a figura aparece colorida, a estrutura cristalográfica está em roxo e o resultado da função Goldscore em azul/ciano, embora para fins deste pedido de patente tais cores sejam irrelevantes).

[0065] A figura 9 mostra as principais interações observadas para AM6538 no sítio de ligação do receptor CB1 .

[0066] A Figura 10 mostra as principais interações observadas para o rimonabanto no sítio de ligação do receptor CB1 . [0067] A Figura 1 1 mostra as principais interações observadas para o canabidiol no sítio de ligação do receptor CB1 .

[0068] A Figura 12 mostra as principais interações observadas para o peptídeo da invenção NFKF no sítio de ligação do receptor CB1 .

[0069] A Figura 13 mostra os resultados do processo de obtenção de estrutura do receptor CB2. Em A) é mostrada a estrutura tridimensional do receptor CB2 obtida; em B) é mostrado o Gráfico de Ramachandran para o modelo de CB2 humano obtido.

[0070] A figura 14 mostra as principais interações entre o receptor CB2 e o ligante AM6538.

[0071] A Figura 15 mostra as principais interações entre o receptor CB2 e o rimonabanto.

[0072] A Figura 16 mostra as principais interações entre o receptor CB2 e o canabidiol.

[0073] A Figura 17 mostra as principais interações entre o receptor CB2 e o tetrapeptídeo NFKF.

Descrição Detalhada da Invenção

[0074] O composto da invenção demonstrou diversas utilidades e resultados surpreendentes em testes in vitro e in vivo. O composto da invenção é útil para a preparação de outros compostos de interesse farmacêutico. O composto da invenção é útil para a preparação de uma composição farmacêutica. A composição farmacêutica da invenção é moduladora de receptores canabinóides e/ou muscarínicos, sendo particularmente útil na modulação de funções metabólicas e/ou na neuromodulação de um animal mamífero.

[0075] O conceito inventivo comum aos diversos objetos da invenção é o uso de um composto com até 6 aminoácidos de fórmula:

R ₁ -N-AA ₁ -K-AA ₂ -R ₂

onde:

AAi é um aminoácido selecionado do grupo que consiste de F, W, L, I, V, P, G; AA ₂ é hidrogénio ou um aminoácido selecionado do grupo que consiste de F, W, L, I, V, P, G;

Ri é hidrogénio, o aminoácido V, ou dipeptídeo PV; e

R ₂ é ausente quando AA ₂ é hidrogénio ou é hidrogénio, o aminoácido L, ou o dipeptídeo LS quando Ri é hidrogénio, e/ou formas modificadas, cíclicas dos mesmos, versões amidadas, metiladas, PEGiladas, seus sais; e/ou combinações dos mesmos para a preparação de uma composição de interesse farmacêutico.

[0076] Para fins da presente invenção as seguintes definições são utilizadas:

[0077] Composto de interesse farmacêutico

[0078] No contexto do presente pedido de patente, deve-se entender "composto de interesse farmacêutico" qualquer entidade molecular que compreenda o composto descrito como conceito inventivo comum ao presente pedido de patente, incluindo também entidades moleculares obtidas mediante derivatização química do mesmo, com a inclusão de outros grupos funcionais, cadeias laterais lineares ou ramificadas, alteração de hidrofilicidade ou hidrofobicidade, entre outras, desde que compreendam como núcleo a entidade R1-N-AA1-K-AA2-R2 conforme definido acima, excetuando-se as entidades naturais e já conhecidas.

[0079] Composição farmacêutica

[0080] No contexto do presente pedido de patente, deve-se entender "composição farmacêutica" como toda e qualquer composição que contenha um princípio ativo, com fins profiláticos, paliativos e/ou curativos, atuando de forma a manter e/ou restaurar a homeostase, podendo ser administrada de forma oral, tópica, parenteral, enteral e/ou intratecal.

[0081] Formulação farmaceuticamente aceitável

[0082] No contexto do presente pedido de patente, deve-se entender "formulação farmaceuticamente aceitável" uma formulação contendo excipientes e carreadores farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos por técnicos no assunto, como é o desenvolvimento de doses e tratamentos convenientes para uso em composições particulares que podem ser descritas em uma série de regimentos de tratamento, incluindo oral, parenteral, intravenoso, intranasal, intravítreo e intramuscular, intracerebral, intracerebroventricular e intraocular e sua administração e/ou formulação.

[0083] Peptídeo modificado

[0084] No contexto do presente pedido de patente, deve-se entender "peptídeo modificado" como um peptídeo não natural, modificado artificialmente ou obtido por síntese, incluindo os ciclizados, amidados, metilados, PEGilados, ou suas formas de sal, bem como um peptídeo compreendendo um ou mais aminoácido não natural, como as formas d-aminoácido. O composto peptídico pode ser peguilado utilizando as técnicas conhecidas pelos versados na arte, como, por exemplo, a peguilação com reagentes contendo o grupamento succinimidil, os quais reagem preferencialmente com aminas primárias presentes na região N- terminal do peptídeo.

[0085] Peptídeo cíclico ou circular

[0086] No contexto do presente pedido de patente, deve-se entender "peptídeo cíclico, ciclizado ou "circular" como um peptídeo que teve uma ligação covalente entre as duas extremidades de uma molécula linear de peptídeo através de qualquer método conhecido da técnica, particularmente pela atividade de enzimas. O peptídeo cíclico pode ser utilizado em substituição ao peptídeo linear devido ao fato de ser mais difícil de ser degradado, já que suas extremidades ou zonas de ataque por enzimas hidrolisantes não estão tão expostas quanto em um peptídeo linear.

[0087] Aqonista

[0088] No contexto do presente pedido de patente, deve-se entender "agonista" como um fármaco, droga, hormônio, neurotransmissor ou outra molécula sinalizadora que forma um complexo com um sítio receptor, dessa forma acionando uma resposta ativa de uma célula.

[0089] Aqonista inverso / antagonista

[0090] No contexto do presente pedido de patente, deve-se entender "agonista inverso ou antagonista" como agente(s) (por exemplo: fármacos, drogas, hormônios ou enzimas) que se liga(m) aos receptores dos agonistas e produz(em) efeitos farmacológicos opostos aos dos agonistas, de tal forma que a ação de um inibe parcialmente ou totalmente o efeito da outra. Particularmente, um composto é um agonista inverso quando atua na presença de um agonista, mas reduzindo sua atividade; um antagonista é um composto que bloqueará totalmente a atividade do agonista.

[0091] Dose Equivalente em Humanos

[0092] Na presente invenção, o conceito de "dose equivalente em humanos" é a dose na qual, em humanos, se espera a mesma magnitude de efeitos observada em animais numa dada dose, conforme preconiza o "Guidance for Industry Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinicai Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers" publicado pelo U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration Center for Drug Evaluation and Research (CDER), July 2005 Pharmacology and Toxicology. No referido guia, a conversão de dose observada em animais (mg/kg) para Dose Equivalente em Humanos (mg/kg) implica na divisão do resultado obtido em ratos por 6,2 e do resultado obtido em camundongos por 12,3. Esse valores são aplicáveis a um humano com 60 kg de peso padrão. Para outras espécies ou para pesos fora das faixas de peso padrão, a Dose Equivalente em Humanos (DEH) pode ser calculada pela fórmula: DEH = dose no animal em mg/kg x (peso do animal em kg/peso do humano em kg) ^{0 33} . O referido Guidance considera adequada uma faixa de segurança de 10 vezes os limites de concentração testados.

[0093] Modular a função de receptor CB ou do sistema canabinóide

[0094] No contexto do presente pedido de patente, deve-se entender "modular a função de receptor CB" como uma interação que acarreta na alteração da atividade bioquímica do receptor CB, particularmente CB1 ou CB2. Entende-se que a alteração é positiva quando ocorre um efeito antagonista ou agonista inverso nos receptores CB e que a alteração é negativa quando ocorre um efeito agonista nos receptores CB. Os testes apresentados no presente pedido de patente sugerem que o composto da invenção interage com e/ou modula o receptor CB1 e/ou o receptor CB2, provavelmente como um modulador alostérico do receptor CB1 e/ou CB2. Assim o composto da invenção é útil para modular o sistema canabinóide, seja pela modulação do receptor CB1 , do receptor CB2, de ambos concomitantemente, pela modulação da ligação ou da ação de outras substâncias que interagem no sistema canabinóide, pela modulação de proteases ou peptidases que levam à geração ou degradação de peptídeos ativos no sistema canabinóide, ou combinações dos mesmos.

[0095] Modular a função de receptores muscarínicos

[0096] No contexto do presente pedido de patente, deve-se entender "modular a função de receptores muscarínicos" como uma interação que acarreta alterações neuronais, incluindo receptor muscarínico de acetilcolina (mAChRs), que desempenha um papel importante nas funções cognitivas, tais como a aprendizagem e memória, controle da liberação de dopamina, modulação da atividade locomotora, sua modulação sendo também útil no controle da doença de Alzheimer e/ou controle da dependência ou vício de drogas de abuso. Entende-se que a alteração é positiva quando ocorre um efeito antagonista ou agonista inverso nos receptores muscarínicos e que a alteração é negativa quando ocorre um efeito agonista nos receptores muscarínicos. Os testes apresentados no presente pedido de patente sugerem que o composto da invenção interage com e/ou modula receptores muscarínicos.

[0097] Modulação de funções metabólicas

[0098] No contexto do presente pedido de patente, deve-se entender esta expressão como incluindo a modulação de: metabolismo de energia e/ou de lipídeos; hipertensão arterial, regulação da motilidade intestinal; sistema imune; equilíbrio do ciclo do cálcio, condições associadas à glândula tiroidal, órgãos periféricos e tecidos, incluindo órgãos reprodutivos, tecido adiposo, fígado, músculos e trato gastrointestinal, sendo útil no tratamento de obesidade, diabetes, doenças ou distúrbios imunes/inflamatórios, osteopenia, osteoporose, câncer.

[0099] Neuromodulador

[0100] No contexto do presente pedido de patente, deve-se entender por "neuromodulador" ou "neuromoduladora" a função de modular a função neuronal/neurológica, incluindo a modulação da atividade cerebral, do córtex, hipocampo, amígdala, pituitário, hipotálamo; glândula adrenal. A neuromodulação inclui a modulação benéfica de neuroproteção contra agentes ou condições que levam a processos fisiopatológicos. Agentes ou compostos neuroprotetores são preferencialmente usados antes da (ou durante a) fase prodrômica das doenças, o que muitas vezes tem início muitos anos antes do surgimento dos sintomas. Na presente invenção, um neuromodulador é potencialmente útil no tratamento curativo ou profilático de diversas condições ou doenças neurológicas, incluindo tremor essencial, enxaqueca, dor neuropática, transtornos psiquiátricos como ansiedade, esquizofrenia ou transtorno bipolar, Alzheimer, Parkinson, autismo, sendo também potencialmente útil na modificação dos processos fisiopatológicos envolvidos na ocorrência de convulsões e/ou epilepsia, bem como em outras condições clínicas relacionadas a distúrbios da excitabilidade neuronal ou de lesões neuronais decorrentes de isquemia, hipoxia ou outras condições danosas.

[0101] Embora nesta invenção seja demonstrado que o referido composto se liga e/ou modula receptores canabinóides, a surpreendente ação farmacêutica da invenção pode estar ligada à ação sobre CB1 e/ou CB2 e/ou muscarínicos ou eventualmente estar ligada à modulação do uptake de adenosina, do GGPR55, de receptores PPARy, do nível de cálcio intracelular ou combinações destes. Assim, qualquer indicação terapêutica relacionada a estes alvos pode se beneficiar da presente invenção.

[0102] A presente invenção é também definida pelas seguintes cláusulas.

[0103] Uso do composto descrito acima.

[0104] Uso conforme descrito acima em que AAi e/ou AA ₂ é F, W ou L.

[0105] Uso conforme descrito acima em que o referido peptídeo é selecionado do grupo consiste de: NFK, NWK, NLK, NFKF, NWKF, NLKF, NFKW, NWKW, NLKW, NFKL, NWKL, NLKL, VNFK, VNWK, VNLK, NFKFL, NWKFL, NLKFL, NFKWL, NWKWL, NLKWL, NFKLL, NWKLL, NLKLL, VNFKF, VNWKW, VNLKL, VNFKFL, VNWKWL, VNLKLL, PVNFKF, PVNWKW, PVNLKL, NFKFLS, NWKWLS, NLKLLS, bem como formas modificadas, cíclicas, amidadas, metiladas e/ou PEGiladas dos mesmos; seus sais; ou combinações dos mesmos.

[0106] Intermediário de síntese na preparação de compostos de interesse farmacêutico compreendendo o composto descrito acima.

[0107] Uso do composto descrito acima como intermediário de síntese na preparação de outros compostos de interesse farmacêutico.

[0108] O composto descrito acima, com modificado.

[0109] Uso do composto descrito acima para preparação de uma composição farmacêutica moduladora do sistema canabinóide e/ou de receptores muscarínicos.

[0110] Uso do composto descrito acima para preparação de uma composição farmacêutica moduladora de funções metabólicas.

[0111] Uso do composto descrito acima para a preparação de um medicamento modulador de funções metabólicas, neuromodulador, neuroprotetor e/ou curativo ou profilático de convulsões em um mamífero em um mamífero.

[0112] Uso do composto descrito acima para a preparação de um ligante de interesse diagnóstico em um mamífero.

[0113] Composição farmacêutica moduladora de funções metabólicas em um mamífero compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável; e, como princípio ativo, o composto descrito acima.

[0114] Composição farmacêutica neumoduladora curativa ou profilática em um mamífero compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável; e, como princípio ativo, o composto descrito acima.

[0115] Composição farmacêutica para o tratamento curativo ou profilático de convulsões em um mamífero compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável; e, como princípio ativo, o composto descrito acima.

[0116] Composição farmacêutica neuromoduladora compreendendo o tripeptídeo NFK, o tetrapeptídeo NFKF, o tetrapeptídeo NFKL, ou combinações dos mesmos. [0117] Composição farmacêutica conforme descrito acima na forma de tablete, comprimido, gel, líquido oral ou xarope, cápsula, supositório, solução injetável, forma inalável ou em adesivo.

[0118] Método terapêutico modulador de funções metabólicas de um animal, compreendendo a administração do peptídeo descrito acima. Particularmente para esta aplicação, o peptídeo da invenção é preferencialmente modificado para que seu peso molecular seja maior, minimizando ou impedindo a passagem do mesmo pela barreira hematoencefálica.

[0119] Método terapêutico para a neuromodulação, neuroproteção e/ou tratamento curativo ou profilático de convulsões compreendendo a administração, a um animal, do composto descrito acima.

[0120] Testes in vitro e in silico mostraram que o composto da invenção proporciona vantagens na preparação de composições farmacêuticas, em sua estabilidade, na ligação a receptores canabinóides CB1 e/ou CB2.

[0121] O composto da invenção mostrou-se muito mais estável que a hemopressina, que ademais acarreta os problemas técnicos de formação de fibra ou fibrilas, assim como ocorre com seus variantes maiores conhecidos.

[0122] Testes in vivo em mamíferos mostraram excelente efeito terapêutico a baixas dosagens, sem indícios de efeitos colaterais importantes.

[0123] O efeito neuromodulador/neuroprotetor é evidenciado pela ausência sintomas, danos cerebrais e mortes associadas à administração de substâncias reconhecidamente danosas, como é o caso da pilocarpina.

[0124] Em uma concretização, a invenção proporciona o uso do referido composto para a preparação de um medicamento neuromodulador, neuroprotetor e/ou para o tratamento curativo ou profilático de convulsões em um mamífero. A administração, a um animal, do composto da invenção proporciona atividade neuromoduladora, neuroprotetora e/ou anticonvulsivante; viabiliza administração oral; não tem ou acarreta os inconvenientes decorrentes da produção, armazenamento, transporte e uso de substâncias canabinóides, além de proporcionar adicionais vantagens na preparação de produtos terapêuticos para mamíferos, em sua administração e/ou efeitos. Além disso, a administração do composto da invenção a um animal proporciona importantes e surpreendentes vantagens técnicas, incluindo superior atividade anticonvulsivante em relação à hemopressina, cujo uso como anticonvulsivante é objeto do pedido de patente co-pendente dos mesmos inventores.

[0125] A presente invenção descreve o uso de um composto para a preparação de composições farmacêuticas úteis para um variado conjunto de condições médicas, incluindo aquelas relacionadas ao sistema nervoso central. Surpreendentemente, embora o composto ativo da invenção seja peptídico ou predominantemente peptídico, a administração oral proporcionou efeitos cerebrais em animais.

[0126] Em uma concretização, testes in vivo com a composição da invenção demonstraram resultados surpreendentes quanto à sua atividade neuroprotetora. A composição da invenção, quando administrada previamente a animais, proporcionou surpreendente, potente e longa proteção contra danos decorrentes da subsequente administração de substâncias sabidamente danosas aos neurónios. Assim sendo, a neuroproteção proporcionada pelo composto da invenção é particularmente útil como alternativa terapêutica para diversas condições médicas, incluindo aquelas relacionadas a distúrbios de excitabilidade neuronal, como, por exemplo, as convulsões.

[0127] Em várias concretizações, testes in vivo com o composto da invenção demonstraram resultados surpreendentes quanto à sua atividade anticonvulsivante. O composto da invenção, quando usado como anticonvulsivante, adicionalmente proporciona a vantagem de ser um bom candidato a substituto dos compostos canabinoides conhecidos por sua atuação como anticonvulsivantes, como é o caso o Canabidiol. O Canabidiol, apesar de seus efeitos comprovados como anticonvulsivante, tem enfrentando problemas regulatorios devido à sua origem, a planta Cannabis sativa. A presente invenção proporciona uma adicional abordagem terapêutica para os pacientes que sofrem de convulsões e que têm dificuldade de obter medicamentos, sendo baseada em um peptídeo, ou seja, não usa derivados da Cannabis sativa. Além disso, os resultados mostraram que o composto da invenção, quando usado como anticonvulsivante, proporciona outras surpreendentes vantagens técnicas no uso, incluindo maior efeito terapêutico, uso oral, menor dosagem, menor ocorrência de efeitos colaterais como a prostração e sangramento nasal, dentre outras vantagens técnicas.

[0128] Nos testes com modelo experimental de convulsão, a administração da composição farmacêutica da invenção a mamíferos resultou em excelente efeito terapêutico em baixas dosagens, quando comparado às dosagens de um composto de referência, o canabidiol. Além disso, os resultados de testes mostraram que a composição da invenção proporciona surpreendentes vantagens técnicas no uso, incluindo maior efeito terapêutico, viabilidade de uso oral, desnecessidade de usar óleo como veículo (que em muitos casos causa efeitos colaterais), menor dosagem e menor ocorrência de efeitos colaterais como a prostração e sangramento nasal, entre outros.

[0129] Testes comparativos in vivo demonstram que o composto da invenção tem atividade superior e/ou requer menor dosagem que a hemopressina, cujo uso como anticonvulsivante é objeto do pedido de patente co-pendente dos mesmos inventores.

[0130] A composição farmacêutica da invenção é também útil para o tratamento de doenças associadas à modulação da atividade do sistema canabinóide, de receptores canabinóides (CB) e/ou muscarínicos - com diversas vantagens técnicas e sem que ocorram efeitos indesejáveis conhecidos dos congéneres disponíveis no estado da técnica.

[0131] Na presente invenção, o composto conforme descrito acima é útil para a preparação de um medicamento modulador de funções metabólicas.

[0132] Na presente invenção, o composto conforme descrito acima é útil para a preparação de um medicamento neuromodulador, neuroprotetor e/ou de um medicamento para o tratamento de convulsões.

[0133] Adicionalmente, conforme será demonstrado nos exemplos a seguir, o uso do composto da invenção na preparação de um medicamento neuromodulador, neuroprotetor e/ou anticonvulsivante proporciona a obtenção de um medicamento administrável oralmente a um mamífero. Os resultados dos testes revelaram importante ação cerebral, sugerindo que a administração do composto da invenção proporciona que o elemento ativo ultrapasse a barreira hematoencefálica. Assim, os resultados mostram/suportam o uso do composto da invenção independentemente de o composto de invenção ser o ativo que atua diretamente no alvo, ou seja, não se degradando durante a ingestão oral, ou de o composto ser um precursor que, após modificação química pós-administração, atua no alvo - neste caso, se caracterizando como pró-droga. Essa característica de proporcionar importantes efeitos mesmo mediante administração oral é particularmente desejável, uma vez que as enzimas naturais de um mamífero em geral degradam peptídeos e proteínas quando no trato digestivo e raramente um medicamento com um ativo peptídico se mostra viável. Entretanto, de forma surpreendente, o composto da invenção - mesmo quando administrado pela via oral - proporciona forte ação terapêutica, neste caso ainda mais surpreendentemente, atuando no cérebro.

[0134] Portanto, independentemente do mecanismo de ação, o qual não é objeto do presente pedido de patente, o fato de a administração oral da composição farmacêutica da invenção ter proporcionado importante ação neuromoduladora, neuroprotetora e anticonvulsivante e mesmo evitar mortes, mostra com clareza a surpreendente magnitude e relevância dos problemas técnicos resolvidos.

[0135] O presente pedido de patente revela uma composição farmacêutica que compreende o composto descrito acima. A referida composição farmacêutica compreende também um veículo farmaceuticamente aceitável, opcionalmente compreendendo também outros ativos e/ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos. O composto da invenção é o ou um componente ativo da composição farmacêutica da invenção, que é administrada na forma de tablete, gel, cápsula, líquido oral ou xarope, supositório, solução injetável ou outras formas de administração adequadas para fins farmacêuticos e médicos.

[0136] Os exemplos a seguir mostrados têm o intuito somente de exemplificar algumas das diversas maneiras de se concretizar a invenção, contudo, sem limitar o escopo da mesma. [0137] Testes comparativos mostraram que o composto da invenção mostrou superior estabilidade in vitro em extremos de temperatura quando comparado à hemopressina.

[0138] Em alguns exemplos, foram avaliados in vivo os efeitos neuromoduladores/neuroprotetores/anticonvulsivantes da composição da invenção mediante a administração oral a animais. A composição farmacêutica da invenção foi administrada a mamíferos {Mus musculus ou camundongo) com dose oral de tratamento com diferentes concretizações do composto da invenção, comparativamente a outros compostos ou ao controle com salina. Nestes experimentos, os compostos-teste foram administrados oralmente 10 minutos antes da administração (intraperitoneal) da pilocarpina. O hidrocloreto de pilocarpina (320 mg/kg, Merck), dissolvido em 0,9% de salina estéril, foi administrado de forma intraperitoneal para indução do SE {status epileticus) (Turski et al., 1983). No modelo de Turski, os efeitos neurotóxicos iniciam-se cerca de 15-25 minutos após a injeção de Pilo, com a ocorrência de crises convulsivas motoras e límbicas, os animais evoluindo para um estado de crises contínuas (clônicas) que caracterizam o SE (Sanabria e Cavalheiro, 2000).

[0139] Testes comparativos mostraram também que o composto desta invenção mostrou superior atividade terapêutica in vivo quando comparado à hemopressina, cujo uso como anticonvulsivante é objeto do pedido de patente co-pendente dos mesmos inventores.

[0140] Diante dos surpreendentes resultados obtidos mediante a administração in vivo de diferentes concretizações do composto da invenção, em outros exemplos foram avaliadas in vitro e in silico as formas de ligação do composto da invenção aos receptores CB1 e CB2.

Exemplos

[0141] Exemplo 1. Testes de estabilidade em condições extremas

[0142] Nesta concretização, a estabilidade do composto da invenção foi comparada à da hemopressina (Hp, PVNFKFLSH) em condições extremas. A Hp sabidamente tem o problema de formação de fibrilas, assim como os variantes da mesma que têm um número maior de aminoácidos. Amostras de NFKF e de Hp foram submetidas a dois testes separados, o da estabilidade mediante congelamento por 24h e mediante aquecimento a 100 ^° C por 10 minutos.

[0143] Os resultados da figura 1 mostram que, mediante congelamento por 24h, significante parte da Hp é perdida ou degradada (de 140 para 97, ou seja, aproximadamente 31 %), conforme evidenciam as medidas por HPLC (coluna analítica de 2.1 mm, com corrida em gradiente de 10-60%B. O solvente A é água/0.1 %TFA e o solvente B é acetonitrila/0,075%TFA). O composto da invenção na concretização NFKF, por outro lado, seguiu muito mais estável e sofreu substancialmente menos degradação (de 120 para 100, ou seja, 16,7%). Os resultados da figura 1 mostram também que mediante aquecimento a 100 ^° C por 10 minutos, ainda mais significante parte da Hp é perdida ou degradada (de 140 para 50, ou seja, aproximadamente 64,3%), conforme evidenciam as medidas por HPLC. O composto da invenção na concretização NFKF, por outro lado, seguiu estável não sofreu degradação estatisticamente significante.

[0144] Em conjunto, esses dados mostram que o composto da invenção proporciona muito maior estabilidade e menor degradação em condições extremas de temperatura, o que o favorece na manipulação, galênica, preparações medicamentosas e na estabilidade do produto farmacêutico tanto na fase pós-obtenção do princípio ativo, quanto na produção industrial de medicamentos e, não menos importante, na cadeia logística de transporte. Os dados sugerem que o tempo de prateleira do produto farmacêutico contendo o composto da invenção devem ser maiores que os congéneres contendo Hp ou outros ativos com problemas de instabilidade.

[0145] Exemplo 2. Uso do composto R -N-AA -K-AA2-R2 para a preparação de composição farmacêutica

[0146] Nesta concretização, o composto R -N-AA -K-AA ₂ -FÍ2 é o tetrapeptídeo NFKF, que foi sintetizado por síntese química. Referido peptídeo foi utilizado na preparação de uma composição farmacêutica líquida de uso oral compreendendo entre 2,7x10 ^"4 Molar do referido peptídeo e um veículo farmaceuticamente aceitável. Nesta concretização, o referido veículo é solução salina, a composição farmacêutica sendo uma solução de uso oral. Referida composição foi utilizada para a administração oral in vivo a mamíferos conforme exemplos 3 -6 a seguir.

[0147] Em outras concretizações, a composição farmacêutica se apresenta na forma de tablete, gel, líquido oral ou xarope, cápsula, supositório, solução injetável ou formas inaláveis ou em adesivo, opcionalmente compreendendo outros princípios ativos.

[0148] Exemplo 3. Composição farmacêutica neuromoduladora compreendendo o composto NFKF - resultados de testes in vivo

[0149] Nesta concretização, o efeito neuromodulador da composição da invenção preparada de acordo com o exemplo 2 foi avaliado mediante prévia administração da composição invenção e subsequente administração de pilocarpina a animais. Outros compostos-teste também foram avaliados conforme descrito a seguir. A administração de pilocarpina leva a lesões encefálicas severas, neurotoxicidade e normalmente culmina na morte dos animais. Esta substância foi usada nos experimentos descritos a seguir, porém seus efeitos neuronais/encefálicos danosos foram inibidos pela prévia administração da composição da presente invenção: a vasta maioria dos animais submetidos a estes experimentos não apresentou sintomas relacionados às lesões cerebrais e sobreviveu sem danos aparentes, em contraste aos grupos de animais tratados com outras substâncias conhecidas.

[0150] A composição da invenção preparada de acordo com o Exemplo 2 foi administrada previamente aos animais. A figura 2 apresenta os resultados de testes de neuroproteção com o com o composto da invenção NFKF no modelo de pilocarpina, sendo indicado o perfil de sobrevivência/morte dos animais mediante a administração do peptídeo da invenção. Em A) é mostrado o perfil de sobrevivência dos animais aos quais foi administrado o controle (apenas salina); Em B) é mostrado o perfil de sobrevivência dos animais aos quais foi administrado o canabidiol 30mg/kg; Em C) é mostrado o perfil de sobrevivência dos animais aos quais foi administrado o peptídeo da invenção NFKF 500^g/kg; Em D) são mostrados todos os perfis em um só gráfico. Interessante notar que no grupo tratado com o composto da invenção NFKF 500 μg/kg apenas dois animais que morreram. Os demais animais do grupo tratado com o peptídeo da invenção, no total de 3, seguiram vivos por mais de uma semana, enquanto praticamente todos os demais morreram em menos de 30 minutos. Consequentemente, o tempo médio de sobrevida para este grupo é significativamente diferente e muito maior do que o dos demais. Ademais, quando se compara o grupo ao qual foi administrado o composto invenção NFKF (500 μg/kg) com o grupo ao qual foi administrado o canabidiol (30mg/kg) destaca-se que a sobrevivência é três vezes maior no primeiro grupo, ou seja, no grupo ao qual foi administrado o composto invenção NFKF 500 μg/kg, mesmo usando uma concentração relativa de composto 60 vezes menor.

[0151] Além dos resultados mostrados na figura 2 acima, importantes efeitos técnicos adicionais incluem a observação de não ocorrência de prostração ou sangramento nasal nos animais submetidos ao tratamento com o composto da invenção NFKF, enquanto que no grupo dos animais tratados com canabidiol tanto a prostração quanto o sangramento nasal foram observados. Estes, portanto, são adicionais problemas técnicos resolvidos pelo composto da invenção.

[0152] Exemplo 4. Composição farmacêutica anticonvulsivante compreendendo o composto NFKF - resultados de testes in vivo

[0153] Nesta concretização, o efeito anticonvulsivante da composição da invenção preparada de acordo com o exemplo 2 foi avaliado mediante prévia administração da composição invenção e subsequente administração de pilocarpina a animais. A figura 3 apresenta os resultados de testes com o modelo de pilocarpina, sendo indicado o tempo para a ocorrência da primeira salivação com a administração de controle, canabidiol (30mg/kg) do composto da invenção R -N-AA -K-AA ₂ -FÍ2, em concretização na qual é o tetrapeptídeo NFKF (500μg/kg). Os dados entre controle e demais compostos teste não apresentem significância estatística entre si nas condições testadas.

[0154] A figura 4 apresenta os resultados de testes com o modelo de pilocarpina, sendo indicado o tempo para a ocorrência da primeira convulsão com a administração de canabidiol (30mg/kg) e o peptídeo da invenção NFKF (50C^g/kg). Os asteriscos indicam: ( ^** ) P<0.02 vs Controle; ( ^*** ) P<0.002 vs Controle.

[0155] Além dos resultados mostrados nas figuras 3 e 4, importantes efeitos técnicos adicionais incluem a observação de não ocorrência de prostração ou sangramento nasal nos animais submetidos ao tratamento com o composto da invenção NFKF, enquanto que no grupo dos animais tratados com canabidiol tanto a prostração quanto o sangramento nasal foram observados. Estes, portanto, são adicionais problemas técnicos resolvidos pelo composto da invenção.

[0156] Exemplo 5. Comparativo da composição farmacêutica compreendendo o composto NFKF com a composição farmacêutica compreendendo Hp - resultados de testes in vivo

[0157] Neste exemplo, foram comparados os efeitos da composição da invenção em relação à composição farmacêutica contendo Hemopressina (Hp ou PVNFKFLSH), cujo uso como anticonvulsivante é objeto de pedido de patente co-pendente dos mesmos inventores.

[0158] A figura 5 apresenta os resultados de testes do composto da invenção NFKF como comparativamente aos resultados de testes da hemopressina, ambos no modelo de pilocarpina. São apresentados os porcentuais de tempo em relação ao controle para a ocorrência da primeira salivação com a administração das seguintes doses de tratamento: o controle (salina) ; hemopressina (Hp ou PVNFKFLSH, 0,551334 μιτιοΙ/kg); hemopressina (0,91889 μη-iol/kg); o peptídeo da invenção NFKF (0,540882 μη-ιοΙ/kg); NFKF (0,901469 μηποΙ/kg); o PEP-19 (DIIADDEPLT, 0,9081 17 μηποΙ/kg). Os asteriscos indicam a significância estatística: ( ^* ) P<0.05 vs Controle; ( ^** ) P<0.01 vs Controle; o sinal + indica P<0.05 vs Hp 0,91889 μπιοΙ/kg.

[0159] De um lado, a salivação induzida pela administração de pilocarpina é indicativa de alterações nos receptores muscarínicos. Consequentemente, a substancial alteração no perfil de tempo para a ocorrência da primeira salivação observada com a administração prévia do composto da invenção, sugere modulação, direta ou indireta, de receptores muscarínicos.

[0160] Além disso, os resultados da figura 5 mostram claramente que a administração oral do composto da presente invenção proporciona atividade moduladora do tempo de ocorrência da primeira salivação substancialmente maior que aquela observada com a administração oral da Hp.

[0161] Exemplo 6. Comparativo da composição farmacêutica anticonvulsivante compreendendo o composto NFKF com a composição farmacêutica anticonvulsivante compreendendo Hp - resultados de testes in vivo

[0162] Neste exemplo, foram comparados os efeitos anticonvulsivantes da composição da invenção em relação à composição farmacêutica contendo Hemopressina (Hp ou PVNFKFLSH), cujo uso como anticonvulsivante é objeto de pedido de patente co-pendente dos mesmos inventores.

[0163] A figura 6 apresenta os resultados de testes do composto da invenção NFKF como anticonvulsivante comparativamente aos resultados de testes da hemopressina como anticonvulsivante, ambos no modelo de pilocarpina. São apresentados os porcentuais do tempo (em relação ao controle) para a ocorrência da primeira convulsão com a administração das seguintes doses de tratamento: hemopressina (Hp ou PVNFKFLSH, 0,551334 μιηοΙ/kg); hemopressina (0,91889 μιηοΙ/kg); o peptídeo da invenção NFKF (0,540882 μηποΙ/kg); NFKF (0,901469 μηποΙ/kg); o PEP-19 (DIIADDEPLT, 0,9081 17 μιηοΙ/kg) e o controle (salina). Os asteriscos indicam: ( ^* ) P<0.05 vs Controle; ( ^** ) P<0.01 vs Controle; o sinal + indica P<0.05 vs Hp 0,91889 μπιοΙ/kg.

[0164] Além disso, os resultados da figura 6 mostram claramente que a administração oral do composto da presente invenção proporciona atividade moduladora da ocorrência da primeira convulsão substancialmente maior que aquela observada com a administração oral da Hp. Observa-se, por exemplo, o mesmo efeito com metade da dose do composto da invenção quando comparado com a Hp. [0165] Os resultados dos testes realizados nos exemplos 3 a 6 acima mostram importantes e significativos resultados in vivo, em faixas de dosagem da ordem de 500 a 1000 μg de composto da invenção por kg de animal. Considerando se tratar de testes em camundongos e a conversão para a Dose Equivalente em Humanos referida acima, efeitos de mesma magnitude são esperados em humanos na faixa de dosagem de 40 a 80 μg de composto da invenção por kg de humano e, considerando-se as faixas de segurança cabíveis, concentrações entre 4 a 800 μg/kg para administração em humanos são consideradas na presente invenção.

[0166] Exemplo 7. Testes in silico de liqação/interação do composto NFKF ao receptor CB1

[0167] O receptor canabinóide 1 (CB1 ) corresponde ao GPCR (do inglês, Receptores Acoplados à Proteína G) mais expresso no cérebro humano e é encontrado em elevados níveis no Sistema Nervoso Central de modo geral (Figura 7). É ativado por endocanabinóides e tem sido apontado como um alvo terapêutico promissor para o tratamento de diversas doenças como dor e inflamação, esclerose múltipla e doenças neurodegenerativas (efeito agonista) e ainda, obesidade, fibrose hepática e dependência à nicotina (efeito antagonista) (HUA et al., 2016).

[0168] A figura 7 mostra uma visão geral da estrutura tridimensional de um GPCR, neste caso, o receptor canabinóide do subtipo 1 . Em destaque as sete hélices transmembranares (l-VII), as alças intracelulares (ICL1 e ICL2) e, as alças extracelulares (ECL2 e ECL3).

[0169] Através da utilização de ferramentas de Modelagem Molecular foi avaliado neste exemplo o modo de interação, no sítio de ligação de CB1 , do composto da invenção R1-N-AA1-K-AA2-R2, em concretização na qual é o tetrapeptídeo NFKF. Além disso, foi comparado o perfil observado com o modo de interação de outros ligantes conhecidos, como o canabidiol, rimonabanto e AM6538.

[0170] Os testes in silico do perfil de interação do tetrapeptídeo NFKF com o receptor CB1 foram feitos a partir do desenho e otimização das estruturas dos ligantes. Inicialmente, foi utilizado o programa Percepta para a verificação do estado de ionização desses ligantes em pH plasmático (pH = 7,4). Posteriormente, a construção das estruturas dos ligantes foi realizada no Programa Spartan v. 16 (Wavefunction, Inc.) seguida de minimização de energia por mecânica molecular.

[0171] A seleção da estrutura cristalográfica CB1 para os estudos de docking foi feita a partir dos dados disponíveis no Protein Data Bank (PDB), código PDB 5TGZ, pertencendo à espécie Homo sapiens e apresentando uma resolução de 2,8 Á. A referida estrutura corresponde ao único cristal de CB1 disponível no banco de dados e foi disponibilizada após a data de prioridade deste pedido de patente.

[0172] Em seguida, foi feita a validação das funções do Programa GOLD v. 5.1 e realização dos estudos de docking. Para identificação do complexo mais estável, foram consideradas três funções de pontuação presentes no Programa GOLD (ChemScore, Goldscore e ChemPLP). Para a realização do ancoramento molecular no Programa GOLD v. 5.5 (CCDC) foi necessária a localização do sítio ativo utilizando-se como referência o próprio ligante co- cristalizado (AM6538) e todos os aminoácidos a 6 Á de distância do mesmo. Posteriormente, foi realizado o ancoramento molecular e análise dos resultados no Programa PyMOL v. 1 .8.6.2 (Schrodinger, LCC).

[0173] Inicialmente, as funções de pontuação do programa GOLD v. 5.5 foram avaliadas segundo a capacidade de prever complexos proteína-ligante compatíveis com os resultados obtidos experimentalmente. Para isso, três funções de pontuação {Goldscore, Chemscore e ChemPLP) foram validadas através do redocking do ligante de referência, AM6538, no sítio de ligação do receptor CB1 (PDB 5TGZ). Primeiramente, realizou-se o docking na ausência de moléculas de água e, posteriormente, buscando-se estimar o quanto as moléculas de água presentes no sítio de ligação poderiam influenciar na orientação do ligante, a mesma avaliação foi feita na presença de moléculas de água. Os resultados alcançados por desvio quadrático médio {Root Mean Square Deviation RMSD), considerando os complexos de maior pontuação, podem ser observados na tabela 1 .

[0174] Para o cálculo do RMSD são considerados e comparados pares de átomos do resultado dos experimentos de modelagem molecular e dos experimentos de estrutura cristalográfica. Assim, a raiz quadrada da média entre as distâncias desses átomos é calculada, obtendo-se os valores para o desvio. Quanto menor é este desvio, maior é a aproximação entre os resultados, indicando portanto a função mais adequada a ser utilizada (MAIOROV; CRIPPEN, 1994; HILDEBRANDT et al., 2013).

[0175] Tabela 1 : Valores de RMSD obtidos a partir da validação das funções de pontuação do programa GOLD v. 5.5 para o redocking de AM6538 no receptor CB1 .

Função RMSD

Com água Sem água

CHEMPLP 0,9543 0,9134

CHEMSCORE 1 ,1762 1 ,1578

GOLDSCORE 0,9384 0,8864 [0176] Como indicado na tabela 1 , a função que apresentou menores valores de RMSD, e que demonstrou ser a mais adequada para os experimentos de docking, foi a Goldscore na ausência de moléculas de água no sítio de ligação, indicando que tais moléculas não influenciam no modo de interação do ligante.

[0177] A Figura 8 mostra de forma visual a sobreposição entre o complexo da estrutura cristalográfica (PDB 5TGZ) e o complexo resultante do experimento de redocking de AM6538 utilizando a metodologia validada.

[0178] O complexo resultante do redocking de AM6538 em CB1 obteve uma pontuação de 87,39 e o perfil de interação observado foi coerente com o descrito na literatura (HUA et al., 2016), sendo observadas diversas interações hidrofóbicas com resíduos de aminoácidos como: Phe-102, Phe-170, Phe-174 e Phe-379, bem como resíduos de leucina, metionina, cisteína e valina (ver Figura 9).

[0179] Por outro lado, para o rimonabanto e canabidiol, os perfis de interação observados foram bastante semelhantes ao do AM6538, apresentando, respectivamente, pontuações de 73,43 e 54,91 (Figuras 10 e 1 1 , respectivamente).

[0180] No experimento do docking de uma concretização do composto da invenção (tetrapeptídeo NFKF) sua estrutura foi analisada quanto a seu estado de ionização em pH plasmático (pH = 7,4) no programa Percepta, que indicou a estrutura apresentada abaixo, a ual foi utilizada para os estudos de docking.

[0181] O complexo resultante do docking do tetrapeptídeo NFKF em CB1 obteve uma pontuação de 100,66, substancialmente maior que a pontuação alcançada pelos ligantes de referência. Este fato pode ser explicado por ligações de hidrogénio adicionais observadas entre o tetrapeptídeo e os resíduos Ser-123, Thr-197, Ser-167 e Ser-383. Além disso, as interações hidrofóbicas observadas para AM6538 também estão presentes no modo de interação de NFKF (Figura 12).

[0182] Em conjunto, os resultados destes experimentos mostram que o perfil de interação observado para NFKF, com interações semelhantes aos ligantes de referência, bem como interações adicionais que resultaram em uma maior pontuação obtida nos estudos de docking, sugerem que o tetrapeptídeo NFKF é um potencial ligante de receptores canabinóides do subtipo 1 .

[0183] Exemplo 8. Testes in silico de liqação/interação do composto NFKF ao receptor CB2

[0184] Para viabilizar experimentos in silico da interação do composto da invenção R -N-AA -K-AA ₂ -FÍ2, em concretização na qual é o tetrapeptídeo NFKF, com o receptor CB2, foi primeiramente construído um modelo tridimensional do receptor CB2, para subsequentes experimentos de docking.

[0185] Nesta concretização, a construção do modelo 3D de CB2 foi feita a partir de uma busca no banco de dados UniProt da sequência de aminoácidos deste receptor. O critério utilizado para a seleção da sequência foi a espécie {Homo sapiens). Assim, a sequência selecionada para a realização dos estudos de modelagem molecular foi a de código P34972.

[0186] Em seguida, foi utilizada a ferramenta Template Identification do servidor SwissModel para identificação e seleção da proteína molde. A sequência apontada pelo servidor como a de maior identidade estrutural com a sequência de CB2 humana foi a de código PDB 5TGZ (HUA et al., 2016) pertencente à espécie Homo sapiens, correspondente ao receptor CB1 .

[0187] As sequências alvo e molde foram então alinhadas, utilizando-se o software ClustalW2 vinculado ao banco de dados UniProt, visando a comparação entre as sequências para estabelecer a porcentagem de identidade entre elas. O modelo 3D por homologia de CB2 humana foi construído através da ferramenta Automated Mode disponível na página do servidor Swiss-model e, para a validação do modelo gerado, foram analisadas a qualidade estrutural global e a qualidade estereoquímica do modelo através do valor apresentado para o parâmetro GMQE e da análise do gráfico de Ramachandran.

[0188] Após a criação do modelo 3D para CB2, foram realizados os estudos de docking para o tetrapeptídeo NFKF bem como para o canabidiol, rimonabanto e AM6538.

[0189] Após a identificação e seleção da sequência do receptor CB2 humano no UniProt e da identificação da proteína-molde (código PDB 5TGZ) a partir da ferramenta Template Identification no servidor Swiss-Model, foi feito o alinhamento entre ambas as sequências no programa ClustalW2. A identidade entre as duas sequências foi de 46,18%, o que viabiliza a utilização da modelagem comparativa como ferramenta de obtenção da estrutura 3D do receptor CB2 humano, conforme preconizado em estudos previamente publicados (MORGAN; HURLEY, 2015), os quais afirmam ser necessária a identidade de no mínimo 30% entre sequências primárias para a criação de modelos por homologia.

[0190] A qualidade estereoquímica do modelo foi analisada através do gráfico de Ramachandran (figura 13B). O gráfico de Ramachandran corresponde a um modelo matemático, o qual relaciona os ângulos diedros Φ (ângulo C-N-Ca-C) no eixo-x e Ψ (ângulo N-Ca-C-N) no eixo-y. Este gráfico é dividido em regiões capazes de representar a probabilidade de uma combinação entre os ângulos Φ e Ψ (RAMACHANDRAN; RAMAKRISHNAN; SASISEKHARAN, 1963). Essas regiões são classificadas em: favoráveis, permitidas, generosamente permitidas e proibidas.

[0191] O gráfico de Ramachandran construído para o modelo de CB2 humano mostrou a presença de aproximadamente 96% dos resíduos de aminoácidos nas regiões mais favoráveis e mais de 4% dos resíduos em regiões aceitáveis. Nenhum resíduo de aminoácido foi localizado em regiões proibidas, indicando a validação estereoquímica do modelo criado. Após a validação do modelo foram realizados os estudos de docking em CB2 do tetrapeptídeo NFKF, do antagonista AM6538, do ligante endógeno canabidiol e do antagonista rimonabanto.

[0192] Para todos os compostos analisados a pontuação obtida nos estudos foi inferior às atingidas para CB1 , sendo de 61 ,53 para AM6538, 72,33 para o tetrapeptídeo NFKF, 43,31 para o canabidiol e finalmente, 57,40 para o rimonabanto.

[0193] Como, de maneira simplista, os valores de pontuação podem ser considerados como um somatório das interações identificadas entre a proteína e o ligante, as pontuações menores podem então ser explicadas por um menor número de interações no sítio de ligação, ainda que as principais interações hidrofóbicas observadas em CB1 sejam mantidas em CB2 como pode ser observado nas Figuras 14-17.

[0194] Também é importante ressaltar que para o tetrapeptídeo NFKF as interações por ligação de hidrogénio apontadas em CB1 não ocorrem em CB2, contribuindo para sua pontuação inferior em CB2 (Figura 17), ainda que este peptídeo tenha apresentado uma outra ligação de hidrogénio com o resíduo de Lys-192.

[0195] A Tabela 2 apresenta de forma resumida a comparação entre as pontuações obtidas pelos estudos de docking em ambos os receptores (CB1 e CB2) nos exemplos 7 e 8 acima:

[0196] Tabela 2: Comparação entre as pontuações obtidas nos estudos de docking para os receptores CB1 e CB2.

[0197] Os resultados dos testes experimentais descritos nos exemplos 7 e 8 acima permitiram reproduzir, para os demais compostos testados, o modo de interação do antagonista AM6538 no sítio de ligação do receptor CB1 , conforme descrito na literatura por Hua e colaboradores. Além disso, os resultados proporcionaram a validação da metodologia de docking para os experimentos com o tetrapeptídeo NFKF comparativamente ao canabidiol e ao antagonista rimonabanto, sendo possível, portanto, a previsão de seus perfis de interação em CB1 .

[0198] A construção e validação de um modelo 3D por homologia do receptor CB2 resultou também na visualização do comportamento de todos os ligantes citados no sítio de ligação de tal receptor, proporcionando uma análise comparativa com os resultados obtidos com CB1 .

[0199] Em resumo, os resultados dos experimentos in silico dos exemplos 7 e 8 indicam que o tetrapeptídeo NFKF é um ligante de receptores CB1 . Além disso, interações menos favoráveis desse composto foram evidenciadas em receptores CB2, indicando um eventual perfil de seletividade. Além disso, os resultados dos experimentos dos exemplos 7 e 8, notadamente os mostrados nas das figuras 12 e 17, mostram que os aminoácidos NFK participam muito mais fortemente das ligações com CB1 e com CB2 do que o aminoácido F da posição C-terminal, indicando que este tripeptídeo é um potencial candidato a ligante/modulador de tais receptores.

[0200] Exemplo 9. Testes in vitro de ligação do composto NFKF ao receptor CB1

[0201] Neste exemplo, foi avaliado o perfil de afinidade in vitro do composto da invenção R -N-AA -K-AA ₂ -FÍ2, em concretização na qual é o tetrapeptídeo NFKF, com o receptor canabinóide CB1 .

[0202] Para tanto, foram usadas de técnicas de binding para a medição da afinidade do tetrapeptídeo NFKF (em pó com 100% de pureza e preparado como solução estoque 10mM em DMSO) pelo receptor canabinóide CB1 nas concentrações de 1 e 10 μΜ. Esta avaliação foi feita usando o receptor canabinóide CB1 recombinante humano, associado ao radioligante agonista CP 55940 (IC 50(M)=1 .1 nM; Ki(M)=0.94 nM; nH=1 ). Os ensaios in vitro de binding foram realizados com o uso de células CHO recombinantes expressando o receptor CB1 humano e do ligante [ ³ H]CP 55940 (concentração 0.5nM; Kd 3.5nM) em incubação por 1 20 minutos a 37 ^° C, usando o composto não específico WIN 5521 2-2 (1 0mM), sendo a detecção por contagem de cintilografia (Munro et al, 1 993).

[0203] Os resultados são expressos como o porcentual do binding do controle específico de acordo com a fórmula:

Binding específico medido X 1 00

Binding específico do controle

[0204] E como a inibição porcentual do binding do controle específico obtida na presença do composto da invenção:

1 00 - ( Binding específico medido X 1 00)

Binding específico do controle

[0205] Os valores de IC50 (concentração que causa metade de máxima inibição do binding do controle específico) e coeficientes de Hill (nH) foram determinados por regressão não linear das curvas de competição geradas com os valores médios das replicatas usando a equação de Hill.

Y = D + ( A - D )

1 + (C/C ₅₀ ) ^nH

[0206] Onde Y = binding específico, A = assintótica esquerda da curva, D = assintótica direita da curva, C= concentração do composto, CscHCso e nH= coeficiente da curva/s/ope fator. Esta análise foi realizada usando o Hill software a validada por comparação com dados gerados pelo software Sigmaplot 4.0. As constantes de inibição (K,) foram calculadas usando a equação de Chen Prusoff:

[0207] Onde L=concentração do radioligante no ensaio; K _D =afinidade do radioligante pelo receptor. Um gráfico é usado para determinar o KD. [0208] Resultados mostrando inibição ou estimulação superior a 50% são considerados como representativos de efeito significativo do composto teste. Resultados mostrando inibição ou estimulação entre 25% e 50% são indicativos de baixo a moderado efeito do composto teste. Resultados mostrando inibição ou estimulação inferior a 25% podem ser considerados como pouco significativos. Resultados mostrando inibição maior ou igual a 50% são indicativos efeitos não específicos ou de efeito alostérico do composto- teste.

[0209] Os resultados obtidos em duplicata para cada concentração testada (1 e 10 μΜ) são mostrados na tabela 3.

[0210] Tabela 3 - Dados de inibição in vitro de binding do agonista radioligante CP55940 ao receptor CB1 pelo NFKF.

% de inibição do binding do controle específico

[0211] Ainda que fosse desconsiderada a primeira medida a 1 mM, em função do valor surpreendentemente alto, o dado da segunda medida a 1 mM tomado sozinho ainda seria considerado indicativo de efeito.

[0212] Os resultados indicam que o NFKF tem maior poder de modular o binding do respectivo radioligante quando em baixas concentrações, sugerindo que na faixa de nM os efeitos são maiores.

[0213] Estes resultados apontam que o provável mecanismo de ação associado ao perfil terapêutico evidenciado para o tetrapeptídeo NFKF envolve a modulação alostérica de receptores canabinóides CB1 , o que é consistente com os surpreendentes/inesperados resultados dos experimentos in silico (exemplo 7) e experimentos in vivo (exemplos 3, 4, 5, 6).

[0214] Estes dados experimentais indicam que o composto da invenção interage com e/ou modula a atividade do receptor CB1 e/ou seus ligantes endógenos. Assim o composto da invenção é potencialmente em diversas funções metabólicas, incluindo o controle de ingestão de alimentos, o metabolismo de energia e/ou de lipídeos, na regulação da motilidade intestinal, no sistema imune, no equilíbrio do ciclo do cálcio, entre outros. Os receptores canabinóides são amplamente expressos no cérebro, incluindo córtex, hipocampo, amígdala, pituitário, hipotálamo, glândula adrenal. Os receptores CB, particularmente CB1 , já foram identificados em inúmeros órgãos periféricos e tecidos, incluindo glândula tiroidal, órgãos reprodutivos, tecido adiposo, fígado, músculos e trato gastrointestinal. Estes resultados suportam, portanto, o uso do composto da invenção na modulação de funções metabólicas e/ou na neumodulação.

[0215] Exemplo 10. Testes in vitro de ligação do composto NFKF ao receptor CB2

[0216] Neste exemplo, foi avaliado o perfil de afinidade in vitro do composto da invenção R -N-AA -K-AA ₂ -R2, em concretização na qual é o tetrapeptídeo NFKF, com o receptor canabinoide CB2.

[0217] Para tanto, foram usadas de técnicas de binding para a medição da afinidade do tetrapeptídeo NFKF (em pó com 100% de pureza e preparado como solução estoque 10mM em DMSO) pelo receptor canabinoide CB2 nas concentrações de 1 e 10 μΜ. Esta avaliação foi feita usando o receptor canabinoide CB2 recombinante humano, associado ao radioligante agonista WIN 55212-2 (IC 50(M)=1 .5 nM; Ki(M)=0.96 nM; nH=0.9). Os ensaios in vitro de binding foram realizados com o uso de células CHO recombinantes expressando o receptor CB2 humano e do ligante [ ³ H]WIN55212-2 (concentração 0.8nM; Kd 1 .5nM) em incubação por 120 minutos a 37 ^° C, usando o composto não específico WIN 55212-2 (5mM), sendo a detecção por contagem de cintilografia (Rinaldi-Carmona et al, 1996).

[0218] Os resultados são expressos conforme indicado no exemplo 9 acima.

[0219] Os resultados obtidos em duplicata para cada concentração testada (1 e 10 μΜ) são mostrados na tabela 4.

[0220] Tabela 4 - Dados de inibição in vitro de binding do agonista radioligante WIN 55212-2 ao receptor CB2 pelo NFKF. % de inibição do binding do controle específico

[0221] Os resultados indicam que o NFKF não proporcionou significativa modulação no binding do respectivo radioligante nas condições testadas.

[0222] Tomando estes resultados em conjunto com os resultados dos experimentos descritos no exemplo 8, pode-se chegar a interessantes conclusões. A despeito do peptídeo NFKF ter se demonstrado um ligante seletivo de receptores canabinóides CB2, conforme indicam os resultados dos experimentos de docking para este receptor, os resultados dos teste in vitro indicam que este tetrapeptídeo não é capaz de se ligar a este receptor canabinoide de forma significativa. Entretanto, não se pode descartar uma interação do composto da invenção com o receptor CB2 do tipo alostérica. Assim, os resultados de testes indicaram uma modulação positiva de receptor CB2, ainda que moderada nas concentrações testadas, sugerem um efeito combinado de modulação (alostérica) negativa para CB1 e positiva para CB2.

[0223] Além disso, os resultados dos testes in vitro (exemplos 9 e/ou 10) demonstram que o composto da invenção pode ser usado como ligante de interesse diagnóstico, como por exemplo a marcação radioativa ou com cromóforos para subsequente identificação dos locais de ligação em células e/ou tecidos.

[0224] O conceito inventivo ora revelado e exemplificado de uma ou mais formas foi tratado como segredo industrial e não foi previamente revelado até o momento do depósito deste pedido de patente. Este segredo industrial é ativo imaterial do depositante. A eventual futura publicação do pedido de patente não constitui, em si, autorização de uso por terceiros, servindo apenas como: (i) cientificação a terceiros da existência do referido segredo industrial na data do depósito; (ii) indicação inequívoca de seu detentor; e (iii) estímulo ao desenvolvimento de novas melhorias a partir do conceito ora revelado, para evitar o reinvestimento no desenvolvimento do mesmo bem já detido pelo depositante.

[0225] Desde logo se adverte que eventual uso comercial requer autorização do detentor e que o uso não autorizado enseja sanções previstas em Lei. Neste contexto, desde logo se esclarece que a partir da revelação do presente conceito inventivo, os versados na arte poderão considerar outras formas de concretizar a invenção não idênticas às meramente exemplificadas acima, mas que na hipótese de pretensão de uso comercial tais formas poderão ser consideradas como estando dentro do escopo das reivindicações anexas.